JPH05192151A - リボザイムを用いた新規ｒｎａ転写システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 転写されるＲＮＡの５′末端と３′末端とを
各々、セルフプロセッシングにより切断するリボザイム
ＲＮＡをコードするＤＮＡが連結されたベクター、また
は転写されるＲＮＡの５′末端と３′末端をセルフプロ
セッシングするリボザイムとそれらの間に特定の配列を
持つＲＮＡを一つのユニットとし、あるいは転写される
ＲＮＡの３′末端をセルフプロセッシングするリボザイ
ムとその上流に特定の配列を持つＲＮＡを一つのユニッ
トとし、それらのユニットを複数連結させたＲＮＡをコ
ードするＤＮＡ配列を含むベクター、それらを用いたＲ
ＮＡ転写物の製造方法及び前記ベクターにより形質転換
された微生物又は動植物細胞。 【効果】 本発明の２つのリボザイムＲＮＡをコードす
るＤＮＡ断片を含むベクターは、環状のままでも制限酵
素を用いることなく５′末端及び３′末端側において余
分な塩基配列が付加されていないＲＮＡ転写物を製造す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はリボザイムを用いた新規
ＲＮＡ転写システムに関するものである。

【従来の技術】従来、すべての酵素はタンパク質から構
成されていると確信されていたが、１９８１年に酵素活
性を有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムが発見さ
れ、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期
的発見はコロラド大学のＴ．Ｃｅｃｈ教授らによっても
たらされ、原生動物のテトラヒメラのリボソームＲＮＡ
（ｒＲＮＡ）前駆体はタンパク質の力を借りずに、遺伝
情報伝達上不必要なイントロン（ＩＶＳ）をセルフスプ
ライシングにより取り除くことを証明した（Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｖｏｌ．３０８，ｐ．８２０−８２５（１９８
４））。その後、ホスホジエステル結合をセルフスプラ
イシングするような触媒機能を有するＲＮＡ分子が次々
と発見されているほか、他のＲＮＡ分子を切断するリボ
ザイムも見い出されている。このような中で、最近、
Ｊ．ＨａｓｅｌｏｆｆとＷ．Ｌ．Ｇｅｒｌａｃｈは、数
種の植物ウイルスのリボザイムの間で共通に保持されて
いる塩基配列に着目し、わずか２４塩基で触媒活性部位
を構成する人工リボザイムの構築に成功している（Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３３４，ｐ．５８５−５９１（１９
８８））。図１はこの人工リボザイムのデザインを示す
もので、この人工リボザイムは、基質となるＲＮＡ分子
の塩基配列を認識して塩基対を形成するバインディング
サイトＣと、２４個の特定の塩基配列を有する触媒活性
部位Ｂから構成されており、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅとして
示された基質ＲＮＡのＡ（ＧＵＣ）部分に隣接する位置
でＲＮＡの切断を行う（図中、矢印で示す）。なお、こ
のＡ部分のＲＮＡ配列は、ＧＵＣのみでなく、他の配列
に変更することも可能である。そして、このＪ．Ｈａｓ
ｅｌｏｆｆ等の人工リボザイムの構築において使用した
手法は、上記のリボザイムのデザインに基づいてリボザ
イムＲＮＡと相補塩基配列を有し、リボザイムＲＮＡを
コードするＤＮＡを合成してプラスミドに挿入し、さら
にこの組み換えプラスミドを形質転換して得られたクロ
ーンを制限酵素で切断して、リボザイムＲＮＡをコード
するＤＮＡ断片を得、これを鋳型としてｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで転写して人工リボザイムを得るもので、この実施に
おいてはバインディグサイトの塩基配列が異なる３種の
リボザイムを合成し、この３種のリボザイムがクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼに対応するｍ
ＲＮＡを各々異なる位置で切断することを明らかにして
いる。一方、特定のＲＮＡ転写物を得ようとする場合、
従来法においては、目的とするＲＮＡをコードするＤＮ
Ａを鋳型として、ＲＮＡに転写する際に、該ＤＮＡによ
り組み換えられたプラスミドを制限酵素で切断してから
転写するという余分の手間を要するものであった（ラン
・オフ法と呼ばれている）。この理由は、該プラスミド
に挿入されたＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡを転写する
場合には、５′末端側と３′末端側における余分な塩基
配列が転写されてしまい、この余分な塩基配列をできる
だけ転写させないようにするためであった。すなわち、
５′末端側は、プロモータのすぐ下流に上記ＤＮＡを連
結させることによって処理していたが、３′末端側の処
理は、ＲＮＡの転写において未だユニバーサルなターミ
ネータが見い出されていないので、３′末端側の処理に
際して制限酵素を使用するいわゆるランオフ法を採らざ
るを得なかったものであり（図２参照）、前述したリボ
ザイムＲＮＡの製造においても、このランオフ法を採用
していた。

【発明が解決しようとする課題】しかし、このような従
来の制限酵素を使用する方法においては、制限酵素を使
用するという余分の手間に加えて、転写において切断さ
れた線状のＤＮＡを使用するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
は、ＲＮＡを合成することも可能であるが、生体内にお
いて、ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を含む組み換えベ
クターを保持、増殖せしめつつＲＮＡ転写物を産生させ
ることはできないものであった。また、５′末端側の処
理においてプロモーターのすぐ下流に目的とするＲＮＡ
に対応するＤＮＡを連結したとしても、転写開始点から
目的とするＲＮＡに対応するＤＮＡまでの間の余分な塩
基配列が付加してしまうということはさけられなかっ
た。本発明の課題は、上記のような制限酵素による切断
を行わずに、目的とするＲＮＡ転写物をコードするＤＮ
Ａにより組み換えられた環状のベクターをそのまま鋳型
として用いることができるとともに余分な塩基配列を有
しないＲＮＡを転写することができ、かつ生体内におい
ても該組み換えベクターを保持増殖させながら目的とす
るＲＮＡ転写物を産生できる、リボザイムを用いた新規
なＲＮＡ転写システムを提供しようとするものである。

【課題を解決するための手段】本発明者等は、鋭意研究
の結果、ベクターの構築において、目的とするＲＮＡ転
写物の５′端末と３′端末とを各々セルフプロセッシン
グにより切断するリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ
を連結することにより、上記課題を解決し得ることを見
い出し、本発明を完成するに至ったものである。すなわ
ち、本発明は、（１）転写されるＲＮＡの５′末端と
３′末端とを各々、セルフプロセッシングにより切断す
るリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡが連結されたベ
クター、（２）転写されるＲＮＡの５′末端と３′末端
をセルフプロセッシングするリボザイムとそれらの間に
特定の配列を持つＲＮＡを一つのユニットとし、そのユ
ニットを複数（２〜１００）連結させたＲＮＡをコード
するＤＮＡ配列を含むべクター。（３）転写されるＲＮ
Ａの３′末端をセルフプロセッシングするリボザイムと
その上流に特定の配列を持つＲＮＡを一つのユニットと
し、そのユニットを複数連結させたＲＮＡをコードする
ＤＮＡ配列を含むベクター。（４）上記（１）乃至
（３）のいずれか記載のベクターを鋳型としてＲＮＡに
転写することを特徴をする、５′末端側と３′末端側が
セルフプロセッシングされたＲＮＡ転写物の製造方法、
（５）上記（１）乃至（３）のいずれか記載のベクター
により形質転換された微生物又は動植物細胞、にある。
以下、本発明を更に詳述する。本発明におけるベクター
の構築においては、目的とするＲＮＡ転写物の５′末端
側と３′末端側を処理するため２つのリボザイムＲＮＡ
をコードするＤＮＡ断片を連結する。このうち、第１の
ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ転写物の５′末端側を処理するた
めのもので、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位をコード
する部分と、その両端の基質となる転写されるＲＮＡの
切断部位（５′端末側）を認識するバインディングサイ
トをコードする部分を含む。このリボザイムＲＮＡとコ
ードするＤＮＡは目的とするＲＮＡ転写物をコードする
ＤＮＡの５′上流側に連結する。また、同じく挿入され
る第２のＤＮＡ配列は、転写されたＲＮＡの３′末端側
を処理するためのもので前記目的とするＲＮＡ転写物を
コードするＤＮＡの３′下流側に連結され、リボザイム
ＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分とその両端の基
質となる転写されるＲＮＡの切断部位（３′端末側）を
認識するバインディングサイトをコードする部分より成
る。そして、本発明において、このベクターを用いてＲ
ＮＡ転写物を製造する場合は、該組み換えベクターを試
験管内あるいは酵母、カビ、植物、動物等の生体中に保
持せしめてＲＮＡの転写を行う。転写は、プロモーター
の３′の下流側の転写開始点から開始され、目的とする
ＲＮＡ転写物の領域をすぎても終了せず、目的とするＲ
ＮＡ転写物よりも長鎖のＲＮＡ転写物が生成するが、こ
の生成したＲＮＡの３′末端及び５′端末は、すでにリ
ボザイムによるセルフプロセッシングにより切断されて
余分な塩基配列は付加されない。以上の点を図３、４、
５に基づき更に具体的に説明する。例えば図３は、酵母
の凝集性に関する遺伝子由来ｍＲＮＡ（以下、ＳＦＬ１
ｍＲＮＡという。）を切断し得る本発明の組み換えプラ
スミドｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３の構造を表すものであ
り、前述のｐＧＥＮＥ ８４５９（多比良等、特願平１
−３２９８８３１及びＫ．Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３，７３３−
７３７（１９９０））のＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片を取
り除き、常法により化学合成した新たなオリゴヌクレオ
チドＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片を代わりに挿入した。挿
入した塩基配列は図３のｐＧＥＮＥ８４５９ｖ３のＥｃ
ｏＲｌサイトからＳａｃＩサイトに相当し、両鎖とも化
学合成した後、それぞれの５′未満をリン酸化してリガ
ーゼを用いて連結した。 該プラスミドは、Ｔ_７ＲＮＡ
ポリメラーゼのためのプロモータの下流側にＳＦＬ１ｍ
ＲＮＡの切断部位を認識するバインディングサイトをコ
ードする部分とループ状の触媒活性部位をコードする部
分からなるリボザイムＲＮＡに対応するＤＮＡ部分を有
しており、更にその５′上流側と３′下流側において転
写されたＲＮＡがセルフプロセッシングにより切断され
る切断部位（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）と、この切
断を行うループ状の触媒活性部位及び上記セルフプロセ
ッシングの切断部位を認識するバインディングサイトか
らなるリボザイムＲＮＡをコードする２つのＤＮＡ配列
を有している。そして、上記バインディングサイトをコ
ードするＤＮＡ配列は、切断部位直前にある一つの塩基
部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係にあり塩
基対を形成する。該プラスミドは、転写をＴ_７プロモー
タの下流＋１から始め、ＳＦＬ１用のリボザイム部分及
びその下流側の塩基配列部分を順次ＲＮＡに転写してい
くが、転写されたＲＮＡは前記した５′末端及び３′末
端の切断部位において２つのリボザイムによりセルフプ
ロセッシングされることにより、余分な塩基配列は得ら
れるリボザイムには付加されない。したがって、この図
３の組み換えプラスミドを鋳型として転写することによ
り得られるリボザイムＲＮＡは図４の塩基配列を有する
ものとなる。このリボザイムＲＮＡは５′及び３′末端
側に相補の塩基配列を有し、塩基対を形成してヘアピン
構造となっており、このため生体内におけるエキソヌク
レアーゼによる分解に対し、安定性を有するものであ
る。この図３の組み換えプラスミドの構築においては、
製造するリボザイムとしてＳＦＬ１切断用のリボザイ
ム、プロモータとしてＴ_７ＲＮＡポリメラーゼのための
プロモータ及びベクターとしてｐＵＣ１１９を用いてい
るが、本発明は特にこれらにより限定されるものではな
い。すなわち、上記の図３のプラスミドはリボザイムＲ
ＮＡを製造するためのものではあるが本発明は、このＲ
ＮＡに限らず、例えばＲＮＡウイルスのＲＮＡ、アンチ
センスＲＮＡ、種々のｍＲＮＡ等、広くＲＮＡ転写産物
の製造に適用できることは容易に理解されよう。また、
プロモータも例えばＳＰ６、ＧＡＬ７等種々のものを使
用でき、さらに組み換えるベクターについても本発明の
組み換えベクターは、特に環状のままでも、ＲＮＡを転
写できるため種々の生体中においても充分機能を有する
ものであって、リボザイム機能を発揮させようとする生
体例えば植物、動物等の種類に応じて適当なベクターを
選択すればよいものである。また、従来、転写因子やプ
ロモータ領域の研究においてＧフリーシステムが用いら
れている（図７）。このシステムを用いると、前述した
ように転写効率の良い環状ＤＮＡを用いることができる
ために、活性の弱い転写因子の研究にも利用できるから
である。しかし、このシステムを利用するためには、シ
チジンを含まないＤＮＡ領域を合成して環状ＤＮＡに挿
入する必要がある（Ｓａｗａｄｏｇｏａｎｄ Ｒｏｅｄ
ｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８２，４３９４−４３９８）。また、転写を行なう
場合には、ＧＴＰを除いた条件、もしくはＧＴＰを含む
場合にはＲＮａｓｅ Ｔ_１を併用し、またベクター領域
での伸長反応を停止させるために３′−Ｏ−メチル−Ｇ
ＴＰも添加する必要がある。我々が発明した系を用いる
と、上記の制限なく、転写因子やプロモータ領域の研究
を行なうことができる。すなわち、我々が開発したベク
ターを一般的に表すと図８のようになり、Ｇフリー配列
の代わりに、鋳型ＤＮＡ（ＤＮＡ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）
より転写されて５′と３′が処理されたＲＮＡ転写産物
の量を測定することにより、転写因子の強さやプロモー
タ領域の重要性を調べることができる。つまり、例えば
図３の構築を用いた場合には、「ＳＦＬ１用リボザイ
ム」（図５）の発現量を測定することにより、定量化が
可能となる。図５において「ＳＦＬ１用リボザイム」の
量が、（Ｈ）よりも（Ｄ）の方が多いという観測に基づ
き、環状ＤＮＡ（Ｄ）の方が線状ＤＮＡ（Ｈ）よりも転
写効率が優れていると結論付けたが、同様な測定を行な
うことにより転写因子やプロモータの強度を調べること
ができる訳である。また、３′−Ｏ−メチル−ＧＴＰや
ＲＮａｓｅ Ｔ_１などを併用する必要もないので、Ｇフ
リーシステムより簡便である。このベクターの最大の利
用価値は、抗エイズウイルス用リボザイムの開発におい
てであろう。最近、リボザイムを抗エイズウイルス剤と
して利用する開発が世界中で進められているが、従来の
ベクターを用いるとエイズウイルスの一ケ所を切断する
リボザイムしか導入できない。しかし、エイズウイルス
は変り身が速いので有名で、エイズ遺伝子に変異が起こ
りやすい。そこで、一ケ所をターゲットとしたリボザイ
ムを導入しても、そのターゲットサイトに変異が起こっ
た場合、リボザイムは抗ウイルス剤としての機能を忘
う。そこで、数ケ所を同時に攻撃するリボザイムの導入
が望まれるが、そのようなものは従来知られておらず本
発明によるベクターにより初めて可能となる。例えば、
従来のベクターを用いて数ケ所を攻撃するリボザイムを
作成しようとすると図９のような構築になる。ここで、
「リボザイムＡ」はエイズウイルスのＡ部位を切断する
リボザイム、また「リボザイムＢ」はＢ部位を、「リボ
ザイムＣ」はＣ部位をそれぞれ切断するリボザイムとし
よう。これらのリボザイムはプロモータとターミネータ
の間に導入されているので、すべてのリボザイムが一本
の長いＲＮＡ鎖の中に埋め込まれた型で転写される。結
果として、リボザイムＡがＡ部位を攻撃している間は、
リボザイムＢはＢ部位を攻撃することができない。それ
ぞれのリボザイムが独立に行動できないだけでなく、図
９の構築では相同性の高い領域を持つリボザイムが一本
のＲＮＡ鎖の中に多数存在するので、実際は、図９のよ
うにきれいにリボザイムが並んだような構造はとらず、
リボザイムＡの一部がリボザイムＣの一部と塩基対を形
成するなど、それぞれのリボザイムが不活性化する。こ
の問題を解決する手段が我々が開発したベクターであ
る。具体的には、図８の鋳型ＤＮＡの領域にエイズウイ
ルスのＡ部位を攻撃するリボザイムＡを導入する。ま
た、平行して、別の試験管内では鋳型ＤＮＡ領域にＢ部
位を攻撃するリボザイムＢを導入する。同様にして、数
ケ所のターゲットサイトを持つリボザイムをそれぞれ鋳
型ＤＮＡ領域に導入した後、それぞれのエイズウイルス
を攻撃するリボザイムの上流と下流に位置する５′及び
３′端処理用リボザイムを含む型で切り出し（これを１
ユニットとする）、最終的にすべてのユニットを図１０
のように連結させる。図１０においては、エイズウイル
スを攻撃するリボザイムは生体内での安定化を計るため
に（Ｃｏｔｔｅｎ ａｎｄ Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，８，３８６１−３８６６（１９８９））ｔ
ＲＮＡに埋め込んである（図１１）。図１０の構築を用
いると、エイズウイルスを攻撃するそれぞれのリボザイ
ムは、５′と３′端で切断を受けるので、それぞれのリ
ボザイムが独立して、設計された位置を攻撃し、エイズ
ウイルスを切断する。この場合、Ａ部位に変異が起き
て、リボザイムＡが作用できなくなったとしても、リボ
ザイムＢが変異が起こっていないＢ部位でエイズウイル
スを切断するのでエイズウイルスを失活させることがで
きる。

【発明の効果】本発明の２つのリボザイムＲＮＡをコー
ドするＤＮＡ断片を含むベクターは、環状のままでも制
限酵素を用いることなく５′末端及び３′末端側におい
て余分な塩基配列が付加されていないＲＮＡ転写物を製
造することが可能なものであり、従来のように制限酵素
を用いる場合に比べて簡便な操作でＲＮＡ転写物の製造
を行うことができるほか、試験管内のみでなく、生体内
においても該組み換えベクターを保持増殖せしめなが
ら、ＲＮＡ転写物の産生を図ることができる。さらに、
図５の電気泳動図より明らかなように、線状ＤＮＡを鋳
型とする従来のラン・オフ法（図２）よりも、環状ｐＧ
ＥＮＥ ８４５９ｖ３ＤＮＡを鋳型として用いた方が、
転写効率が優れている。これはＲＮＡポリメラーゼがよ
りナチュラルな環状ＤＮＡを鋳型として好むためと思わ
れ、ＲＮＡを単離する場合、転写効率及び純度などの面
からｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３を用いる方が従来のラン
・オフ法より優れている。また、このプラスミドを用い
ることにより、Ｇフリーシステムより簡便に、さらによ
りナチュラルな条件下で転写因子やプロモーター領域を
調べることができる。さらに、抗エイズウィルス剤とし
てリボザイムを用いる際、エイズウィルスの数カ所を同
時に攻撃するシステムが望まれる。これは現在のとこ
ろ、我々が開発したユニット（５′および３′処理用リ
ボザイムおよび分子間で働くリボザイムの３種類のリボ
ザイム領域より構成される）を図１０のように連結する
ことにより始めて可能となる。以下、本発明を実施例に
より具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例
によりその技術的範囲が限定されるものではない。

【実施例】

（１） 組み換えベクターｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３の
構築 先に述べた方法（多比良等、特願平１−３２９８３１
号；Ｔａｉｒａ Ｋ．，Ｏｄａ，Ｍ．，Ｓｈｉｎｓｈ
ｉ，Ｈ．，Ｍａｅｄａ，Ｈ．， ａｎｄ Ｆｕｒｕｋａ
ｗａ，Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，３，７３３−７３７）で図３のＥｃｏＲＩ
／ＳａｃＩ断片を化学合成し、うまく連結されたポジテ
ィブなクローンの確認には制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＤＮ
Ａシークエンサー（アプライドバイオシステム社製３７
０Ａ）を用いた。 （２） リボザイムの製造 前述の方法（多比良等、特願平１−３２９８３１号；Ｔ
ａｉｒａ Ｋ．，Ｏｄａ，Ｍ．，Ｓｈｉｎｓｈｉ，
Ｈ．，Ｍａｅｄａ，Ｈ．， ａｎｄ Ｆｕｒｕｋａｗ
ａ，Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ，３，７３３−７３７）でＲＮＡの転写を行っ
た。その結果を図５の電気泳動図に示す。図５におい
て、（Ａ）から（Ｄ）は、鋳型ＤＮＡとして環状のｐＧ
ＥＮＥ ８４５９ｖ３を用いた場合を、また、（Ｅ）か
ら（Ｈ）は鋳型ＤＮＡとしてＨｉｎｄＩＩＩにより切断
した線状ｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３を用いた場合をそれ
ぞれ示している。転写反応時間は、（Ａ）と（Ｅ）の場
合３０分、（Ｂ）と（Ｆ）の場合１時間、（Ｃ）と
（Ｇ）の場合２時間３０分、（Ｄ）と（Ｈ）の場合６時
間であった。^３２Ｐでラベル化された上記（Ａ）〜
（Ｈ）の各転写産物は８．３％尿素を含む６％ポリアク
リルアミドゲルを用いて解析した。図５には約５０塩基
から１３０塩基までの領域を示す。 （３）リボザイム反応 図５の「ＳＦＬ１用リボザイム」及び線状ｐＡＭ１９Ｓ
ＦＬｌａｃ（ＰｓｔＩ）を鋳型として同様に転写及び電
気泳動された「ＳＦＬ１ｍＲＮＡ」をそれぞれポリアク
リルアミドゲルより切り出し、４００μＬの０．３Ｍ酢
酸ナトリウム／０．１ｍＭＥＤＴＡ／２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８）を用いてそれぞれのＲＮＡを抽出
した。常法によりエタノール沈澱を行い、単離した基質
（ＳＦＬ１ｍＲＮＡ）が酵素（ＳＦＬ１用リボザイム）
より過剰な条件で混合し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ８）／１０ｍＭＭｇＣｌ_２中３７℃で切断反応を
追った。図５と同じ組成のゲルで解析した結果を図６に
示す。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）の反応
時間は、それぞれ０．１、２．５、５．５、９．５時間
である。時間と共にＳＦＬ１ｍＲＮＡが図４のような複
合体をリボザイムと形成し、ＳＦＬ１ｍＲＮＡが二つに
切断される。図５及び図６の結果より明らかなように、 Ａ． 環状のｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３を鋳型とした場
合、６１塩基で構成されるＳＦＬ１用リボザイムが放出
された。これは５′端処理用及び３′端処理用のリボザ
イムが効率よく作用したためである。また、５′端処理
用リボザイムとＳＦＬｌ用リボザイムが連結した断片も
徐々に切断を受け二つに別れる（図５、Ａ〜Ｄ）。 Ｂ， ３′端処理用リボザイムのすぐ下流にあるＨｉｎ
ｄＩＩＩサイトを切断した線状ｐＧＥＮＥ ８４９５ｖ
３を鋳型とした場合、まず５′端処理用リボザイム、Ｓ
ＦＬ１用リボザイム、及び３′端処理用リボザイムが連
結された状態で産生され、徐々に切断を受けるが、環状
のｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３を鋳型とした場合と比べて
転写効率が悪く、また副産物も多い（図５、Ｅ〜Ｈ）。 Ｃ． 図５より明らかなように、５′端及び３′端処理
用リボザイムの間に挿入された配列（図８の鋳型ＤＮＡ
領域、今回の場合はＳＦＬｌ用リボザイム配列）は、
５′端及び３′端処理用リボザイムの外側の配列に関係
なく、転写後、切り出される。このことは、５′端処理
用リボザイムと３′端処理用リボザイム及びその間に挿
入された特定の配列（例えば、分子間で働くリボザイ
ム）を一つのユニットとし、そのユニットを複数（１〜
１００）連結させても、挿入された配列に由来するＲＮ
Ａが切り出されることを意味する。 Ｄ． Ｔ_７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＳＦＬ１遺伝子
の転写産物を作成し、その後、単離したＳＦＬ１用リボ
ザイムと混ぜた場合においては、ＳＦＬ１用リボザイム
がうまく作用すると７６塩基のＳＦＬ１転写産物が切り
出されるように結合部位を設計したものであり（図
４）、実際予想どおり７６塩基の断片が確認できた（図
６）。 以上の結果をまとめると、５′端処理用リボザイムと
３′端処理用リボザイムは分子内で設計どおりに切断反
応を起こした。また、ＳＦＬ１用リボザイムも設計どお
りに分子間で切断反応を起こした。また環状ＤＮＡを鋳
型とする方が転写効率および純度の面で優れており、ま
たｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３の「ＳＦＬ１用リボザイ
ム」領域はカセット式になっており他の配列と置き換え
ることができるので、特に短いＲＮＡ転写産物を単離す
る場合、ｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３の方が従来のラン・
オフ法より優れている。また、制限酵素を用いて切断す
る手間もはぶける。なお、本発明のプラスミドｐＧＥＮ
Ｅ ８４５９ｖ３は大腸菌ＪＭ１０９に導入し、工業技
術院微生物工業技術研究所にＪＭ１０９／ｐＧＥＮＥ
８４５９ｖ３として寄託している。そして、その寄託番
号は微工研条寄第３３３１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３３
１）である。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｊ．Ｈａｓｅｌｏｆｆ等が示した人工リボザイ
ムのデザインを示す図である。

【図２】従来の転写手段であるラン・オフ法を示す模式
図である。

【図３】本発明における組み換えプラスミドｐＧＥＮＥ
８４５９ｖ３の構造を示す図である。

【図４】ＳＦＬ１用リボザイムの塩基配列とその５′端
および３′端におけるシステム構造、さらにＳＦＬ１ｍ
ＲＮＡとの複合体を示す図である。

【図５】環状および線状のｐＧＥＮＥ ８４５９ｖ３を
鋳型として転写して得られた各種転写産物の電気泳動図
である。

【図６】ＳＦＬ１用リボザイムによるＳＦＬ１ｍＲＮＡ
の切断を示す電気泳動図である。

【図７】従来のＧフリーＲＮＡ転写システムを示す。

【図８】図３の組換えプラスミドを一般化したものを示
す図。

【図９】従来の方法で、異なる部位を攻撃する数種類の
リボザイムを連結させた場合の模式図。

【図１０】今回開発したベクターを用いて、異なる部位
を攻撃する数種類のリボザイムを連結させる模式図。

【図１１】図８のＤＮＡ鋳型領域にｔＲＮＡに埋め込ま
れた安定なリボザイムを挿入した例を示す図。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 転写されるＲＮＡの５′末端と３′末端
   とを各々、セルフプロセッシングにより切断するリボザ
   イムＲＮＡをコードするＤＮＡが連結されたベクター。
2. 【請求項２】 転写されるＲＮＡの５′末端と３′末端
   をセルフプロセッシングするリボザイムとそれらの間に
   特定の配列を持つＲＮＡを一つのユニットとし、そのユ
   ニットを複数連結させたＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
   を含むベクター。
3. 【請求項３】 転写されるＲＮＡの３′末端をセルフプ
   ロセッシングするリボザイムとその上流に特定の配列を
   持つＲＮＡを一つのユニットとし、そのユニットを複数
   連結させたＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクタ
   ー。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれかに記載のベク
   ターを鋳型としてＲＮＡに転写することを特徴をする、
   ５′末端側と３′末端側がセルフプロセッシングされた
   ＲＮＡ転写物の製造方法。
5. 【請求項５】 請求項１乃至３のいずれかに記載のベク
   ターにより形質転換された微生物又は動植物細胞。