JPH05196610A - 試料の成分分析物を分離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】極性および無極性成分を含む試料のオン・カラ
ム濃縮を界面活性剤の極性溶媒で混合させることによっ
て提供し、広範囲にわたる極性成分を含む試料の分離を
可能にする。 【構成】界面活性剤によって無極性分析物は極性溶媒に
溶解しているミセルに取り込まれる。界面活性剤の濃度
は、カラムの頂部に混合物が導入される際、ミセルが維
持される十分なレベルに維持される。試料の導入が完了
すると、混合物を希釈し、界面活性剤濃度をミセルを維
持する際に要求されるレベル以下に降下させ、よってミ
セルを分解する。そして、逆相勾配溶出法を用いて分析
物を分離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は化学分析システムに関
し、より詳細には、広範囲にわたる極性を有する試料分
析物を分離するために改善されたクロマトグラフィーに
関するものである。

【０００２】

【従来技術とその問題点】分析化学はタンパク質等の複
雑な分子を分解し、分析物を分離して同定、定量するこ
とによって、生体系に関する我々の理解を進歩させてい
る。「クロマトグラフィー」とは、固定相と移動相の間
における分析物の分配に関係する技術であり、分析物は
移動相と共に流れるが、その流れは固定相に対するそれ
らの分析物の分配の程度に比例して遅れる。この遅延の
結果、移動相中で分析物が分離される。高性能液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）においては、試料は、固定
相（例えば支持物質に吸収された溶媒）を充填した小口
径のカラムに注入される。次に、液体移動相は固定相を
介してポンプで送られ、試料をカラムの中へ案内する。
試料がカラム中を移動すると、各試料は固定相と移動相
の間で分配される。

【０００３】分離は、固体相による選択的成分保持によ
って達成される。ある成分についての保持時間はその成
分の容量比(capacity factor) ｋ′と関係があり、容量
比ｋ′は分配係数と固定相容積との積を移動相のすきま
容積(interstital mobile phase volume) で割ることに
よって求められる。異なる成分の分離には、それらが異
なる容量比を有することが必要である。異なる試料成分
の容量比が小さすぎると、分離は十分に行われない。容
量比が大きいと、分離は改善されるが、バンド幅が大き
くなり、分析時間が長くなる。理想的には、試料成分が
比較的分離したバンドとなって分離カラムを通過するこ
とである。次に、各バンドはそれらの分配係数の増加順
に従って分離カラムから溶出される。分析物は溶出する
に伴って、収集または検出され、あるいは収集と検出を
併せて行うことができる。カラムによる保持時間によっ
て成分を同定することができ、これに対応する検出ピー
ク面積によって定量することができる。なお、ピーク面
積はそのピークを生じさせた成分の量に比例する。同様
な容量比を有する分析物を互いにどの程度分離すること
がきるかは、分離プロセス開始時のカラム頂部における
試料プラグの長さに部分的に依存する。このプラグの長
さは、試料容積、すなわち溶液中の試料の容積に比例す
る。溶媒の量は、試料容積を最小限にするためにできる
だけ少なくし、しかも試料全体を溶解させるのに十分な
量とすべきである。

【０００４】「オンカラム濃縮(on-column enrichmen
t)」は、クロマトグラフィーにおいて弱溶媒、すなわち
分析物に比較的大きい容量比を与える溶媒を使うことに
よって、所定の試料容積について試料プラグの長さでよ
り短くするための技術である。容量比が大きくなること
によって、クロマトグラフィーにおける弱溶媒中の分析
物は固体相に優先的に分布する。このようにして、分析
物分子が停滞する(holdup) する結果、分析物をカラム
頂部で濃縮させることができる。このオンカラム濃縮法
によると、最初に生じる試料プラグの幅が狭くなる。次
に、クロマトグラフィーにおいて強い移動相を導入する
と、分析物はそれらの容量比に応じた速度でカラムを通
って溶出される。分離の間にはバンドのブロードが必然
的に生じると同時に、オンカラム濃縮によって最初の試
料プラグが狭くなるほど、溶出バンドも狭くなる。分析
物バンドは狭いほど分析しやすい。このように、オンカ
ラム濃縮は特に分析物が少量しか含まれていないとき、
その検出及び定量に顕著な向上がみられる。これについ
ては、1977年の136 、63-72 頁に記載の「逆相高性能液
体クロマトグラフィにおけるトレース濃縮技術(Trace E
nrichment Techniques in Reserved-Phase High-Perfor
mance Liquid Chromatography)」 に述べられている。

【０００５】オンカラム濃縮に用いるクロマトグラフィ
ー的に弱い溶媒を、試料の分離のための移動相にも使用
すると、過剰のバンドのブロードが生じることがある。
分析物は、クロマトグラフィー的に弱い移動相では、容
量比がより大きくなる。従って、分析物は固体相にさら
に優先的に分布し、カラム中をよりゆっくりと進む。そ
の結果、バンドのブロードが生じる時間が増大する。こ
のような過剰のバンドのブロードは、移動相が比較的極
性のある（弱い）溶媒から比較的無極性の（強い）溶媒
に変わる逆相勾配溶出方法を用いることによって回避す
ることができる。移動相が極性であると、無極性成分は
固定相に優先的に分配され、極性成分がカラムを通って
進む。移動相が徐々に無極性に変化するにつれて、無極
性成分は分離し始め、カラム内で極性成分の後に続いて
移動する。この方法は、無極性化合物がカラムに保持さ
れる時間を短くし、従ってブロードを最小化する。勾配
溶出方法によれば、分析時間の短縮に加えて、ピーク形
状が改善され、その結果、有効検出感度が向上する。

【０００６】広範囲にわたる極性（容量比）を有する試
料は、オンカラム濃縮法に対して１つの課題が提示され
る。溶媒がかなり弱いと、いくつかの比較的極性の強い
分析物を溶解することができない場合がある。代わり
に、全ての分析物を溶解させるため、比較的高濃度の弱
溶媒が必要なことにより、オンカラム濃縮の長所が大き
く相殺されることもある。一方、比較的強い溶媒を使用
すると、オンカラム濃縮の有効性が消滅または減少す
る。そのために、広範囲にわたる極性の試料を考慮し
て、オンカラム濃縮の長所をより効果的に達成する方法
が求められている。

【０００７】

【発明の目的】本発明の目的は、上述の問題点を解消
し、極性から無極性にわたる広範囲の分析物から成る試
料を分離させることができる方法を提供することにあ
る。

【０００８】

【発明の概要】本発明では、試料、極性溶媒、界面活性
剤の溶液をカラムに導入する。極性溶媒の濃度は、極性
分析物を溶解させるのに十分であるが、界面活性剤が存
在しない場合、少なくとも一部の無極性分析物を溶解さ
せるに足らない極性溶媒の濃度を用いる。界面活性剤
は、無極性分析物と共にミセルを形成し、無極性分析物
の溶解を促進させる。試料の注入を終えた後、溶液を希
釈し、ミセルを分解させる。次に、逆相勾配溶出方法を
用いて分析物を分離する。好適な界面活性剤としては、
ポリオキシエチレン化モノオレイン酸ソルビタン(polyo
xyethylnated sorbitan monooleate) 等のポリオキシエ
チレン化ソルビタンが用いられる。実際には、本発明の
各工程は別個に進める必要はない。より一般的には、ミ
セルは、少なくとも過半比率の試料がカラム頂部に達す
るまで維持すべきである。また、分離の進行度が過半比
率に達する以前に過半比率のミセルを分解させるべきで
ある。ここで「過半比率(predominant proportion)」と
は、半分を超えるという意味である。最良の結果を得る
ためには、それぞれの場合における過半比率をできるだ
け１に近づけることである。

【０００９】本発明は、様々なアミノ酸を含む試料など
広範囲にわたる極性を有する試料のオンカラム濃縮が可
能であるということである。その結果、より濃縮された
分析物のピークが得られ、従ってより感度の高い検出及
び定量が可能となる。実験にの結果、溶出バンドにおけ
るバンド分離性の同等な低下を伴うことなく、このよう
な感度の向上が達成されることが確かめられている。実
際、界面活性剤の添加によって、極性の範囲は分離の準
備段階としてのオンカラム濃縮のために一時的に圧縮さ
れ、分離中には極性の範囲が少なくとも部分的に回復さ
れる。オンカラム濃縮の結果生じる比較的狭い試料プラ
グによって、より大きい分離度が得られる。これに付随
して、ピーク高さが増大し、分析物のより信頼度の高い
検出とより正確な定量が可能となる。以下、本発明を実
施例により図面を参照しつつ詳細に説明する。

【００１０】

【発明の実施例】クロマトグラフ・システム１００は、
図１に示すように、タンパク質シーケンサ(protein seq
uencer) １０２等の試料調整装置、試料マニピュレータ
１０４、分析物を含む試料１０５、調製溶媒、分離溶
媒、界面活性剤の各供給源１０６、試料−界面活性剤貯
蔵器１０８、カラム１１０、検出器１１２、ピーク・プ
ロセッサ１１４から構成されている。本発明によれば、
試料マニピュレータ１０４から取り出された試料１０５
は、上記の供給源１０６に貯蔵された界面活性剤溶液１
０７と混合され、試料‐界面活性剤混合液１０９とな
り、試料‐界面活性剤貯蔵器１０８に貯蔵される。この
試料−界面活性剤混合液１０９は、次に試料注入器１１
６によってカラム１１０へ注入される。カラム・ポンプ
装置１１８は、移動相容器１２１に貯蔵された移動相溶
媒１２０をカラム１１０へ送り出す。移動相の組成は、
勾配プログラマ１２２によって調節される。試料‐界面
活性剤貯蔵器１０８及びカラム１１０の温度は、温度コ
ントローラ１２６、１２８によってそれぞれ制御され
る。

【００１１】カラム１１０は、図２に示すように、オク
タデシルシラン変性シリカ球(octadecyl silane-modifi
ed silica spheres)よりなる充填材２０３が充填されて
いる延伸されたステンレス鋼管２０１よりなる。充填材
２０３は溶出のための固定相として機能する。カラム１
１０はカラム頂部２０４を有し、ここには混合液１０９
が入口端部２０５より導入される際、試料プラグ２０２
が形成される。ステンレス鋼管２０１のー実施例では、
内径約２．１ｍｍ、長さ約１０〜３０ｃｍがある。移動
相が導入されると、混合液１０９は成分バンド２０６に
分離する。これら成分バンド２０６は、管２０１の出口
端部２０７より溶出し、検出器１１２を通過する時に検
出される。検出器１１２は、例えば、成分の吸光度及び
／または吸収スペクトルを測定する紫外−可視分光光度
計である。各分析物の濃度は成分バンド２０６の吸光度
から容易に求めることができる。

【００１２】本発明の分析方法３００によれば、図３に
示すステップ３０１において、試料をシーケンサ１０２
を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によって得る。試
料は広範囲の極性を有する多数のフェニルチオヒダント
インアミノ酸(phenylthiohydantoin amino acids) より
なる。ステップ３０２において、試料を水−界面活性剤
混合液１０７と混合する。試料はこの溶液に溶ける。よ
り極性の強い分析物を溶解させるには水だけで十分であ
る。しかしながら、無極性の分析物を溶解させるには界
面活性剤が必要である。試料−界面活性剤溶液１０９中
の界面活性剤濃縮が臨界ミセル濃度を越えて、無極性分
析物のミセルを形成するのに十分な量の界面活性剤を添
加する。ミセルは既に溶解している極性分析物によって
は形成されない。混合液温度の上昇は、ミセル溶解度が
高くなることにより、濃縮を向上させることができる。
そのため、温度コントローラ１２６によって、試料−界
面活性剤貯蔵器１０８を加熱する。ミセルの形成につい
ては、例えば、Rosen 及びGoldsmith 共著(1972 年第２
判Wiley New York 18頁以降) の「海面活性剤の系統的
分析(Systematic Analysisof Surface-Active Agents)」
に記載がなされている。

【００１３】ステップ３０３において、試料−界面活性
剤溶液１０９が無極性の固体相が充填されたカラム１１
０に導入される。この場合、水はクロマトグラフィー的
に弱い溶媒である。試料−界面活性剤溶液の導入によっ
て、オンカラム濃縮が行われる。いったん試料の注入を
終了したならば、ステップ３０４で試料を希釈し、ミセ
ルをカラム中で分解させる。希釈は、単に界面活性剤を
含まない移動相をカラムにポンプで送り込むことによっ
て行われる。実際に、移動相がカラム中に付加的な試料
を洗浄することも可能である。控え目に見て、界面活性
剤を含まない移動相をカラムへポンプで送り出す前に、
半分以上の試料がすでにカラムに注入されている。ポン
プで注入された移動相が試料−界面活性剤溶液と混合す
ると、界面活性剤の濃度が臨界ミセル濃度以下に下が
り、ミセルの分解が始まる。さらに移動相を導入するこ
とによって、ミセルの分解が確実となり、カラムから界
面活性剤が洗い流される。界面活性剤は、ミセルに伴う
ものも含めて分析物の前に溶出されおよび／または検出
されないことから、対象となる分析物ピークへの妨害を
回避することができる。

【００１４】次に、ステップ３０５の逆相勾配溶出の間
に試料成分が分離される。この逆相勾配溶出では、水と
１５％のアセトニトリルが初期極性溶媒となる。ミセル
分解とカラム中の分析物の移動とを区別できるような明
確な変化はない。しかしながら、ミセルは分離プロセス
の比較的早い段階で実質的に分解される。逆相勾配溶出
時には、イソプロパノールが移動相に導入され、そのた
めに移動相は極性が弱くなり、クロマトグラフィー的に
強くなる。水−イソプロパノール移動相中のイソプロパ
ノールの割合は徐々に１まで増加させる。分析物ピーク
は、分析物がカラム１１０から溶出する時に検出され
る。

【００１５】試料１０５は、ペプチド分析において効果
的に用いられるエドマン分解方法のー実施例であるシー
ケンサ１０２によって調製される。エドマン分解法は、
広範囲の極性を有する成分を含む試料をピコモル(picom
ole)レベルで調製することができる。シーケンサ１０２
から送り出された試料を収集し、乾燥する。界面活性剤
溶液１０７は、好ましくは、Atlas Chemical Industri
es製の(Wilmington, Delaware)「Ｔｗｅｅｎ８０」、ポ
リオキシエチレン化モノオレイン酸ソルビタンの０．１
％水溶液を使用する。この水溶液の調製に用いる水は、
精製した脱イオン水とし、例えば、ＨＰ６６１Ａ型浄水
機（ヒューレット・パッカード・カンパニー製）によっ
て得ることができる。このような水は、ゴーストピーク
の原因となるプラスチックとの接触を避け、ガラスまた
は石英ガラス蒸留器で２回蒸留して得ることができる。
界面活性剤は、界面活性剤や溶媒の供給源１０６に貯蔵
されている。界面活性剤溶液５０〜１００ｕＬを乾燥し
た試料と混合する。これによって得られた試料−界面活
性剤混合液１０９はすぐにインジェクタ１１６によりカ
ラム１１０に注入される。他の実施例においては、界面
活性剤の注入濃度が臨界ミセル濃度より高くありさえす
れば、溶液はこの実施例より高いものでも低いものでも
使用することができる。

【００１６】インジェクタ１１６はシーケンサ制御下で
動作するバルブ・ループ・インジェクタが含まれる。こ
のインジェクタは、試料−界面活性剤貯蔵器１０８から
少なくとも一部の混合液を取り出し、その混合液をカラ
ム１１０に注入する。試料を注入し終えたならば、イン
ジェクタ１１６は溶出を開始させることができるようカ
ラム・ポンプ装置１１８をカラム１１０に接続させる。
カラム・ポンプ装置１１８は１またはそれ以上の移動相
溶媒１２０をカラム１１０を介して送り出す。これらの
移動相溶媒の混合液は、勾配プログラマ１２２の調節に
よって移動相の極性を小さくするように変化させること
ができる。勾配プログラムは、所望の通りに漸進的勾配
溶出あるいは段階的勾配溶出を行うことができる。次
に、極性成分及びこれに同伴する無極性成分は、カラム
１１０を通って検出器１１２へ至る間に分離する。その
後、各成分はクロマトグラム１２４に表される溶出のタ
イミングによって同定される。

【００１７】本発明によって達成されるシステムの効率
改善の結果、より短いカラム１１０の使用が可能とな
り、さらにはより複雑な試料の分離が可能となる。ま
た、分析時間を短縮することができるので、エドマン分
解生成物の一部の成分のような数時間以内で分解する試
料を遅れることなく、注入し、迅速に処理することがで
きる。本実施例においては、混合は試料−界面活性剤貯
蔵器１０８内における拡散によって行ったが、本発明に
おいては他の混合方法も同様に使用することができる。
界面活性剤と試料の混合は、界面活性剤を試料に添加し
て混合するかあるいはその他適宜の方法によって行うこ
とができる。実施例においては、希釈した界面活性剤を
乾燥した試料に添加する。代わりに、界面活性剤を部分
的に溶解させた試料に添加することもできる。試料と界
面活性剤をカラム１１０の注入前に手動で混合してもよ
い。試料は、注入時に互いに混り合うように同時にカラ
ムに注入することもできる。試料は界面活性剤充填ヘッ
ドに注入することができる。界面活性剤は試料プラグに
注入することができる。場合によっては、全ての試料が
カラム頂部に注入される前に希釈を開始することもでき
る。しかしながら、希釈を開始する前に少なくとも過半
比率の試料がカラムに入っているべきである。

【００１８】界面活性剤は、非イオン性及び両性界面活
性剤であってもよい。ポリオキシエチレン化モノオレイ
ン酸ソルビタン以外にも、次のような非イオン性界面活
性剤を用いることができる。Atlas Chemical Industrie
s 社が「Tween 20」という商標名で製造しているポリオ
キシエチレン化モノラウリン酸ソルビタン、また、グリ
コール、グルコシド及びソルビトールの長鎖カルボン酸
エステルを含む他のエステル、エーテル及びグリコー
ル、（ポリ）オキシエチレングリコールのアルキルエー
テル及びアルキルフェニルエーテル等のグリコールのエ
ーテル、びポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレン
グリコール等がある。移動相溶媒として、水、メタノー
ル、アセトニトリル及びテトラヒドロフラン等の一般に
使用される逆相溶媒、及び酢酸ナトリウム等の緩衝溶液
であってもよい。

【００１９】本発明は、タンパク質、タンパク質フラグ
メント、ペプチドチェーン及びペプチドフラグメントの
ようなペプチドを含む広範囲の試料物質に適用可能であ
り、また土壌や殺虫剤の分析、さらには内因性及び外因
性の血液成分の分析に適用可能である。本発明において
は、シークエネータ(sequenator)を含む他のシーケンサ
も同様に使用可能である。また、溶出試料の供給源を別
途に設けるようにしてもよい。試料注入のためには、ロ
ボット制御によって案内されるシリンジを有する自動試
料注入装置を含め、他の手段を用いることもできる。ま
た、本発明においては、他の検出器も使用可能である。
カラムにフューズド・シリカ管を使用する場合は、測定
対象の平衡を乱すことなく定量的濃度測定を行うことが
でき、それらの測定値を用いて、溶出液バンド２０６を
カラム１１０中にある間に検出することができる。以上
説明した実施例については種々の変更及び修正態様が可
能であることは当業者にとって自明のことである。

【００２０】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によって無
極性分析物を界面活性剤の添加によってミセル化し、よ
ってカラム頂部に濃縮させ、逆相勾配溶出法を利用し
て、広範囲の極性分析物を備える試料の分離を高精度に
おこなうことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明を実施するためのクロマトグラフ・シス
テムの概略図。

【図２】図１に示すカラムの部分詳細図。

【図３】本発明のー実施例の動作説明図。

【符号の説明】

１００：クロマトグラフ・システム １０２：タンパク質シーケンサ １０４：試料マニピュレータ １０８：試料−界面活性剤貯蔵器 １１０：カラム １１２：検出器 １１４：ピーク・マイクロプロセッサ １１６：試料注入器 １１８：ポンブ装置 １２２：勾配プログラマ １２６、１２８：温度コントローラ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の（イ）から（ハ）の工程を含む少なく
   ともーつの極性分析物および無極性分析物を有する試料
   の成分分析物を分離する方法。 （イ）前記試料に界面活性剤を比較的クロマトグラフィ
   ー的に弱い溶媒で混合し、無極性分析物のミセルを含む
   溶液を生成し、前記溶液の濃度は、極性分析物を溶解す
   るのに十分であり、無極性分析物が界面活性剤なしでは
   溶解しないように調整し、 （ロ）前記ミセルと前記極性分析物を含む溶液をカラム
   の頂部に導入し、界面活性剤の濃度は、前記ミセルを保
   持するレベルで、少なくとも過半数の試料が前記カラム
   頂部に導入されるまで維持し、 （ハ）前記試料を希釈して前記ミセルを分解させ、 （ニ）前記分析物を逆相勾配溶出によってカラムを通し
   て分離し、前記逆相勾配溶出は前記クロマトグラフィー
   的に弱い溶媒から比較的強い溶媒になるように変化さ
   せ、前記逆相勾配溶出は過半数の前記ミセルが分解した
   後、前記分析物の分離が主として行われるように制御さ
   れる。