JPH05199876A

JPH05199876A - 粘液細菌の遺伝子操作方法

Info

Publication number: JPH05199876A
Application number: JP4080460A
Authority: JP
Inventors: Samir Jaoua; ジャオウアサミール; Thomas Schupp; シュップトーマス; Snezana Neff; ネッフスネツァナ
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-03-02
Publication date: 1993-08-10
Anticipated expiration: 2022-06-20
Also published as: IL101097A; US5686295A; ES2161213T3; EP0501921A3; IE920654A1; GR3036885T3; KR100229152B1; NZ241786A; HU218035B; ATE203275T1; DK0501921T3; IL101097A0; CA2062095C; KR920018216A; AU1132892A; EP0501921A2; DE59209908D1; HUT63875A; PT501921E; TW201792B

Abstract

(57)【要約】【目的】粘液細菌の染色体上に存在する構造要素または
特定の転移作用と関係なく、粘液細菌内への遺伝物質の
間接または好ましくは標的化挿入を可能にする、全ての
粘液細菌、特にソランジウム(Sorangium) ／ポリアンジ
ウム(Polyangium)群の粘液細菌の遺伝子操作のために普
遍的に適用可能な方法の提供。【構成】同種もしくは異種由来の遺伝物質またはその組
合せを粘液細菌の細胞中に挿入し、そして相同的組換え
を介してランダムに、または挿入されたＤＮＡと粘液細
菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性に基づいて正
確に規定される部位に特異的に、粘液細菌の染色体上に
存在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、
前記粘液細菌の染色体中に組み込む遺伝子操作方法、該
方法に適当な組換えＤＮＡ分子、それを含むクローニン
グベクターおよび遺伝子改変粘液細菌。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は粘液細菌、好ましくはソ
ランジウム(Sorangium) ／ポリアンジウム(Polyangium)
群の遺伝子操作の新規方法に関するものであり、該方法
はこの群の生物に組換えＤＮＡ技術を特異的に適用する
ことを初めて可能にするものである。

【０００２】特に本発明は、同種もしくは異種由来のＤ
ＮＡ配列または同種および異種由来のＤＮＡ配列の組合
せの上記粘液細菌の染色体への相同的組換えを介する挿
入方法、およびこの方法により作出される遺伝子的に改
変された粘液細菌に関する。

【０００３】同様に、本発明に係る方法の使用に特に適
している組換えＤＮＡ分子、プラスミドおよびベクタ
ー、そして同種および／または異種由来の外来ＤＮＡを
含むソランジウム／ポリアンジウム群の遺伝子的に改変
された粘液細菌細胞も包含される。

【０００４】

【従来の技術】ソランジウム／ポリアンジウム群の粘液
細菌は通常土壌、腐敗した植物体または動物の糞中に検
出される非常に特殊化した生物である。この群の微生物
の特徴は唯一の炭素源としてセルロースまたはセルロー
ス含有減成物を利用できる能力である。この群のもう１
つの特徴は非常に活性な二次代謝物質を産生する能力で
ある。

【０００５】例えば植物微生物殺傷性化合物を合成でき
るこの群からの非常に多くの菌株が今では記載されてい
る。これに関して特に重要なのは、植物病原性微生物、
特に植物病原菌に対して有用な殺生物性スペクトルを有
するいわゆるソラフェンと呼ばれる、巨大環状化合物で
ある。これらの化合物は非常に有利な治療的、浸透的、
そして特に予防的特性を有し、多くの栽培植物を保護す
るために使用され得る〔２４〕（〔〕内の数字は本明
細書の末尾に記載した参考文献一覧の相当する番号の文
献に一致する）。

【０００６】抗生物質作用を有する非常に活性な化合物
を合成できる粘液細菌の群のその他の代表的なものも知
られている〔１８〕。これらの化合物の重要性により、
適当な場合に該化合物に特異的に影響を及ぼし得る可能
性を提供するためにその合成の遺伝子的基礎を理解する
ことに大きな興味がある。

【０００７】このための必須条件は、例えば全体のプラ
スミドを含む新規遺伝子もしくは遺伝子断片またはその
他のＤＮＡ配列の粘液細菌のゲノム内への標的化混入に
よる、組換えＤＮＡ技術を用いたこれらの生物の直接、
そして好ましくは標的化操作を可能にする方法の提供で
ある。

【０００８】粘液細菌の群のいくつかの代表種は既にこ
の方向での研究の対象となっている。これに関連した特
別な興味は主としてミクソコッカス・キサントゥス(Myx
ococcus xanthus)に向けられていたが、これはいまでは
詳しく研究され、そして種々の遺伝子移入方法が既に記
載されている粘液細菌である。このために、例えば大腸
菌ファージＰ１が、最初はミクソコッカス・キサントゥ
ス染色体中にトランスポゾンＴｎ５の挿入のために〔１
０，１１〕、そしてその後にミクソコッカス・キサント
ゥス中にクローン化された遺伝子を最初の大腸菌宿主に
戻し移入するために〔１６，２１〕、非常に集中的に使
用されてきた。

【０００９】遺伝子移入のもう１つの方法は非常に広い
宿主範囲を有するプラスミドＲＰ４の使用に基づいてい
る。ブレットン等はこのプラスミドが大腸菌からミクソ
コッカス・キサントゥス中に接合を介して移入され得、
そして染色体中に安定に組み込まれ得ることを示すこと
ができた〔１〕。これらの性質に基づいて、ブレットン
等やブレットンおよびゲスピン−ミカエルはミクソコッ
カス・キサントゥスの染色体中に外来遺伝子を組み込む
ことができた〔２，３〕。ジャオウア等による研究は観
察された組み込みが高い確率を有し、いわゆる部位特異
的組換えに基づいていることを明らかにした〔８，
９〕。後者は、ミクソコッカス・キサントゥスの染色体
内の狭い空間的制限を有する特定の部位に制限され、そ
してＰＲ４プラスミド上の１つ以上のいわゆるホットス
ポットにより仲介される。さらに、ここで発見された公
知ミクソコッカス系はソランジウム／ポリアンジウム群
の細菌に適用され得ないことが本発明の範囲内で行われ
た研究の間に明らかになった。これらの生物はその染色
体上での部位特異的組換えに必要である特定の構造要素
を欠いていることが予想される。さらに、例えばトラン
スポゾンＴｎ５の使用ではこれらの生物に安定な転移が
起こらないことが見いだされた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は主として、公知方法の上記の制限がなく、従
って粘液細菌の染色体上に存在する構造要素または特定
の転移作用と関係なく、粘液細菌内への遺伝物質の間接
または好ましくは標的化挿入を可能にする、全ての粘液
細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の粘液細菌
の遺伝子操作のために普遍的に適用可能な方法の提供で
ある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記課題は本発明に従っ
て、例えば、その特定の構造により染色体内の所望部位
に挿入され得、そして上記公知方法における場合のよう
に粘液細菌の染色体または使用されるプラスミド（ホッ
トスポット）の機能的機構により前もって決定される、
または組み込まれるトランスポゾンの転移に依存する特
定の組み込み部位に結合されない、遺伝子構築物、特に
プラスミドベクターを調製することにより解決され得
る。

【００１２】従って、本発明はまず、同種もしくは異種
由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝物質の
組合せを粘液細菌の細胞中に挿入し、そして相同的組換
えを介してランダムに、または細菌のゲノムの構造的お
よび機能的機構の適当な知識がある場合には、挿入され
たＤＮＡと粘液細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相
同性に基づいて正確に規定される部位に特異的に、粘液
細菌の染色体上に存在する構造要素または特定の転移作
用とは無関係に、前記粘液細菌の染色体中に組み込むこ
とを特徴とする粘液細菌目の細菌、特にソランジウム／
ポリアンジウム群の細菌の遺伝子操作方法に関する。

【００１３】粘液細菌目の細菌の遺伝子操作のための本
発明に係る方法は特に、（ａ）粘液細菌の染色体上の相
当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に
相同であるＤＮＡ部分を１つ以上自然に含む、同種もし
くは異種由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺
伝物質の組合せ、または（ｂ）粘液細菌の染色体上の相
当する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に
相同である部分を自然に含まないが、そのような相同ま
たは実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮ
Ａ技術を用いて人工的に結合されている遺伝物質、を粘
液細菌の細胞中に挿入し、そして粘液細菌の染色体上に
存在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、
挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在す
る相同性により正確に規定される部位で相同的組換えを
介して前記粘液細菌の染色体中に組み込むことを特徴と
する。

【００１４】相同的組換えを介する細菌染色体への遺伝
物質の組み込みは、挿入されるべきＤＮＡ内の１つ以上
のＤＮＡ部分により仲介され、該ＤＮＡ部分は粘液細菌
の染色体上の相当する領域と相同であるか、または少な
くとも実質的に相同である。従って、その組み込みは特
定の染色体構造の存在に拘束されず、そして原理的に細
菌染色体内のあらゆる所望の部位に起こり得る。

【００１５】本発明に係る方法の範囲内で使用され得る
相同ＤＮＡ部分は、所望の組換え結果を引き起こし得る
ために粘液細菌の染色体上の相当する部分と１００％の
同一性を有することを必ずしも必要としない。これらの
ＤＮＡ部分は細菌のゲノム上の相当する領域と実質的に
相同であれば、すなわちこれらが６０％と１００％の
間、好ましくは８０％と１００％の間、そして特に９０
％と１００％の間の相同性の度合いを有していれば十分
である。

【００１６】従って、「相同」ＤＮＡ部分はまた、以下
において、粘液細菌染色体上の相当する領域と１００％
の同一性を有しないが、これと少なくとも「実質的に相
同」である部分を意味することが意図される。

【００１７】これに関連して、相同ＤＮＡ部分は、例え
ば特定のゲノムの断片化の後に、標的生物自体または関
連生物のいずれかから単離されることが可能である。各
々の場合に組み込みのために使用されることが意図され
る粘液細菌染色体上のＤＮＡ部分のＤＮＡ配列が公知で
ある場合、これらの染色体部分と相同であるか、または
少なくとも実質的に相同である相当するＤＮＡ断片はも
ちろん合成により調製され得る。

【００１８】本発明の範囲内で使用され得る同種由来の
ＤＮＡ部分はさらに、公知配列のＤＮＡ部分、または任
意に例えば相同ＤＮＡの制限消化の後に得られるＤＮＡ
断片のいずれであってもよい。

【００１９】粘液細菌のゲノムの構造的および機能的機
構が公知である場合に、本発明に係る方法は、天然もし
くは人工改変遺伝子、遺伝子断片またはその他の有用な
ＤＮＡ配列と細菌ゲノム内の相同ＤＮＡ部分との交換に
より、粘液細菌ゲノム上に存在する遺伝子の標的化され
た予測可能な改変（その場での改変）を初めて可能にす
る。さらに、本発明に係る方法は、遺伝子の特異的スイ
ッチオフ（遺伝子分裂）またはその他の方法、特に突然
変異方法の適用により予め不活性化された遺伝子の補足
により、粘液細菌の完全ゲノム内の個々の遺伝子の機能
の特異的同定を可能にする。

【００２０】細菌に固有の遺伝子の標的化およびそれ故
に非常に効率の良いその場での改変（直接突然変異誘
発）の他に、本発明に係る方法は多くのその他の可能な
用途、例えば高い発現速度を有することが知られている
領域中の付加的遺伝子コピーの混入、ならびに望ましく
ない遺伝子の除去およびスイッチオフを有する。さらに
以下に示す別の可能な用途について今では考えることも
可能である：・細菌に固有の興味深い機能を有する遺伝子の前に強力
または調節可能なプロモーターの混入。・粘液細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の粘
液細菌中に種々の起源の遺伝子のクローニング。・種々の起源の遺伝子のクローニングおよび発現。・挿入された遺伝子のもう１つの微生物、例えばさらに
別の操作のための大腸菌への戻し移入。・最初に、組み込み部位に隣接する粘液細菌断片を同定
するための放射性プローブとして、そして次にポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の範囲内での増幅のためのパター
ン（鋳型）としての、挿入されたベクターの異種ＤＮＡ
の使用。

【００２１】本発明はさらに、（ａ₁）粘液細菌の染色
体上の相当する領域と相同であるか、または少なくとも
実質的に相同であるＤＮＡ部分を１つ以上自然に含む、
同種もしくは異種由来の遺伝物質または同種および異種
由来の遺伝物質の組合せ、または（ａ₂）粘液細菌の染
色体上の相当する領域と相同であるか、または少なくと
も実質的に相同である部分を自然に含まないが、そのよ
うな相同または実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公
知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に結合されている遺伝
物質、を粘液細菌の細胞中に挿入し、そして粘液細菌の
染色体上に存在する構造要素または特定の転移作用とは
無関係に、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの
間に存在する相同性により正確に規定される部位で相同
的組換えを介して前記粘液細菌の染色体中に組み込み、
そして（ｂ）陽性形質転換体をそれ自体公知の選択方法
を用いて選択し、そして純粋な培養物として培養する、
ことからなる粘液細菌目、特にソランジウム／ポリアン
ジウム群の遺伝子的に改変された細菌の作出方法に関す
る。

【００２２】従って、本発明は、遺伝物質の組み込みが
計画された操作の個々の目的に応じて、公知配列の相同
ＤＮＡ部分または未知配列の任意に選択される相同部分
により仲介され得る場合に、粘液細菌、特にソランジウ
ム／ポリアンジウム群の粘液細菌のゲノムの標的化遺伝
子操作を初めて可能にする。

【００２３】同様に、本発明は、それらの特定の構造に
より、遺伝物質、例えば適当な場合には、相同的組換え
により細菌ゲノム内に、ランダムに、または細菌のゲノ
ムの構造的および機能的機構が知られている場合には、
挿入されたＤＮＡと粘液細菌に固有のＤＮＡとの間に存
在する相同性により正確に規定される特定の部位に標的
化されて、新規で所望の特性をコードする遺伝子もしく
は遺伝子断片またはその他の有用なＤＮＡ配列を組み込
むことを可能にする組換えＤＮＡ分子、ならびに該組換
えＤＮＡ分子の製造方法を含む。

【００２４】本発明はさらに、適当な場合には新規およ
び／または改良された特性を有し、前記組換えＤＮＡ分
子の挿入により作出された、遺伝子的に改変された粘液
細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の遺伝子的
に改変された粘液細菌を含む。

【００２５】本発明はさらに、前記組換えＤＮＡ分子を
依然として含む前記改変粘液細菌の子孫ならびにその突
然変異体および変種に関する。

【００２６】組換えＤＮＡ技術および細菌遺伝学におい
て慣用である多くの用語が以下の記載において使用され
る。

【００２７】発明の詳細な説明および特許請求の範囲、
ならびにこれらの用語にあてられた範囲の明確な、そし
て首尾一貫した理解を確実にするために、以下に定義を
記載する。異種由来の遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコード
するか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子
が挿入される種以外の種に由来するＤＮＡ配列；該ＤＮ
Ａ配列は外来遺伝子もしくは外来ＤＮＡまたは外因性Ｄ
ＮＡとも呼ばれる。同種由来の遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコード
するか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子
が挿入される種と同一種に由来するＤＮＡ配列。このＤ
ＮＡは内因性ＤＮＡとも呼ばれる。ＤＮＡ相同性：２またはそれ以上のＤＮＡ配列間の一致
の度合い。合成遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコードする
か、または生物学的機能を遂行し、そして合成手段によ
り製造されるＤＮＡ配列。プロモーター：宿主細胞内であらゆる所望の同種または
異種ＤＮＡ遺伝子配列の転写を確実に行わせるＤＮＡ発
現の調節配列であるが、前記遺伝子配列はそのようなプ
ロモーターと操作可能な様式で結合されており、後者は
宿主細胞内で活性である。終結塩基配列：転写工程の終了をシグナルで伝える転写
単位の末端のＤＮＡ配列。過産生植物プロモーター（ＯＰＰ）：このＯＰＰで形質
転換されなかった宿主細胞において自然状態で観察され
るよりも明らかに高い程度まで（ＲＮＡの形態またはポ
リペプチドの量で測定される）、操作可能な様式で結合
されたあらゆる機能遺伝子配列の宿主細胞内での発現を
引起し得るプロモーター。３’／５’非翻訳領域：ｍＲＮＡに転写されるけれども
ポリペプチドに翻訳されないコード領域の上流／下流に
位置するＤＮＡ部分。この領域は、調節配列例えばリボ
ソーム結合部位（５’）を含む。ＤＮＡ発現ベクター：適当な宿主細胞内に挿入されたＤ
ＮＡの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクロ
ーニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオ
ファージ。ＤＮＡトランスファーベクター：適当な宿主細胞内への
遺伝物質の挿入を可能にするトランスファービヒクル、
例えばプラスミドまたはバクテリオファージベクター。相同的組換え：相同ＤＮＡ分子間のＤＮＡ片の相互交
換。突然変異体，変種：自然に、または公知方法例えば紫外
線処理、突然変異誘発剤での処理その他を用いて人工的
に作出され、そして本発明に必須の特徴および特性を依
然有する微生物誘導体、外因性ＤＮＡでの形質転換によ
り本発明に必須の特徴および特性を獲得した出発菌株の
誘導体。

【００２８】遺伝物質が組み込まれ、そしてその中でラ
ンダムに、または細菌のゲノムの構造的および機能的機
構の適当な知識がある場合には、粘液細菌の染色体上に
存在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、
ある場合に予め決定され得る、細菌ゲノム内の特異的に
正確に規定される位置で発現されることが今可能であ
る、粘液細菌目の細菌、特にソランジウム／ポリアンジ
ウム群の細菌のゲノムの好ましくは標的化遺伝子操作を
可能にする方法を提供することが本発明の範囲内で初め
て今可能になった。

【００２９】本発明に係る方法はさらに、粘液細菌のゲ
ノム中に相同的組換えにより外因性遺伝物質を混入する
ことを可能にする認識に実質的に基づいており、全体の
プラスミドを含む天然遺伝子もしくは遺伝子断片または
その他のＤＮＡ配列の他に、人工的に改変された、およ
び／または合成遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他
のＤＮＡ配列を、それらが組換えに十分であり、粘液細
菌のゲノム上の相当する部分と相同性を有するＤＮＡ部
分を含むか、該ＤＮＡ部分により挟まれている限り、使
用することが可能である。

【００３０】本発明の範囲内で使用され得る相同ＤＮＡ
部分は、所望の組換え結果を引き起こし得るために粘液
細菌の染色体上の相当する部分と１００％の同一性を有
することを必ずしも必要としない。これらのＤＮＡ部分
は細菌のゲノム上の相当する領域と実質的に相同であれ
ば、すなわちこれらが６０％と１００％の間、好ましく
は８０％と１００％の間、そして特に９０％と１００％
の間の相同性の度合いを有していれば十分である。

【００３１】前記相同領域の大きさは変化し得るが、し
かし少なくとも１００Ｂｐであるべきである。０．３Ｋ
ｂと４Ｋｂの間、好ましくは１Ｋｂと３Ｋｂの間からな
る相同の領域が本発明の範囲内で好ましい。

【００３２】特定の構造により全体のプラスミドを含む
遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の興味深いＤＮ
Ａ配列を上記のような相同的組換えにより標的細胞のゲ
ノム中に特異的に混入することを可能にする組換えＤＮ
Ａ分子は本発明の必須構成要件を形成する。

【００３３】本発明は特に、相同ＤＮＡ領域を含む粘液
細菌細胞の形質転換の際に、粘液細菌の染色体上に存在
する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、挿入
されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相
同性により正確に規定される部位で相同的組換えを介し
て前記粘液細菌のゲノム中に組み込まれるべき上記ＤＮ
Ａの間接または好ましくは標準化組み込みが起こるよう
な程度に、粘液細菌ゲノム内の相当するＤＮＡ領域と相
同性を有する組み込まれるべきＤＮＡ、またはそのよう
なＤＮＡ配列により挟まれている組み込まれるべきＤＮ
Ａを含む、粘液細菌、特にソランジウム／ポリアンジウ
ム群の粘液細菌のゲノム内の規定された部位に遺伝物
質、例えば遺伝子、遺伝子断片またはその他のＤＮＡ断
片の標的化組み込みを可能にする組換えＤＮＡ分子に関
する。

【００３４】上記組換えＤＮＡ分子は、組み込まれるべ
き、そして上記特性を有するＤＮＡを、（ａ）適当な供
給源から単離するか、または（ｂ）組み込まれるべき上
記ＤＮＡが、粘液細菌の染色体上の相当する領域に相同
であるか、または少なくとも実質的に相同である部分を
自然に含まない場合には、このＤＮＡを相当する相同ま
たは実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮ
Ａ技術を用いて人工的に結合する、方法で非常に容易に
製造され得る。

【００３５】組み込まれるべき前記ＤＮＡが発現性ＤＮ
Ａ配列であるならば、該ＤＮＡ配列は細菌細胞において
機能し得る発現シグナルに操作可能な様式で結合されて
おり、そして適当な場合には、細菌のゲノム内の特定の
領域と相同性を有するＤＮＡ部分により挟まれているこ
とが有利である。これらのフランキング相同ＤＮＡ部分
は環の形態に閉じられているＤＮＡ分子の成分としてユ
ニットに一緒に融合されていることが好ましい。

【００３６】上記の後者のものは、前記発現性ＤＮＡ配
列自体が細菌のゲノム内の相当するＤＮＡ領域と十分大
きな相同性を既に有するならば不要となり得、このＤＮ
Ａ配列と上記相同ゲノムＤＮＡとの直接交換が相同的組
換えにより起こり得る。

【００３７】二本鎖ＤＮＡの他に、本発明に係る方法に
おいて、一本鎖ＤＮＡおよび部分的に一本鎖ＤＮＡを使
用することも可能である。

【００３８】本発明の範囲内とされる定義に従う同種お
よび異種遺伝子またはＤＮＡ配列の両方、ならびに合成
遺伝子またはＤＮＡ配列が本発明に係る方法における使
用に適している。

【００３９】さらに、組み込まれるべきＤＮＡ配列はゲ
ノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡから排他的に構
築され得る。もう１つの可能性はｃＤＮＡおよびゲノム
ＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡからなるハイブリッド
ＤＮＡ配列の構築を含む。

【００４０】この場合、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと同一
遺伝子またはＤＮＡ部分に由来していても、また、ｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡは異なる遺伝子またはＤＮＡ部
分に由来していてもよい。しかしながら、各々の場合に
おいて、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡは同一ま
たは異なる遺伝子またはＤＮＡ部分から調製されること
が可能である。

【００４１】ＤＮＡ配列が１つ以上の遺伝子またはＤＮ
Ａ部分を含むならば、これらは１つの同一生物から、様
々な株に属する多数の生物から、または同一種の変種も
しくは同一属の異なる種、または１属以上もしくは別の
分類学的単位に属する生物から誘導され得る。

【００４２】細菌細胞中の構造遺伝子の発現を可能にす
るために、適当である場合にはコード遺伝子配列が粘液
細菌細胞中で機能し得る発現配列に操作可能な様式で最
初に結合されることが可能である。

【００４３】従って、本発明の発現性ハイブリッド遺伝
子構築物は構造遺伝子の他に、プロモーターおよびター
ミネーター配列の両方、好ましくはさらに３’および
５’非翻訳領域の調節配列を包含する発現シグナルをも
通常含有する。

【００４４】粘液細菌において発現性ＤＮＡ配列の発現
の誘導を起こし得るあらゆるプロモーターおよびターミ
ネーターがハイブリッド遺伝子構築物の成分として使用
され得る。

【００４５】本発明に係る方法における使用に適するプ
ロモーターの例は以下のものである：・ミクソコッカス・キサントゥスの光誘導性プロモータ
ー〔２３〕・その他のミクソコッカス・キサントゥスのプロモータ
ー・放線菌、特にストレプトマイセテスのプロモーター・大腸菌のプロモーター、例えばＴａｃ（ハイブリッ
ド）、Ｐ_LまたはＴｒｐブロモーター。

【００４６】本発明の範囲内で使用され得る適当な終結
塩基配列は例えば文献〔７，２０〕に記載されている。

【００４７】この方法で形成され、そして粘液細菌細胞
中で活性な遺伝子および発現シグナルからなる機能単位
は引続き、適当である場合には、相同ＤＮＡ領域を含む
粘液細菌細胞の形質転換の際に、ランダムにまたは好ま
しくは、相同的組換えにより前記粘液細菌のゲノム内
で、挿入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存
在する相同性に基づいて規定される部位に相同ＤＮＡ配
列により挟まれている遺伝子配列の特異的組み込みが起
こるような程度に、粘液細菌ゲノム内に相当するＤＮＡ
領域と相同性を有する１つ以上のＤＮＡ部分を両端に配
置させ得る。さらに、このフランキング相同ＤＮＡ部分
は本発明の範囲内で、環の形態に閉じられているＤＮＡ
分子の成分としてユニットに一緒に融合されていること
が好ましい。

【００４８】さらに、好ましい実施態様において、挿入
されるべきＤＮＡは、同種ＤＮＡ部分を既に含むか、ま
たはそれを後にクローン化することを必要とするプラス
ミド中に組み込まれる。

【００４９】従って、目的が粘液細菌のゲノム中に、単
一遺伝子または遺伝子断片のみを組み込むのではなく、
上記遺伝子群または遺伝子断片群を含み得る完全プラス
ミドＤＮＡを組み込むことであるならば、上記同種ＤＮ
Ａ配列をプラスミドＤＮＡ中に所望部位でクローン化す
れば十分であるが、可能であれば、発現が意図される遺
伝子は機能的に維持されるべきである。従って、この場
合にもまた、これらの相同ＤＮＡ部分が環の形態に閉じ
られているＤＮＡ分子の成分としてユニットに一緒に融
合されているとみなされ得るから、組み込まれるべきＤ
ＮＡ（プラスミドＤＮＡ）が相同ＤＮＡ配列により挟ま
れていると原理的にはみなされることが可能である。

【００５０】構造遺伝子の他に、あらゆるその他の所望
の遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他の有用なＤＮ
Ａ配列、例えば調節分子の結合部位、プロモーター、タ
ーミネーター等を使用することもまた可能である。

【００５１】細菌ゲノム内の相当する部分と十分な大き
な相同性を有し、そのため相同的組換えを介して遺伝物
質の交換を可能にする同種または異種由来の適当なＤＮ
Ａ配列の選択により、遺伝子またはその他のＤＮＡ配列
を、粘液細菌ゲノム中の予め決定された部位に特異的に
組み込み、そして適当な場合にそこで発現させることが
今初めて可能になった。

【００５２】相同的組換えを介する交換に必要である、
相同ＤＮＡ部分と相当するゲノムＤＮＡ領域との間の相
同性の程度は種々のパラメーターに依存し、そしてそれ
故に使用されるＤＮＡ配列に依存して各々の場合に適当
な要求に適合させなければならない。少なくとも１００
Ｂｐからなる相同領域が必要な組換え結果を引き起こす
のに十分であると現時点の知識では考えられる。

【００５３】０．３ないし４Ｋｂ、好ましくは１ないし
３Ｋｂに及ぶ相同領域が本発明の範囲内で好ましい。

【００５４】本発明の範囲内の相同ＤＮＡ部分としての
使用に適当なのは、主として、粘液細菌完全ＤＮＡの単
離、次に適当な制限酵素での消化により得られる同種由
来のＤＮＡ配列である。上記相同ＤＮＡ断片のＤＮＡ配
列が公知である場合には、それらはもちろん合成により
調製されてもよい。

【００５５】しかしながら、標的生物のゲノムから直接
単離されず、例えば関連生物から単離され、そのため、
標的生物のゲノム上の相当するＤＮＡ領域とは１００％
の同一性を必ずしも有せず、実質的に相同である、すな
わち６０％と１００％の間、好ましくは８０％と１００
％の間、そして特に９０％と１００％の間の相同性の度
合いを有する異種由来の相同ＤＮＡ部分を使用すること
も可能である。

【００５６】それ故に、本発明の必須構成要件は、同種
由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝子物質
の組合せを粘液細菌細胞中に挿入し、そして粘液細菌の
染色体中に、存在する相同性により正確に規定される部
位に特異的に相同的組換えを介して組み込むことを特徴
とする、粘液細菌目の細菌の特異的遺伝子操作の方法に
より形成される。

【００５７】従って、上記の方法で適当なハイブリッド
遺伝子構築物を調製することにより、粘液細菌のゲノム
内の細菌固有遺伝子の特異的改変を行うか、または粘液
細菌ゲノム中に付加的遺伝子またはその他のＤＮＡ断片
を混入することが本発明の範囲内で初めて今可能となっ
た。組み込みが機能的遺伝子またはオペロン内で起こる
ならば、これは通常それらの不活性化を導き、結果とし
て表現型に目視できる悪影響を導く。

【００５８】このための特定の方法は、相同的組換えに
よりランダムに、または好ましくは存在する相同性によ
り規定され、そのために予め決められ得る部位で細菌ゲ
ノム中に組み込まれる、上記組換えＤＮＡ分子、該組換
えＤＮＡ分子を含む遺伝子、ハイブリッド遺伝子または
その他のＤＮＡ断片の１つで粘液細菌細胞を形質転換す
ることである。

【００５９】本発明の特定の実施態様において、遺伝物
質の粘液細菌、特にソランジウム／ポリアンジウム群の
粘液細菌への挿入は、供与細胞からソランジウム／ポリ
アンジウム受容細胞への接合移入を介して間接的様式で
起こる。

【００６０】相同的組換えを介する組み込みに十分であ
る粘液細菌染色体との相同性を有する適当なプラスミド
の製造方法は、例えば、まず最初に完全ＤＮＡを粘液細
菌から単離し、そして断片化することである。この断片
化は剪断力等の作用による機械的または好ましくは適当
な制限酵素により行われ得る。

【００６１】非常に多数の生成断片から適当な大きさの
ものを単離し、引続きそれらを適当なプラスミド中にク
ローン化することが可能である。同種ＤＮＡ断片ならび
に同種および異種由来のＤＮＡ断片の適当なクローニン
グベクターへの結合は例えば文献〔１３〕に記載される
ような標準法を用いて行われる。

【００６２】これは通常、最初に適当な制限酵素で切断
された、ベクターと組み込まれるべきＤＮＡ配列を必要
とする。適当な制限酵素は、例えばブラント末端を有す
る断片を生じるもの、例えばSma Ｉ、Hpa ＩおよびEcoR
V 、または粘着端を形成する酵素、例えばEcoRI 、Sac
Ｉ、BamHI 、SalI、Pvu Ｉ等である。

【００６３】互いに相補的である、ブラント末端を有す
る断片および粘着端を有する断片のどちらも、適当なＤ
ＮＡリガーゼにより再び結合され、単一の連続的ＤＮＡ
分子が形成される。

【００６４】突出する粘着端を有するＤＮＡ断片を大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片と処理して、適当
な相補的ヌクレオチドで空隙を充填することによりブラ
ント末端を製造することもできる。

【００６５】他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを用いて所望のＤＮＡ配列および
切断されたベクター分子の端部に相補的ホモポリマー尾
部を添加するか、または制限切断部位を有する合成オリ
ゴヌクレオチド配列（リンカー）を添加し、そして次に
適当な酵素で切断することにより、粘着端を人工的に製
造することもできる。

【００６６】上記され、そして同種由来のＤＮＡ断片ま
たは同種および異種由来のＤＮＡ断片の組合せを含む構
築物の製造および増幅のために、全ての慣用クローニン
グベクター、例えば宿主細胞に適合する種に由来する複
製および調節配列を必ず有するプラスミドまたはバクテ
リオファージベクターを使用することも原理的に可能で
ある。

【００６７】通常クローニングベクターは形質転換され
た宿主細胞において表現型の選択特徴、特に抗生物質に
対する耐性を導く特定の遺伝子の他に複製開始点を有す
る。形質転換されたベクターは宿主細胞への形質転換の
後にこれらの表現型マーカーに基づいて選択され得る。

【００６８】本発明の範囲内で使用され得る選択可能な
表現型マーカーは、本発明の対象に制限を与えるもので
はないが、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ク
ロラムフェニコール、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、カ
ナマイシン、ネオマイシンおよびブレオマイシンに対す
る耐性を含む。特定のアミノ酸に対する原栄養株はその
他の選択マーカーとして例えば機能し得る。

【００６９】本発明の範囲内では主として大腸菌プラス
ミド、例えば本発明の範囲内で使用されるプラスミドｐ
ＳＵＰ２０２１が好ましい。

【００７０】本発明の範囲内の上記クローニングのため
に適当な宿主細胞は主として原核生物であり、細菌宿
主、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス
(A. tumefaciens)、大腸菌(E. coli) 、エス．・チフィ
ムリウム(S. typhimurium)およびセルラチア・マルセッ
センス(Serratia marcescens) 、さらにシュードモナ
ド、放線菌、サルモネラおよび粘液細菌自体を含む。

【００７１】大腸菌宿主、例えば大腸菌ＨＢ１０１株が
特に好ましい。大腸菌ＨＢ１０１株の感応細胞はこれに
関連して大腸菌の形質転換に慣用の方法を用いて製造さ
れる（"General recombinant DNA techniques"参照）。

【００７２】形質転換および次の適当な培地上での単離
は、選択培地上に平板培養することによる異なるスクリ
ーニングに供される生成コロニーにより続けられる。引
続き、その中にクローン化されてＤＮＡ断片を有するプ
ラスミドを含むコロニーから適当なプラスミドＤＮＡを
単離することが可能である。

【００７３】異なる大きさの組換えプラスミドはこのよ
うにして得られる。制限分析の後に、適当な大きさのプ
ラスミドは、該プラスミドＤＮＡの粘液細菌細胞への次
の挿入のために選択されることが可能である。このＤＮ
Ａ移入はさらに、直接または好ましくは接合移入の範囲
内で仲介宿主（供与細胞）を介して起こり得る。

【００７４】それ故に、本発明の必須構成要件は、相同
部分の他に、適当な場合に、細菌細胞またはその他の有
用なＤＮＡ配列中で機能し得る発現シグナルに操作可能
な様式で結合されている構造遺伝子もしくはその他の所
望遺伝子または遺伝子断片１つ以上からなる遺伝子構築
物を１つ以上含むプラスミドの構築に関する。これに関
連して相同ＤＮＡ断片は細菌（粘液細菌）に固有であ
り、そのため完全に同種由来であるゲノム部分から全体
が構成されるか、またはそれらは相同部分の他に異種由
来のより高いまたは低い発現部分をも含み得る。純粋に
異種由来の相同ＤＮＡ部分の使用もまた考えられる。

【００７５】プラスミドは、上記され、そして適当な場
合に所望遺伝子産物をコードする構造遺伝子を含む遺伝
子構築物の粘液細菌細胞への挿入、および細菌ゲノム中
への組み込みのための別の工程段階において使用され得
る。

【００７６】粘液細菌細胞への本発明に係る遺伝子構築
物の移入は種々の方法で行われ得る。供与細胞から受容
粘液細菌への接合移入が本発明の範囲内で好ましい。

【００７７】さらに移入されるべきＤＮＡをまず最初に
慣用のクローニングベクター中で上記したようにクロー
ン化し、次に供与細胞として作用する適当な仲介宿主中
に形質転換することは接合移入の範囲内で可能である。
仲介宿主を介する迂回経路はＤＮＡのクローニングのた
め、および接合の範囲内の供与細胞としての使用のため
の両方に適当である宿主株を用いることにより回避され
得る。

【００７８】供与細胞として本発明の範囲内で使用され
得る仲介宿主は実質的に、大腸菌、シュードモナド、放
線菌、サルモネラおよび粘液細菌自体からなる群から選
択される原核細胞である。

【００７９】供与細胞から受容体へのプラスミドＤＮＡ
の接合移入のための必要条件はトランスファー機能（ｔ
ｒａ）および移動機能（ｍｏｂ）の存在である。さら
に、移動機能は少なくともトランスファー開始点（ｏｒ
ｉＴ）を含み、そして移入されるべきプラスミド上に位
置されていなければならない。一方、トランスファー機
能（ｔｒａ）はプラスミドもしくはヘルパープラスミド
上に位置されているか、または供与細胞の染色体中に組
み込まれて存在していてもよい。

【００８０】上記の条件に合致し、それ故に本発明の範
囲内で好ましいプラスミドは実質的に不適合群Ｐ，Ｑ，
Ｔ，Ｎ，ＷおよびＣｏｌＩである。Ｐ群プラスミドの原
型はプラスミドＲＰ４である。本発明の範囲内で特に好
ましいのは、ｍｏｂ機能（ＲＰ４ｍｏｂ）の成分として
トランスファー開始点（ｏｒｉＴ）を有するプラスミド
ＲＰ４からの１．９Ｋｂ断片を含むプラスミドｐＳＵＰ
２０２１である。ｍｏｂ機能（ＲＰ４ｍｏｂ）を有する
その他のプラスミド、例えばｐＳＵＰ１０１、ｐＳＵＰ
３０１、ｐＳＵＰ４０１、ｐＳＵＰ２０１、ｐＳＵＰ２
０２、ｐＳＵＰ２０３またはｐＳＵＰ２０５およびそれ
から誘導される誘導体〔２２〕は同様に本発明に係る方
法の範囲内で使用され得る。

【００８１】本発明の範囲内で行われた実験の間に、受
容粘液細菌が供与株との保温の前で接合移入の間に短時
間の熱処理に晒される場合に有利であることが明らかと
なった。３５℃ないし６０℃、好ましくは４２℃ないし
５５℃、特に４８℃ないし５２℃の温度で１ないし１２
０分、好ましくは５ないし２０分の受容細胞の予備保温
が好ましい。

【００８２】染色体ＤＮＡに混入されたプラスミドＲＰ
４のトランスファー遺伝子（ｔｒａ）を含む大腸菌供与
株が本発明の好ましい実施態様において使用される。Ｒ
Ｐ４のトランスファー機能（ｔｒａ）を有するヘルパー
プラスミドｐＭＥ３０５を含む大腸菌供与Ｗ３１０１株
（ｐＭＥ３０５）が本発明の範囲内で好ましい。

【００８３】方法技術にとって特に興味深く、そして本
発明の範囲内で特に好ましいのは、組み込まれたＤＮＡ
配列を有するベクターのクローニングのためと、接合移
入の範囲内で供与細胞として使用するための両方に適当
である細菌株である。制限陰性であり、そのために挿入
された外来ＤＮＡを分解しない細菌株も同様に特に好ま
しい。上記の両方の条件を大腸菌ＥＤ８７６７株（ｐＵ
Ｚ８）は理想的に満たしているが、その他の適当な細菌
株の代表としてここで記載するにすぎず、本発明の範囲
を限定するものではない。

【００８４】上記した供与細胞から受容粘液細菌への接
合遺伝子移入の他に、粘液細菌に遺伝物質を挿入するた
めのその他の適当な遺伝子移入方法を使用することもも
ちろん可能である。ここでは、粘液細菌細胞が高い電場
強度に短時間晒されるエレクトロポレーション〔１２〕
を介する遺伝子移入が主として記載され得る。原核細胞
のエレクトロポレーションのための一般的でおおまかな
条件は文献〔２５〕に記載されている。

【００８５】

【実施例】次に実施例に基づいて本発明を説明するが、
本発明はこれに制限されるものではない。一般的な組換えＤＮＡ技術本発明において用いられる組換えＤＮＡ技術の多くは当
業者にとって一般的なものであるので、通常用いられる
技術に関してここで簡潔に記載しておく。別に特記した
ことを除いて、これらの全ての操作は文献〔１３〕に記
載されている。

【００８６】Ａ．制限エンドヌクレアーゼでの切断反応バッチは典型的には、マサチューセッツ州ビバリー
のニュー・イングランド・バイオラブス(New England B
iolabs) およびドイツ国マンハイムのベーリンガー(Boh
ringer) により推奨される緩衝溶液中に約５０ないし５
００μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む。制限エンドヌクレアー
ゼ２ないし５単位をＤＮＡ１μｇにつき添加し、そして
反応バッチを上記の会社により推奨される温度で１ない
し３時間保温する。６５℃で１０分間加熱するか、また
はフェノールでの抽出により反応を終結させ、エタノー
ルでＤＮＡを沈澱させる。この方法は文献〔１３〕の第
１０４ないし１０６頁にも記載されている。

【００８７】Ｂ．ブラント末端を製造するためのＤＮＡ
のポリメラーゼでの処理ＤＮＡ断片５０ないし５００μｇ／ｍｌを、製造会社ニ
ュー・イングランド・バイオラブスおよびベーリンガー
により推奨される緩衝液中の反応バッチに添加する。反
応バッチは全４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を
０．２ｍＭの濃度で含有する。反応は１５℃で３０分間
行われ、次いで６５℃で１０分間加熱することにより終
結される。５’突出末端を製造する制限エンドヌクレア
ーゼ例えばEcoRI およびBamHI で切断することにより得
られる断片のためには、ＤＮＡポリメラーゼの大断片ま
たはクレノウ断片が使用される。３’突出末端を製造す
るエンドヌクレアーゼ例えばPstII およびSacIにより製
造される断片のためには、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが使
用される。これらの２つの酵素の使用は文献〔１３〕の
第１１３ないし１２１頁に記載されている。

【００８８】Ｃ．アガロースゲル電気泳動およびゲルか
らのＤＮＡ断片の精製アガロースゲル電気泳動を文献〔１３〕の第１５０ない
し１６３頁に記載のように水平型装置で行う。使用され
る緩衝液はその中に記載されているトリス−アセテート
緩衝液である。ＤＮＡ断片は、電気泳動の間にゲルまた
はタンク緩衝液に存在するか、または電気泳動の後に添
加されるいずれかの０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを
用いて染色される。ＤＮＡを長波長の紫外線の照射によ
り可視化する。断片をゲルから分離する場合には、使用
されるアガロースは低いゲル化温度のものであり、これ
はミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル(Sigma C
hemical)から入手できる。電気泳動後、望ましい断片を
削り取り、プラスチック管内に入れ、６５℃で約１５分
間加熱し、次いでフェノールで３回抽出し、そしてエタ
ノールで２回沈澱させる。この操作は文献〔１３〕の第
１７０頁の記載とはわずかに異なっている。

【００８９】変法として、ＤＮＡはジェネクリーン・キ
ット(Geneclean kit)[米国カリフォルニア州ラ・ジョラ
のバイオ１０１社(Bio 101 Inc.)] を用いてアガロース
から単離され得る。

【００９０】Ｄ．ＤＮＡ末端への合成リンカー断片の付加ＤＮＡ分子末端へ新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を
添加することが必要な場合、上の項に記載したように、
ブラント末端を製造するために、場合によってはこの分
子をまずＤＮＡポリメラーゼで処理する。この断片約
０．１ないし１．０μｇを、ニュー・イングランド・バ
イオラブスから得られるホスホリル化リンカーＤＮＡ約
１０ｎｇに、同社のＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌおよび同
社により推奨される緩衝液中の１mMＡＴＰを含有する２
０ないし３０μｌ容量中で添加する。１５℃で一晩保温
後、６５℃で１０分間加熱することにより反応を終結さ
せる。反応バッチを次に、合成リンカー配列で切断する
制限エンドヌクレアーゼに適当な緩衝液中に約１００μ
ｌに希釈し、そしてこのエンドヌクレアーゼ約５０ない
し２００単位を添加する。混合物を適温で２ないし６時
間保温し、次に断片をアガロースゲル電気泳動に供し、
そして上記Ｃのように断片を精製する。精製した断片は
今では制限エンドヌクレアーゼでの切断により製造され
た終端を有するであろう。これらの終端は通常粘着性で
あり、その結果、生成断片は同じような粘着端を有する
その他の断片に容易に連結され得る。

【００９１】Ｅ．ＤＮＡ断片からの５’末端ホスフェートの除去プラスミドクローニング工程の間に、ベクタープラスミ
ドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減
少させる（文献〔１３〕の第１３頁に記載されてい
る）。正しい制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡの切断
の後、ベーリンガー−マンハイム(Boehringer-Mannhei
m) から得られる子ウシ消化管のアルカリホスファター
ゼ１単位を添加する。ＤＮＡを３７℃で１時間保温し、
次にフェノールで２回抽出し、そしてエタノールで沈澱
させる。

【００９２】Ｆ．ＤＮＡ断片の連結相補的な粘着端を有する断片を互いに結合させる場合、
各々の断片約１００ｎｇは、ニュー・イングランド・バ
イオラブスからのＴ４ＤＮＡリガーゼ約０．２単位をこ
の会社により推奨される緩衝液中に含有する２０ないし
４０μｌの反応混合物中で保温される。保温は１５℃で
１ないし２０時間行われる。ブラント末端を有するＤＮ
Ａ断片が結合される場合、それらはＴ４ＤＮＡリガーゼ
の量を２ないし４単位に増加させる以外は上記と同様に
保温される。

【００９３】Ｇ．ＤＮＡの大腸菌内への形質転換大腸菌ＨＢ１０１株、Ｗ３１０１株およびＥＤ８７６７
株がほとんどの実験において使用される。文献〔１３〕
の第２５０および２５１頁に記載されているように、塩
化カルシウム法を用いてＤＮＡが大腸菌内に導入され
る。

【００９４】Ｈ．プラスミドのための大腸菌のスクリーニング形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニーは迅速プラ
スミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験され
る。２種の慣用の方法は、文献〔１３〕の第３６６ない
し３６９頁に記載されている。

【００９５】Ｉ．プラスミドＤＮＡの大規模な単離大腸菌からプラスミドを大規模に単離する方法は文献
〔１３〕の第８８ないし９４頁に記載されている。

【００９６】実施例１：ソランジウムの培養条件ソランジウム・セルロスム(Sorangium cellulosum)をＧ
５１ｂ液体培地（「培地および緩衝液」の項参照）中３
０℃の温度で培養する。１８０ｒｐｍで震盪することに
より培養液に空気を通す。別の培地としてＧ５２ｃ培地
を使用することも可能である。「培地および緩衝液」の
項に記載されたＳｏｌＥ培地は固体培地での培養に使用
され得る。培養温度はこの場合も３０℃である。

【００９７】実施例２：大腸菌の培養条件大腸菌細胞をＬＢ培地〔１４〕中３７℃の温度で培養す
る。

【００９８】実施例３：ソランジウム・セルロスムのス
トレプトマイシン耐性の自然発生突然変異体の調製液体培地中ですすいだ３日齢のソランジウム・セルロス
ム培養液（野生型Ｓｏｃｅ２６株）２００μｌを、３
００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した固体培地
（ＳｏｌＥ培地）上で平板培養する。３０℃の温度で培
養時間は１４日である。この培地上に成長するコロニー
は自然発生のストレプトマイシン耐性突然変異体であ
り、これはさらに濃縮および精製のために同一培地（ス
トレプトマイシン含有）上でもう１回培養される。

【００９９】これらのストレプトマイシン耐性コロニー
の１つが選択され、そしてＳＪ３と命名される。この突
然変異ソランジウム・セルロスムＳｏｃｅ２６株
は、ブダペスト条約に従って国際寄託機関として認めら
れている「ドイチェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオ
ルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベ
ーハー」（ドイツ国ブラウンスヴァイク）に、寄託番号
ＤＳＭ６３８０の下に１９９１年１月２５日寄託され
た。

【０１００】実施例４：ソランジウムの完全ＤＮＡの調
製完全ＤＮＡを単離するために、定常期にあるソランジウ
ム培養液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
細胞を除去し、そしてＳＴＥ緩衝液（「培地および緩衝
液」の項参照）中に再び懸濁し、そして細胞密度を約１
０⁹細胞／ｍｌに調整する。

【０１０１】次にこの懸濁液４５０μｌをＲＬＭ緩衝液
（「培地および緩衝液」の項参照）２００μｌおよびジ
エチルピロカーボネート２μｌと混合する。十分で均一
な混合は適当な装置、例えばボルテックス等を用いるこ
とにより確実に行われる。７０℃で３０分間インキュベ
ーター中で保温した後、酢酸カリウム（５Ｍ）１００μ
ｌを添加する。この混合物を氷上で１５分間保温し、５
分毎に十分に混合する（ボルテックス）。遠心分離（１
００００ｒｐｍで１５分間）後、上澄みをフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／
１）５００μｌとタンパク質の抽出のために混合する。
もう１回の遠心分離（１００００ｒｐｍで１５分間）の
後、ＤＮＡ画分を含む上層を除去し、そしてその中に依
然として存在するフェノール分をジエチルエーテル（１
ｍｌ）で除去する。ＤＮＡを次にエタノール１ｍｌの添
加により沈殿させる。−７０℃で３０分間の保温の後、
全混合物を１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペ
レットを７０％エタノールで洗浄し、そして真空下で乾
燥させる。最後にＤＮＡをＴＥＲ緩衝液中に溶解させ
る。

【０１０２】実施例５：ソランジウム・セルロスムＳＪ
３中へのｐＳＪＢ５５の接合移入５．１２段階法５．１．１プラスミドｐＳＵＰ２０２１中へのソラン
ジウムＤＮＡのクローニングソランジウムＳＪ３株から単離された染色体を制限酵素
Pvu Ｉで切断する。この方法で得られる断片をプラスミ
ドｐＳＵＰ２０２１〔２２〕中にクローン化する。これ
は最初にPvu Ｉで消化され、次にエタノールで沈殿され
る、プラスミドＤＮＡ０．２μｇおよび染色体ＤＮＡ１
μｇを必要とする。沈殿物を除去し、乾燥し、そして乾
燥ペレットを２回蒸留水１４μｌ中に再び懸濁する。次
に１０倍濃縮連結緩衝液（「培地および緩衝液」の項参
照）２．５μｌ、ウシ血清アルブミン（０．１％）２．
５μｌ、ＡＴＰ（１０ｍＭ）２．５μｌ、ＤＴＴ（０．
２Ｍ）２．５μｌ、Ｈ₂Ｏ８μｌおよびＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１μｌを添加する。全連結混合物を次いで約８℃の
温度で一晩保温する。

【０１０３】この連結混合物５μｌを組換えプラスミド
のクローニングのために大腸菌ＨＢ１０１株中に形質転
換する。このために大腸菌ＨＢ１０１株の感応細胞を大
腸菌の形質転換に通常用いられる方法（"General recom
binant DNA techniques"参照）により調製する。

【０１０４】形質転換および引き続くカナマイシン（２
５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ
／ｍｌ）を補足したＬＢ寒天上での２４時間の培養の後
に、生成するコロニーを、アンピシリン含有（６０μｇ
／ｍｌ）培地およびアンピシリン非含有培地上での平行
平板培養による鑑別スクリーニングに供する。結果とし
て、ソランジウムＤＮＡ断片の組み込みによるそれらの
アンピシリン耐性を消失したコロニーを単離することが
可能である。次にプラスミドをこれらのアンピシリン感
受性コロニーから単離する。

【０１０５】異なる大きさの組換えプラスミドがこの方
法で得られる。制限分析の後、これらのプラスミドの３
つがさらに実験するために選択される。これらのプラス
ミドはｐＳＪＢ５０、ｐＳＪＢ５５およびｐＳＪＢ５８
と命名され、それぞれ１Ｋｂ、３．５Ｋｂおよび４Ｋｂ
のソランジウムＤＮＡ挿入物を含む。

【０１０６】５．１．２ソランジウム・セルロスム中
へのプラスミドｐＳＪＢ５５の接合移入ソランジウム・セルロスム中へのプラスミドｐＳＪＢ５
５の移入はソランジウムと接合様情報交換し得る大腸菌
Ｗ３１０１株（ｐＭＥ３０５）〔８〕の仲介で起こる。
大腸菌プラスミドｐＭＥ３０５〔１７〕はこの場合ｐＳ
ＪＢ５５の移動のためのヘルパープラスミドとして使用
される。

【０１０７】最初に、大腸菌Ｗ３１０１株（ｐＭＥ３０
５）の感応細胞を、大腸菌の形質転換に通常用いられる
方法により、予め単離されたｐＳＪＢ５５プラスミドＤ
ＮＡ５μｌで形質転換させる。形質転換された大腸菌細
胞はそれによりプラスミドｐＳＪＢ５５のための供与体
となる。

【０１０８】実際の移入のために、定常期にあるソラン
ジウム・セルロスムＳＪ３培養液（４×１０⁸ないし１
−４×１０⁹細胞／ｍｌ）１５ｍｌを、相当量の細胞を
含む大腸菌供与細胞の後期対数期にある培養液１０ｍｌ
と混合する。これらを次に４０００ないし８０００ｒｐ
ｍで１０分間一緒に遠心分離し、そしてＧ５１ｂまたは
Ｇ５１ｔ培地５００μｌ中に再び懸濁する。

【０１０９】ソランジウム受容細胞を大腸菌との接合前
に水浴中での熱処理に短時間晒すことは有利である。ソ
ランジウム・セルロスムＳＪ３株での最良の移入結果は
５０℃の温度で１０分間の熱処理で達成され得る。これ
らの条件下で１−５×１０^-5の移入頻度が達成され得、
これは予備的な熱処理なしでの操作と比較して１０倍の
増加に相当する。

【０１１０】ＳｏｌＥ固体培地のプレートに移し、３０
℃で２日間保温する。細胞を次に集め、そしてＧ５１ｂ
またはＧ５１ｔ培地１ｍｌ中に再び懸濁する。この細菌
懸濁液１００μｌを、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）の
他にフレオマイシン（２０ないし３５ｍｇ／ｌ）および
ストレプトマイシン（３００ｍｇ／ｌ）を選択剤として
含有する選択ＳｏｌＥ培地上に平板培養する。供与株
〔大腸菌Ｗ３１０１（ｐＭＥ３０５）〕の逆選択がスト
レプトマイシンを用いて行われる。

【０１１１】１０ないし１４日の培養期間の後に選択Ｓ
ｏｌＥ培地上に成長するコロニーはプラスミドｐＳＪＢ
５５の接合移入によりフレオマイシン耐性を獲得したソ
ランジウム・セルロスムのトランス接合体である。これ
らのフレオマイシン耐性コロニーは次の分子生物学的研
究に使用され得る。プラスミドｐＳＪＢ５５のソランジ
ウムへの移入の形質転換頻度は平均で受容ＳＪ３株に基
づいて３×１０^-6である。

【０１１２】プラスミドｐＳＪＢ５０およびｐＳＪＢ５
８はソランジウムに同様の方法で移入され得る。

【０１１３】５．２１段階法５．２．１プラスミドｐＳＵＰ２０２１中へのソラン
ジウムＤＮＡのクローニングプラスミドｐＳＵＰ２０２１中へのソランジウムＤＮＡ
のクローニングは実施例５．１．１に記載のように行わ
れ得る。

【０１１４】５．１．１で使用されたヘルパープラスミ
ドｐＭＥ３０５を、このプラスミドとは異なり、アンピ
シリン耐性遺伝子を含まないプラスミドｐＵＺ８〔６〕
に代えることにより、接合移入に意図される大腸菌供与
株ＥＤ８７６７中での直接クローニングが今では可能で
あるので、大腸菌仲介宿主ＨＢ１０１でのクローニング
段階を省略できる。

【０１１５】プラスミドｐＵＺ８は、広い宿主範囲を有
し、そして文献〔４〕に記載されているプラスミドＲＰ
４の誘導体である。出発プラスミドＲＰ４と比べた場合
の相違はアンピシリン耐性遺伝子および挿入エレメント
ＩＳ２１（これらの両方は欠失されている）、そして水
銀イオンに対する耐性を付与する付加的遺伝子の混入に
実質的に関する〔８〕。

【０１１６】それ故に、実施例５．１．１で調製された
連結混合物は今では大腸菌ＥＤ８７６７株中に直接形質
転換され得る。このために、大腸菌ＥＤ８７６７株の感
応細胞は大腸菌の形質転換に通常用いられる方法（"Gen
eral recombinant DNA techniques"参照）により調製さ
れる。

【０１１７】形質転換および引き続くテトラサイクリン
（１０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５
μｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ寒天上での２４時間の培養
の後に、生成するコロニーを、アンピシリン含有（６０
μｇ／ｍｌ）培地およびアンピシリン非含有培地上での
平行平板培養による鑑別スクリーニングに供する。結果
として、ソランジウムＤＮＡ断片の組み込みによるそれ
らのアンピシリン耐性を消失したコロニーを単離するこ
とが可能である。このようにして得られる培養体は次に
ソランジウム・セルロスム細胞中への組換えプラスミド
の接合移入のための供与細胞として直接使用され得る。

【０１１８】上記連結混合物の代わりに、この場合に
は、実施例５．１．１で調製されたような組換えプラス
ミドｐＳＪＢ５０、ｐＳＪＢ５５およびｐＳＪＢ５８を
大腸菌ＥＤ８７６７株中にクローン化することも可能で
あることはもちろんである。

【０１１９】５．２．２ソランジウム・セルロスム中
への組換えプラスミドの接合移入実際の移入のために、定常期にあるソランジウム・セル
ロスムＳＪ３培養液（１−４×１０⁹細胞／ｍｌ）１５
ｍｌを、相当量の細胞を含む大腸菌供与細胞の後期対数
期にある培養液１０ｍｌと混合する。これらを次に４０
００ｒｐｍで１０分間一緒に遠心分離し、そしてＧ５１
ｂまたはＧ５１ｔ培地５００μｌ中に再び懸濁する。

【０１２０】ソランジウム受容細胞を大腸菌との接合前
に水浴中での熱処理に短時間晒すことは有利である。ソ
ランジウム・セルロスムＳＪ３株での最良の移入結果は
５０℃での温度で１０分間の熱処理で達成され得る。こ
れらの条件下で１−５×１０^-5の移入頻度が達成され
得、これは予備的な熱処理なしでの操作と比較して１０
倍の増加に相当する。

【０１２１】形質転換されたソランジウム細胞の培養は
実施例５．１．２に記載した方法と同様に行われる。

【０１２２】供与株としての制限陰性大腸菌株、例えば
大腸菌ＥＤ８７６７〔１５〕の使用により、形質転換頻
度は上記の方法と比べ著しく（１０³倍まで）高められ
得る。

【０１２３】分子遺伝学的分析（Ａ）ソランジウム・セルロスムＳＪの染色体内へのプ
ラスミドｐＳＪＢ５５の組み込みの検出上記のようにして（実施例４参照）形質転換されたソラ
ンジウム細胞から単離された完全ＤＮＡをSmaIおよびSa
lIで消化し、そして水平トリスアセテート（４０ｍＭト
リスＨＣｌ，２０ｍＭ酢酸ナトリウム，２ｍＭＥＤＴ
ＡＮａ₂，ｐＨ７．８）アガロースゲル（０．９％）
上に注入する。電気泳動の後、ゲルを最初に変性溶液
（１．５ＭＮａＣｌ，０．５ＭＮａＯＨ）中に３０
分間、次に中和溶液（１．５ＭＮａＣｌ，０．５Ｍト
リスＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡＮａ₂，ｐＨ７．２）
中に入れる。２０倍濃縮ＳＳＣ緩衝液（「培地および緩
衝液」の項参照）を用いるサザン・キャピラリー・ブロ
ッティングによりＤＮＡをナイロンメンブラン（例えば
アマルシャム・ハイボンド・ナイロンメンブラン，アマ
ルシャム・インターナショナル社，英国ＨＰ７９Ｎ
Ａ，アマルシャム，アマルシャム・プレイス）上に移送
し、そして６分間のＵＶ処理によりそこに固定する。こ
の方法のその他の詳細はアマルシャム・インターナショ
ナル・ハンドブック"Membrane Transfer and Detection
Methods" (1985)に記載されている。

【０１２４】ハイブリダイゼーションプローブとされる
ＤＮＡをニックトランスレーション〔１９〕により標識
する。これにより、プラスミドｐＳＪＢ５５より３．５
Ｋｂからなる³²Ｐ−標識ＰｖｕＩ挿入物の形態で採取さ
れる。実際のハイブリダイゼーションはデンハルトの方
法〔５〕をわずかに改変した方法により行われる。予備
ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
に使用される緩衝液は以下の組成を有する：６×ＳＳＣ
〔１３〕＋５×デンハルト〔１３〕＋０．５％ＳＤＳ＋
０．２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ。

【０１２５】予備ハイブリダイゼーションは６５℃で行
われ、３時間を要し、一方、実際のハイブリダイゼーシ
ョン反応は２０時間後に完了する。ハイブリダイゼーシ
ョンのために、プラスミドｐＳＪＢ５５由来の３．５Ｋ
ｂからなる³²Ｐ−標識（１０⁵ｃｐｍ／ｃｍ²フィルタ
ー）変性ＰｖｕＩ断片を添加する。ハイブリダイゼーシ
ョンの後に、フィルターを２倍濃縮ＳＳＣ中６５℃の温
度で２×１５分、次に２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中同
様に６５℃で３０分、そして最後に０．５×ＳＳＣでさ
らにもう１回（６５℃で１５分）洗浄する。

【０１２６】引続き、オートラジオグラフィーがＸ線フ
ィルム（例えばフジＸ線フィルム）を用いて行われる。
トランス接合体のオートラジオグラフは、過らせん体の
形態にある遊離ｐＳＪＢ５５プラスミドＤＮＡに相当す
るバンドを示さない。しかしながら、これに対し、陽性
シグナルはフィルターメンブランの染色体領域中に見い
だされる。

【０１２７】SmaI消化プラスミドｐＳＪＢ５５は８．
９、６．７および１．６Ｋｂの３つのバンドを与える。
親株ＳＪ３のSmaI消化後のハイブリダイゼーションパタ
ーンは同様に３つのバンドを示し、その１つはプラスミ
ドｐＳＪＢ５５中にクローン化されたソランジウム挿入
物の１．６Ｋｂからなる内部断片に相当する。トランス
接合体のSmaI消化ＤＮＡのハイブリダイゼーションパタ
ーンは、３種全てに共通する１．６Ｋｂバンドを含む５
つのバンド（プラスミドｐＳＪＢ５５およびＳＪ３バン
ドの８．９および６．７Ｋｂバンド）を示す。

【０１２８】SalI消化の後、１４．１Ｋｂのバンドがプ
ラスミドｐＳＪＢ５５に見いだされる（ｐＳＪＢ５５の
３．１Ｋｂからなるその他のSalI断片はプローブとハイ
ブリッド形成しない）。SalI消化ＳＪ３ＤＮＡのハイブ
リダイゼーションパターンは同様に５Ｋｂのバンドを示
す。トランス接合体において、プラスミドｐＳＪＢ５５
の１４．１Ｋｂ断片およびＳＪ３の５Ｋｂ断片はSalI消
化の後に消失する。これらは１１．５Ｋｂおよび７．７
Ｋｂの２つの新たなバンドに置換される。

【０１２９】SmaIデータは、全てのｐＳＪＢ５５断片が
トランス接合体のゲノム中で無傷であることを示す。こ
の場合、SmaI断片の少なくとも１つが必ず消失するであ
ろうから、部位特異的組換えの可能性がなくなる。さら
に、SalI消化の結果は、プラスミドｐＳＪＢ５５がソラ
ンジウムゲノム中に、特にｐＳＪＢ５５と相同なＤＮＡ
領域（＝３．５ＫｂＰｖｕＩ断片）が位置する部位に
組み込まれたことを明らかにする。この組み込みは、ｐ
ＳＪＢ５５由来の３．５Ｋｂからなるソランジウム挿入
物とソランジウムゲノム内の同様な挿入物との間の相同
的組換えにより起こる。

【０１３０】培地および緩衝液Ｇ５１ｂ培地（ｐＨ７．４）グルコース０．２％デンプン０．５％〔ジャガイモデンプン，Noredux type；セレスタール・
イタリア社(CERESTARITALIA S.p.a.)，イタリア国ミラ
ノ〕ペプトン０．２％〔ディフコ・ラボラトリーズ(DIFCO Laboratories)，ア
メリカ合衆国〕プロビオンＳ０．１％〔シングル・セル・プロテイン；ヘキスト社，ドイツ国
フランクフルト〕ＣａＣｌ₂×２Ｈ₂Ｏ０．０５％ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ０．０５％ＨＥＰＥＳ〔フルカ〕１．２％Ｇ５１ｔ培地（ｐＨ７．４）グルコース０．２％デンプン０．５％〔ジャガイモデンプン，Noredux type；セレスタール・
イタリア社，イタリア国ミラノ〕トリプトン０．２％〔マルコ(MARCO) ，アメリカ合衆国ニュージャージー州
ハッケンサック〕プロビオンＳ０．１％〔シングル・セル・プロテイン；ヘキスト社，ドイツ国
フランクフルト〕ＣａＣｌ₂×２Ｈ₂Ｏ０．０５％ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ０．０５％ＨＥＰＥＳ〔フルカ〕１．２％Ｇ５２ｃ培地（ｐＨ７．４）グルコース２．０ｇ／ｌデンプン８．０ｇ／ｌ〔ジャガイモデンプン，Noredux type；セレスタール・
イタリア社，イタリア国ミラノ〕脱脂大豆粉２．０ｇ／ｌ〔ムセドラ社(MUCEDOLA S.r.l)，イタリア国セッチモ・
ミラネッセ〕イーストエキス２．０ｇ／ｌ〔フォールド・アンド・スプリンガー(FOULD & SPRINGE
R)，フランス国メゾン・アルフォ〕ＣａＣｌ₂×２Ｈ₂Ｏ１．０ｇ／ｌＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ１．０ｇ／ｌＦｅ−ＥＤＴＡ〔８ｇ／ｌ貯蔵液〕１．０ｍｌＨＥＰＥＳ〔フルカ〕２．０ｇ／ｌ蒸留水全体を１０００ｍｌとするｐＨは殺菌〔１２０℃で２０分〕前にＮａＯＨで７．４
に調整される。殺菌後のｐＨ：７．４ＳｏｌＥ培地（ｐＨ７．４）グルコース^* ０．３５％トリプトン０．０５％〔マルコ，アメリカ合衆国ニュージャージー州ハッケンサック〕ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ０．１５％硫酸アンモニウム^* ０．０５％ＣａＣｌ₂×２Ｈ₂Ｏ^* ０．１％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ^* ０．００６％硫酸ジチオニット^* ０．０１％Ｆｅ−ＥＤＴＡ^* ０．０００８％ＨＥＰＥＳ〔フルカ〕１．２％殺菌された定常期のソランジウム・３．５％（ｖ／ｖ）セルロスム培養液上澄み^* 寒天１．５％ ^*添加は殺菌後に行うｐＨは殺菌〔１２０℃で２０分〕前にＮａＯＨで７．４に調整される。ＬＢ培地トリプトン１０．０ｇ／ｌイーストエキス５．０ｇ／ｌＮａＣｌ５．０ｇ／ｌＳＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）シュークロス２５％ＥＤＴＡＮａ₂ １ｍＭトリスＨＣｌ１０ｍＭＰＬＭ緩衝液（ｐＨ７．６）ＳＤＳ５％ＥＤＴＡＮａ₂ １２５ｍＭトリスＨＣｌ０．５ｍＭＴＥＲ緩衝液トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＭＥＤＴＡＮａ₂ １ｍＭＲＮアーゼ１０μｇ／ｍｌ連結緩衝液ＭｇＣｌ₂ ０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）０．５Ｍ

【０１３１】表表１：細菌株およびプラスミド菌株関連する特徴 ─────────────────────────────────── 大腸菌Ｗ３１０１ＮａｌＲｅｃＡ１３，ｔｒｐＥ，ＮａｌＲＨＢ１０１Ｆ−，ｈｓｄｓ２０（ｒ−，ｍ−），ｒｅｃＡ１３，ａｒａ１４，ｐｒｏＡ２，ｌａｃＹ１，ｇａｌＫ２，ｒｐｓＬ２０（ＳｍＲ），ｘｙｌ−５，ｍｔｌ−１，ｓｕｐＥ４４，ラムダ− ＥＤ８７６７ｒｅｃＡ，ｓｕｐＥ，ｓｕｐＦ，ｈｓｄＳソランジウム・セルロスムＳｏｃｅ２６野生型株Ｓｏｃｅ２６／ＳＪ３ＳｍＲ自然発生突然変異体 ─────────────────────────────────── プラスミド ─────────────────────────────────── ｐＳＵＰ２０２１Ａｐ，Ｃｍ，Ｋｍ．ＰｈｐＳＪＢ５０Ｃｍ，Ｋｍ，ＰｈｐＳＪＢ５５Ｃｍ，Ｋｍ，ＰｈｐＳＪＢ５８Ｃｍ，Ｋｍ，ＰｈｐＭＥ３０５Ａｐ，ＴｃｐＵＺ８Ｔｃ，Ｋｍ，Ｈｇ ───────────────────────────────────

【０１３２】寄託本発明の範囲内の以下の微生物およびプラスミドはブダ
ペスト条約に従って国際寄託機関として認められている
ドイツ国ブラウンスヴァイクにある「ドイチェ・ザンム
ルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェ
ルクルツレン・ゲーエムベーハー」に、特許手続上の微
生物の寄託の国際的承認に関する要求を満たすために寄
託された。

【０１３３】参考文献一覧

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者トーマスシュップスイス国 4313 メーリンフレッシュマットヴェーク５ (72)発明者スネツァナネッフスイス国 4416 ブーベンドルフフルーアシュトラーセ 21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）粘液細菌の染色体上の相当する領
域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同であ
るＤＮＡ部分を１つ以上自然に含む、同種もしくは異種
由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝物質の
組合せ、または（ｂ）粘液細菌の染色体上の相当する領域と相同である
か、または少なくとも実質的に相同である部分を自然に
含まないが、そのような相同または実質的に相同なＤＮ
Ａ部分にそれ自体公知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に
結合されている遺伝物質、を粘液細菌の細胞中に挿入
し、そして粘液細菌の染色体上に存在する構造要素また
は特定の転移作用とは無関係に、挿入されたＤＮＡと細
菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により正確に
規定される部位で相同的組換えを介して前記粘液細菌の
染色体中に組み込むことを特徴とする粘液細菌目の細菌
の遺伝子操作方法。
【請求項２】挿入されるべき遺伝物質が前記相同また
は実質的に相同なＤＮＡ部分により挟まれている請求項
１記載の方法。
【請求項３】挿入されるべき前記遺伝物質が粘液細菌
の細胞において機能し得る発現配列に操作可能な様式で
結合されている発現性ＤＮＡである請求項２記載の方
法。
【請求項４】遺伝物質の挿入が供与体から受容粘液細
菌への接合転移を介して起こる請求項１記載の方法。
【請求項５】以下の段階：（ａ）粘液細菌標的生物または関連生物の完全ＤＮＡの
調製；（ｂ）（ａ）で単離された完全ＤＮＡの断片化；（ｃ）（ｂ）で調製されたような断片の適当なプラスミ
ドベクター内へのクローニングおよびクローニングのた
めに通常使用される宿主生物の１種内への上記ベクター
の形質転換；（ｄ）組み込まれた粘液細菌ＤＮＡ断片を有するプラス
ミドを含むコロニーの選択および上記プラスミドの単
離；（ｅ）粘液細菌標的生物と接合様情報交換し得る供与生
物内への（ｄ）で単離されたプラスミドＤＮＡの形質転
換；（ｆ）粘液細菌標的生物への組換えプラスミドＤＮＡの
接合転移；（ｇ）形質転換された粘液細菌細胞の培養および陽性形
質転換体の選択からなる請求項１記載の粘液細菌目の細菌の遺伝子操作
方法。
【請求項６】挿入されるべき遺伝物質が、発現され得
る１つ以上のＤＮＡ部分を場合により含み、そしてその
中にクローン化された相同または実質的に相同なＤＮＡ
領域を含むプラスミドである請求項１または５のいずれ
かに記載の方法。
【請求項７】粘液細菌目の上記細菌がソランジウム／
ポリアンジウム群のものである請求項１または５のいず
れかに記載の方法。
【請求項８】前記相同ＤＮＡ部分と粘液細菌の染色体
の相当する領域との間の相同性の度合いが６０％と１０
０％の間である請求項１または５のいずれかに記載の方
法。
【請求項９】前記相同ＤＮＡ部分が少なくとも１００
Ｂｐからなる請求項１または５のいずれかに記載の方
法。
【請求項１０】前記相同ＤＮＡ部分が０．３と４Ｋｂ
の間からなる請求項１または５のいずれかに記載の方
法。
【請求項１１】大腸菌、シュードモナド、放線菌、サ
ルモネラおよび粘液細菌自体からなる群から選択される
原核生物が粘液細菌ＤＮＡ断片のクローニングのための
宿主生物として、または接合ＤＮＡ転移の範囲内の供与
生物として使用される請求項５記載の方法。
【請求項１２】制限陰性または制限欠失菌株が粘液細
菌ＤＮＡ断片のクローニングのための宿主生物として、
または接合ＤＮＡ転移の範囲内の供与生物として使用さ
れる請求項５記載の方法。
【請求項１３】粘液細菌ＤＮＡ断片のクローニングが
粘液細菌標的生物と接合様情報交換し得る供与生物内で
直接行われる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】粘液細菌細胞が接合ＤＮＡ転移の直前
に短時間の熱処理に晒される請求項５記載の方法。
【請求項１５】熱処理が３５℃ないし６０℃の温度で
１ないし１２０分の間行われる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】相同ＤＮＡ領域を含む粘液細菌細胞の
形質転換の際に、粘液細菌の染色体上に存在する構造要
素または特定の転移作用とは無関係に、挿入されたＤＮ
Ａと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性により
正確に規定される部位で相同的組換えを介して前記粘液
細菌のゲノム中に組み込まれるべき上記ＤＮＡの組み込
みが起こるような程度に、粘液細菌ゲノム内の相当する
ＤＮＡ領域と相同性を有する組み込まれるべきＤＮＡ、
またはそのようなＤＮＡ配列により挟まれている組み込
まれるべきＤＮＡを含む、粘液細菌のゲノム内の規定さ
れた部位に遺伝物質の組み込みを可能にする組換えＤＮ
Ａ分子。
【請求項１７】前記相同ＤＮＡ部分と粘液細菌の染色
体の相当する領域との間の相同性の度合いが６０％と１
００％の間である請求項１６記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１８】前記相同ＤＮＡ部分が少なくとも１０
０Ｂｐの領域からなる請求項１６記載の組換えＤＮＡ分
子。
【請求項１９】組み込まれるべき前記ＤＮＡ配列自体
が細菌のゲノム内の相当するＤＮＡ領域と十分大きな相
同性を既に有し、このＤＮＡ配列と上記相同ゲノムＤＮ
Ａとの直接交換が相同的組換えにより起こり得る請求項
１６記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２０】挿入されるべき前記ＤＮＡが二本鎖Ｄ
ＮＡである請求項１６記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２１】挿入されるべき前記ＤＮＡが一本鎖Ｄ
ＮＡである請求項１６記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２２】挿入されるべき前記ＤＮＡが粘液細菌
の細胞において機能し得る発現配列に操作可能な様式で
結合されている発現性ＤＮＡである請求項１６記載の組
換えＤＮＡ分子。
【請求項２３】前記フランキングＤＮＡ部分が環の形
態に閉じられているＤＮＡ分子の成分としてユニットに
一緒に融合されている請求項１６記載の組換えＤＮＡ分
子。
【請求項２４】前記相同ＤＮＡ部分が粘液細菌ゲノム
自体に由来する請求項１６記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２５】請求項１６ないし２４のいずれか１項
に記載の組換えＤＮＡ分子を含むクローニングベクタ
ー。
【請求項２６】挿入されるべきＤＮＡの他に、相同ま
たは実質的に相同なＤＮＡ部分、ならびに粘液細菌細胞
への転移に適当なトランスファー機能（ｔｒａ）および
移動機能（ｍｏｂ）を含む、供与生物から受容粘液細菌
への接合転移のためのプラスミドＤＮＡ。
【請求項２７】請求項１６ないし２４のいずれか１項
に記載の組換えＤＮＡ分子を含む請求項２６記載のプラ
スミドＤＮＡ。
【請求項２８】相同ＤＮＡ領域を含む粘液細菌ゲノム
の形質転換の際に、粘液細菌の染色体上に存在する構造
要素または特定の転移作用とは無関係に、挿入されたＤ
ＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する相同性によ
り規定される部位で相同的組換えを介して前記細菌のゲ
ノム中に上記ＤＮＡの組み込みが起こるような程度に、
粘液細菌のゲノム内の相当するＤＮＡ領域と相同性を有
する粘液細菌のゲノム中に組み込まれるべきＤＮＡを、
（ａ）適当な供給源から単離するか、または（ｂ）組み
込まれるべき上記ＤＮＡが、粘液細菌の染色体上の相当
する領域に相同であるか、または少なくとも実質的に相
同である部分を自然に含まない場合には、このＤＮＡを
相当する相同または実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自
体公知のｒＤＮＡ技術を用いて人工的に結合する、請求
項１６記載の組換えＤＮＡ分子の製造方法。
【請求項２９】挿入されるべき前記ＤＮＡがプラスミ
ド上に位置し、そして相同ＤＮＡ配列があらゆる所望の
部位でプラスミドＤＮＡ内にクローン化されるが、しか
しそれにより挿入されるべきＤＮＡの機能的完全性を破
壊することがない請求項２８記載の方法。
【請求項３０】（ａ₁）粘液細菌の染色体上の相当す
る領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相同
であるＤＮＡ部分を１つ以上自然に含む、同種もしくは
異種由来の遺伝物質または同種および異種由来の遺伝物
質の組合せ、または（ａ₂）粘液細菌の染色体上の相当
する領域と相同であるか、または少なくとも実質的に相
同である部分を自然に含まないが、そのような相同また
は実質的に相同なＤＮＡ部分にそれ自体公知のｒＤＮＡ
技術を用いて人工的に結合されている遺伝物質、を粘液
細菌の細胞中に挿入し、そして粘液細菌の染色体上に存
在する構造要素または特定の転移作用とは無関係に、挿
入されたＤＮＡと細菌に固有のＤＮＡとの間に存在する
相同性により正確に規定される部位で相同的組換えを介
して前記粘液細菌の染色体中に組み込み、そして（ｂ）
陽性形質転換体をそれ自体公知の選択方法を用いて選択
し、そして純粋な培養物として培養する、ことからなる
粘液細菌目の遺伝子的に改変された細菌の作出方法。
【請求項３１】請求項１ないし１５および３０のいず
れか１項に記載の方法により作出された遺伝子的に改変
された粘液細菌細胞。
【請求項３２】相同的組換えを介して粘液細菌のゲノ
ム内に組み込まれた同種および／または異種由来の外来
ＤＮＡを含むソランジウム／ポリアンジウム群の遺伝子
的に改変された粘液細菌細胞。