JPH05202099A - 免疫学的検出方法 - Google Patents
免疫学的検出方法Info
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/32—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Bacillus (G)
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-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】害虫の中腸の刷子縁膜上に存在するバチラス・
スリンギエンシス（Ｂｔ）δ内毒素に対する結合性タン
パク質（ＢＰ）と特異的に反応する抗体を提供し、抗体
と毒素、毒素とＢＰおよび抗体とＢＰの結合の免疫学的
検出を可能にする。 【構成】Ｂｔδ内毒素およびその誘導体に対するＢＰと
特異的に反応する抗体および抗イディオタイプ抗体、該
抗体を含む試験キット、Ｂｔδ内毒素の単離方法および
そのＢｔδ内毒素、前記抗体または試験キットを用いる
以下の方法：ＢＰを認識するＢｔδ内毒素を同定する方
法，存在するＢＰの量を決定する方法，有害生物防除に
おける耐性発生の可能性を減らす方法，異種ＢＰの関連
の程度を決定する方法，異なる昆虫における相当する毒
素に対するＢＰの有効性および近づきやすさを決定する
方法，ＢＰまたは結合性部位の欠如に起因する耐性を分
析する方法。
スリンギエンシス（Ｂｔ）δ内毒素に対する結合性タン
パク質（ＢＰ）と特異的に反応する抗体を提供し、抗体
と毒素、毒素とＢＰおよび抗体とＢＰの結合の免疫学的
検出を可能にする。 【構成】Ｂｔδ内毒素およびその誘導体に対するＢＰと
特異的に反応する抗体および抗イディオタイプ抗体、該
抗体を含む試験キット、Ｂｔδ内毒素の単離方法および
そのＢｔδ内毒素、前記抗体または試験キットを用いる
以下の方法：ＢＰを認識するＢｔδ内毒素を同定する方
法，存在するＢＰの量を決定する方法，有害生物防除に
おける耐性発生の可能性を減らす方法，異種ＢＰの関連
の程度を決定する方法，異なる昆虫における相当する毒
素に対するＢＰの有効性および近づきやすさを決定する
方法，ＢＰまたは結合性部位の欠如に起因する耐性を分
析する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はバチラス・スリンギエン
シス(Bacillus thringiensis) δ内毒素およびそれらの
誘導体に対する結合性タンパク質と特異的に反応する抗
体に関する。本発明はさらに、バチラス・スリンギエン
シスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合性タン
パク質と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体に関す
る。本発明はまた、新規抗体を含む試験キットを提供す
る。本発明はさらに、新規バチラス・スリンギエンシス
δ内毒素の単離方法、該新規バチラス・スリンギエンシ
スδ内毒素、新規結合性タンパク質を認識する新規バチ
ラス・スリンギエンシスδ内毒素を同定する方法、その
新規バチラス・スリンギエンシスδ内毒素、存在する結
合性タンパク質の量を決定する方法、および有害生物防
除における耐性発生の可能性を減らす方法に関する。本
発明はさらに、毒素結合性タンパク質の免疫学的交差反
応性を分析して、それらの関連の程度を決定するため
の、および異なる昆虫における相当する毒素に対する結
合性タンパク質の有効性および近づきやすさを決定する
ための新規抗体および試験キットの使用方法に関する。
本発明はまた、結合性タンパク質または結合性部位の欠
如に起因し得る耐性を分析するための新規抗体の使用方
法に関する。
シス(Bacillus thringiensis) δ内毒素およびそれらの
誘導体に対する結合性タンパク質と特異的に反応する抗
体に関する。本発明はさらに、バチラス・スリンギエン
シスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合性タン
パク質と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体に関す
る。本発明はまた、新規抗体を含む試験キットを提供す
る。本発明はさらに、新規バチラス・スリンギエンシス
δ内毒素の単離方法、該新規バチラス・スリンギエンシ
スδ内毒素、新規結合性タンパク質を認識する新規バチ
ラス・スリンギエンシスδ内毒素を同定する方法、その
新規バチラス・スリンギエンシスδ内毒素、存在する結
合性タンパク質の量を決定する方法、および有害生物防
除における耐性発生の可能性を減らす方法に関する。本
発明はさらに、毒素結合性タンパク質の免疫学的交差反
応性を分析して、それらの関連の程度を決定するため
の、および異なる昆虫における相当する毒素に対する結
合性タンパク質の有効性および近づきやすさを決定する
ための新規抗体および試験キットの使用方法に関する。
本発明はまた、結合性タンパク質または結合性部位の欠
如に起因し得る耐性を分析するための新規抗体の使用方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】胞子形成の間に、バチラス・スリンギエ
ンシスは特定の昆虫の幼虫に致死的であるタンパク質を
含む結晶封入体を産生する。これらのタンパク質はδ内
毒素または殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）として知ら
れる。異なるＩＣＰは文献〔８，以下〔 〕内の数字は
本明細書末尾にまとめて示す表２の参考文献の番号と一
致する〕のスキームに従って分類され得る。公知ＩＣＰ
ははＣｒｙＩＡ（ａ）、ＣｒｙＩＡ（ｂ）およびＣｒｙ
ＩＣ毒素を包含する。天然の結晶タンパク質は不活性の
毒素前駆体であり、幼虫による摂取の後に昆虫のアルカ
リ性の腸内で溶解され、そしてタンパク質が加水分解さ
れて活性化される。活性化された毒素は標的昆虫の中腸
上皮細胞の刷子縁膜(brush border membrane, ＢＢＭ）
上の１種またはそれ以上のタンパク質に結合し、そして
前記腸の上皮細胞を破壊し、そして幼虫を死滅させる。
生物学的有害生物防除において、バチラス・スリンギエ
ンシス毒素は胞子懸濁液の形態で主として使用される。
しかしながら、異なる植物は、有害生物に対する耐性を
それらに付与するためにバチラス・スリンギエンシス毒
素遺伝子で形質転換されている（ＥＰ２９２４３５，Ｅ
Ｐ３１７５１１参照）。そのうちに有害生物は、毒素結
合性タンパク質のＢＢＭに結合する能力に関連する、毒
素に対する耐性を発達させる〔４，１２〕。毒素上のあ
る種の決定基はバチラス・スリンギエンシス毒素の特異
性を決定する。これらの決定基は活性化毒素のＣ末端の
半分の可変領域に局在されている〔２，５，１４〕。特
定の毒素に対する結合性タンパク質が失われるか、また
はその認識領域が特定の毒素をもはや結合しないように
変更されるならば、そのとき昆虫はその毒素に対する感
受性を失い、そして耐性になる。異なる結合性タンパク
質に結合する異なる毒素の使用により、耐性の迅速な発
生を未然に防ぐことが可能になる。毒素と相当する結合
性タンパク質の相互作用に関する知識は標的昆虫の中腸
上皮のＢＢＭ中の異なる結合性タンパク質を占有するそ
れらの毒素を選択し、そして組合せることを可能にする
（ＥＰ４００２４６）。バチラス・スリンギエンシスお
よび植物はそのように組み合わせた毒素の相当する遺伝
子で形質転換され得る。それ故に昆虫が組換えバチラス
・スリンギエンシスまたはトランスジェニック植物に耐
性であるような可能性は顕著に低下する。なぜならば、
異なる結合性タンパク質に結合する毒素に同時に耐性に
なるには多くの同時突然変異体が必要であるからである
（ＥＰ４００２４６）。毒素と結合性タンパク質との間
の相互作用は、特に免疫学的方法を用いて研究され得
る。そのような方法はかなりの期間、分析のために使用
されてきており、そして抗原と抗体との間の特異的結合
を利用することからなる。抗原、すなわち分析されるべ
き化合物は動物、典型的にはウサギ、マウスまたはラッ
トに数週間の間隔で繰り返し注射される。動物の免疫系
は抗原に特異的に結合し、そしてその結合性領域が抗原
の結合性領域の陰画を構成する抗体を産生する。抗体産
生細胞と典型的にはミエローマ細胞との融合は、それに
よりモノクローナル抗体が産生され得る、いわゆるハイ
ブリドーマ細胞の形成を生じる。使用される方法は文献
に記載され、そして当業者に公知である。
ンシスは特定の昆虫の幼虫に致死的であるタンパク質を
含む結晶封入体を産生する。これらのタンパク質はδ内
毒素または殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）として知ら
れる。異なるＩＣＰは文献〔８，以下〔 〕内の数字は
本明細書末尾にまとめて示す表２の参考文献の番号と一
致する〕のスキームに従って分類され得る。公知ＩＣＰ
ははＣｒｙＩＡ（ａ）、ＣｒｙＩＡ（ｂ）およびＣｒｙ
ＩＣ毒素を包含する。天然の結晶タンパク質は不活性の
毒素前駆体であり、幼虫による摂取の後に昆虫のアルカ
リ性の腸内で溶解され、そしてタンパク質が加水分解さ
れて活性化される。活性化された毒素は標的昆虫の中腸
上皮細胞の刷子縁膜(brush border membrane, ＢＢＭ）
上の１種またはそれ以上のタンパク質に結合し、そして
前記腸の上皮細胞を破壊し、そして幼虫を死滅させる。
生物学的有害生物防除において、バチラス・スリンギエ
ンシス毒素は胞子懸濁液の形態で主として使用される。
しかしながら、異なる植物は、有害生物に対する耐性を
それらに付与するためにバチラス・スリンギエンシス毒
素遺伝子で形質転換されている（ＥＰ２９２４３５，Ｅ
Ｐ３１７５１１参照）。そのうちに有害生物は、毒素結
合性タンパク質のＢＢＭに結合する能力に関連する、毒
素に対する耐性を発達させる〔４，１２〕。毒素上のあ
る種の決定基はバチラス・スリンギエンシス毒素の特異
性を決定する。これらの決定基は活性化毒素のＣ末端の
半分の可変領域に局在されている〔２，５，１４〕。特
定の毒素に対する結合性タンパク質が失われるか、また
はその認識領域が特定の毒素をもはや結合しないように
変更されるならば、そのとき昆虫はその毒素に対する感
受性を失い、そして耐性になる。異なる結合性タンパク
質に結合する異なる毒素の使用により、耐性の迅速な発
生を未然に防ぐことが可能になる。毒素と相当する結合
性タンパク質の相互作用に関する知識は標的昆虫の中腸
上皮のＢＢＭ中の異なる結合性タンパク質を占有するそ
れらの毒素を選択し、そして組合せることを可能にする
（ＥＰ４００２４６）。バチラス・スリンギエンシスお
よび植物はそのように組み合わせた毒素の相当する遺伝
子で形質転換され得る。それ故に昆虫が組換えバチラス
・スリンギエンシスまたはトランスジェニック植物に耐
性であるような可能性は顕著に低下する。なぜならば、
異なる結合性タンパク質に結合する毒素に同時に耐性に
なるには多くの同時突然変異体が必要であるからである
（ＥＰ４００２４６）。毒素と結合性タンパク質との間
の相互作用は、特に免疫学的方法を用いて研究され得
る。そのような方法はかなりの期間、分析のために使用
されてきており、そして抗原と抗体との間の特異的結合
を利用することからなる。抗原、すなわち分析されるべ
き化合物は動物、典型的にはウサギ、マウスまたはラッ
トに数週間の間隔で繰り返し注射される。動物の免疫系
は抗原に特異的に結合し、そしてその結合性領域が抗原
の結合性領域の陰画を構成する抗体を産生する。抗体産
生細胞と典型的にはミエローマ細胞との融合は、それに
よりモノクローナル抗体が産生され得る、いわゆるハイ
ブリドーマ細胞の形成を生じる。使用される方法は文献
に記載され、そして当業者に公知である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の欠点を
解決するためになされたものであり、バチラス・スリン
ギエンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合
性タンパク質と特異的に反応する抗体および抗イディオ
タイプ抗体、該抗体を含む試験キット、これらの抗体お
よび試験キットの使用方法、前記δ内毒素の単離方法、
前記結合性タンパク質を認識するδ内毒素を同定する方
法、それらのδ内毒素、存在する結合性タンパク質の量
を決定する方法、および有害生物防除における耐性発生
の可能性を減らす方法の提供を課題とする。
解決するためになされたものであり、バチラス・スリン
ギエンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合
性タンパク質と特異的に反応する抗体および抗イディオ
タイプ抗体、該抗体を含む試験キット、これらの抗体お
よび試験キットの使用方法、前記δ内毒素の単離方法、
前記結合性タンパク質を認識するδ内毒素を同定する方
法、それらのδ内毒素、存在する結合性タンパク質の量
を決定する方法、および有害生物防除における耐性発生
の可能性を減らす方法の提供を課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、バチラス・ス
リンギエンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する
結合性タンパク質と特異的に反応する抗体に関する。本
発明の好ましい実施態様は、バチラス・スリンギエンシ
スＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対する
結合性タンパク質と特異的に反応する抗体、好ましくは
バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素
およびその誘導体に対するヘリオチス(Heliothis) 結合
性タンパク質と特異的に反応する抗体、とりわけバチラ
ス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素および
その誘導体に対するヘリオチス・ビレッセンス(Helioth
is virescens) １７０ｋＤａ結合性タンパク質と特異的
に反応する抗体に関する。本発明の範囲内で、バチラス
・スリンギエンシスδ内毒素の誘導体は、化学的または
微生物学的性質の変性により得られるこれらの毒素の殺
虫性誘導体を意味するものと理解されるであろう。新規
抗体は、昆虫の中腸のＢＢＭ小胞からバチラス・スリン
ギエンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合
性タンパク質を製造し、そして公知方法〔７〕により前
記抗体を製造するために使用することにより得られる。
操作は、典型的には、（ａ）昆虫の中腸のＢＢＭ小胞か
らバチラス・スリンギエンシスδ内毒素およびそれらの
誘導体に対する結合性タンパク質を製造し、（ｂ）哺乳
動物、例えばウサギ、マウスまたはラットを結合性タン
パク質で免疫化し、そして（ｃ１）バチラス・スリンギ
エンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合性
タンパク質に対して指示される免疫グロブリンを選択す
るか、または（ｃ２）免疫化動物の脾臓細胞を相当する
ミエローマ細胞と融合し、特定のハイブリドーマ細胞を
選択し、そして該ハイブリドーマ細胞を用いて所望の抗
体を製造することからなる。昆虫の中腸からＢＢＭ小胞
の調製は公知である。操作は以下のようであってよい：
第４齢の幼虫を氷上で１５分間冷却する。中腸を次に幼
虫から注意深く除去する。各中腸を縦方向に切断して開
き、次にホイルのリンガー液（１４０ｍＭＮａＣｌ；
９．４ｍＭ ＫＣｌ；３．９５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ
2 Ｏ；３．６ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ；６．５５ｍＭ Ｎａ
2 ＨＰＯ4 ；５．４４ｍＭ ＣａＣｌ2 ，ｐＨ７．２）
ですすぎ腸内容物を除去する。周囲栄養膜の除去後、中
腸を３００ｍＭマンニトール；５ｍＭ ＥＧＴＡ；１７
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中ですぐに凍結し、そ
して使用時まで−７０℃で貯蔵する。ヘリオチス・ビレ
ッセンス、ヘリオチス・ゼア(Heliothis zea) 、スポド
プテラ・リットラリス(Spodoptera littoralis) 、スポ
ドプテラ・エクシグア(S. exigua) およびスポドプテラ
・リトゥラ(S. litura) のＢＢＭ小胞（ＢＢＭＶ）は次
に文献〔１６〕に記載のように以下のプロテアーゼ阻害
剤を用いて調製される：１μｇ／ｍｌロイペプチン、１
μｇ／ｍｌアンチペイン、５μｇ／ｍｌアプロチニン、
１０μｇ／ｍｌダイズからのトリプシン阻害剤、１０μ
ｇ／ｍｌベンズアミジン塩化水素、１μｇ／ｍｌペプス
タチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ。最終ペレットをＰＢＳ中に
再懸濁するか、または４０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＥＧＴＡ、３０
％グリセロールおよび１０ｍＭＣＨＡＰＳを含有する緩
衝液中に溶解させる。ＢＢＭＶのタンパク質含量は標準
としてＢＳＡを用いて文献〔１〕の方法により決定され
る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは文献〔１０〕に従って行われ
る。ヘリオチス・ビレッセンスからのＣｒｙＩＡ（ｂ）
結合性タンパク質は文献〔１０〕の緩衝液系中で調製Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより典型的に得られる。電気泳動の後
に、１つの列をクーマシーブルー溶液で染色し、結合性
タンパク質の位置決定する。１７０ｋＤａ結合性タンパ
ク質を含むバンドをゲルから切出し、そして小片に切断
する。次いで該小片を細かい金属ネットに通してつぶ
し、注射され得る懸濁液を得る。
リンギエンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する
結合性タンパク質と特異的に反応する抗体に関する。本
発明の好ましい実施態様は、バチラス・スリンギエンシ
スＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対する
結合性タンパク質と特異的に反応する抗体、好ましくは
バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素
およびその誘導体に対するヘリオチス(Heliothis) 結合
性タンパク質と特異的に反応する抗体、とりわけバチラ
ス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素および
その誘導体に対するヘリオチス・ビレッセンス(Helioth
is virescens) １７０ｋＤａ結合性タンパク質と特異的
に反応する抗体に関する。本発明の範囲内で、バチラス
・スリンギエンシスδ内毒素の誘導体は、化学的または
微生物学的性質の変性により得られるこれらの毒素の殺
虫性誘導体を意味するものと理解されるであろう。新規
抗体は、昆虫の中腸のＢＢＭ小胞からバチラス・スリン
ギエンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合
性タンパク質を製造し、そして公知方法〔７〕により前
記抗体を製造するために使用することにより得られる。
操作は、典型的には、（ａ）昆虫の中腸のＢＢＭ小胞か
らバチラス・スリンギエンシスδ内毒素およびそれらの
誘導体に対する結合性タンパク質を製造し、（ｂ）哺乳
動物、例えばウサギ、マウスまたはラットを結合性タン
パク質で免疫化し、そして（ｃ１）バチラス・スリンギ
エンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合性
タンパク質に対して指示される免疫グロブリンを選択す
るか、または（ｃ２）免疫化動物の脾臓細胞を相当する
ミエローマ細胞と融合し、特定のハイブリドーマ細胞を
選択し、そして該ハイブリドーマ細胞を用いて所望の抗
体を製造することからなる。昆虫の中腸からＢＢＭ小胞
の調製は公知である。操作は以下のようであってよい：
第４齢の幼虫を氷上で１５分間冷却する。中腸を次に幼
虫から注意深く除去する。各中腸を縦方向に切断して開
き、次にホイルのリンガー液（１４０ｍＭＮａＣｌ；
９．４ｍＭ ＫＣｌ；３．９５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ
2 Ｏ；３．６ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ；６．５５ｍＭ Ｎａ
2 ＨＰＯ4 ；５．４４ｍＭ ＣａＣｌ2 ，ｐＨ７．２）
ですすぎ腸内容物を除去する。周囲栄養膜の除去後、中
腸を３００ｍＭマンニトール；５ｍＭ ＥＧＴＡ；１７
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中ですぐに凍結し、そ
して使用時まで−７０℃で貯蔵する。ヘリオチス・ビレ
ッセンス、ヘリオチス・ゼア(Heliothis zea) 、スポド
プテラ・リットラリス(Spodoptera littoralis) 、スポ
ドプテラ・エクシグア(S. exigua) およびスポドプテラ
・リトゥラ(S. litura) のＢＢＭ小胞（ＢＢＭＶ）は次
に文献〔１６〕に記載のように以下のプロテアーゼ阻害
剤を用いて調製される：１μｇ／ｍｌロイペプチン、１
μｇ／ｍｌアンチペイン、５μｇ／ｍｌアプロチニン、
１０μｇ／ｍｌダイズからのトリプシン阻害剤、１０μ
ｇ／ｍｌベンズアミジン塩化水素、１μｇ／ｍｌペプス
タチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ。最終ペレットをＰＢＳ中に
再懸濁するか、または４０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＥＧＴＡ、３０
％グリセロールおよび１０ｍＭＣＨＡＰＳを含有する緩
衝液中に溶解させる。ＢＢＭＶのタンパク質含量は標準
としてＢＳＡを用いて文献〔１〕の方法により決定され
る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは文献〔１０〕に従って行われ
る。ヘリオチス・ビレッセンスからのＣｒｙＩＡ（ｂ）
結合性タンパク質は文献〔１０〕の緩衝液系中で調製Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより典型的に得られる。電気泳動の後
に、１つの列をクーマシーブルー溶液で染色し、結合性
タンパク質の位置決定する。１７０ｋＤａ結合性タンパ
ク質を含むバンドをゲルから切出し、そして小片に切断
する。次いで該小片を細かい金属ネットに通してつぶ
し、注射され得る懸濁液を得る。
【０００５】本発明の別の目的は、バチラス・スリンギ
エンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合性
タンパク質と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体を
提供することである。本発明の好ましい実施態様は、バ
チラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素お
よびその誘導体に対する結合性タンパク質と特異的に反
応する抗イディオタイプ抗体に関し、好ましくは、バチ
ラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素およ
びその誘導体に対するヘリオチス結合性タンパク質と特
異的に反応する抗イディオタイプ抗体、より好ましくは
バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素
およびその誘導体に対するヘリオチス・ビレッセンス１
７０ｋＤａ結合性タンパク質と特異的に反応する抗イデ
ィオタイプ抗体に関する。実際の抗原に対して生産され
た抗体がそれ自体、動物を免疫化するための抗原として
使用される場合に、抗イディオタイプ抗体は動物の免疫
系により産生される。抗イディオタイプ抗体の結合性領
域は最初の抗原の結合性領域の１つの像である。本発明
の範囲内で特に好ましいのは、結合性タンパク質の特定
領域と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体である。
本発明の抗イディオタイプ抗体は、天然の活性化毒素に
対する抗体を生産し、そしてこれらの抗体を用いて公知
方法により抗イディオタイプ抗体を製造することにより
得られる。操作は典型的には、天然の活性化毒素に対す
る抗体を生産し、そしてこれらの抗体で繰り返し免疫化
することからなり得る。バチラス・スリンギエンシスお
よびその誘導体に対する結合性タンパク質に対して指示
される免疫グロブリンはその後に免疫化動物の血清から
選択により得られるか、または免疫化動物の脾臓細胞が
相当するミエローマ細胞と融合され、特定のハイブリド
ーマ細胞が選択され、そして所望の抗イディオタイプ抗
体が上記ハイブリドーマ細胞を用いて産生される。天然
の活性化毒素は、例えば以下の操作により得られる：バ
チラス・スリンギエンシスＨＤ１ＣｒｙＩＢをプラスミ
ドｐＸＩ９３に対してＥＰ３４２６３３に記載された方
法に従ってｐＸＩ９３、ｐＸＩ９４およびｐＸＩ９５の
一つで形質転換し、次いで培養する。細胞溶菌後、残留
未溶菌細胞を細胞ソニケーターで破壊し、そして胞子結
晶の混合物を集める。結晶を文献〔３〕の方法に従って
溶解し、そして０．０５％トリプシンおよび１０ｍＭト
リエタノールアミン（ｐＨ１０．２）を含有する緩衝液
（８ｇ／ｌ ＮａＣｌ，０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ，０．０
５ｇ／ｌ ＮａＨ2 ＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ，１ｇ／ｌグルコ
ース，１ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ3 ，０．６８ｇ／ｌ クエ
ン酸ナトリウムｐＨ６．５５）中２８℃で３時間の保温
により活性化する。ＣｒｙＩＣ毒素の場合、ＤＴＴを最
終濃度５ｍＭまで緩衝液に添加する。残留胞子または未
溶解結晶を遠心分離（１００００×ｇ，１０分，４℃）
により除去する。ＣｒｙＩＡ（ｂ）毒素３０μｇを用い
て上記免疫化操作を行うことにより天然の活性化Ｃｒｙ
ＩＡ（ｂ）毒素に対して抗体が生産される。ブースター
注射を４週、３カ月および４カ月後に行う。注射は皮下
に行われる。免疫化１２日後、次いで２週間毎に血液試
料を採取する。架橋アガロースが結合しているプロテイ
ンＡを含むカラムで溶離液０．１Ｍ酢酸および０．１５
Ｍ ＮａＣｌを用いてＩｇＧを分離する。バチラス・ス
リンギエンシスδ内毒素およびその誘導体に対する結合
性タンパク質の特定領域と特異的に反応する抗イディオ
タイプ抗体は、（ａ）天然の活性化バチラス・スリンギ
エンシスδ内毒素に対する抗体を生産し、（ｂ）該抗体
から、サブトラクティブアフィニティークロマトグラフ
ィー(subtractive affinity chromatography，消去式ア
フィニティークロマトグラフィー)により毒素の特定領
域に対して指示されない抗体を分離し、（ｃ）毒素の特
定領域に対して指示される抗体で繰り返し免疫化し、そ
して（ｄ１）バチラス・スリンギエンシスδ内毒素およ
びそれらの誘導体に対する結合性タンパク質の特定領域
に対して指示される免疫グロブリンを選択するか、また
は（ｄ２）免疫化動物の脾臓細胞を相当するミエローマ
細胞と融合し、特定のハイブリドーマ細胞を選択し、そ
して所望の抗イディオタイプ抗体を上記ハイブリドーマ
細胞を用いて産生することにより得られる。サブトラク
ティブアフィニティークロマトグラフィーにおいて、特
定の毒素と特異的に反応し、そして上記毒素の決定基だ
けを認識する抗体は、別の毒素またはその他の多数の毒
素と交差反応するような抗体から分離される。これは、
上記毒素が結合されているマトリックスが充填されてい
るカラムにこの特定の活性化毒素に対する抗体を通すこ
とにより行われる。マトリックスに結合した毒素は全体
の毒素に対して指示される抗体の混合物を結合する。こ
れらの抗体のいくつかはその他の毒素と交差反応する。
これらの毒素を分離するために、抗体混合物はカラムか
ら通常ジエチルアミンおよびデスオキシコレートの溶液
を用いて溶離され、次いで第２の毒素が結合されている
か、または多数の毒素が結合されているマトリックスが
充填されている第２のカラムに通される。毒素または異
なる毒素の混合物は、特定毒素の特定領域を認識する全
ての抗体が結合され、特定毒素の特定領域に特異的に結
合する抗体が流出液中に見出されるように選択される。
プロテインＡに結合した架橋アガロースがマトリックス
として典型的に使用され得る。適当な材料は文献に記載
されている。
エンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合性
タンパク質と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体を
提供することである。本発明の好ましい実施態様は、バ
チラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素お
よびその誘導体に対する結合性タンパク質と特異的に反
応する抗イディオタイプ抗体に関し、好ましくは、バチ
ラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素およ
びその誘導体に対するヘリオチス結合性タンパク質と特
異的に反応する抗イディオタイプ抗体、より好ましくは
バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素
およびその誘導体に対するヘリオチス・ビレッセンス１
７０ｋＤａ結合性タンパク質と特異的に反応する抗イデ
ィオタイプ抗体に関する。実際の抗原に対して生産され
た抗体がそれ自体、動物を免疫化するための抗原として
使用される場合に、抗イディオタイプ抗体は動物の免疫
系により産生される。抗イディオタイプ抗体の結合性領
域は最初の抗原の結合性領域の１つの像である。本発明
の範囲内で特に好ましいのは、結合性タンパク質の特定
領域と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体である。
本発明の抗イディオタイプ抗体は、天然の活性化毒素に
対する抗体を生産し、そしてこれらの抗体を用いて公知
方法により抗イディオタイプ抗体を製造することにより
得られる。操作は典型的には、天然の活性化毒素に対す
る抗体を生産し、そしてこれらの抗体で繰り返し免疫化
することからなり得る。バチラス・スリンギエンシスお
よびその誘導体に対する結合性タンパク質に対して指示
される免疫グロブリンはその後に免疫化動物の血清から
選択により得られるか、または免疫化動物の脾臓細胞が
相当するミエローマ細胞と融合され、特定のハイブリド
ーマ細胞が選択され、そして所望の抗イディオタイプ抗
体が上記ハイブリドーマ細胞を用いて産生される。天然
の活性化毒素は、例えば以下の操作により得られる：バ
チラス・スリンギエンシスＨＤ１ＣｒｙＩＢをプラスミ
ドｐＸＩ９３に対してＥＰ３４２６３３に記載された方
法に従ってｐＸＩ９３、ｐＸＩ９４およびｐＸＩ９５の
一つで形質転換し、次いで培養する。細胞溶菌後、残留
未溶菌細胞を細胞ソニケーターで破壊し、そして胞子結
晶の混合物を集める。結晶を文献〔３〕の方法に従って
溶解し、そして０．０５％トリプシンおよび１０ｍＭト
リエタノールアミン（ｐＨ１０．２）を含有する緩衝液
（８ｇ／ｌ ＮａＣｌ，０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ，０．０
５ｇ／ｌ ＮａＨ2 ＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ，１ｇ／ｌグルコ
ース，１ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ3 ，０．６８ｇ／ｌ クエ
ン酸ナトリウムｐＨ６．５５）中２８℃で３時間の保温
により活性化する。ＣｒｙＩＣ毒素の場合、ＤＴＴを最
終濃度５ｍＭまで緩衝液に添加する。残留胞子または未
溶解結晶を遠心分離（１００００×ｇ，１０分，４℃）
により除去する。ＣｒｙＩＡ（ｂ）毒素３０μｇを用い
て上記免疫化操作を行うことにより天然の活性化Ｃｒｙ
ＩＡ（ｂ）毒素に対して抗体が生産される。ブースター
注射を４週、３カ月および４カ月後に行う。注射は皮下
に行われる。免疫化１２日後、次いで２週間毎に血液試
料を採取する。架橋アガロースが結合しているプロテイ
ンＡを含むカラムで溶離液０．１Ｍ酢酸および０．１５
Ｍ ＮａＣｌを用いてＩｇＧを分離する。バチラス・ス
リンギエンシスδ内毒素およびその誘導体に対する結合
性タンパク質の特定領域と特異的に反応する抗イディオ
タイプ抗体は、（ａ）天然の活性化バチラス・スリンギ
エンシスδ内毒素に対する抗体を生産し、（ｂ）該抗体
から、サブトラクティブアフィニティークロマトグラフ
ィー(subtractive affinity chromatography，消去式ア
フィニティークロマトグラフィー)により毒素の特定領
域に対して指示されない抗体を分離し、（ｃ）毒素の特
定領域に対して指示される抗体で繰り返し免疫化し、そ
して（ｄ１）バチラス・スリンギエンシスδ内毒素およ
びそれらの誘導体に対する結合性タンパク質の特定領域
に対して指示される免疫グロブリンを選択するか、また
は（ｄ２）免疫化動物の脾臓細胞を相当するミエローマ
細胞と融合し、特定のハイブリドーマ細胞を選択し、そ
して所望の抗イディオタイプ抗体を上記ハイブリドーマ
細胞を用いて産生することにより得られる。サブトラク
ティブアフィニティークロマトグラフィーにおいて、特
定の毒素と特異的に反応し、そして上記毒素の決定基だ
けを認識する抗体は、別の毒素またはその他の多数の毒
素と交差反応するような抗体から分離される。これは、
上記毒素が結合されているマトリックスが充填されてい
るカラムにこの特定の活性化毒素に対する抗体を通すこ
とにより行われる。マトリックスに結合した毒素は全体
の毒素に対して指示される抗体の混合物を結合する。こ
れらの抗体のいくつかはその他の毒素と交差反応する。
これらの毒素を分離するために、抗体混合物はカラムか
ら通常ジエチルアミンおよびデスオキシコレートの溶液
を用いて溶離され、次いで第２の毒素が結合されている
か、または多数の毒素が結合されているマトリックスが
充填されている第２のカラムに通される。毒素または異
なる毒素の混合物は、特定毒素の特定領域を認識する全
ての抗体が結合され、特定毒素の特定領域に特異的に結
合する抗体が流出液中に見出されるように選択される。
プロテインＡに結合した架橋アガロースがマトリックス
として典型的に使用され得る。適当な材料は文献に記載
されている。
【０００６】本発明の本質的な面は、抗体の毒素への結
合、毒素の結合性タンパク質への結合および抗体の結合
性タンパク質への結合の検出にあり、該検出は当業者に
公知である通常の方法によりオートラジオグラフィック
的または免疫学的に行われる（例えば文献〔７〕）。ヘ
リオチス・ビレッセンスのＣｒｙＩＡ（ｂ）ＢＰへの抗
体の結合は通常次のように行われ得る： （ａ）ＢＢＭタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解像
し、そしてエレクトロトランスファーにより膜に移す
（０．４Ａ；１時間）。非特異的結合をＴＢＳＴＭ中で
の保温（１時間）によりブロックする。次に膜をＴＢＳ
ＴＭ中の抗体の適当な希釈溶液と少なくとも２時間保温
する。その後に未結合抗体をＴＢＳＴで洗浄して除去
し、アルカリホスファターゼで標識したヤギ抗マウス抗
体と膜を保温する。未結合抗体をＴＢＳＴで洗浄して除
去する。結合した抗体を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ，１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 （ｐＨ９．８）中でのＮＢＴおよびＢＣ
ＩＰとの反応により可視化する。 （ｂ）ＢＢＭタンパク質をいわゆるスロット−ブロット
装置(Schleicher and Schull) を用いて膜に移す。ＴＢ
ＳＴＭ中での飽和の後、膜をＴＢＳＴＭ中の抗体の適当
な希釈溶液と保温する。洗浄して未結合抗体の除去後、
膜をこの抗体に対して指示される 125Ｉ標識抗体と保温
する。次に、未結合抗体を洗浄により除去し、そしてオ
ートラジオグラフ信号の強度を測定する。
合、毒素の結合性タンパク質への結合および抗体の結合
性タンパク質への結合の検出にあり、該検出は当業者に
公知である通常の方法によりオートラジオグラフィック
的または免疫学的に行われる（例えば文献〔７〕）。ヘ
リオチス・ビレッセンスのＣｒｙＩＡ（ｂ）ＢＰへの抗
体の結合は通常次のように行われ得る： （ａ）ＢＢＭタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解像
し、そしてエレクトロトランスファーにより膜に移す
（０．４Ａ；１時間）。非特異的結合をＴＢＳＴＭ中で
の保温（１時間）によりブロックする。次に膜をＴＢＳ
ＴＭ中の抗体の適当な希釈溶液と少なくとも２時間保温
する。その後に未結合抗体をＴＢＳＴで洗浄して除去
し、アルカリホスファターゼで標識したヤギ抗マウス抗
体と膜を保温する。未結合抗体をＴＢＳＴで洗浄して除
去する。結合した抗体を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ，１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 （ｐＨ９．８）中でのＮＢＴおよびＢＣ
ＩＰとの反応により可視化する。 （ｂ）ＢＢＭタンパク質をいわゆるスロット−ブロット
装置(Schleicher and Schull) を用いて膜に移す。ＴＢ
ＳＴＭ中での飽和の後、膜をＴＢＳＴＭ中の抗体の適当
な希釈溶液と保温する。洗浄して未結合抗体の除去後、
膜をこの抗体に対して指示される 125Ｉ標識抗体と保温
する。次に、未結合抗体を洗浄により除去し、そしてオ
ートラジオグラフ信号の強度を測定する。
【０００７】本発明の別の目的は新規抗体に基づいた試
験キットの提供である。本発明の特定の実施態様は慣用
のイムノアッセイ、通常ラジオイムノアッセイ、酵素結
合イムノアッセイおよび化学発光アッセイからなる群か
ら選択される一つに基づいた試験キットに関する。その
ようなキットのレシピは選択された検出方法に依存し、
そして当業者には公知である。
験キットの提供である。本発明の特定の実施態様は慣用
のイムノアッセイ、通常ラジオイムノアッセイ、酵素結
合イムノアッセイおよび化学発光アッセイからなる群か
ら選択される一つに基づいた試験キットに関する。その
ようなキットのレシピは選択された検出方法に依存し、
そして当業者には公知である。
【０００８】本発明はまた、（ａ）抗体を結合すること
により、与えられたδ内毒素に対する結合性タンパク質
を飽和し、そして（ｂ）前処理した中腸膜タンパク質の
その他の結合性タンパク質に新規毒素を結合することか
らなる、新規バチラス・スリンギエンシスδ内毒素を同
定する方法に関する。本発明はまた、公知毒素に対する
サブトラクティブアフィニティークロマトグラフィーに
より調製された特異的抗体をマトリックスに結合し、そ
して１株または複数の株の全体の毒素と前記マトリック
スを保温することからなり、その他の構造的特徴を有す
る新規毒素が抗体により認識されず、それ故に結合しな
いで、溶液中に残る、新規バチラス・スリンギエンシス
δ内毒素を単離するもう一つの方法を提供する。さらに
本発明は得られた新規毒素に関する。本発明の範囲内で
「新規」バチラス・スリンギエンシスδ内毒素という用
語は今まで同定されていなかったか、または同定できな
かったδ内毒素を意味すると理解されるであろう。本発
明はさらに、公知δ内毒素に対する異なる昆虫のＢＢＭ
Ｖの結合性タンパク質を該δ内毒素との結合により飽和
し、そして新規毒素が依然として結合するか否かを調べ
ることからなる、新規結合性タンパク質を認識する新規
バチラス・スリンギエンシスδ内毒素を同定する方法を
提供する。本発明はまた、本明細書に記載された方法に
より同定され得る新規毒素に関する。
により、与えられたδ内毒素に対する結合性タンパク質
を飽和し、そして（ｂ）前処理した中腸膜タンパク質の
その他の結合性タンパク質に新規毒素を結合することか
らなる、新規バチラス・スリンギエンシスδ内毒素を同
定する方法に関する。本発明はまた、公知毒素に対する
サブトラクティブアフィニティークロマトグラフィーに
より調製された特異的抗体をマトリックスに結合し、そ
して１株または複数の株の全体の毒素と前記マトリック
スを保温することからなり、その他の構造的特徴を有す
る新規毒素が抗体により認識されず、それ故に結合しな
いで、溶液中に残る、新規バチラス・スリンギエンシス
δ内毒素を単離するもう一つの方法を提供する。さらに
本発明は得られた新規毒素に関する。本発明の範囲内で
「新規」バチラス・スリンギエンシスδ内毒素という用
語は今まで同定されていなかったか、または同定できな
かったδ内毒素を意味すると理解されるであろう。本発
明はさらに、公知δ内毒素に対する異なる昆虫のＢＢＭ
Ｖの結合性タンパク質を該δ内毒素との結合により飽和
し、そして新規毒素が依然として結合するか否かを調べ
ることからなる、新規結合性タンパク質を認識する新規
バチラス・スリンギエンシスδ内毒素を同定する方法を
提供する。本発明はまた、本明細書に記載された方法に
より同定され得る新規毒素に関する。
【０００９】本発明の種々の面のうちの別のもう一つに
おいて、アミノ酸配列からヌクレオチド配列全体または
一部を誘導し、そして公知方法により相当する遺伝子を
合成するか、またはプローブを用いて天然に生じる遺伝
子を同定して次に上記遺伝子を単離することにより新規
毒素をコードする遺伝子を製造する方法を提供する。本
発明また、供与バクテリアの遺伝子バンクを発現し、発
現産物を上記新規毒素に対する抗体で調べ、そして当業
者には周知である慣用方法により所望の遺伝子を陽性ク
ローンから単離することからなる新規毒素に対する遺伝
子の製造方法を含む。遺伝子を単離するその他の全ての
方法が適用可能であることは容易に理解されるであろ
う。
おいて、アミノ酸配列からヌクレオチド配列全体または
一部を誘導し、そして公知方法により相当する遺伝子を
合成するか、またはプローブを用いて天然に生じる遺伝
子を同定して次に上記遺伝子を単離することにより新規
毒素をコードする遺伝子を製造する方法を提供する。本
発明また、供与バクテリアの遺伝子バンクを発現し、発
現産物を上記新規毒素に対する抗体で調べ、そして当業
者には周知である慣用方法により所望の遺伝子を陽性ク
ローンから単離することからなる新規毒素に対する遺伝
子の製造方法を含む。遺伝子を単離するその他の全ての
方法が適用可能であることは容易に理解されるであろ
う。
【００１０】新規抗体は耐性を分析することを可能にす
る。従って、特定の結合性タンパク質が存在するか否か
を調べることが可能である。さらに、新規抗イディオタ
イプ抗体を用いて、存在する結合性タンパク質の結合部
位が変化しているか否かを決定することができる。よっ
て、本発明は、結合性タンパク質の欠如または結合性部
位の欠如に起因し得る耐性を分析するための新規抗体の
使用方法、ならびに結合性部位または結合性タンパク質
の数の変化を決定し、そしてそれに応じて適当な毒素ま
たは毒素の混合物を用いることからなる、有害生物防除
における耐性発生の可能性を減らす方法に関する。
る。従って、特定の結合性タンパク質が存在するか否か
を調べることが可能である。さらに、新規抗イディオタ
イプ抗体を用いて、存在する結合性タンパク質の結合部
位が変化しているか否かを決定することができる。よっ
て、本発明は、結合性タンパク質の欠如または結合性部
位の欠如に起因し得る耐性を分析するための新規抗体の
使用方法、ならびに結合性部位または結合性タンパク質
の数の変化を決定し、そしてそれに応じて適当な毒素ま
たは毒素の混合物を用いることからなる、有害生物防除
における耐性発生の可能性を減らす方法に関する。
【００１１】本発明はまた、前記結合性タンパク質に対
する新規抗体または新規抗体を含む試験キットを用い
た、存在する結合性タンパク質の量を決定する方法の提
供する目的を有する。この方法は実質的には、結合性タ
ンパク質を含む試料を抗体または試験キットと保温し、
次に結合性タンパク質−抗体複合体の量を決定すること
からなる。
する新規抗体または新規抗体を含む試験キットを用い
た、存在する結合性タンパク質の量を決定する方法の提
供する目的を有する。この方法は実質的には、結合性タ
ンパク質を含む試料を抗体または試験キットと保温し、
次に結合性タンパク質−抗体複合体の量を決定すること
からなる。
【００１２】新規抗体および試験キットを用いて、結合
性タンパク質の免疫学的交差反応性を決定することによ
り毒素結合性タンパク質の間の関連の程度を決定するこ
とができる。それ故に本発明は、特定の結合性タンパク
質に対する抗体の、異なる起源の固定化結合性タンパク
質への結合を決定することにより毒素結合性タンパク質
の免疫学的交差反応性を分析してそれらの関連の程度を
決定するために、新規抗体または試験キットを使用する
方法に関する。
性タンパク質の免疫学的交差反応性を決定することによ
り毒素結合性タンパク質の間の関連の程度を決定するこ
とができる。それ故に本発明は、特定の結合性タンパク
質に対する抗体の、異なる起源の固定化結合性タンパク
質への結合を決定することにより毒素結合性タンパク質
の免疫学的交差反応性を分析してそれらの関連の程度を
決定するために、新規抗体または試験キットを使用する
方法に関する。
【００１３】新規抗体および試験キットは、相当する毒
素に対する結合性タンパク質の有効性および近づきやす
さに対して異なる昆虫を調べることを可能にする。これ
らの抗体および試験キットは、標的昆虫の腸膜の結合性
タンパク質を簡単で迅速に同定することを可能にする。
それ故に本発明は、異なる昆虫における相当する毒素に
対する結合性タンパク質の有効性および近づきやすさを
決定するための新規抗体または試験キットの使用方法に
関する。
素に対する結合性タンパク質の有効性および近づきやす
さに対して異なる昆虫を調べることを可能にする。これ
らの抗体および試験キットは、標的昆虫の腸膜の結合性
タンパク質を簡単で迅速に同定することを可能にする。
それ故に本発明は、異なる昆虫における相当する毒素に
対する結合性タンパク質の有効性および近づきやすさを
決定するための新規抗体または試験キットの使用方法に
関する。
【００１４】 略号 ＢＢＭ（Ｖ） 刷子縁膜（小胞） ＢＣＩＰ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートトル イジン塩 ＢＰ 結合性タンパク質 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ＣＨＡＰＳ ３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１ −プロパンスルホネート ＤＴＴ ジチオトレイトール ＥＤＡＣ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ イミド ＥＧＴＡ 〔エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）〕四酢酸 ＩＣＰ 殺虫性結晶タンパク質 ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ ＮＢＴ ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド ＰＢＳ リン酸緩衝液 ＰＭＳＦ フェニルメチルスルホニルフルオリド ＰＶＤＦ ポリビニリデンジフルオリド ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＴＢＳＴＭ ＴＢＳＴ〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％ポリオキシエチレンソルビトー ルモノラウレート〕＋１％脱脂粉乳
【００１５】
細菌株およびプラスミドＤＮＡ バチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢはブダペス
ト条約に従ってバチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒ
ｙβとして寄託されている（ＤＳＭ４５７４）。ｐＸＩ
９３はブダペスト条約に従ってｐＫ９３として寄託され
ている（ＤＳＭ４５７１）〔バチラス・スリンギエンシ
ス・クルスタキＨＤ１（ＤＳＭ３６６７）からのｃｒｙ
ＩＡ（ｂ）遺伝子を含む〕。
ト条約に従ってバチラス・スリンギエンシスＨＤ１ｃｒ
ｙβとして寄託されている（ＤＳＭ４５７４）。ｐＸＩ
９３はブダペスト条約に従ってｐＫ９３として寄託され
ている（ＤＳＭ４５７１）〔バチラス・スリンギエンシ
ス・クルスタキＨＤ１（ＤＳＭ３６６７）からのｃｒｙ
ＩＡ（ｂ）遺伝子を含む〕。
【００１６】寄託 本発明に関連して、以下のプラスミドがブダペスト条約
に従ってジャーマン・コレクション・オブ・ミクロオル
ガニズムズに寄託されている： DSM 番号 日付 プラスミド DSM 6616 1991年７月23日 pXI 94〔バチラス・スリンギエンシス・クルスタキ HD1 からのcryIA(a)遺伝子を含む〕 DSM 6615 1991年７月23日 pXI 95〔バチラス・スリンギエンシス・クルスタキ HD73からのcryIA(c)遺伝子を含む〕 DSM 6614 1991年７月23日 pXI 109 〔バチラス・スリンギエンシス・クルスタ キGC91 (NCTC 11821) からのcryIC 遺伝子を含む〕
に従ってジャーマン・コレクション・オブ・ミクロオル
ガニズムズに寄託されている： DSM 番号 日付 プラスミド DSM 6616 1991年７月23日 pXI 94〔バチラス・スリンギエンシス・クルスタキ HD1 からのcryIA(a)遺伝子を含む〕 DSM 6615 1991年７月23日 pXI 95〔バチラス・スリンギエンシス・クルスタキ HD73からのcryIA(c)遺伝子を含む〕 DSM 6614 1991年７月23日 pXI 109 〔バチラス・スリンギエンシス・クルスタ キGC91 (NCTC 11821) からのcryIC 遺伝子を含む〕
【００１７】実施例１：ＣｒｙＩＡ（ａ），ＣｒｙＩＡ
（ｂ），ＣｒｙＩＡ（ｃ）およびＣｒｙＩＣ毒素とヘリ
オチスおよびスポドプテラからのＢＢＭタンパク質への
それらの結合 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（全タンパク質１０μｇ）の後、ヘリ
オチス・ビレッセンス、ヘリオチス・ゼア、スポドプテ
ラ・リットラリス、スポドプテラ・エクシグアおよびス
ポドプテラ・リトゥラの中腸からの変性ＢＢＭタンパク
質をＰＶＤＦ膜に４℃、０．４Ａで１時間移す〔１
５〕。膜をポンソーＳ（３％トリクロロ酢酸中で０．２
％）(Serva) で染色して全タンパク質を可視化する。非
特異的結合はＴＢＳＴＭ中室温で３０分間の保温により
ブロックされる。膜を各々１．５μｇ／ｍｌのＣｒｙＩ
Ａ（ａ），ＣｒｙＩＡ（ｂ），ＣｒｙＩＡ（ｃ）および
ＣｒｙＩＣ毒素中で一晩保温し、そして未結合毒素をＴ
ＢＳＴ中での洗浄により除去する。結合毒素をモノクロ
ーナル抗体８２．１
（ｂ），ＣｒｙＩＡ（ｃ）およびＣｒｙＩＣ毒素とヘリ
オチスおよびスポドプテラからのＢＢＭタンパク質への
それらの結合 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（全タンパク質１０μｇ）の後、ヘリ
オチス・ビレッセンス、ヘリオチス・ゼア、スポドプテ
ラ・リットラリス、スポドプテラ・エクシグアおよびス
ポドプテラ・リトゥラの中腸からの変性ＢＢＭタンパク
質をＰＶＤＦ膜に４℃、０．４Ａで１時間移す〔１
５〕。膜をポンソーＳ（３％トリクロロ酢酸中で０．２
％）(Serva) で染色して全タンパク質を可視化する。非
特異的結合はＴＢＳＴＭ中室温で３０分間の保温により
ブロックされる。膜を各々１．５μｇ／ｍｌのＣｒｙＩ
Ａ（ａ），ＣｒｙＩＡ（ｂ），ＣｒｙＩＡ（ｃ）および
ＣｒｙＩＣ毒素中で一晩保温し、そして未結合毒素をＴ
ＢＳＴ中での洗浄により除去する。結合毒素をモノクロ
ーナル抗体８２．１
〔９〕またはＣｒｙＩＣに対して指
示されるウサギ抗体（実施例３）（ＴＢＳＴＭ中に１：
１０００に希釈された血清）で同定する。未結合抗体を
ＴＢＳＴ中での洗浄により除去する。次に保温をアルカ
リホスファターゼにより標識されたヤギ−抗マウスまた
はヤギ−抗ウサギ抗体中、１時間室温で行う。０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 および１ｍＭ ＭｇＣｌ2 （ｐＨ９．
８）中でのＮＢＴおよびＢＣＩＰとの反応により、膜結
合複合体が可視化される。３種のＣｒｙＩＡ毒素および
ＣｒｙＩＣ毒素は各昆虫種の中腸の１種またはそれ以上
の結合性タンパク質を認識する（表１） 表１：異なる昆虫の中腸のバチラス・スリンギエンシス
毒素結合性タンパク質（分子量，ｋＤａ；ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） 全ての場合においてＣｒｙＩＡ（ａ）およびＣｒｙＩＡ
（ｂ）は同一タンパク質を認識するが、結合性タンパク
質はある昆虫種と別のものでは異なる。ＣｒｙＩＡ
（ｃ）は多くの異なる毒素結合性タンパク質に結合す
る。全ての場合において３種のスポドプテラ種およびヘ
リオチス・ビレッセンスＣｒｙＩＣは分子量４０ｋＤａ
の結合性タンパク質に結合する。
示されるウサギ抗体（実施例３）（ＴＢＳＴＭ中に１：
１０００に希釈された血清）で同定する。未結合抗体を
ＴＢＳＴ中での洗浄により除去する。次に保温をアルカ
リホスファターゼにより標識されたヤギ−抗マウスまた
はヤギ−抗ウサギ抗体中、１時間室温で行う。０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 および１ｍＭ ＭｇＣｌ2 （ｐＨ９．
８）中でのＮＢＴおよびＢＣＩＰとの反応により、膜結
合複合体が可視化される。３種のＣｒｙＩＡ毒素および
ＣｒｙＩＣ毒素は各昆虫種の中腸の１種またはそれ以上
の結合性タンパク質を認識する（表１） 表１：異なる昆虫の中腸のバチラス・スリンギエンシス
毒素結合性タンパク質（分子量，ｋＤａ；ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） 全ての場合においてＣｒｙＩＡ（ａ）およびＣｒｙＩＡ
（ｂ）は同一タンパク質を認識するが、結合性タンパク
質はある昆虫種と別のものでは異なる。ＣｒｙＩＡ
（ｃ）は多くの異なる毒素結合性タンパク質に結合す
る。全ての場合において３種のスポドプテラ種およびヘ
リオチス・ビレッセンスＣｒｙＩＣは分子量４０ｋＤａ
の結合性タンパク質に結合する。
【００１８】実施例２：ヘリオチス・ビレッセンスから
のＣｒｙＩＡ（ｂ）ＢＰに対する抗体 ゲル内に固定されたヘリオチス・ビレッセンスからのＣ
ｒｙＩＡ（ｂ）結合性タンパク質１５μｇを含む懸濁液
の一部をチンチラウサギの背中に皮下注射する。タンパ
ク質１５μｇのブースター注射は３および７週間後に行
われる。最後のブースター注射の２週間後に血清を集め
る。血清を全血から凝固および低速遠心分離により分離
する。血清は少量ずつに分けて使用時まで−２０℃で貯
蔵する。この抗血清を用いた場合にウエスタンブロット
上に得られるバックグラウンドを減らすために、アフィ
ニティーカラムに結合させた大腸菌溶菌物を用いて非特
異的抗体を除去する〔１３〕。
のＣｒｙＩＡ（ｂ）ＢＰに対する抗体 ゲル内に固定されたヘリオチス・ビレッセンスからのＣ
ｒｙＩＡ（ｂ）結合性タンパク質１５μｇを含む懸濁液
の一部をチンチラウサギの背中に皮下注射する。タンパ
ク質１５μｇのブースター注射は３および７週間後に行
われる。最後のブースター注射の２週間後に血清を集め
る。血清を全血から凝固および低速遠心分離により分離
する。血清は少量ずつに分けて使用時まで−２０℃で貯
蔵する。この抗血清を用いた場合にウエスタンブロット
上に得られるバックグラウンドを減らすために、アフィ
ニティーカラムに結合させた大腸菌溶菌物を用いて非特
異的抗体を除去する〔１３〕。
【００１９】ＣｒｙＩＡ（ｂ）ＢＰ間の免疫学的相違 ヘリオチス・ビレッセンスからのＣｒｙＩＡ（ｂ）ＢＰ
に対して生産された抗体は５種の異なる昆虫種の幼虫の
ＢＢＭタンパク質の免疫ブロッティング分析のために使
用される。これはＢＢＭタンパク質３μｇをスロット−
ブロット装置(Schleicher and Schull) を用いて膜に移
すことにより行われる。ＴＢＳＴミルク中での飽和の
後、膜をＴＢＳＴＭ中の抗体の適当な希釈溶液と保温す
る。洗浄による未結合抗体の除去後、膜を 125Ｉ標識ヤ
ギ−抗ウサギ抗体と保温する。次に、未結合抗体を洗浄
により除去し、そしてオートラジオグラフ信号の強度を
島津ＣＳ−９３０ＴＬＣスキャナーで測定する。抗体は
ヘリオチス・ゼアからの結合性タンパク質とだけでな
く、スポドプテラ種のタンパク質とも交差反応する。Ｃ
ｒｙＩＡ（ｂ）毒素は各昆虫における１種または複数の
結合性タンパク質を認識するけれども、ヘリオチスから
の結合性タンパク質はスポドプテラからの結合性タンパ
ク質と免疫学的に同一ではない。
に対して生産された抗体は５種の異なる昆虫種の幼虫の
ＢＢＭタンパク質の免疫ブロッティング分析のために使
用される。これはＢＢＭタンパク質３μｇをスロット−
ブロット装置(Schleicher and Schull) を用いて膜に移
すことにより行われる。ＴＢＳＴミルク中での飽和の
後、膜をＴＢＳＴＭ中の抗体の適当な希釈溶液と保温す
る。洗浄による未結合抗体の除去後、膜を 125Ｉ標識ヤ
ギ−抗ウサギ抗体と保温する。次に、未結合抗体を洗浄
により除去し、そしてオートラジオグラフ信号の強度を
島津ＣＳ−９３０ＴＬＣスキャナーで測定する。抗体は
ヘリオチス・ゼアからの結合性タンパク質とだけでな
く、スポドプテラ種のタンパク質とも交差反応する。Ｃ
ｒｙＩＡ（ｂ）毒素は各昆虫における１種または複数の
結合性タンパク質を認識するけれども、ヘリオチスから
の結合性タンパク質はスポドプテラからの結合性タンパ
ク質と免疫学的に同一ではない。
【００２０】実施例３：ＣｒｙＩＣ毒素に対する抗体 標準的方法により活性化ＣｒｙＩＣ毒素に対して抗体が
生産される：４００μｌのＨ2 Ｏ中の活性化ＣｒｙＩＣ
毒素１０μｇおよび等量のフロイントの完全アジュバン
トをチンチラウサギの背中に皮下注射する。ブースター
注射は４および１０週間後にフロイントの不完全アジュ
バント中の等量の抗原を用いて行われる。これらのブー
スター注射の１２日後に動物から血液を採取し、そして
血清を分離する。架橋アガロースが結合しているプロテ
インＡを含むカラムでＩｇＧを分離する。
生産される：４００μｌのＨ2 Ｏ中の活性化ＣｒｙＩＣ
毒素１０μｇおよび等量のフロイントの完全アジュバン
トをチンチラウサギの背中に皮下注射する。ブースター
注射は４および１０週間後にフロイントの不完全アジュ
バント中の等量の抗原を用いて行われる。これらのブー
スター注射の１２日後に動物から血液を採取し、そして
血清を分離する。架橋アガロースが結合しているプロテ
インＡを含むカラムでＩｇＧを分離する。
【００２１】実施例４：抗イディオタイプ抗体 抗イディオタイプ抗体の調製 天然の活性化ＣｒｙＩＡ（ｂ）毒素に対する抗体４０ｍ
ｇを、ＣｒｙＩＡ（ｂ）毒素５ｍｇがＥＤＡＣを用いて
架橋されているアミノアルキルアガロースを充填したカ
ラムに通す。流出液中に２８０ｎｍの吸光度によりもは
やタンパク質が検出されなくなるまで、カラムを５０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄する。結合した抗体の
溶離は１０ｍＭジエチルアミンおよび０．５％デスオキ
シコレート（ｐＨ１１．３）の溶液で行われる。溶離画
分は１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）を５０分の１容量添加
することによりすぐに中和される。ＩｇＧ約３ｍｇが溶
離され、続いてこれをＣｒｙＩＡ（ｃ）が架橋結合され
ているアミノアルキルアガロースが充填されたカラムに
通す。ＣｒｙＩＡ（ｂ）とＣｒｙＩＡ（ｃ）との同一領
域を認識する抗体はこのカラムに結合し得、一方Ｃｒｙ
ＩＡ（ｂ）の可変領域〔６〕を認識する抗体は結合せ
ず、それ故に流出液中に存在する。これらの抗体（Ｃｒ
ｙＩＡ（ｂ）に対する）はチンチラウサギを免疫化する
ために使用される（８０μｇ）。ブースター注射を４週
間毎に行う。各免疫化の１２日後にウサギから血液を採
取し、そして血清を調製する。異なる血清はウエスタン
ブロットで１７０ｋＤａヘリオチス・ビレッセンスＣｒ
ｙＩＡ（ｂ）ＢＰへの結合性が試験される。抗イディオ
タイプＩｇＧは文献〔１１〕の方法によりヘリオチス・
ビレッセンスからＣｒｙＩＡ（ｂ）ＢＰに対して精製さ
れる。
ｇを、ＣｒｙＩＡ（ｂ）毒素５ｍｇがＥＤＡＣを用いて
架橋されているアミノアルキルアガロースを充填したカ
ラムに通す。流出液中に２８０ｎｍの吸光度によりもは
やタンパク質が検出されなくなるまで、カラムを５０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄する。結合した抗体の
溶離は１０ｍＭジエチルアミンおよび０．５％デスオキ
シコレート（ｐＨ１１．３）の溶液で行われる。溶離画
分は１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）を５０分の１容量添加
することによりすぐに中和される。ＩｇＧ約３ｍｇが溶
離され、続いてこれをＣｒｙＩＡ（ｃ）が架橋結合され
ているアミノアルキルアガロースが充填されたカラムに
通す。ＣｒｙＩＡ（ｂ）とＣｒｙＩＡ（ｃ）との同一領
域を認識する抗体はこのカラムに結合し得、一方Ｃｒｙ
ＩＡ（ｂ）の可変領域〔６〕を認識する抗体は結合せ
ず、それ故に流出液中に存在する。これらの抗体（Ｃｒ
ｙＩＡ（ｂ）に対する）はチンチラウサギを免疫化する
ために使用される（８０μｇ）。ブースター注射を４週
間毎に行う。各免疫化の１２日後にウサギから血液を採
取し、そして血清を調製する。異なる血清はウエスタン
ブロットで１７０ｋＤａヘリオチス・ビレッセンスＣｒ
ｙＩＡ（ｂ）ＢＰへの結合性が試験される。抗イディオ
タイプＩｇＧは文献〔１１〕の方法によりヘリオチス・
ビレッセンスからＣｒｙＩＡ（ｂ）ＢＰに対して精製さ
れる。
【００２２】５種の異なる昆虫の幼虫からのＢＢＭタン
パク質への抗イディオタイプ抗体の結合上で得られた抗
イディオタイプ抗体は、結合性タンパク質の毒素付着部
位が試験された昆虫において保存されているか否かを調
べるために使用される。ヘリオチス・ビレッセンスから
の１７０ｋＤａ結合性タンパク質ならびにヘリオチス・
ゼアからのものが抗イディオタイプ抗体により特異的に
認識される。抗体はスポドプテラ種のＢＢＭ結合性タン
パク質を認識しない。ウエスタンブロットが文献〔１
５〕に従ってＰＶＤＦ膜を用いて行われる。ＢＢＭＶタ
ンパク質の膜への転移および非特異的結合部位のＴＢＳ
ＴＭでのブロッキングの後、膜を抗イディオタイプ抗体
（ＴＢＳＴＭ中に１：１００に希釈されたＩｇＧ画分）
と保温する。膜結合抗体をアルカリホスファターゼによ
り標識されたヤギ−抗ウサギ抗体と１時間保温し、次に
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 および１ｍＭ ＭｇＣｌ2 中で
のＮＢＴおよびＢＣＩＰとの反応により可視化する。
パク質への抗イディオタイプ抗体の結合上で得られた抗
イディオタイプ抗体は、結合性タンパク質の毒素付着部
位が試験された昆虫において保存されているか否かを調
べるために使用される。ヘリオチス・ビレッセンスから
の１７０ｋＤａ結合性タンパク質ならびにヘリオチス・
ゼアからのものが抗イディオタイプ抗体により特異的に
認識される。抗体はスポドプテラ種のＢＢＭ結合性タン
パク質を認識しない。ウエスタンブロットが文献〔１
５〕に従ってＰＶＤＦ膜を用いて行われる。ＢＢＭＶタ
ンパク質の膜への転移および非特異的結合部位のＴＢＳ
ＴＭでのブロッキングの後、膜を抗イディオタイプ抗体
（ＴＢＳＴＭ中に１：１００に希釈されたＩｇＧ画分）
と保温する。膜結合抗体をアルカリホスファターゼによ
り標識されたヤギ−抗ウサギ抗体と１時間保温し、次に
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 および１ｍＭ ＭｇＣｌ2 中で
のＮＢＴおよびＢＣＩＰとの反応により可視化する。
【００２３】実施例５：毒素単離のための抗体の使用 （ａ）バチラス・スリンギエンシス・クルスタキＨＤ１
の副芽胞結晶を実施例１に記載したように集め、そして
タンパク質加水分解により活性化する。次に毒素混合物
０．５ｍｇを、ＣｒｙＩＡ（ａ）およびＣｒｙＩＡ
（ｂ）と特異的に反応するプロテインＡ上の抗体５ｍｇ
に結合されている架橋結合されたアガロースを充填した
カラムに通す。ＣｒｙＩＡ（ａ）およびＣｒｙＩＡ
（ｂ）は結合されるが、その他の毒素は流出液中に存在
し、そしてヘリオチス・ビレッセンスの毒素付着タンパ
ク質との特異的反応によりＣｒｙＩＡ（ｃ）として同定
され得る。同様にして「新規」毒素もまた単離され得
る。多数の「新規」毒素が流出液中に存在しているなら
ば、その他の単離段階は公知方法、典型的にはＨＰＬＣ
または２−Ｄ−クロマトグラフィー、例えばＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよび等電点電気泳動により行われる。 （ｂ）天然ＢＢＭＶはスロット−ブロット装置(Schleic
her and Schull) を用いて膜に移され、そして該膜はそ
の後ＴＢＳＴＭ中で保温される（実施例２）。ＣｒｙＩ
Ａ（ａ）と反応する結合性タンパク質をこの毒素とその
後保温する。（ａ）で得られた毒素ＣｒｙＩＡ（ｃ）を
125Ｉで標識し、そして試料を注入された膜と保温す
る。オートラジオグラフ測定は、ＣｒｙＩＡ（ｃ）がＣ
ｒｙＩＡ（ａ）の反応しない結合性タンパク質に結合す
ることを示す。この方法は「新規」δ内毒素を同定する
のにも使用され得る。
の副芽胞結晶を実施例１に記載したように集め、そして
タンパク質加水分解により活性化する。次に毒素混合物
０．５ｍｇを、ＣｒｙＩＡ（ａ）およびＣｒｙＩＡ
（ｂ）と特異的に反応するプロテインＡ上の抗体５ｍｇ
に結合されている架橋結合されたアガロースを充填した
カラムに通す。ＣｒｙＩＡ（ａ）およびＣｒｙＩＡ
（ｂ）は結合されるが、その他の毒素は流出液中に存在
し、そしてヘリオチス・ビレッセンスの毒素付着タンパ
ク質との特異的反応によりＣｒｙＩＡ（ｃ）として同定
され得る。同様にして「新規」毒素もまた単離され得
る。多数の「新規」毒素が流出液中に存在しているなら
ば、その他の単離段階は公知方法、典型的にはＨＰＬＣ
または２−Ｄ−クロマトグラフィー、例えばＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよび等電点電気泳動により行われる。 （ｂ）天然ＢＢＭＶはスロット−ブロット装置(Schleic
her and Schull) を用いて膜に移され、そして該膜はそ
の後ＴＢＳＴＭ中で保温される（実施例２）。ＣｒｙＩ
Ａ（ａ）と反応する結合性タンパク質をこの毒素とその
後保温する。（ａ）で得られた毒素ＣｒｙＩＡ（ｃ）を
125Ｉで標識し、そして試料を注入された膜と保温す
る。オートラジオグラフ測定は、ＣｒｙＩＡ（ｃ）がＣ
ｒｙＩＡ（ａ）の反応しない結合性タンパク質に結合す
ることを示す。この方法は「新規」δ内毒素を同定する
のにも使用され得る。
【００２４】表２：参考文献
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パスカル オッドウ ストック スイス国 4056 バーゼル ミットラーレ シュトラーセ 39／203 ハー (72)発明者 ヘルベルト ハルトマン ドイツ連邦共和国 3004 イゼルンハーゲ ン １ ブレッシュンヴェーク 14
Claims (34)
- 【請求項１】 バチラス・スリンギエンシスδ内毒素お
よびそれらの誘導体に対する結合性タンパク質と特異的
に反応する抗体。 - 【請求項２】 バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ
（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対する結合性タンパ
ク質と特異的に反応する請求項１記載の抗体。 - 【請求項３】 バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ
（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対するヘリオチス結
合性タンパク質と特異的に反応する請求項２記載の抗
体。 - 【請求項４】 バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＡ
（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対するヘリオチス・
ビレッセンス１７０ｋＤａ結合性タンパク質と特異的に
反応する請求項３記載の抗体。 - 【請求項５】 抗体が昆虫の中腸の刷子縁膜小胞からバ
チラス・スリンギエンシスδ内毒素およびそれらの誘導
体に対する結合性タンパク質を製造することにより得ら
れ、そして該抗体がバチラス・スリンギエンシスδ内毒
素およびそれらの誘導体に対する結合性タンパク質と特
異的に反応する抗体を製造するために公知方法により使
用される、バチラス・スリンギエンシスδ内毒素および
それらの誘導体に対する結合性タンパク質と特異的に反
応する抗体。 - 【請求項６】 δ内毒素がＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素お
よびそれらの誘導体である請求項５記載の抗体。 - 【請求項７】 結合性タンパク質がヘリオチス結合性タ
ンパク質である請求項６記載の抗体。 - 【請求項８】 結合性タンパク質がヘリオチス・ビレッ
センス１７０ｋＤａ結合性タンパク質である請求項７記
載の抗体。 - 【請求項９】 バチラス・スリンギエンシスδ内毒素お
よびそれらの誘導体に対する結合性タンパク質と特異的
に反応する抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項１０】 バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩ
Ａ（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対する結合性タン
パク質と特異的に反応する請求項９記載の抗イディオタ
イプ抗体。 - 【請求項１１】 バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩ
Ａ（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対するヘリオチス
結合性タンパク質と特異的に反応する請求項１０記載の
抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項１２】 バチラス・スリンギエンシスＣｒｙＩ
Ａ（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対するヘリオチス
・ビレッセンス１７０ｋＤａ結合性タンパク質と特異的
に反応する請求項１１記載の抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項１３】 バチラス・スリンギエンシスδ内毒素
およびそれらの誘導体に対する結合性タンパク質の特定
領域と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項１４】 天然の活性化バチラス・スリンギエン
シスδ内毒素に対する抗体を生産し、そしてこれらの抗
体を用いて公知方法により抗イディオタイプ抗体を製造
することにより得られる抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項１５】（ａ）天然の活性化バチラス・スリンギ
エンシスδ内毒素に対する抗体を生産し、（ｂ）該抗体
から、サブトラクティブアフィニティークロマトグラフ
ィーにより毒素の特定領域に対して指示されない抗体を
分離し、（ｃ）毒素の特定領域に対して指示される抗体
で繰り返し免疫化し、そして（ｄ）バチラス・スリンギ
エンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合性
タンパク質の特定領域に対して指示される免疫グロブリ
ンを選択することにより得られる、バチラス・スリンギ
エンシスδ内毒素およびそれらの誘導体に対する結合性
タンパク質の特定領域と特異的に反応する抗イディオタ
イプ抗体。 - 【請求項１６】 毒素がＣｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素およ
びその誘導体である請求項１４または１５のいずれかに
記載の抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項１７】 結合性タンパク質がヘリオチス結合性
タンパク質である請求項１６記載の抗イディオタイプ抗
体。 - 【請求項１８】 結合性タンパク質がヘリオチス・ビレ
ッセンス１７０ｋＤａ結合性タンパク質である請求項１
７記載の抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項１９】 バチラス・スリンギエンシスδ内毒素
およびそれらの誘導体に対する結合性タンパク質と特異
的に反応する抗体を含む試験キット。 - 【請求項２０】 抗体がバチラス・スリンギエンシスＣ
ｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素およびそれらの誘導体に対する
結合性タンパク質と特異的に反応する請求項１９記載の
試験キット。 - 【請求項２１】 抗体がバチラス・スリンギエンシスＣ
ｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対するヘリ
オチス結合性タンパク質と特異的に反応する請求項２０
記載の試験キット。 - 【請求項２２】 抗体がバチラス・スリンギエンシスＣ
ｒｙＩＡ（ｂ）δ内毒素およびその誘導体に対するヘリ
オチス・ビレッセンス１７０ｋＤａ結合性タンパク質と
特異的に反応する請求項２１記載の試験キット。 - 【請求項２３】（ａ）抗体を結合することにより、与え
られたδ内毒素に対する結合性タンパク質を飽和し、そ
して（ｂ）前処理した中腸膜タンパク質のその他の結合
性タンパク質に新規毒素を結合することからなる、新規
バチラス・スリンギエンシスδ内毒素を同定する方法。 - 【請求項２４】 公知毒素に対するサブトラクティブア
フィニティークロマトグラフィーにより調製された特異
的抗体をマトリックスに結合し、そして１株または複数
の株の全体の毒素と前記マトリックスを保温することか
らなる、新規バチラス・スリンギエンシスδ内毒素を単
離する方法。 - 【請求項２５】 請求項２４記載の方法により得られる
新規毒素。 - 【請求項２６】 公知δ内毒素に対する異なる昆虫のＢ
ＢＭＶの結合性タンパク質を該δ内毒素との結合により
飽和し、そして新規毒素が依然として結合するか否かを
調べることからなる、新規結合性タンパク質を認識する
新規バチラス・スリンギエンシスδ内毒素を同定する方
法。 - 【請求項２７】 請求項２６記載の方法により同定され
得る新規毒素。 - 【請求項２８】 請求項１ないし２２のいずれか１項に
記載の抗体または試験キットを用いて存在する結合性タ
ンパク質の量を決定する方法。 - 【請求項２９】 結合性部位または結合性タンパク質の
数の変化を決定し、そしてそれに応じて適当な毒素また
は毒素の混合物を用いることからなる、有害生物防除に
おける耐性発生の可能性を減らす方法。 - 【請求項３０】 特定の結合性タンパク質に対する抗体
の、異なる起源の固定化結合性タンパク質への結合を決
定することにより毒素結合性タンパク質の免疫学的交差
反応性を分析してそれらの関連の程度を決定するため
に、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載の抗体ま
たは試験キットを使用する方法。 - 【請求項３１】 結合性タンパク質の欠如に起因し得る
耐性を分析するための請求項１ないし１８のいずれか１
項に記載の抗体の使用方法。 - 【請求項３２】 結合性タンパク質の欠如に起因し得る
耐性を分析するための請求項９ないし１８のいずれか１
項に記載の抗イディオタイプ抗体の使用方法。 - 【請求項３３】 異なる昆虫における相当する毒素に対
する結合性タンパク質の有効性および近づきやすさを決
定するための請求項１ないし１８のいずれか１項に記載
の抗体の使用方法。 - 【請求項３４】 異なる昆虫における相当する毒素に対
する結合性タンパク質の有効性および近づきやすさを決
定するための請求項１９ないし２２のいずれか１項に記
載の試験キットの使用方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH223791 | 1991-07-25 | ||
| CH2237/91-0 | 1991-08-28 | ||
| CH2517/91-6 | 1991-08-28 | ||
| CH251791 | 1991-08-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05202099A true JPH05202099A (ja) | 1993-08-10 |
Family
ID=25689868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4218456A Pending JPH05202099A (ja) | 1991-07-25 | 1992-07-24 | 免疫学的検出方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
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