JPH05207827A - 形質転換植物の製造方法 - Google Patents
形質転換植物の製造方法Info
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- JPH05207827A JPH05207827A JP3307168A JP30716891A JPH05207827A JP H05207827 A JPH05207827 A JP H05207827A JP 3307168 A JP3307168 A JP 3307168A JP 30716891 A JP30716891 A JP 30716891A JP H05207827 A JPH05207827 A JP H05207827A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 イネ科植物の葯に内包される一核期中期の花
粉細胞の葯培養過程において、分裂を開始する直前また
は初期分裂中の段階で、当該花粉細胞にレーザーパルス
により形成された孔を経て遺伝子物質を導入せしめ、当
該遺伝子物質の遺伝子情報を発現せしめることを特徴と
するイネ科形質転換植物の製造方法並びにイネ科植物の
葯に内包される一核期中期の花粉細胞の葯培養過程にお
いて、分裂を開始する直前または初期分裂中の段階で、
当該花粉細胞に、レーザーパルスにより形成された孔を
経て遺伝子物質を導入せしめることを特徴とするイネ科
植物形質転換方法。 【効果】 本発明によれば、プロトプラストを調製する
必要がないので、形質転換の時間と作業を大幅に削減で
きる。また、半数体細胞を形質転換するので、後代に分
離することなく導入形質が伝達する。
粉細胞の葯培養過程において、分裂を開始する直前また
は初期分裂中の段階で、当該花粉細胞にレーザーパルス
により形成された孔を経て遺伝子物質を導入せしめ、当
該遺伝子物質の遺伝子情報を発現せしめることを特徴と
するイネ科形質転換植物の製造方法並びにイネ科植物の
葯に内包される一核期中期の花粉細胞の葯培養過程にお
いて、分裂を開始する直前または初期分裂中の段階で、
当該花粉細胞に、レーザーパルスにより形成された孔を
経て遺伝子物質を導入せしめることを特徴とするイネ科
植物形質転換方法。 【効果】 本発明によれば、プロトプラストを調製する
必要がないので、形質転換の時間と作業を大幅に削減で
きる。また、半数体細胞を形質転換するので、後代に分
離することなく導入形質が伝達する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はイネ科形質転換植物の製
造方法およびイネ科植物形質転換方法に関する。
造方法およびイネ科植物形質転換方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】植物の
形質転換法として、アグロバクテリウムを利用した遺伝
子導入方法が確立されているが、アグロバクテリウムは
オオムギを含む禾本科植物には感染することが出来ず、
他の方法が試みられている。
形質転換法として、アグロバクテリウムを利用した遺伝
子導入方法が確立されているが、アグロバクテリウムは
オオムギを含む禾本科植物には感染することが出来ず、
他の方法が試みられている。
【０００３】それらの方法として、ベクターＤＮＡの直
接導入の方法が検討されている。例えば、エレクトロポ
レーション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリ
コール法あるいはマイクロインジェクション法を用いて
形質転換する方法、即ちトウモロコシ 「Nature, 319
巻, 791(1986) 」、イネ「Mol. Gen. Genet., 204 巻,2
04(1986) 」、ムギ「Mol. Gen. Genet., 199 巻, 178(1
985) 」および牧草「Mol, Gen. Genet., 199 巻, 178(1
985) 」で植物細胞への遺伝子導入が可能であることが
報告されている。
接導入の方法が検討されている。例えば、エレクトロポ
レーション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリ
コール法あるいはマイクロインジェクション法を用いて
形質転換する方法、即ちトウモロコシ 「Nature, 319
巻, 791(1986) 」、イネ「Mol. Gen. Genet., 204 巻,2
04(1986) 」、ムギ「Mol. Gen. Genet., 199 巻, 178(1
985) 」および牧草「Mol, Gen. Genet., 199 巻, 178(1
985) 」で植物細胞への遺伝子導入が可能であることが
報告されている。
【０００４】しかし、パーテイクルガン法、マイクロイ
ンジェクション法といった物理的に遺伝子を細胞に移入
する方法では、処理効率の低さやキメラ形質転換植物の
発生などの問題がある。
ンジェクション法といった物理的に遺伝子を細胞に移入
する方法では、処理効率の低さやキメラ形質転換植物の
発生などの問題がある。
【０００５】さらに、エレクトロポレーションによるイ
ネ科植物への遺伝子導入系を使う形質転換植物の製造法
「特開平１−１８１７９１号公報」やポリエチレングリ
コール法などプロトプラストを介する方法が報告されて
いるが、多くのムギ類ではプロトプラストから植物体に
至る系が確立されていない。また、プロトプラストの調
製に多くの選抜培養と長い期間が必要で、さらにプロト
プラスト培養は同一の作物であっても一部の培養特性の
優れた品種、系統にしか適用できないのが現状である。
ネ科植物への遺伝子導入系を使う形質転換植物の製造法
「特開平１−１８１７９１号公報」やポリエチレングリ
コール法などプロトプラストを介する方法が報告されて
いるが、多くのムギ類ではプロトプラストから植物体に
至る系が確立されていない。また、プロトプラストの調
製に多くの選抜培養と長い期間が必要で、さらにプロト
プラスト培養は同一の作物であっても一部の培養特性の
優れた品種、系統にしか適用できないのが現状である。
【０００６】レーザーパルスにより形質転換する方法と
しては現在のところ、動物細胞の形質転換に用いられて
おり、植物組織およびその細胞については予備的な実験
への使用に留まり「 Weber等、Plant Cell Tissue and
Organ Culture,12巻, 219(1988) 」、またオルガネラに
ついての実験「西ドイツ特許出願第３７０７１１１Ａ公
報」においても使用されているが、上記の方法によって
植物の花粉を形質転換することは知られていない。ま
た、トウモロコシ胚へのレーザーによる遺伝子導入系を
使う形質転換植物の製造法が報告されている「特開平２
−９３７８号公報」が、この方法により得られる形質転
換体はキメラであり、オオムギ等のムギ類でホモ体の形
質転換体を得る方法は未だ確立されていない。上述の如
く、植物体の形質転換は種々試みられてはいるが、単子
葉植物、特にイネ科植物において長らく強い要望がある
にも拘らず成し得ていなかった。
しては現在のところ、動物細胞の形質転換に用いられて
おり、植物組織およびその細胞については予備的な実験
への使用に留まり「 Weber等、Plant Cell Tissue and
Organ Culture,12巻, 219(1988) 」、またオルガネラに
ついての実験「西ドイツ特許出願第３７０７１１１Ａ公
報」においても使用されているが、上記の方法によって
植物の花粉を形質転換することは知られていない。ま
た、トウモロコシ胚へのレーザーによる遺伝子導入系を
使う形質転換植物の製造法が報告されている「特開平２
−９３７８号公報」が、この方法により得られる形質転
換体はキメラであり、オオムギ等のムギ類でホモ体の形
質転換体を得る方法は未だ確立されていない。上述の如
く、植物体の形質転換は種々試みられてはいるが、単子
葉植物、特にイネ科植物において長らく強い要望がある
にも拘らず成し得ていなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
克服すべく、鋭意検討を重ねた結果、イネ科植物の花粉
に外来遺伝子を効率よく導入し、形質転換されたイネ科
植物を製造する方法を見出し、本発明を完成するに至っ
た。
克服すべく、鋭意検討を重ねた結果、イネ科植物の花粉
に外来遺伝子を効率よく導入し、形質転換されたイネ科
植物を製造する方法を見出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００８】即ち本発明は、イネ科植物の葯に内包され
る一核期中期の花粉細胞の葯培養過程において、分裂を
開始する直前または初期分裂中の段階で、当該花粉細胞
にレーザーパルスにより形成された孔を経て遺伝子物質
を導入せしめ、当該遺伝子物質の遺伝子情報を発現せし
めることを特徴とするイネ科形質転換植物の製造方法並
びにイネ科植物の葯に内包される一核期中期の花粉細胞
の葯培養過程において、分裂を開始する直前または初期
分裂中の段階で、当該花粉細胞にレーザーパルスにより
形成された孔を経て遺伝子物質を導入せしめることを特
徴とするイネ科植物形質転換方法を提供するものであ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
る一核期中期の花粉細胞の葯培養過程において、分裂を
開始する直前または初期分裂中の段階で、当該花粉細胞
にレーザーパルスにより形成された孔を経て遺伝子物質
を導入せしめ、当該遺伝子物質の遺伝子情報を発現せし
めることを特徴とするイネ科形質転換植物の製造方法並
びにイネ科植物の葯に内包される一核期中期の花粉細胞
の葯培養過程において、分裂を開始する直前または初期
分裂中の段階で、当該花粉細胞にレーザーパルスにより
形成された孔を経て遺伝子物質を導入せしめることを特
徴とするイネ科植物形質転換方法を提供するものであ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明の方法は、通常葯に内包される一核
期中期の花粉細胞の葯培養過程において、分裂を開始す
る直前または初期分裂中の段階で、適当な花粉細胞を、
導入したい遺伝情報を有する遺伝子物質を含有する溶
液、典型的には水溶液中に懸濁させることにより行い得
る。次いで、レーザー装置の焦点を当該花粉細胞の一つ
に合わせ、そしてレーザーを照射して細胞壁中に孔を形
成させ、この孔を通じて遺伝子物質を細胞内に導入す
る。この細胞をカルス誘導培地で培養し、カルスおよび
／または胚様体を形成せしめ、その後再分化培地に植え
継ぎ、形質転換を確認し、形質転換植物を得ることがで
きる。
期中期の花粉細胞の葯培養過程において、分裂を開始す
る直前または初期分裂中の段階で、適当な花粉細胞を、
導入したい遺伝情報を有する遺伝子物質を含有する溶
液、典型的には水溶液中に懸濁させることにより行い得
る。次いで、レーザー装置の焦点を当該花粉細胞の一つ
に合わせ、そしてレーザーを照射して細胞壁中に孔を形
成させ、この孔を通じて遺伝子物質を細胞内に導入す
る。この細胞をカルス誘導培地で培養し、カルスおよび
／または胚様体を形成せしめ、その後再分化培地に植え
継ぎ、形質転換を確認し、形質転換植物を得ることがで
きる。
【００１０】イネ科植物の葯をカルス誘導培地で培養
し、内包される一核期中期の花粉が培養細胞として分裂
を開始する直前または初期分裂中の段階で、適当な花粉
細胞を培養する方法は、葯を改変ＭＳ培地「Carlsberg
Res. Commun. 52 巻,393(1987)」、ＦＨＧ培地「Kasha
等，XIX Stadler Genetics Symp. 213(1989)」、Clapha
mI, II, III 培地「Z. Pflanzenzucht, 69巻, 142(197
3) 」、Foroughi−Weir等の培地「Z. Pflanzenzucht, 7
7巻, 198(1976) 」およびそれらの培地の変法培地等の
培地より培養する葯の特性に基づいて選定した培地中で
培養する。培養温度は、培養する葯によるが、通常２２
〜２８℃、好ましくは２５℃付近であり、培養時のｐＨ
は、通常5.６〜6.０、好ましくは5.８であり、培養期間
は、培養する葯によるが、通常０〜１４日間である。レ
ーザー処理は、花粉細胞が分裂し、カルス誘導培地中に
ＤＮＡを複製する能力を獲得したとき、即ち花粉細胞が
形態的に細胞質リッチの細胞に変化したときに実施すべ
きである。一般に、花粉細胞は２週間以内にレーザー処
理に適した細胞に変わる。
し、内包される一核期中期の花粉が培養細胞として分裂
を開始する直前または初期分裂中の段階で、適当な花粉
細胞を培養する方法は、葯を改変ＭＳ培地「Carlsberg
Res. Commun. 52 巻,393(1987)」、ＦＨＧ培地「Kasha
等，XIX Stadler Genetics Symp. 213(1989)」、Clapha
mI, II, III 培地「Z. Pflanzenzucht, 69巻, 142(197
3) 」、Foroughi−Weir等の培地「Z. Pflanzenzucht, 7
7巻, 198(1976) 」およびそれらの培地の変法培地等の
培地より培養する葯の特性に基づいて選定した培地中で
培養する。培養温度は、培養する葯によるが、通常２２
〜２８℃、好ましくは２５℃付近であり、培養時のｐＨ
は、通常5.６〜6.０、好ましくは5.８であり、培養期間
は、培養する葯によるが、通常０〜１４日間である。レ
ーザー処理は、花粉細胞が分裂し、カルス誘導培地中に
ＤＮＡを複製する能力を獲得したとき、即ち花粉細胞が
形態的に細胞質リッチの細胞に変化したときに実施すべ
きである。一般に、花粉細胞は２週間以内にレーザー処
理に適した細胞に変わる。
【００１１】また、Ziauddin等の方法「Plant Cell Rep
orts, 9 巻, 59(1990)」により得られた花粉細胞を用い
ても良い。ここで用いられるイネ科植物は、イネ，トウ
モロコシ，ムギ類等が挙げられ、ムギ類としては、オオ
ムギ，コムギ，ライムギ，オーツムギ，ライコムギ等が
挙げられ、オオムギとしてはＤｉｓｓａ，Ｉｇｒｉ，Ｔ
ＲＵＭＰＦ，ＣＡＲＩＮＡ，はるな二条等が挙げられ
る。これらの植物から常法にしたがって葯を採取すれば
よい。また、用いられる当該花粉細胞は、葯から単離さ
れた一核期中期のものが挙げられる。
orts, 9 巻, 59(1990)」により得られた花粉細胞を用い
ても良い。ここで用いられるイネ科植物は、イネ，トウ
モロコシ，ムギ類等が挙げられ、ムギ類としては、オオ
ムギ，コムギ，ライムギ，オーツムギ，ライコムギ等が
挙げられ、オオムギとしてはＤｉｓｓａ，Ｉｇｒｉ，Ｔ
ＲＵＭＰＦ，ＣＡＲＩＮＡ，はるな二条等が挙げられ
る。これらの植物から常法にしたがって葯を採取すれば
よい。また、用いられる当該花粉細胞は、葯から単離さ
れた一核期中期のものが挙げられる。
【００１２】遺伝情報を有する遺伝子物質は、イネ科植
物でその遺伝情報を安定化せしめ、その遺伝情報を発現
するように制御されたものであり、具体的にはイネ科植
物で機能するプラスミドが挙げられ、例えばイネ科植物
で機能するプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓ，ＣａＭ
Ｖ１９Ｓ等のカリフラワーモザイクウイルス由来のプロ
モーター、ＰＲ蛋白プロモーター、ＡＤＨ−１プロモー
ター等、ターミネータとしてＣａＭＶ３５Ｓ，ＣａＭＶ
１９Ｓ，ＮＯＳ等のターミネーター、形質転換特性とし
て所望の除草剤耐性遺伝子、ＢＴ毒素，プロテアーゼイ
ンヒビター等の昆虫抵抗性遺伝子、ウイルス抵抗性遺伝
子、ゼイン，グルテニン等の貯蔵蛋白遺伝子、Ａｃ，Ｄ
ａ等の転移因子遺伝子等の外来遺伝子等を有する。さら
に、初期選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を有しても
よい。
物でその遺伝情報を安定化せしめ、その遺伝情報を発現
するように制御されたものであり、具体的にはイネ科植
物で機能するプラスミドが挙げられ、例えばイネ科植物
で機能するプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓ，ＣａＭ
Ｖ１９Ｓ等のカリフラワーモザイクウイルス由来のプロ
モーター、ＰＲ蛋白プロモーター、ＡＤＨ−１プロモー
ター等、ターミネータとしてＣａＭＶ３５Ｓ，ＣａＭＶ
１９Ｓ，ＮＯＳ等のターミネーター、形質転換特性とし
て所望の除草剤耐性遺伝子、ＢＴ毒素，プロテアーゼイ
ンヒビター等の昆虫抵抗性遺伝子、ウイルス抵抗性遺伝
子、ゼイン，グルテニン等の貯蔵蛋白遺伝子、Ａｃ，Ｄ
ａ等の転移因子遺伝子等の外来遺伝子等を有する。さら
に、初期選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を有しても
よい。
【００１３】当該遺伝子物質を含有する溶液は、細胞中
に導入することを希望する遺伝子約１０〜２0,０００μ
ｇ／ｍｌと他成分、具体的には正確な浸透圧の平衡化ま
たは高張化を促進するための不活性塩類、細胞栄養物ま
たは他の添加剤を有するものである。より具体的に例示
すると、９〜１５％のマンニトールを含有する遺伝子懸
濁液を挙げることができる。
に導入することを希望する遺伝子約１０〜２0,０００μ
ｇ／ｍｌと他成分、具体的には正確な浸透圧の平衡化ま
たは高張化を促進するための不活性塩類、細胞栄養物ま
たは他の添加剤を有するものである。より具体的に例示
すると、９〜１５％のマンニトールを含有する遺伝子懸
濁液を挙げることができる。
【００１４】次に、レーザー装置の焦点を当該花粉細胞
の一つに合わせ、そしてレーザーを照射して細胞壁中に
孔を形成させ、この孔を通じて遺伝子物質を細胞内に導
入するわけであるが、孔の寸法は変動させ得るが、細胞
の寸法と比較して余り大きいものであってはならない。
具体的には通常５〜５００nmの直径を有する孔を形成せ
しめる。パルスの印加時間は通常５〜２０ナノセカンド
であり、好ましくは１０〜１５ナノセカンドである。パ
ルスエネルギーは、通常0.１〜１０マイクロジュール
（μＪ）の範囲に調整する。用いられるレーザー装置
は、原則的には適度に微小な焦点にレーザーを集中する
ことができる任意の装置を使用しうる。好適には、既に
哺乳動物細胞のレーザー マイクロインジェクションに
利用可能な装置として市販されている日立製作所製の日
立レーザー セル プロセッサーが挙げられる。
の一つに合わせ、そしてレーザーを照射して細胞壁中に
孔を形成させ、この孔を通じて遺伝子物質を細胞内に導
入するわけであるが、孔の寸法は変動させ得るが、細胞
の寸法と比較して余り大きいものであってはならない。
具体的には通常５〜５００nmの直径を有する孔を形成せ
しめる。パルスの印加時間は通常５〜２０ナノセカンド
であり、好ましくは１０〜１５ナノセカンドである。パ
ルスエネルギーは、通常0.１〜１０マイクロジュール
（μＪ）の範囲に調整する。用いられるレーザー装置
は、原則的には適度に微小な焦点にレーザーを集中する
ことができる任意の装置を使用しうる。好適には、既に
哺乳動物細胞のレーザー マイクロインジェクションに
利用可能な装置として市販されている日立製作所製の日
立レーザー セル プロセッサーが挙げられる。
【００１５】レーザー処理を行った後、遺伝子物質をそ
の溶液から穿孔後の花粉細胞中に拡散、侵入させるのに
十分な時間、当該花粉細胞を当該遺伝子物質を含有する
溶液中で、インキュベートする。インキュベート時間
は、通常５秒〜２時間であり、インキュベーションの温
度は、通常０〜２８℃である。
の溶液から穿孔後の花粉細胞中に拡散、侵入させるのに
十分な時間、当該花粉細胞を当該遺伝子物質を含有する
溶液中で、インキュベートする。インキュベート時間
は、通常５秒〜２時間であり、インキュベーションの温
度は、通常０〜２８℃である。
【００１６】上述の如くして行われたレーザー処理とイ
ンキュベーションを行った後、得られた花粉細胞または
これから誘導された細胞を培養して植物体を生ぜしめ
る。本発明の好ましい態様として、Olsen 等の方法「Ca
rlsberg Res. Commun.52巻,393(1987)」、Ziauddin等の
方法「Plant Cell Reports, 9 巻, 59(1990)」が挙げら
れる。さらに、好ましい態様としてナース細胞の利用を
挙げることができる。
ンキュベーションを行った後、得られた花粉細胞または
これから誘導された細胞を培養して植物体を生ぜしめ
る。本発明の好ましい態様として、Olsen 等の方法「Ca
rlsberg Res. Commun.52巻,393(1987)」、Ziauddin等の
方法「Plant Cell Reports, 9 巻, 59(1990)」が挙げら
れる。さらに、好ましい態様としてナース細胞の利用を
挙げることができる。
【００１７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、
これらは何等本発明を限定するものではない。 実施例１ オオムギ cv Dissa 播種後、１２℃−明−１６時間、１
０℃−暗−８時間で生育せしめ、花粉一核期中期(mid u
ninucleate stage microspores) の葯を改変ＭＳ＋ Fic
ol培地に植え付け、２５度−２週間培養後、ピンセット
及び薬匙で葯を裂開し、花粉細胞をＤＮＡ溶液中に流し
だす。１０〜２０個の葯を１ml溶液に取り、９６μｍφ
ナイロンメッシュでカルスと夾雑物を除いて分裂を開始
する直前の培養細胞を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍ
ｉｎ）で２０〜１００μｌに濃縮回収し、レーザー処理
サンプルとする。
これらは何等本発明を限定するものではない。 実施例１ オオムギ cv Dissa 播種後、１２℃−明−１６時間、１
０℃−暗−８時間で生育せしめ、花粉一核期中期(mid u
ninucleate stage microspores) の葯を改変ＭＳ＋ Fic
ol培地に植え付け、２５度−２週間培養後、ピンセット
及び薬匙で葯を裂開し、花粉細胞をＤＮＡ溶液中に流し
だす。１０〜２０個の葯を１ml溶液に取り、９６μｍφ
ナイロンメッシュでカルスと夾雑物を除いて分裂を開始
する直前の培養細胞を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍ
ｉｎ）で２０〜１００μｌに濃縮回収し、レーザー処理
サンプルとする。
【００１８】用いるＤＮＡ溶液はOkada 溶液＋15％マン
ニトール＋pBI221〔東洋紡績株式会社販売〕１０μｇ／
ml＋pSBG102(Hmr ）〔上記pBI221のBamHI, PstI サイト
に囲まれたβ−グルクロニダーゼ構造遺伝子をハイグロ
マイシンＢフォスフォトランスフェラーゼ構造遺伝子
「Gene, 25巻,179(1983)」に置き換えたもの〕１０μｇ
／ml＋Calf Thymus DNA 50μｇ／mlである。
ニトール＋pBI221〔東洋紡績株式会社販売〕１０μｇ／
ml＋pSBG102(Hmr ）〔上記pBI221のBamHI, PstI サイト
に囲まれたβ−グルクロニダーゼ構造遺伝子をハイグロ
マイシンＢフォスフォトランスフェラーゼ構造遺伝子
「Gene, 25巻,179(1983)」に置き換えたもの〕１０μｇ
／ml＋Calf Thymus DNA 50μｇ／mlである。
【００１９】シャーレ上にこの液滴を置き、乾燥を防ぐ
ために５mm角の１％アガロース片をのせ、シャーレに蓋
をしてフィルムで巻き、日立レーザー セル プロセッ
サーにセットした。このサンプルは花粉細胞，発生した
単細胞および分裂を開始した細胞塊を含有している。細
胞質リッチの発生単細胞を選び、0.４μJ のエネルギー
でレーザーパルス穿孔した。
ために５mm角の１％アガロース片をのせ、シャーレに蓋
をしてフィルムで巻き、日立レーザー セル プロセッ
サーにセットした。このサンプルは花粉細胞，発生した
単細胞および分裂を開始した細胞塊を含有している。細
胞質リッチの発生単細胞を選び、0.４μJ のエネルギー
でレーザーパルス穿孔した。
【００２０】処理後のサンプルは、１００〜２００μｌ
の改変ＭＳ液体培地で希釈し、２５℃で静置培養した。
２週間後に等量の培地（ハイグロマイシンＢ含有）を加
えた。数ミリ径のカルスになったものについてＧＵＳ酵
素の導入形質を調査した。その結果、約１／１６の割合
でＧＵＳ活性が認められた。以下にＧＵＳ活性の測定方
法を示す。
の改変ＭＳ液体培地で希釈し、２５℃で静置培養した。
２週間後に等量の培地（ハイグロマイシンＢ含有）を加
えた。数ミリ径のカルスになったものについてＧＵＳ酵
素の導入形質を調査した。その結果、約１／１６の割合
でＧＵＳ活性が認められた。以下にＧＵＳ活性の測定方
法を示す。
【００２１】ＧＵＳアッセイの方法 ガス分析用染色液の処方 Ｘ−ｇｌｕ溶液（５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−グルクロン酸）貯蔵溶媒 〔２０ｍｇ／１ Ｘ−ｇｌｕＤＭＦ〕 ５ｍｇ Ｘ−ｇｌｕ in deoxydized DMF(dimethyl formamide) ↓ solute in 5ml 50mM K.P.buffer （カリウムリン酸バッファー）〔ｐＨ7.０ 終 濃度１ｍｇ／ｍｌ〕
リル−β−Ｄ−グルクロン酸）貯蔵溶媒 〔２０ｍｇ／１ Ｘ−ｇｌｕＤＭＦ〕 ５ｍｇ Ｘ−ｇｌｕ in deoxydized DMF(dimethyl formamide) ↓ solute in 5ml 50mM K.P.buffer （カリウムリン酸バッファー）〔ｐＨ7.０ 終 濃度１ｍｇ／ｍｌ〕
【００２２】ＧＵＳ溶解バッファー 50mM K.P. buf pH7.０＋10mM EDTA＋0.１％Triton X 1
00＋0.１％ Sarkosyl ＋10mM ２−Mercaptoethanol
00＋0.１％ Sarkosyl ＋10mM ２−Mercaptoethanol
【００２３】細胞の調製 小さいコロニーや組織の表面を染色する場合は、そのま
ま液に浸せばよい。反応を定量的に、または正確に行わ
せる場合は、組織に少量のＧＵＳ溶解バッファーを加え
て摺り潰し、基質を加える。１mmカルスではＧＵＳ溶解
バッファー２０μｌ，Ｘ−ｇｌｕ溶液１００μｌでよ
い。
ま液に浸せばよい。反応を定量的に、または正確に行わ
せる場合は、組織に少量のＧＵＳ溶解バッファーを加え
て摺り潰し、基質を加える。１mmカルスではＧＵＳ溶解
バッファー２０μｌ，Ｘ−ｇｌｕ溶液１００μｌでよ
い。
【００２４】実施例２ オオムギＩｇｒｉ播種後、１２℃−明−１６時間、１０
℃−暗−８時間で生育させ、花粉一核期中期(mid uninu
cleate stage microspores) の葯を得た。次いで、この
葯を改変ＭＳ＋Ｆｉｃｏｌ培地に植え付け、２５℃で２
週間培養後、ピンセット及び薬匙で葯を裂開し、花粉細
胞をＤＮＡ溶液中に流しだす。１０〜２０個の葯を１ml
溶液に取り、９６μｍφナイロンメッシュでカルスと夾
雑物を除いて初期分裂中の培養細胞を遠心分離（１００
０ｒｐｍ×５ｍｉｎ）で２０〜１００μｌに濃縮回収
し、レーザー パルス処理サンプルとした。
℃−暗−８時間で生育させ、花粉一核期中期(mid uninu
cleate stage microspores) の葯を得た。次いで、この
葯を改変ＭＳ＋Ｆｉｃｏｌ培地に植え付け、２５℃で２
週間培養後、ピンセット及び薬匙で葯を裂開し、花粉細
胞をＤＮＡ溶液中に流しだす。１０〜２０個の葯を１ml
溶液に取り、９６μｍφナイロンメッシュでカルスと夾
雑物を除いて初期分裂中の培養細胞を遠心分離（１００
０ｒｐｍ×５ｍｉｎ）で２０〜１００μｌに濃縮回収
し、レーザー パルス処理サンプルとした。
【００２５】用いるＤＮＡ溶液はOkada 溶液＋15％マン
ニトール＋pBI221〔東洋紡績株式会社販売〕１０μｇ／
ml＋pSBG102(Hmr ）〔上記pBI221のBamHI, PstI サイト
に囲まれたβ−グルクロニダーゼ構造遺伝子をハイグロ
マイシンＢフォスフォトランスフェラーゼ構造遺伝子
「Gene, 25巻,179(1983)」に置き換えたもの〕１０μｇ
／ml＋Calf Thymus DNA 50μｇ／mlである。
ニトール＋pBI221〔東洋紡績株式会社販売〕１０μｇ／
ml＋pSBG102(Hmr ）〔上記pBI221のBamHI, PstI サイト
に囲まれたβ−グルクロニダーゼ構造遺伝子をハイグロ
マイシンＢフォスフォトランスフェラーゼ構造遺伝子
「Gene, 25巻,179(1983)」に置き換えたもの〕１０μｇ
／ml＋Calf Thymus DNA 50μｇ／mlである。
【００２６】シャーレ上にこの液滴を置き、乾燥を防ぐ
ために５mm角の１％アガロース片をのせ、シャーレに蓋
をしてフィルムで巻き、日立レーザー セル プロセッ
サーにセットした。このサンプルを、0.４μJ のエネル
ギーで自動的にレーザー穿孔する。
ために５mm角の１％アガロース片をのせ、シャーレに蓋
をしてフィルムで巻き、日立レーザー セル プロセッ
サーにセットした。このサンプルを、0.４μJ のエネル
ギーで自動的にレーザー穿孔する。
【００２７】処理後のサンプルは、５００μｌの改変Ｍ
Ｓ液体培地で希釈し、２５℃で静置培養した。２週間後
に等量のハイグロマイシン選抜培地（２０μｇ／ｍｌハ
イグロマイシンＢ）を加えた。数ミリ径のカルスになっ
たものについてＧＵＳ酵素またはハイグロマイシン耐性
などの導入形質を調査した。その結果、処理細胞の約１
／２０００の割合でハイグロマイシン耐性が認められ
た。
Ｓ液体培地で希釈し、２５℃で静置培養した。２週間後
に等量のハイグロマイシン選抜培地（２０μｇ／ｍｌハ
イグロマイシンＢ）を加えた。数ミリ径のカルスになっ
たものについてＧＵＳ酵素またはハイグロマイシン耐性
などの導入形質を調査した。その結果、処理細胞の約１
／２０００の割合でハイグロマイシン耐性が認められ
た。
【００２８】植物体への再分化 オオムギ形質転換植物の再分化 子葉に相当する葉原基を、ホルモンを除いた発根培地に
移植して、同条件で培養することにより根の発達と地上
部の生育を促し、ほぼ１ヶ月で完全な植物体が再分化し
た。その生葉よりＣＴＡＢ法(Plant Molecular Biology
Reporter ７：２，１９８９）で核ＤＮＡを単離し、マ
ーカー遺伝子の構造遺伝子部分の２０mersをプライマー
にして、ＰＣＲ(Science 239巻、487,1988) を試みたと
ころ、各々の遺伝子に値するＤＮＡが合成された。この
ことから、核ゲノム中の外来遺伝子の存在が確認され
た。
移植して、同条件で培養することにより根の発達と地上
部の生育を促し、ほぼ１ヶ月で完全な植物体が再分化し
た。その生葉よりＣＴＡＢ法(Plant Molecular Biology
Reporter ７：２，１９８９）で核ＤＮＡを単離し、マ
ーカー遺伝子の構造遺伝子部分の２０mersをプライマー
にして、ＰＣＲ(Science 239巻、487,1988) を試みたと
ころ、各々の遺伝子に値するＤＮＡが合成された。この
ことから、核ゲノム中の外来遺伝子の存在が確認され
た。
【００２９】
【発明の効果】本発明を用いることにより、イネ科植物
の培養細胞の形質転換を行うことができる。本発明によ
れば、プロトプラストを調製する必要がないので、形質
転換の時間と作業を大幅に削減できる。また、半数体細
胞を形質転換するので、後代に分離することなく導入形
質が伝達する。しかも、品種，系統間の試験の難易度の
差が少ないので、実用品種への応用が容易である。本発
明の方法によれば、エレクトロポレーション法に比べて
大きな穿孔が起こるので、分子量の大きなＤＮＡや物質
が導入できる。
の培養細胞の形質転換を行うことができる。本発明によ
れば、プロトプラストを調製する必要がないので、形質
転換の時間と作業を大幅に削減できる。また、半数体細
胞を形質転換するので、後代に分離することなく導入形
質が伝達する。しかも、品種，系統間の試験の難易度の
差が少ないので、実用品種への応用が容易である。本発
明の方法によれば、エレクトロポレーション法に比べて
大きな穿孔が起こるので、分子量の大きなＤＮＡや物質
が導入できる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/87
Claims (5)
- 【請求項１】 イネ科植物の葯に内包される一核期中期
の花粉細胞の葯培養過程において、分裂を開始する直前
または初期分裂中の段階で、当該花粉細胞に、レーザー
パルスにより形成された孔を経て遺伝子物質を導入せし
め、当該遺伝子物質の遺伝子情報を発現せしめることを
特徴とするイネ科形質転換植物の製造方法。 - 【請求項２】 イネ科植物が、ムギ類である請求項１記
載のイネ科形質転換植物の製造方法。 - 【請求項３】 ムギ類が、オオムギである請求項２記載
のイネ科形質転換植物の製造方法。 - 【請求項４】 イネ科植物の葯に内包される一核期中期
の花粉細胞の葯培養過程において、分裂を開始する直前
または初期分裂中の段階で、当該花粉細胞に、レーザー
パルスにより形成された孔を経て遺伝子物質を導入せし
めることを特徴とするイネ科植物形質転換方法。 - 【請求項５】 イネ科植物の葯に内包される一核期中期
の花粉細胞の葯培養過程において、分裂を開始する直前
または初期分裂中の段階で、当該花粉細胞に、レーザー
パルスにより形成された孔を経て遺伝子物質を導入せし
め、当該遺伝子物質の遺伝子情報を発現する細胞を選択
し、この選択された細胞をカルス誘導培地で培養し、カ
ルスおよび／または胚様体を形成せしめ、その後再分化
培地に植え継ぎ、植物体を得、形質転換を確認すること
を特徴とするイネ科形質転換植物の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-293582 | 1990-11-01 | ||
| JP29358290 | 1990-11-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05207827A true JPH05207827A (ja) | 1993-08-20 |
Family
ID=17796599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3307168A Pending JPH05207827A (ja) | 1990-11-01 | 1991-10-28 | 形質転換植物の製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5272072A (ja) |
| EP (1) | EP0483847A3 (ja) |
| JP (1) | JPH05207827A (ja) |
| AU (1) | AU643563B2 (ja) |
| CA (1) | CA2054607C (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002281970A (ja) * | 2001-01-17 | 2002-10-02 | Univ Osaka | 細胞の加工方法 |
| US7132289B2 (en) | 2000-12-25 | 2006-11-07 | Osaka University | Method for introducing foreign matters into living cells |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6803499B1 (en) | 1989-08-09 | 2004-10-12 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US5550318A (en) * | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6777589B1 (en) * | 1990-01-22 | 2004-08-17 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6025545A (en) * | 1990-01-22 | 2000-02-15 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6329574B1 (en) | 1990-01-22 | 2001-12-11 | Dekalb Genetics Corporation | High lysine fertile transgenic corn plants |
| JP3209744B2 (ja) | 1990-01-22 | 2001-09-17 | デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション | 結実能力のある遺伝子変換コーン |
| US6395966B1 (en) | 1990-08-09 | 2002-05-28 | Dekalb Genetics Corp. | Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein |
| US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
| US6326527B1 (en) | 1993-08-25 | 2001-12-04 | Dekalb Genetics Corporation | Method for altering the nutritional content of plant seed |
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| KR100807434B1 (ko) * | 2000-08-03 | 2008-02-25 | 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤 | 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법 |
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| US11178823B2 (en) | 2014-04-07 | 2021-11-23 | Premier Citrus Apz, Llc | Systems and methods for using light energy to facilitate penetration of substances in plants |
| US10278334B2 (en) * | 2014-04-07 | 2019-05-07 | Premier Citrus Apz, Llc | Systems and methods for delivering nucleic acids to a plant |
| US9265260B1 (en) | 2014-04-07 | 2016-02-23 | Gpd Technologies Llc | Systems and methods for using light energy to facilitate penetration of substances in plants |
| US11191278B2 (en) * | 2016-03-25 | 2021-12-07 | Premier Citrus Apz, Llc | Systems and methods for delivering nucleic acids to a plant |
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| CN113854149A (zh) * | 2021-10-20 | 2021-12-31 | 上海市农业科学院 | 一种利用小麦小孢子培养愈伤组织的方法 |
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| EP0275069A3 (en) * | 1987-01-13 | 1990-04-25 | DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) | Pollen-mediated gene transformation in plants |
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1991
- 1991-10-24 AU AU86081/91A patent/AU643563B2/en not_active Ceased
- 1991-10-28 JP JP3307168A patent/JPH05207827A/ja active Pending
- 1991-10-30 US US07/784,709 patent/US5272072A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-31 EP EP19910118617 patent/EP0483847A3/de not_active Withdrawn
- 1991-10-31 CA CA002054607A patent/CA2054607C/en not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0483847A3 (en) | 1992-07-15 |
| AU8608191A (en) | 1992-05-07 |
| CA2054607A1 (en) | 1992-05-02 |
| EP0483847A2 (en) | 1992-05-06 |
| CA2054607C (en) | 1995-08-01 |
| AU643563B2 (en) | 1993-11-18 |
| US5272072A (en) | 1993-12-21 |
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