JPH05207891A

JPH05207891A - 脳性ナトリウム利尿ペプチドの製造方法

Info

Publication number: JPH05207891A
Application number: JP3043641A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Yoshida; 信男吉田; Masaru Shin; 優新; Hiroshi Teraoka; 宏寺岡; Mikio Tamaki; 幹男玉木; Takeshi Inoue; 健井上; Kunio Watanabe; 国夫渡辺
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1991-03-08
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 1993-08-20

Abstract

(57)【要約】【構成】Ｘ-Glu-BNP（Ｘは，インターフェロンγ，Δ
Cysインターフェロンγまたはインターフェロンα80A2
のＮ末端部分配列のような，アミノ酸が70〜170個のリ
ーダー配列；Gluグルタミン酸残基；そしてBNPは脳性ナ
トリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列）で示される融合
タンパクを，V8プロテアーゼなどのGluのＣ末端部分を
特異的に切断する酵素により切断する，脳性ナトリウム
利尿ペプチド（BNP）の製造法。この融合タンパクはBNP
をコードするDNAを含む発現ベクターを用いて，遺伝子
工学の手法で容易に得られ得る。【効果】上記方法によりBNPを容易に得ることができ
る。得られたBNPは，血管拡張剤，特に心不全に対する
薬物として，あるいは，各種分析用の試薬として好適に
使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，脳性ナトリウム利尿ペ
プチド（以下BNPと略称する）を融合タンパクとして生
産した後に酵素で処理してBNPを単離することにより，B
NPを効率よく製造する方法，該方法に使用されるBNPを
コードするDNA配列，該DNA配列を有する発現ベクター，
および該発現ベクターを有する形質転換体に関する。

【０００２】

【従来の技術】心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial
natriuretic peptide;ANP）の発見に続き，脳性ナトリ
ウム利尿ペプチド（brain natriuetic peptide;BNP）が
ブタの脳から単離同定されている。その後，BNPが心臓
ホルモンであり，このBNPは，例えばブタでは特に心房
において脳よりもはるかに高濃度で存在することが明か
となった。Sudoh，T．らは，ブタBNP前駆体をコードす
るcDNA断片をプローブとして用い，ヒトcDNAライブラリ
ーをスクリーニングすることにより，ヒトBNP前駆体のD
NA配列の決定を行った（Biochemical and Biophysical
Reserch Communications, Vol.159, No.3, 1427-1434,
1989；特開平2-231082号）。このようにヒトBNPのDNA配
列が明らかになったため，これをもとにヒトBNP関連ペ
プチドの化学合成も行われたが（特開平2-237999号），
その後，32ヶのアミノ酸残基からなるヒトBNP−32が心
房から直接単離されている（FEBS Letters, Vol.259, N
o.2,341-345）。この他にもラット，ウシなどのBNPが知
られ，その構造は，特定の共通部分を除いては，種族差
がかなりあることが知られている。

【０００３】上記のように，BNP，特にヒトBNPの構造は
明らかになっているが，BNPを遺伝子工学的手法により
発現させた例はこれまでに知られていない。BNPを遺伝
子工学的に大量生産することができれば，血管拡帳剤，
特に心不全の治療に有効な薬物として，あるいは，心不
全などの診断薬として好適に使用され得ると考えられ
る。

【０００４】

【発明の目的】本発明の目的は，BNP，特にヒトBNPを遺
伝子工学的手法により製造する方法を提供することにあ
る。

【０００５】本発明の他の目的は，BNPを融合タンパク
として生産した後に酵素で処理しBNPを単離することに
より，BNPを効率よく製造する方法を提供することにあ
る。

【０００６】本発明のさらに他の目的は，上記融合タン
パクをコードするDNA配列を有し，かつ該DNA配列の情報
を大腸菌において効率よく発現し得る発現ベクター，お
よび該発現ベクターが大腸菌に導入された形質転換体を
提供することにある。

【０００７】本発明のさらに他の目的は，BNPをコード
し，かつ大腸菌の使用頻度の高いコドンからなるDNA配
列を提供することにある。

【０００８】

【発明の構成】本発明のBNPの製造法は，次式（Ｉ）：Ｘ-Glu-BNP （Ｉ）（式中，Ｘはアミノ酸70〜170個のリーダー配列，Gluは
グルタミン酸残基，BNPはBNPのアミノ酸配列を表す）で
示される融合タンパクを得ること；および該融合タンパ
クを GluのＣ末端部分を特異的に切断し得る酵素により
切断し，ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドを採取するこ
と；を包含する。

【０００９】好適な実施態様においては，上記BNPは，
次の工程を含むプロセスにより採取される：前記融合タ
ンパクを変性剤または界面活性剤により可溶化する工
程；得られた可溶化液を希釈して変性剤または界面活性
剤の濃度を下げる工程，該希釈液に前記酵素を加え，該
融合タンパクが部分的に分解した可溶性の中間体を含有
する反応液を得る工程；該反応液を脱塩することによ
り，該中間体および酵素を含有し，かつ変性剤または界
面活性剤，を含有しない画分を得る工程；該画分に含ま
れる酵素による反応を引き続いて行い，BNPを遊離させ
る工程；および該BNPを単離する工程。

【００１０】本発明の発現ベクターは，上記融合タンパ
クをコードするDNA配列を有し，上記融合タンパクを大
腸菌体内で効率よく発現する。

【００１１】本発明の形質転換体は，上記発現ベクター
を大腸菌に導入して得られる。

【００１２】本発明は，ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチ
ドをコードする配列番号２に記載のDNA配列を包含す
る。

【００１３】本発明方法において調製される融合タンパ
クＸ-Glu-BNP（Ｉ）において，Xで示されるリーダー配
列としては発現レベルが高くなるようなアミノ酸配列が
選択される。適当な宿主である大腸菌内でＸをコードす
る配列を導入して発現させた場合に，融合タンパクが，
生産される全タンパクの20％以上となり，さらに，菌体
内で該融合タンパクが，顆粒(inclusion body)を形成す
るような配列が好適である。分子量は10〜20kダルトン
(70〜170アミノ酸)が適当である。Ｘとしては，例え
ば，インターフェロンγ，△Cysインターフェロンγ，
インターフェロンα80A2，インターフェロンσ，インタ
ーロイキン−１β，ウシ成長ホルモン，β−ガラクトシ
ダーゼ，ヒトインターロイキン−８，大腸菌のピルビン
酸キナーゼＩ，アミノグリコシド3'-ホスホトランスフ
ェラーゼ(APH)，これらのポリペプチドのＮ末端部分を
含む配列などが挙げられる。特に, インターフェロン
γ，△Cysインターフェロンγ, およびインターフェロ
ンα80A2のＮ末端の90-140アミノ酸部分を含む配列が好
適である。これらの配列がGlu残基を介してBNPに結合し
た形態のポリペプチドをコードするDNA配列を有する発
現ベクターを構築し，該発現ベクターで大腸菌を形質転
換することにより，BNPを大腸菌内で高効率でしかも安
定した融合タンパク顆粒として発現させることができ
る。

【００１４】以下に，本発明のBNPの製造法を工程の順
に説明する。この工程においての DNA組換え方法は，例
えば，モレキュラークローニング (Cold Spring Harbor
Laboratory, New York, 1982）に記載されている方法
により行うことができる。

【００１５】(A)BNPをコードするDNA配列の設計および
化学合成ヒトBNPのアミノ酸配列は，配列番号１に示される。こ
のヒトBNPをコードするDNA配列は，Sudoh, T.ら（前
出）によりすでに明らかにされている（配列番号１）。
本発明には，この DNA配列が使用され得るが，例えば，
宿主細胞として大腸菌を選択する場合には，大腸菌に利
用される頻度の高いコドンを優先して使用したBNPのDNA
配列を使用するのが有利である。本発明者らは，大腸菌
に利用される頻度の高いコドンを有するヒトBNPのDNA配
列を設計し，これを合成した。そのDNA配列を配列番号
２および図１に示す。

【００１６】このヒトBNPをコードするDNA配列は比較的
短鎖であるため，例えば，化学合成により得ることがで
きる。このような DNAは，例えば，図１に示す１２種類
のフラグメント（Fr１〜１２）を核酸自動合成機を用い
て合成し，高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの
クロマトグラフィーにより精製し，各フラグメントにリ
ン酸基を付加してリガーゼにより連結する常法により合
成され得る。連結して得られたDNA は，フェノール抽
出，エタノール沈澱，アガロースゲル電気泳動などの常
法を用いて単離される。アガロースゲル電気泳動におけ
るDNA断片の回収は，Nucl.Acids Res., 8,253〜264，19
80に記載の方法に従って，アガロースゲルからの溶出に
より行うことができる。

【００１７】BNPをコードする DNA配列を用いて，組換
え体プラスミド（発現ベクター）が構築される。

【００１８】(B)発現ベクターの構築本発明の発現ベクターの一例であるTrppATΔCyshuIFNγ
/huBNPΔApTc^rの構築を以下に述べる。この発現ベクタ
ーは，図３に示されるように，プラスミドpUC119/hBNP
のPstＩ−XbaＩ断片（BNPをコードする配列を含む断
片），およびプラスミドTrppATΔCyshuIFNγ/gulucag
on（ヨーロッパ特許出願公開第0381433号)のPstＩ−Xba
Ｉ断片から構築される。

【００１９】この発現ベクターを構築するには，まず図
２に示すように，プラスミドベクターpUC119（宝酒造）
をPstＩおよびXbaＩで切断し，大きい方の断片を得
る。これに，図１に示されるBNPをコードする配列を含
む約110bpの合成遺伝子断片を挿入して，クローニング
用のプラスミドであるプラスミドpUC119/hBNPを得る。

【００２０】次いで図３に示すように，このプラスミド
pUC119/hBNPをPstＩおよびXbaＩで切断し，短い方の断
片を得る。

【００２１】これとは別に，ヒトインターフェロンγ融
合グルカゴン発現プラスミドであるTrppATΔCyshuIFNγ
/glucagon（ヨーロッパ特許出願公開第0381433号）をPs
tＩおよびXbaＩで切断し，大きい方の断片を得る。上
記断片およびをT4DNAリガーゼを用いて連結するこ
とにより，発現ベクターTrppATΔCyshuINFγ/huBNPΔAp
Tc^rが得られる。この発現ベクターに挿入されたDNA断片
の塩基配列は，例えば，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，
74，5463-5467，1977，に従って調べることにより，該D
NA断片がヒトのBNPの32個のアミノ酸を正確にコードす
ることが確認される。このTrppATΔCyshuIFNγ/huBNPΔ
ApTc^rは，Trp遺伝子のプロモーター支配下に，ヒトIFN
γの４番目のGlnから135番目のSer残基までをコードす
る遺伝子配列を有し，その約30塩基下流にGlu残基をコ
ードする塩基配列を介してBNPのアミノ酸配列をコード
する塩基配列を含む。この発現ベクターのBNPをコード
するDNAの5'末端の接続付近の配列を図３の右下部に示
す。

【００２２】上記例では，ＸとしてΔCysインターフェ
ロンγのＮ末端配列を含む配列を有する発現ベクターを
調製したが，この他に，上述のインターフェロンγ，イ
ンターフェロンα80A2などの部分配列を有する発現ベク
ターが適宜調製され得る。

【００２３】(D)宿主細胞の形質転換および発現上記本発明の発現プラスミド，例えばTrppATΔCyshuIFN
γ/huBNPΔApTc^rは，モレキュラークローニング（前
出）の方法に従って適当な宿主細胞に導入される。形質
転換体は，テトラサイクリン耐性を指標に選択される。
上記発現プラスミドが導入された形質転換体は，ヒトBN
PとヒトIFNγとの融合タンパクを生産する。宿主細胞と
しては，大腸菌K12株C600，JM103，AG-1，931などが挙
げられるが，特に K12株C600が好適であり，この菌株を
用いることによりヒトBNPを含む融合タンパクが効率よ
く生産される。

【００２４】上記発現ベクター，TrppATΔCyshuIFNγ/h
uBNPΔApTc^rで大腸菌K12株C600を形質転換した形質転換
体は，TrppATΔCyshuIFNγfusedhuBNP/C600命名され
た。

【００２５】本発明の形質転換体を培養すると，ヒトBN
Pが融合タンパクとして宿主細胞内で発現する。

【００２６】(E)融合タンパクの可溶化，酵素による分
解およびBNPの単離・精製 BNPを含む融合タンパク(Ｘ-Glu-BNP)からBNPを採取する
には，該融合タンパクが顆粒タンパクとして宿主細胞内
に蓄積されるので，まず該顆粒タンパクを取り出し，そ
の可溶化を行う。

【００２７】それには，例えばまず，常法に従い培養液
を遠心分離して菌体を集め，該菌体を破砕してペレット
を得る。このペレットに，変性剤または界面活性剤を含
有する緩衝液を加え，可溶化する。変性剤としてはグア
ニジン（グアニジン塩酸），尿素などが用いられる。変
性剤は，ペレットが可溶化するのに充分な量で緩衝液に
添加して使用される。グアニジンおよび尿素は飽和に達
するまで添加して使用することもできるが，通常6〜8M
の濃度で使用するのが好ましい。界面活性剤としてはTw
een-80（商品名）が好適に用いられ，通常0.05〜0.2％
の濃度で使用される。緩衝液のpHは，次の酵素処理工程
を考慮し，該工程に用いられる酵素の至適pH付近に設定
するのが好ましい。例えば，酵素として S. aureus由来
のプロテアーゼV8（Sigma社製，No.P-8400）を用いる場
合には，pHを 7.8とするのが好ましい。そのため，緩衝
液としては，pH 7.8付近で緩衝能を有する緩衝液を用い
るのが好ましく，例えば，炭酸水素アンモニウム緩衝液
が好適に使用される。この緩衝液中には，酵素処理で用
いられる酵素が不純物として中性酵素などを含む場合
に，その活性を阻害するための酵素阻害剤として，EDTA
などが添加されてもよい。

【００２８】得られた可溶化液は，変性剤または界面活
性剤を高濃度で含有しており，次の酵素処理工程にその
まま使用すると酵素が充分に働かない場合がある。そこ
で，通常，可溶化液を変性剤または界面活性剤を含まな
い上記緩衝液などの希釈液で希釈する。希釈は，タンパ
クが可溶化した状態を維持でき，かつ後述の酵素処理に
使用する酵素が充分に作用しうる程度にまで行われる。
例えば，変性剤としてグアニジンまたは尿素を使用した
場合には，その濃度が4M以下，好ましくは2M程度となる
ように希釈を行う。ただし，可溶化液中のタンパク濃度
が0.1〜5mg/ml，好ましくは約0.5mg/mlとなるように留
意する。

【００２９】次いで，BNPを酵素処理によりＸタンパク
と分離する。上記可溶化溶液中には，目的とするBNPは
Glu残基を介してＸタンパクもしくはその部分変性体と
融合した状態で存在している。ヒトBNP中にはGlu残基は
存在しないので，Glu残基のＣ末端ペプチド結合を特異
的に切断する酵素で処理することによりBNPを完全な形
で切り出すことができる。このような酵素としては上記
のように S. aureus由来のプロテアーゼV8（Sigma社
製，No.P-8400）が好適であるが，これに限定されず，
Glu残基のカルボキシル側のペプチド結合のみを特異的
に切断する酵素であればいずれも使用され得る。例え
ば，S. aureus ATCC No.12600株由来のV8様プロテアー
ゼまたはB. licheniformis由来のV8様プロテアーゼもま
た，好適に利用され得る。酵素の使用量は，上記希釈液
中のタンパク量に対して1/50〜1/1,000（w/w）であり，
好ましくは約1/125（w/w）である。このような酵素を上
記希釈液に添加した酵素反応液を，室温〜40℃にて30分
〜７時間，穏やかに攪拌しながら反応させる。反応時間
は，添加する酵素の量により異なるが，例えば，酵素を
約1/125（w/w）の量で添加した場合には約３時間反応さ
せるのが好ましい。酵素反応は，塩酸，酢酸などの酸を
添加して，好ましくはpHを３程度に下げることにより停
止する。得られた酵素反応液中には，最終産物であるBN
P，およびＸ-Glu-BNPよりも低分子である中間体が含有
される。この中間体は，Ｘタンパク内のGlu残基が酵素
により切断されて生成されると考えられる。この中間体
は，反応液中の変性剤または界面活性剤が除去された場
合においても可溶性である。このような中間体が生成す
る原因としては，上記酵素反応液中の酵素が変性剤また
は界面活性剤により一時的に変性し，著しく活性が低下
していること；Ｘタンパク内のGlu残基が切断されるこ
とにより生成する低分子の分解産物が酵素作用を阻害し
ていること；融合タンパク中のGlu残基切断部位が，分
子の折りたたみなどの高次構造上の理由から酵素作用を
受けにくい状態になっていること；などが考えられる。
BNPの収率を上げるためには，さらにこの中間体を，上
記酵素で処理し，切断すればよい。そのためには，酵素
反応液中の変性剤または界面活性剤，およびタンパクＸ
内のGlu残基が切断されることにより生成する低分子の
分解産物を除去することが有効である。これらを除去す
るには，ゲル濾過，透析，逆相クロマトグラフィーなど
が有効である。特にゲル濾過が好適に用いられる。ゲル
濾過を行うには，変性剤または界面活性剤，および低分
子の分解産物を除去すると同時に，酵素と中間体とが同
じ画分に溶出されるような条件を採用するのが好まし
い。ゲル濾過により得られた中間体および酵素を含む画
分を集め，pHを酵素の至適pHに調整することにより，酵
素が再び活性化し，可溶化している中間体に作用するよ
うになると考えられる。得られた中間体含有画分を上記
酵素反応と同様の条件で反応させることにより，BNPが
遊離する。

【００３０】このようにして融合タンパクから切断され
たBNPは，常法通り，ゲル濾過クロマトグラフィー，ア
フィニティークロマトグラフィー，イオン交換クロマト
グラフィー，疎水クロマトグラフィー，逆相HPLCなどの
各種クロマトグラフィー，遠心分離操作などを適当に組
み合わせて精製できる。上記方法によれば，用いるGlu
残基を切断する酵素の量が少なくてすみ，経済的であ
る。

【００３１】本発明は，ヒトBNPを融合タンパクとして
製造する方法に限定されるものではなく，該タンパクを
発現させるベクター，形質転換体，およびBNPをコード
する特定の DNA配列が本発明に包含される。

【００３２】

【実施例】本発明を以下の実施例につき説明する。

【００３３】以下の実験において，DNA 組換え方法は，
全てモレキュラークローニング（Molecular Cloning，
Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)に記載の方法に
従って行った。用いた全ての酵素は宝酒造から購入し
た。

【００３４】(A)BNPをコードするDNA配列の設計および
化学合成ヒトBNPのアミノ酸配列をコードするDNA配列を，原則と
して大腸菌に最も利用される頻度の高いコドンを使用し
て設計した。この DNA配列は，第１番目のアミノ酸Ser
から第32番目のアミノ酸Hisまでをコードする，図１に
示されるDNA配列である。

【００３５】核酸自動合成機を用いて図１に示す12種の
短鎖フラグメントを化学合成した。これらのフラグメン
トは，リン酸基を付加した後，リガーゼにより結合さ
せ，図１に示す２本鎖構造を有するDNA配列を得た。こ
のDNA配列は，5'末端にGluをコードするGAAおよびPstＩ
切断部位を，そして3'末端に１つの終止コドンTAAおよ
びXbaＩ切断部位を有する。

【００３６】(B)発現ベクターの構築ヒトBNPを大腸菌において発現しうる発現ベクターであ
るTrppAThuIFNγ/huBNPΔApTc^rを，下記の(1)および(2)
項で得られる２つのDNA断片を連結することにより構築
した。この発現ベクターの構築の概略を図２および図３
に示す。

【００３７】(1)プラスミドpUC119/hBNPのPstＩ-XbaＩ
断片（BNPをコードする配列を含む断片）：図２および
図３に示すように，プラスミドベクターpUC119（宝酒
造）を原型として，目的とする遺伝子のクローニング用
ベクターであるプラスミドpUC119/hBNPを構築した。ま
ず，上記pUC119をPstＩおよびXbaＩで切断し，Ａ項で得
られた約110bpの合成遺伝子（図１に示されるDNA配列）
を挿入し，pUC119/hBNPと命名した。

【００３８】次いで図３に示すようにプラスミドpUC119
/hBNPをPstＩおよびXbaＩで切断し短い方の断片を得
た。

【００３９】(2)プラスミドベクターTrppATΔCyshuIFN
γ/glucagonのPstＩ-XbaＩ断片：図３に示すように，ヒ
トインターフェロンγ融合グルカゴン発現プラスミド
［TrppATΔCyshuIFNγ/glucagon（ヨーロッパ特許出願
公開第0381433号）］をPstＩおよびXbaＩで切断し，大
きい方の断片を得た。

【００４０】これらのおよびのDNA断片（Nucl．Aci
ds．Res．8，253-264，1980，に従ってアガロースゲル
電気泳動法により単離したもの）を図３に示すようにT4
DNAリガーゼを用いて連結して発現ベクターを構築し，
これをTrppATΔCyshuIFNγ/huBNPΔApTc^rと命名した。
次いでこの発現プラスミドに挿入されたDNA断片の塩基
配列をProc．Natl．Acad．Sci．USA，74，5463-5467，1
977，に記載の方法に従って調べることにより該DNA断片
がヒトBNPの32アミノ酸を正確にコードすることを確認
した。

【００４１】このTrppATΔCyshuIFNγ/huBNPΔApTc^rはT
rp遺伝子のプロモーター支配下にヒトIFNγの４番目のG
lnから135番目のSer残基までをコードする遺伝子配列を
有しその約30塩基下流にGlu残基をコードする塩基配列
を介してBNPのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
む。

【００４２】(C)宿主細胞の形質転換および発現宿主細胞として大腸菌K12株C600を用い，上記のように
構築された発現プラスミドTrppAThuIFNγ/huBNPΔApTc^r
で形質転換を行った。発現プラスミドが導入された形質
転換体は，テトラサイクリンに対する抵抗性を獲得する
ので，テトラサイクリン含有培地(15μg／mlのテトラサ
イクリンを含有するLB平板培地）上で37℃にて一晩培養
し，コロニーを形成したものを選択した。次いで，形成
されたコロニーを改変M9培地中で37℃にて24時間培養
し，培養後の菌体を遠心分離することにより集めた。こ
の菌体を緩衝液Ａ（8g/L NaCl，0.2g/L KCl，2.9g/L Na
₂HPO₄・12H₂O，0.2g/L KH₂PO₄，5mM EDTA，10mMβ−メ
ルカプトエタノールおよび10mMベンザミジン，pH6.65）
に懸濁し，よく攪拌した後に遠心分離し洗浄した。洗浄
菌体を集め，再び上記緩衝液Ａに100mL懸濁し，リゾチ
ームを，最終の濃度が60mg/g菌体湿重量となるように加
え，37℃にて１時間反応させた。その後，反応液を超音
波処理し，４℃にて15分間遠心分離（7000rpm）するこ
とにより顆粒画分を沈澱させ，ペレットを回収した。

【００４３】(D)融合タンパクの可溶化，V8プロテアー
ゼによる分解およびBNPの単離・精製 (C)項で得られた顆粒画分を含むペレット（1.65g）を8M
グアニジン塩酸を含む緩衝液Ｂ（50mM NH₄HCO₃，20mM E
DTAおよび10mMジチオスレイトール（DTT），pH7,8）75m
Lに溶解させた後，グアニジン塩酸を含まない緩衝液Ｂ
（225mL）を加えて希釈した。ここでタンパク量を測定
（150mg; Bio-Radプロテインアッセイによる）し，該タ
ンパク量の1/125量のプロテアーゼV8（Sigma社製，No.p
8400）1,2mgを加えて，室温で３時間反応させた。目的
とするBNPはGlu残基を介してIFNγと融合しており，し
かもBNP中にはGlu残基が存在しないので，V8プロテアー
ゼの作用により完全な形で（但し反応液が還元剤DTTを
含むため還元型として）切り出される。しかし，この初
期の消化では，Glu残基のカルボキシル側の結合がすべ
て切断されているわけではなく，得られた反応液（標品
ａ）中には，BNPおよびヒトIFNγが分解されてできた種
々の長さのペプチドが混在している。この標品ａを次の
ようにして精製した。まず，標品ａに1M塩酸を加えてpH
２〜３に調整した後，逆相クロマトグラフィー（₅₀Ｃ₁₈
カラム，30×200mm）にかけ，0.1%トリフルオロ酢酸（T
FA）を含む5%，30%および60%アセトニトリルで順次溶出
した。これにより，目的とするBNP（還元型）およびBNP
を分子内に含む不完全消化物はすべて30%アセトニトリ
ル画分に溶出された。このことは，溶出物をそれぞれプ
ロテアーゼV8で再消化した後，逆相HPLCにより分析し，
BNPのピークが検出されるか否かで確認した。得られた3
0%アセトニトリル画分を凍結乾燥して約30mgの粉末を得
た。次に，上記と同様に，1.65gの顆粒画分含有ペレッ
トから同様の操作により30%アセトニトリル画分（約30m
gの粉末）を得た。得られた上記30%アセトニトリル画分
を合わせて（約60mg）これを50mM酢酸アンモニウム（pH
7.8-8.0，50mL）に溶解させ，これにプロテアーゼV8
（0.16mg）を加え室温で３時間反応させた。ここでは反
応液は還元剤（DTT）を含まないので，BNPそのものが生
成する。反応液（標品ｂ）と標準ヒトBNP-32とをそれぞ
れ分析用逆相HPLC（₅Ｃ₁₈カラム，4.6×150mm）にか
け，アセトニトリルを含む0.1%TFAで溶出したところ
（但し，アセトニトリル濃度は30分を要して０%から60%
へと直線的に変化させた），保持時間14.895分のピーク
が標準BNPに一致した（図４のチャート参照）。そこ
で，標品ｂを分析用HPLCと同一の条件（但し，アセトニ
トリル濃度は0〜36%）で調製用HPLC（₅Ｃ₁₈カラム，20
×150mm）に付した。得られたHPLCのチャートを図５に
示す。分析用HPLCを用いたときの14.895分のピークに対
応する位置に溶出される画分を集めた。この画分（標品
ｃ）を，分析用HPLCにかけ，19.2%のアセトニトリルを
含む0.1%TFA（流速1.13ml/min）で溶出したところ（そ
の結果を図６に示す），保持時間7.215分に主成分が検
出された。そこで同一条件下で，調製用カラムにより標
品ｃのHPLCを行い（図７参照）対応する位置に溶出され
た主画分（標品ｄ）を集め，これを精製ペプチドとした
（収量2.1mg）。この標品ｄの逆相HPLCにおける溶出位
置は標準ヒトBNP-32のそれに全く一致した。

【００４４】次に，下記の方法によりアミノ酸分析なら
びにアミノ酸配列分析を実施した。これらの結果を，そ
れぞれ表１および表２に示す。

【００４５】アミノ酸分析法：検体を，封管中，少量の
フェノール存在下に6M塩酸で72時間加水分解する。この
加水分解物を日立アミノ酸分析機（Model 835）により
分析する。

【００４６】アミノ酸配列分析法：検体を，Applied Bi
osystems Protein Sequencer（Model 477A）を用いて分
析する。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【表２】

【００４９】さらに，次の方法により標品ｄの生物検定
を行った。

【００５０】生物検定法：ラット胸部大動脈をらせん状
に切って幅２〜３mm，長さ約２cmの帯状片を得，これを
0.5cmの長さに４等分してサンプル片とし，これを用い
て，次のように平滑筋弛緩活性を測定する。この帯状の
サンプルをKrebsの炭酸水素ナトリウム緩衝液中に入
れ，垂直に懸架する。37℃で，O₂95%およびCO₂5%の混合
ガスを通気しながら平衡化する。まず50mMKClを含む同
緩衝液中で収縮させる。次いで種々の濃度の検体（標本
ｄ）を加えてこのサンプル片を弛緩させる。最後に，0.
1mMとなるように塩酸パパベリンを添加し，引き起こさ
れたサンプル片の弛緩率を100%と見なし，検体による弛
緩の程度を算出する。

【００５１】標品ｄと標準ヒトBNP-32について測定した
結果を図８に示す。比較のためヒトα-ANPを用いたとき
の結果も合わせて示す。

【００５２】

【配列表】

【００５３】

【配列番号：１】配列の長さ：96 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 起源生物名：ヒト配列の特徴特徴を表す記号:CDS 特徴を決定した方法：Ｓ配列 AGC CCC AAG ATG GTG CAA GGG TCT GGC TGC TTT GGG AGG AAG ATG GAC 48 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp 1 5 10 15 CGG ATC AGC TCC TCC AGT GGC CTG GGC TGC AAA GTG CTG AGG CGG CAT 96 Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30

【００５４】

【配列番号：２】配列の長さ：96 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列 TCT CCG AAG ATG GTT CAG GGT AGC GGG TGC TTT GGC CGC AAA ATG GAT 48 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp 1 5 10 15 CGT ATC AGC TCC TCT TCC GGT CTG GGT TGC AAG GTA CTG CGT CGC CAC 96 Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドをコードする
本発明のDNA配列を含む合成断片を示す配列図である。

【図２】本発明の発現ベクターTrppATΔCyshuIFNγ/huB
NPΔApTc^rの構築に用いるプラスミドpUC119/hBNPの構築
を示す概略図である。

【図３】本発明の発現ベクターTrppATΔCyshuIFNγ/huB
NPΔApTc^rの構築を示す概略図である。

【図４】本発明の方法により生産される融合タンパクを
分解して得られるヒトBNPを含む画分の分析用HPLCのチ
ャートである。

【図５】本発明の方法により生産される融合タンパクを
分解して得られるヒトBNPを含む画分の調製用HPLCのチ
ャートである。

【図６】本発明の方法により生産される融合タンパクを
分解して得られるヒトBNPを含む精製画分の分析用HPLC
のチャートである。

【図７】本発明の方法により生産される融合タンパクを
分解して得られるヒトBNPを含む精製画分の調製用HPLC
のチャートである。

【図８】本発明の方法で得られるBNPを用いたときのラ
ットのインビトロでの血管弛緩作用を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/62 ＺＮＡ 15/70 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＲ 8314−4Ｃ 37/24 ＡＢＮ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者井上健兵庫県神戸市西区伊川谷町前開1296番地 (72)発明者渡辺国夫滋賀県大津市橋本町字杉谷125−67

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）：Ｘ-Glu-BNP （Ｉ）（式中，Ｘはアミノ酸70〜170個のリーダー配列，Gluは
グルタミン酸残基，BNPは脳性ナトリウム利尿ペプチド
のアミノ酸配列を表す）で示される融合タンパクを得る
工程；および該融合タンパクをGluのＣ末端部分を特異
的に切断し得る酵素により切断し，脳性ナトリウム利尿
ペプチドを採取する工程；を包含する脳性ナトリウム利
尿ペプチドの製造法。
【請求項２】前記Ｘがインターフェロンγ，△Cysイン
ターフェロンγ，またはインターフェロンα80A2のＮ末
端部分配列を含む配列である，請求項１に記載の製造
法。
【請求項３】前記脳性ナトリウム利尿ペプチドのアミノ
酸配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する，請
求項１に記載の製造法。
【請求項４】前記融合タンパクが，前記式（Ｉ）で示さ
れる融合タンパクを発現する発現ベクターを大腸菌に導
入して得た形質転換体を培養して前記融合タンパクを生
産させる工程を含むプロセスにより得られる，請求項１
に記載の脳性ナトリウム利尿ペプチドの製造法。
【請求項５】前記脳性ナトリウム利尿ペプチドが次の工
程を含むプロセスにより採取される，請求項１に記載の
製造法：前記融合タンパクを変性剤または界面活性剤に
より可溶化する工程；得られた可溶化液を希釈して変性
剤または界面活性剤の濃度を下げる工程；該希釈液に前
記酵素を加え，該融合タンパクが部分的に分解した可溶
性の中間体を含有する反応液を得る工程；該反応液を脱
塩することにより，該中間体および酵素を含有し，かつ
変性剤または界面活性剤を含有しない画分を得る工程；
該画分に含まれる酵素による反応を引き続いて行い，脳
性ナトリウム利尿ペプチドを遊離させる工程；および該
脳性ナトリウム利尿ペプチドを単離する工程。
【請求項６】前記酵素がスタフィロコッカスアウレウ
ス（Staphylococcus aureus）由来のプロテアーゼV8，
スタフィロコッカスアウレウス ATCC 12600株由来の
V8様プロテアーゼ，またはバシラスリケニホルミス
（Bacillus licheniformis）由来のV8様プロテアーゼで
ある，請求項１に記載の製造法。
【請求項７】脳性ナトリウム利尿ペプチドをコードする
配列番号２に記載のDNA配列。
【請求項８】式（Ｉ）：Ｘ-Glu-BNP （Ｉ）（式中，Ｘはアミノ酸70〜170個のリーダー配列，Gluは
グルタミン酸残基，BNPは脳性ナトリウム利尿ペプチド
のアミノ酸配列を表す）で示される融合タンパクをコー
ドするDNA配列を有する発現ベクター。
【請求項９】前記脳性ナトリウム利尿ペプチドのアミノ
酸配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する，請
求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】前記脳性ナトリウム利尿ペプチドのアミ
ノ酸配列が配列番号２に記載のDNA配列を有する，請求
項８に記載の発現ベクター。
【請求項１１】TrppATΔCyshuIFNγ/huBNPΔApTc^rであ
る請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１２】請求項８に記載の発現ベクターを大腸菌
に導入して得られる形質転換体。