JPH05210052A

JPH05210052A - 顕微鏡を通してレーザ光を照射する装置及び方法

Info

Publication number: JPH05210052A
Application number: JP2916692A
Authority: JP
Inventors: Sei Murakami; 聖村上; Nobuo Kimura; 信夫木村; Masao Takai; 正生高井; Takamori Nakano; 隆盛中野
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1991-02-27
Filing date: 1992-02-17
Publication date: 1993-08-20

Abstract

(57)【要約】【構成】倒立形顕微鏡にＸ方向及びＹ２方向の２枚のガ
ルバノメータミラー２、３を設け、試料台１０上に載せ
られてシャーレ中の生細胞５へのレーザ光照射位置を制
御する。ガルバノメータミラー２、３は対物レンズ４の
レーザ光路上手前に設けられ、望ましくは対物レンズ４
の先端のレーザ光の焦点から該レーザ光路上の距離で２
０cm以内に設けられたことを特徴とする生細胞レーザ照
射装置。【効果】本発明によれば、生細胞レーザ照射装置による
操作を容易にするとともに操作対象となる生細胞の種類
を拡大することが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、顕微鏡を通してレーザ
光を照射する装置及び方法、特に倒立顕微鏡を使用する
ものに関する。

【０００２】

【従来の技術】試料台上に載せた試料にレーザ光を照射
するために光学顕微鏡を用いることが知られている。レ
ーザ光は顕微鏡の対物レンズを通して試料に照射され、
観察と照射が同時に行なわれる。

【０００３】よく知られた用途として生細胞へのレーザ
照射がある。特開昭62-7837号公報に方法と装置が記載
されている。

【０００４】図２に示すように従来から知られているレ
ーザ光の照射装置（公知例）では制御されたレーザ照射
は、通常の(正立)顕微鏡を用いて行なわれている。顕微
鏡光学系は、同図に示されるように試料台１０’の上側
に置かれた対物レンズ４’とそれに続き接眼レンズ２
０’から構成される。試料容器１１’はＤＮＡ溶液と、
レーザ照射される細胞５を収納している。対物レンズ
４’の先端と細胞５の間の距離を作動距離（ＷＤ）とし
て示した。レーザ光源１は顕微鏡の近くに置かれ、レー
ザ光１０１はガルバノメータで制御されたミラー２’，
３’を用いて対物レンズ４’の背面に導かれる。

【０００５】最終段のミラー３’は対物レンズと接眼レ
ンズ２０’を結んだ線上に設置される。

【０００６】細胞５の像の焦点を合わせ、レーザ光を細
胞上に集光させるためには、細胞と溶液は対物レンズ先
端から作動距離（ＷＤ）の位置に置かれなければならな
い。作動距離（ＷＤ）は非常に小さく、通常１mm以下で
ある。もしも細胞と溶液が標準的なペトリディシュに入
れられている場合、ディッシュが溶液で満たされている
場合でも、ほとんどの細胞が底に沈んでしまい対物レン
ズから１mm以上離れてしまうため、この装置は使用する
ことができない。従って特製の密閉容器１１’を用いて
細胞を何らかの方法で上面に付着することが行なわれて
いた。

【０００７】これは又、容器１１’は細胞に溶液が常時
接するようにＤＮＡ溶液で完全に満たされている必要が
あることを意味している。従って大量のＤＮＡ溶液が必
要であると共に通常の培養用ペトリディッシュを用いる
こともできない。

【０００８】操作中は、１ヶもしくは両方のガリバノメ
ータで制御されたミラーはレーザ光を視野内の所望の位
置に向けるように調整される。このようにして、公知の
手法によって細胞に微細な穿孔を行ない外来ＤＮＡを導
入することが可能である。

【０００９】特に生物学において、上記問題の多くは倒
立顕微鏡を用いることによって避けることができる。

【００１０】この顕微鏡は対物レンズ先端が上を向いて
試料台下に設置されている。

【００１１】Journal of cell Science, ８８，第１４
５頁〜第１４９頁（１９８７年版）にレーザによる細胞
融合に倒立顕微鏡を用いた例が記載されている。この装
置ではＺｅｉｓｓのＩＭ３５型倒立顕微鏡を用いてい
る。螢光照明等のための標準照明装置の中に、試料照明
用に顕微鏡の光学系中に組み込まれた傾斜したハーフミ
ラーがある。この標準照明光源が傾斜したミラーに向け
られた色素レーザで置きかえられている。倒立顕微鏡の
光路は非常に複雑である。レーザ光を試料上に集光する
ため、この著者逹は傾斜ミラーの手前のレーザ光路上に
１枚のレンズを置く必要があったため、レーザ光の方向
の制御が容易には行なえなかった。レーザ照射位置は試
料台の水平方向のＸＹ軸制御によってのみ選択すること
ができた。

【００１２】このように倒立顕微鏡においてレーザ光の
方向を制御することの利点があるにもかかわらず、これ
は実現されていなかった。倒立顕微鏡を用いることによ
る利点は技術者には一般に知られている。それらのうち
いくつかは図１を用いて後述する。さらに、倒立顕微鏡
は生物学分野で特に利用されているため、マイクロピュ
レータのような多くの特殊器具が倒立顕微鏡用に作られ
ている。方向制御されたレーザ照射が倒立顕微鏡で行な
えないということは、これらの特殊器具も使えないいと
いう問題も含んでいる。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、初めて
倒立顕微鏡の対物レンズを通してその方向を遠隔制御可
能なレーザ光を照射する装置を提供した。

【００１４】すなわち、本発明はレーザ光を試料に照射
するための顕微鏡装置であり、対物レンズと、光路上対
物レンズの背面に少なくとも２ヶ以上の遠隔制御可能で
あることを特長とするレーザ光偏向装置を備えた倒立顕
微鏡である。

【００１５】発明者らは、集束もしくは発散をしない平
行光の領域が正立顕微鏡と同様に倒立顕微鏡の対物レン
ズ手前の光路内でレーザ光の導入部として選択されるか
作り出されれば、前記公知例のような補助レンズを導入
部の近くに設けることなくレーザ光を試料上に集光でき
ることを見出した。

【００１６】このことによってレーザ光の向きを変える
ための偏向装置の構造が簡略化されるための、遠隔制御
が容易に行なえる。

【００１７】

【課題を解決するための手段】１つの例として光路中に
レーザ光導入用に設けられた偏向装置そのものを、制御
可能な偏向装置の１つとすることができる。

【００１８】通常２ヶもしくはそれ以上の制御可能な偏
向装置をレーザ光路上の設けることによって１つの偏向
装置をＸ軸用、他をＹ軸用とする２次元の方向制御が可
能となる。

【００１９】ガルバノメータで駆動される偏向装置をレ
ーザ光の偏向に用いることができる。これにより容易に
遠隔制御による操作を行なうことができる。

【００２０】レーザ光源は既知のものを用いることがで
きる。発明者らは顕微鏡視野内の有効なレーザ光照射の
ためには、対物レンズ手前からレーザ光偏向装置までの
距離について注意を要することを見出した。もしも１つ
の制御可能な偏向装置がレーザ光路上、対物レンズ背面
より離れ過ぎていると、一定角度の偏向を行なった際に
対物レンズの構造上からレーザ光の一部が欠けて試料ま
で到達しない。すなわち、全ての制御可能な偏向装置が
レーザ光路上、対物レンズの主平面から２００mm以内に
あれば、顕微鏡視野内を有効にレーザ光で照射できるこ
とを見出した。

【００２１】詳細には、水平方向に移動可能な試料台、
焦点合せのために試料台下で光軸方向に移動可能な対物
レンズ、対物レンズ下部の固定された構体を備えた倒立
顕微鏡と、かかる対物レンズとその下部の固定された構
体との間に設けられた遠隔制御可能なレーザ光偏向装置
を用いて、レーザを試料台上の試料に照射するための装
置から構成される。

【００２２】これは、一般的な倒立顕微鏡の構造と同じ
であり、試料台は、水平方向に移動可能であるが、対物
レンズの光軸方向には、顕微鏡の構体に対して固定され
ている。これは試料台が構体に対して上下動をする旧来
の正立顕微鏡とは根本的に異なる。更に、本発明は倒立
顕微鏡の試料台上に載せられた試料の任意の位置にレー
ザ光を照射する方法であり、焦点合せの後、複数のレー
ザ偏向装置を制御することで試料上の任意の位置にレー
ザ光を照射することを特長とする。

【００２３】

【作用】前記のように偏向装置は電気的に遠隔操作可能
なガルバノモータ駆動のミラーを用いることができる。

【００２４】レーザ光の試料上への照射位置はいろいろ
な方法で制御することができる。従来、電動試料台を動
かすことでこれは可能であった。しかし、試料台の慣性
の制限から移動速度をあまり速くすることができなかっ
た。本発明は、慣性の小さなレーザ光偏向装置を用いる
ことにより静止した試料上を高速でレーザ光照射位置を
移動されたり、高い応答性でライトペン等で指示された
任意の位置にレーザ光照射位置を移動することができ
る。

【００２５】本発明は、細胞への遺伝子移入のような生
物学分野への応用に特に適している。

【００２６】

【実施例】以下本発明の一実施例を図を用いて説明す
る。

【００２７】図１は、本発明の一実施例のレーザ照射装
置主要部の構造図である。

【００２８】図２は、一般的な正立型顕微鏡を用いたレ
ーザ光照射装置の構造図である。

【００２９】図３は、レーザ光偏向部回りの詳細の構造
図である。

【００３０】図４は、対物レンズアッヤンブリーの側面
図であり、開口絞りとレンズが見えるように後端部は断
面を示す。

【００３１】図５の（ａ）〜（ｃ）は対物レンズでの各
状態におけるレーザ光の光路を示す。

【００３２】図６は、図５におけるｌ₁とレーザ光照射
可能領域の関係について、２種の倍率のレンズの場合を
示す。

【００３３】図７は、図６の関係におけるレーザ光の口
径の影響を示す。

【００３４】図１は本発明と同様の機構をもつ装置の構
造図である。正立顕微鏡の代わりに倒立顕微鏡が用いら
れている。図１に複雑な倒立顕微鏡の光学系を示す。接
眼レンズ２０から下に向かう光路は主反射鏡２２，２１
を通り、試料台１０の下に上向きに取り付けられた対物
レンズ４に下から入射する。

【００３５】図３に詳細を示す。一点鎖線３０で囲まれ
た範囲は通常顕微鏡の主構体に固定されている。試料台
１０は矢印Ｂで示すように水平方向（Ｘ，Ｙ方向）に移
動可能である。これは試料の異なる部位を観察するのに
便利である。対物レンズユニット４は、固定された顕微
鏡構体に対して矢印Ａの様に鉛直方向に移動可能であ
り、焦点合わせができる。

【００３６】倒立顕微鏡においては、細胞５が溶液６の
底部に沈むための通常のペトリディッシュを用いること
ができ、細胞の載ったペトリディッシュ底面は試料台と
同様に対物レンズ光軸に直行する平面となることができ
る。

【００３７】又、図１に示すレーザ光源は従来から用い
られているものと同じである。ガルバノメータで駆動さ
れる第１及び第２のミラー２，３が設けられている。第
１ミラー２は顕微鏡外にレーザ光源１に向けて取り付け
られている。第２ミラー３は顕微鏡光路中にレーザ光１
０１を導入するために用いられ、対物レンズ４の背面の
光路上に取り付けられる。図３の破線は倒立顕微鏡の対
物レンズ背面の光路の拡大、収束の様子を示している。
本実施例の場合、光路が平行となる領域２５があり、第
２ミラー３は顕微鏡光路上のこの平行光路領域２５に設
けられる。通常この平行光路領域は対物レンズを焦点合
わせのに移動しても、対物レンズから接眼レンズまでの
光路に影響がでないようにするために倒立顕微鏡に設け
られているものである。しかしながら、Journal of Cel
l Science, 88, 第145頁〜第149頁（1987年版）に記載
された装置と同様に、制御されたレーザ光偏向装置を取
り付けるには狭すぎることが多い。

【００３８】特別に製作することによって、制御された
レーザ光偏向装置を平行光路領域に取り付け可能とする
ことができる。しかしながら、オリンパスＩＭＴ−２型
倒立顕微鏡のように本目的に流用可能な平行光路領域を
持ったものが既にある。この顕微鏡は制御されたレーザ
光偏向装置を取り付けるために設計されたものではない
が、落射照明導入用のハーフミラーが平行光路領域にあ
るため、これと交換することにより制御されたレーザ光
偏向装置を取り付けることが可能である。他の顕微鏡の
多くは、Journal of Cell Science, 88, 第145頁〜第14
9頁（1987年版）に記載されるように、非平行光路領域
に落射照明光導入用ハーフミラーが取り付けられてい
る。

【００３９】レーザ光は平行光路領域に導入されるた
め、試料の観察像の焦平面上にレーザ光を集光すること
ができ、レーザ光偏向装置３の手前近房に観察光路に合
わせてレーザ光を拡散もしくは収束させるためのレンズ
類が不用であるため、構造を単純かつ小さくすることが
できる。本構成ではミラー２，３はレーザ光の向きを
変えるためにその動きを制御することが可能である。取
り付け位置については顕微鏡光路中のミラー３は固定と
し、その手前のレーザ光路上に複数の制御可能な可動ミ
ラーを設けることもできる。

【００４０】レーザ光１０１の偏向用の制御可能なミラ
ー２，３が対物レンズ４の手前に十分近く設置されてい
ることが本装置の重要な特長である。ここでいう「手
前」とはレーザ光上で対物レンズ４よりもレーザ光源側
であることを意味する。この理由は新たに検討されたも
のであり、以下に説明する。

【００４１】図４に標準的な対物レンズの構造図を示
す。

【００４２】対物レンズは実際には顕微鏡本体に取り付
けるためのネジ部のある開口を背面にもつケーシング内
に複数のレンズを組み込んだものである。レーザ光が対
物レンズ４の背面の中心に入射したばあい、レーザ光直
径が対物レンズケーシングの開口径ｄ₂および第１段レ
ンズの有効入射径ｄ₁よりも小さければそのまま全部対
物レンズに入射する。対物レンズケーシングの開口径ｄ
₂が最大入射径を規定することもあるが、多くの場合、
第１段レンズ１６の有効径が最大入射径を規定する。通
常レーザ光の直径は対物レンズの入射有効径ｄの１／３
から１／４である。レーザ光が対物レンズ光軸からずれ
て入射する場合でも、ずれ量がｄ₁もしくはｄ₂とレーザ
光直径の差の半分以下であれば、レーザ光はそのまま対
物レンズに入射される。しかしながら、同じレーザ光の
偏向角でも偏向を行なう場所が対物レンズから遠くなる
と対物レンズ入射部での光軸のずれ量が大きくなり、レ
ーザ光の一部が遮られる。このため対物レンズを通過後
の有効照射範囲が狭くなる。

【００４３】前記について以下に詳述する。対物レンズ
を構成する複数のレンズはある特定の位置に物体側主平
面を持つ１枚のレンズとみなすことができる。これは図
１中「ＰＰ」と記されているが、実際の位置は個々の対
物レンズの種類によって異なる。レーザ光偏向装置と主
平面感の距離ｌ₁と有効レーザ照射範囲の関係について
以下に述べる。

【００４４】図５は顕微鏡光軸上に配置された試料面
７、主平面８を持つ対物レンズ４及びレーザ光偏向装置
３を示す。物体側主平面と像側主平面は同一面８上にあ
るとしている。レーザ光は対物レンズ４により作動距離
（ＷＤ）の位置にある試料面７上に集光する。ｌ₁は対
物レンズの主平面８と反射ミラー３の間の距離（ＡＢ）
である。ＢＥ間の距離ｌ₂は次式によって決まる。

【００４５】

【数１】

【００４６】ここでｆは対物レンズ４の焦点距離であ
る。レーザ光が対物レンズで遮られるか否かは前述した
対物レンズ４の絞りｄによって決まる。これを図５
（ｂ）に示す。図５（ｂ）は、図５（ａ）のレーザ光の
直径が無視できるほど小さい場合である。同図中のＦＧ
の２倍の領域がレーザ光の照射可能範囲である。これ以
上の偏向角を与えるとレーザ光は絞りｄによって遮られ
て試料面７に到達しない。

【００４７】倒立顕微鏡の場合は、対物レンズ背面で平
行光領域を作るための補正レンズ９が用いられる。正立
顕微鏡の場合には補正レンズ９を用いることなく平行光
領域が得られる無限遠補正を行った特殊なものもある。
図５（ｃ）にこの補正レンズ９を示す。この場合には図
５（ｂ）と等価なレーザ光偏向装置の位置Ａ’は実際の
位置と異なる。

【００４８】前記条件のもとでｌ₁とレーザ光照射可能
範囲の関係を計算した。よく用いられるレンズとして２
０倍対物レンズ（開口絞り径６.８mm，焦点距離３.９３
mm）および４０倍対物レンズ（開口絞り径１０.８mm，
焦点距離７.６２mm）の場合について計算した。

【００４９】図６に計算結果を示す。顕微鏡に取り付け
たテレビカメラによるモニタテレビ上で観察可能な視野
は４０倍対物レンズの場合、約１００μｍ四方である。
従って同視野内を有効にレーザ光照射するためにはｌ₁
は２２０mm以下でなければならず、さもないと視野の周
辺部では対物レンズ開口絞りによってレーザ光が遮られ
て試料上にレーザ光が到達しない。

【００５０】図６ではレーザ光直径を無視している。実
際にはレーザ光は通常数ミリメータの直径を持つ。図７
は４０倍の対物レンズについてレーザ光直径を２mmとし
たときの計算結果である。実線は図６と同じものであ
る。破線はレーザ光の少なくとも一部が到達する境界を
示す。領域Ｘでは半分以上のレーザ光が視野中の試料に
到達する。領域Ｙでは半分以下のレーザ光が視野中の試
料に到達する。領域Ｚでは視野周辺部では、全くレーザ
光が試料上に到達しない。実際の操作では領域Ｘでの操
作が望ましい。ｌ₁を１００mmとした実験では、径２０
０μｍの視野周辺部で、小さなエネルギーで細胞にレー
ザ光で穿孔することが可能であった。（図７点Ａ参照）
これは前記計算結果と一致する。レーザエネルギーが十
分高ければ、レーザ光の一部だけでも細胞に穿孔するの
に十分なはずである。そこで径３００μｍの視野周辺部
でレーザエネルギーを上げて実験を行ったところ、細胞
に穿孔することができた。

【００５１】

【発明の効果】本発明によれば、ガルバノメータ等の電
気的に遠隔操作可能な光路偏向手段を用いてレーザ光照
射の操作性を向上させながら、生細胞の試料準備を容易
にできるため、生細胞レーザ照射装置による操作が容易
にできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例の倒立形顕微鏡を用いた生細
胞レーザ照射装置のシステム構成図である。

【図２】従来技術の正立形顕微鏡を用いた生細胞レーザ
照射装置のシステム構成図である。

【図３】レーザ光偏光回りの詳細構造図である。

【図４】対物レンズとレーザ光入射側のレンズを示す正
面図である。

【図５】対物レンズ近傍のレーザ光の挙動を示す説明図
である。

【図６】Ｌ₁とレーザ光を照射できる範囲の関係を示す
計算及び実験値の説明図である。

【図７】Ｌ₁とレーザ光を照射できる範囲の関係を示す
計算及び実験値の説明図である。

【符号の説明】１…レーザ光源、２…Ｘ方向ガルバノメータミラー、３
…Ｙ方向ガルバノメータミラー、４…対物レンズ、５…
生細胞、８…対物レンズの物体側主平面、１０…試料
台。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者中野隆盛山口県下松市大字東豊井794番地株式会社日立製作所笠戸工場内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料上にレーザ光を照射するための顕微鏡
装置で、対物レンズを備えた倒立顕微鏡の対物レンズに
入射するレーザ光の方向を変化させる装置を持ち、かか
る方向を変化させる装置はレーザ光源と対物レンズ間に
設けられた２個以上のレーザ光偏向装置であり、操作中
にレーザ光偏向方向を変更可能に制御できることを特徴
とする装置。
【請求項２】１項記載の装置で、かかる倒立顕微鏡は、
その試料観察の光路途中に平行光路となる領域を持ち、
レーザ光がかかる平行光路領域で観察光路に導入される
ことを特徴とする装置。
【請求項３】２項記載の装置で、かかる制御可能なレー
ザ光偏向装置の内の１個がかかる平行光路領域に設けら
れることを特徴とする装置。
【請求項４】１項記載の装置で、制御可能なレーザ光偏
向装置の内、少なくとも１個はガルバノメータで駆動さ
れる反射ミラーであることを特徴とする装置。
【請求項５】１項記載の装置で、２個のレーザ光偏向装
置の動作は試料面上で互いに直交する方向の１次元動作
であり、結果として試料面上に到達するレーザ光の位置
を２次元に変化させることができることを特徴とする装
置。
【請求項６】１項記載の装置で、かかる制御可能なレー
ザ光偏向装置の内の１個が顕微鏡の観察光路上に設けら
れることを特徴とする装置。
【請求項７】１項記載の装置で、全ての制御可能なレー
ザ光偏向装置が、対物レンズとレーザ光源間のレーザ光
路上の距離で、対物レンズの物体側主平面から２００mm
以内にあることを特徴とする装置。
【請求項８】１項記載の装置で、対物レンズ光軸方向に
試料台と顕微鏡構造体が固定され、これらに対して対物
レンズがその光軸方向に相対的に移動可能であり、レー
ザ光の導入用ハーフミラーが顕微鏡構造体と対物レンズ
の間にあることを特徴とする装置。
【請求項９】８項記載の装置で、顕微鏡の観察光路中に
平行光の領域があり、その部分からレーザ光が導入され
ることを特徴とする装置。
【請求項１０】９項記載の装置で、レーザ光偏光装置が
ガルバノメータ駆動の反射ミラーであることを特徴とす
る装置。
【請求項１１】８項記載の装置で、レーザ光導入用のハ
ーフミラーの回転軸が、顕微鏡構造体に対して固定され
ていることを特徴とする装置。
【請求項１２】倒立顕微鏡の試料台上の試料の選択され
た位置にレーザ光を照射する方法で、レーザ光を対物レ
ンズを通して試料に照射するために観察光路中に導入す
る手段、対物レンズを動かすことにより試料上にレーザ
光を集光させる手段および複数の制御可能なレーザ光偏
向装置を制御することにより、試料上の特定の位置にレ
ーザ光を向けることを特徴とする方法。
【請求項１３】１２項記載の方法で、倒立顕微鏡はその
観察光路中に平行光路領域を持ち、かかる平行光路領域
からレーザ光を導入することを特徴とする方法。
【請求項１４】１２項記載の方法で、複数の制御可能な
レーザ光偏向装置を電気的に遠隔制御して試料上の選択
された位置にレーザ光を向けることを特徴とする方法。
【請求項１５】１２項記載の方法で、試料上の特定の位
置を個別に継続的に選定することを特徴する方法。
【請求項１６】１２項記載の方法で、試料上を連続して
レーザ光が走査するようにレーザ光偏向装置を制御する
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】１２項記載の方法で、全てのレーザ光の
偏向制御は対物レンズとレーザ光源間のレーザ光路上の
距離で、対物レンズの物体側主平面から２００ｍｍ以内
で行なうことを特徴とする方法。
【請求項１８】１２項記載の方法で、試料が細胞である
ことを特徴とする方法。