JPH0521508B2 - - Google Patents
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- JPH0521508B2 JPH0521508B2 JP61273082A JP27308286A JPH0521508B2 JP H0521508 B2 JPH0521508 B2 JP H0521508B2 JP 61273082 A JP61273082 A JP 61273082A JP 27308286 A JP27308286 A JP 27308286A JP H0521508 B2 JPH0521508 B2 JP H0521508B2
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
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- G—PHYSICS
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
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- G—PHYSICS
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Description
産業上の利用分野
本発明は、細胞集団もしくは亜集団殊に血液細
胞の定量法並びにこのために好適な試薬に関す
る。 本発明方法は、特に、リンパ球殊にＴ−リンパ
球もしくはその亜集団、Ｔ−ヘルパー（Helfer）
及びＴ−サプレツサー細胞の測定に好適である。 従来の技術 Ｔ−リンパ球は、液体のかつ細胞の免疫系に対
する調整機能を有する。これらは、発生段階及び
機能に応じて分類される。Ｔ−細胞では、種々の
成熟段階が、下位群におけると同様に区別される
はずである。これらは、個々の発生段階及び機能
的下位群にとつて特異的である表面抗原によつて
特徴付けられうる。分類は、一方では機能的判定
で、かつ他方では血清学的識別によつて可能であ
る。種々の抗原組成の比較により、提供者の細胞
集団及びこれに伴なう現時点の免疫状態に関する
推論を引き出すことができる。 静止Ｔ−細胞は、それらが機能的に活性になり
うる以前に抗原によつてまず刺激されるべきであ
る。例えば、Ｔ−ヘルパー細胞は、Ｂ−リンパ球
を刺激して、増殖し、分化しかつ抗体を生産させ
る。これは、同様に、リンパ様細胞系統からマク
ロフアージ及び特異的な表面抗原を有する細胞に
対する細胞毒反応をするように刺激されるＴ−サ
プレツサー細胞を活性化する。 Ｔ−サプレツサーリンパ球は、活性状態で抗体
−生産の抑制及び所望のリンパ球培養液中のオー
トログ（autologen）Ｔ−細胞の反応に作用す
る。同様に、このＴ−サプレツサー細胞は、
HLA−抗原を有する細胞（HLA＝ヒト白血球抗
原）での感作の後のターゲツト細胞に対する細胞
毒性反応を示す。 血液中の通常の濃度並びにＴ−ヘルパーとＴ−
サプレツサー細胞とからの商は、次の範囲内に存
在する： Ｔ−リンパ球（総）
細胞0.5〜1.5×106／血液（ml） Ｔ−サプレツサー
細胞0.15〜0.45×106／血液（ml） Ｔ−ヘルパー 細胞0.3〜0.9×106／血液（ml） Ｔ−ヘルパー／Ｔ−サプレツサー 1.2〜3.9 種々の病気は、Ｔ−細胞亜集団の組成を変える
作用をし、この際、１集団の生産は低減又は強化
される。これらの変動は、疾病経過の非常に早期
に現われる。この例には次のものがある： − 複合リウマチ病、自己免疾病（例えばリウマ
チ性関節炎、系統的紅斑性狼瘡）、 − 伝染性疾病（例えばAIDS、ウイルス性及び
真菌性伝染病）、 − 悪性Ｔ−細胞疾病（例えば白血病、リンパ
腫）。 従つて、免疫状態即ち、Ｔ−リンパ球の総数及
びＴ−ヘルパー及びＴ−サプレツサー細胞の相対
分の検査は、著るしい診断上の発展をもたらす。 細胞集団及び亜集団に関する従来の測定法は、
主として蛍光物質で標識されている相応する特異
性の抗体での細胞の着色及び蛍光顕微鏡下でのそ
の計測よりなつている。この方法は非常に経費が
かかり、人集約的方法であり、主観的評価のみを
可能とすることは公知のことである。 この原理は、蛍光活性化セルソーター
〔fluorescent activated cell sorter（FACS）〕を
用いて機械化し、可視化することができる。この
方法では、機械的計測は排除される。しかしなが
ら、この方法は多大な装置経費を伴ない、熟練者
の取扱いが必要である。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、細胞集団の総数並びに特定の
亜集団のそれを測定することのできる簡単な方法
を提供することであつた。 問題点を解決するための手段 この課題は本発明方法により解決される。 本発明の目的は、細胞集団もしくは亜集団を定
量する方法であり、これは、 特定の細胞集団を有する試料を被測定細胞集団の
特性的表面抗原に特異的に結合しうる標識付抗体
と共にインキユベートし、 既知の種々の粒子濃度を有する１種以上の標準物
を同じ標識付抗体と共に同様にインキユベートし
（この際、この標準溶液は、その沈殿特性が被測
定細胞のそれに匹敵し、標識付抗体もしくはその
一部分に対して特異的に対向している分子を有し
ている粒子よりなる）、 試料溶液の細胞並びに標準溶液の粒子から過剰の
標識付抗体を分離除去し、細胞上並びに粒子上の
標識量を測定し、試料からの測定値と標準溶液か
らの測定値を比較することにより、試料中の被測
定細胞の数を確認することよりなる。 本発明の方法は、一般に、細胞集団もしくは亜
集団を定量するために使用可能である。特に、血
液細胞殊にリンパ球の定量のための方法が好適で
ある。特に、この方法はＴ−細胞及びＴ−ヘルパ
ー及びＴ−サプレツサー亜集団の総数の測定時に
有利であることが立証された。これにより、診断
及び治療経過管理のための現時点での免疫状態に
関する信用しうるかつ正確な報告を得ることがで
きる。 被測定細胞集団を特性付ける抗原（細胞表面抗
原）に結合しうる抗体として、ポリクロナール抗
体もモノクロナール抗体も使用できる。完全抗体
も抗体フラグメントも使用できる。モノクロナー
ル抗体が特に有利である。 使用抗体の標識付けのために、当業者にとつて
は、種々の公知法が提供される。この際、すべて
の慣用の標識物質例えばラジオアイソトープ、染
料、蛍光染料又は酵素を使用することができる。
本発明においては、特に酵素での標識付けが有利
である。標識酵素としては、例えばペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスフアターゼ、グルコースオキ
シダーゼ又は特に有利にβ−ガラクトシダーゼを
使用することができる。 この試験は、有利に抗体結合試験、有利に固相
免疫検定として実施される。固定相として被測定
細胞もしくは細胞と類似の大きさ、密度もしくは
類似の沈澱特性を有する標準物の粒子を使用す
る。 リンパ球の特性をまねることのできる標準物を
見つける試験開発には特別な困難があつたので、
リンパ球をこれで代えることができる。この標準
物は、天然リンパ球−標準物の利点を有すべきで
あるが、次のようなその欠点を有すべきではな
い： − リンパ球は必要な範囲で提供可能でない、 − リンパ球は、バツチ毎の不充分な再現性をも
たらす不均一性である、 − リンパ球は充分に安定ではなく、これがリン
パ球標準物の保持性に関する問題をもたらす。 これらのすべての欠点は、人工粒子を有する標
準物により克服できた。 このような粒子としては、ガラス又はプラスチ
ツクから成つていてよい小さい球が有利である。
特にプラスチツク粒子殊にメタクリレートを基礎
として構成されているラテツクス粒子が有利であ
る。これらの粒子は、有利に、 １〜20μm有利に７〜13μmの直径を有すべきであ
る。 この標準粒子には、標識付抗体もしくはその一
部分に結合しうる分子（蛋白質）が結合されてい
る。この際、これは、被測定細胞上の表面抗原と
同じ作用を有する蛋白質であつてよい。しかしな
がら、この粒子は標識付抗体特にこの抗体のFc
一部に結合している抗−抗体を有していてもよ
い。最後に、この粒子上には、標識付け例えば酵
素標識付けの場合にその酵素を特異的に認識する
抗体も存在していてよい。 本発明のもう１つの目的物は、細胞集団もしく
は亜集団を定量するための、標準物であり、これ
は、被測定細胞のそれと同じで、標識付抗体もし
くはその一部に結合しうる分子を有する粒子を含
有する。 この標準物の製造のために、粒子をまず例えば
過沃素酸ナトリウムで活性化する。引続き、この
活性化された粒子の一部を非特異的抗体例えば羊
−IgGと公知方法でカツプリングさせる。この活
性化された粒子の他の部分を標識付抗体もしくは
その一部分に特異的に結合しうる分子と結合させ
る。この双方の異なる種類の標識された粒子の
種々の分の混合により、その粒子数に関して一定
であるが、結合した特異的分子に関しては変動す
る標準溶液が製造される。 特定の標準物中の特異的分子の正確な濃度は、
免疫蛍光での慣用の計数又はセルソーター
（Zellsorter）を用いて確認することのできる既
知リンパ球濃度との比較により測定することがで
きる。このように検定された粒子の結合性は被測
定細胞集団もしくは亜集団の測定数に相当する。 この標準物は溶液又は凍結乾燥ものとして存在
しうる。この凍結乾燥物は使用前に適当な溶剤例
えば再蒸溜水中に再懸濁させるべきである。 本発明の目的は、更に、本発明方法を実施する
ための試薬キツトであり、これは、被測定細胞集
団に対して特異的に結合しうる標識付抗体、１種
以上の標準物、標識物質測定のための適当な検出
系並びに場合により必要な他の助剤を含有する。 この助剤としては、緩衝剤、安定剤例えば牛血
清アルブミン及び保存剤例えばアジ化ナトリウム
等が挙げられる。 個々の成分も、有利に、凍結乾燥形で存在す
る。これらは、使用前に適当な溶剤例えば再蒸溜
水中に再懸濁させるべきである。 実施例 本発明を次の実施例につき詳述する。 例 １ Ｔ−リンパ球の総数の測定 １ 溶液の製造 ａ 標準溶液 メタクリレートを基礎とするラテツクス粒子
（西ドイツ特許出願公開第3048883号明細書の記載
により製造）をPH5.0で過沃素酸ナトリウムで活
性化する。この活性化されたラテツクス粒子を２
分する。１方の半分を非特異的な羊−IgGと、他
の半分を羊−IgG−抗−マウス−IgGとカツプリ
ングさせる。この双方のバツチの種々の特定割合
で混合することにより、細胞0.45×106、1.56×
106もしくは3.36×106／mlのリンパ球濃度に相当
する３種の標準溶液を製造する。この溶液を凍結
乾燥させると、この形で長時間保存可能である。
その使用前に、この標準物を再蒸溜水中に再懸濁
させる（較正標準懸濁液ａ，ｂ及びｃ）。 ｂ 洗浄−緩衝液 燐酸水素二ナトリウム（Na2HPO4・2H2Ｏ）
1.47ｇ 燐酸二水素ナトリウム（NaH2PO4・H2Ｏ）
0.27ｇ及び塩化ナトリウム 8.77ｇ を再蒸留水中に溶かし、水を充填して１にす
る。この溶液に牛血清アルブミン0.2％（ｗ／ｖ）
及びアジ化ナトリウム0.1％（ｗ／ｖ）を添加す
る。貯蔵のために、凍結乾燥させる。使用前に、
この凍結乾燥物を再蒸留水中に再懸濁させる。 ｃ 抗体−接合体 モノクロナール抗体CD6（Ｍ−T411、P.Rieber
等によるLeucocyte typing；A.Bernard u.a.
Ed.1984、303〜311頁、Springer Verlag，
Berlin，New York中で詳細に特定されている）
を、β−Ｄ−ガラクトシダーセとカツプリングさ
せ、凍結乾燥させる。１回の測定当り、0.025
を洗浄緩衝液中に溶かして使用する。 ｄ 基質溶液 クロルフエノールレツド−β−Ｄ−ガラクトシ
ド60mgを、基質−緩衝液〔HEPES−緩衝液（PH
7.1）100mモル／、アスパラギン酸マグネシウ
ム2mモル／、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）
及びアジ化ナトリウム0.1％（ｗ／ｖ）〕30ml中に
溶かす。 ２ 試料準備 血液試料をエチレンジアミン四酢酸−２ナトリ
ウム塩（EDTA−Na2・2H2Ｏ）と混合する。こ
の新製EDTA−血液7.5mlをリーゼ−緩衝液 （Lyse−Puffer；塩化アンモニウム 155mモル／、炭酸水素カリウム 10mモル／、EDTA−Na2 0.1mモル／）
15mlと混合する。混合物を室温で７〜10分間放置
させ、この際２〜３回注意深く旋回させる。その
後、300ｇで10分間遠心分離する。凍結乾燥した
赤血球を有する上澄みを吸引濾過する（パスツー
ル−ピペツト、真空ポンプ）。 白血球−沈澱を回転混合させ（Vortex−
Mischer）、残留白血球の溶解のために、再度、
リーゼ緩衝液２mlで再懸濁させる。この懸濁液を
５分間放置し、この際場合により振り回す。その
後、PBS（燐酸塩緩衝食塩水）溶液（塩化ナトリ
ウム150mモル／、燐酸ナトリウム−緩衝液
（PH7.3）10mモル／）４mlを加える。これを改
めて300ｇで10分間遠心分離する。上澄みを吸引
濾過する。 細胞沈澱を回転混合させ、それぞれ、PBS−
溶液５mlで２回洗浄する。改めて遠心分離した
後、上澄みを注意深く吸引濾過する。沈澱を回転
混合し、再懸濁−緩衝液（PBS−溶液、牛血清
アルブミン0.2％（ｗ／ｖ）、牛血清免疫グロブリ
ン１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウム0.1％（ｗ／
ｖ）より成る）２ml中に入れる。この細胞懸濁液
を直ちに引き続く操作に使用する。 ３ 測定の実施 波 長：578nm 温 度：室温 半マイクロキユベツト：層厚 １cm 測定量：１ml；試薬空値に対する測定 円錐形底を有する遠心管中に次のものをピペツ
ト導入する：
胞の定量法並びにこのために好適な試薬に関す
る。 本発明方法は、特に、リンパ球殊にＴ−リンパ
球もしくはその亜集団、Ｔ−ヘルパー（Helfer）
及びＴ−サプレツサー細胞の測定に好適である。 従来の技術 Ｔ−リンパ球は、液体のかつ細胞の免疫系に対
する調整機能を有する。これらは、発生段階及び
機能に応じて分類される。Ｔ−細胞では、種々の
成熟段階が、下位群におけると同様に区別される
はずである。これらは、個々の発生段階及び機能
的下位群にとつて特異的である表面抗原によつて
特徴付けられうる。分類は、一方では機能的判定
で、かつ他方では血清学的識別によつて可能であ
る。種々の抗原組成の比較により、提供者の細胞
集団及びこれに伴なう現時点の免疫状態に関する
推論を引き出すことができる。 静止Ｔ−細胞は、それらが機能的に活性になり
うる以前に抗原によつてまず刺激されるべきであ
る。例えば、Ｔ−ヘルパー細胞は、Ｂ−リンパ球
を刺激して、増殖し、分化しかつ抗体を生産させ
る。これは、同様に、リンパ様細胞系統からマク
ロフアージ及び特異的な表面抗原を有する細胞に
対する細胞毒反応をするように刺激されるＴ−サ
プレツサー細胞を活性化する。 Ｔ−サプレツサーリンパ球は、活性状態で抗体
−生産の抑制及び所望のリンパ球培養液中のオー
トログ（autologen）Ｔ−細胞の反応に作用す
る。同様に、このＴ−サプレツサー細胞は、
HLA−抗原を有する細胞（HLA＝ヒト白血球抗
原）での感作の後のターゲツト細胞に対する細胞
毒性反応を示す。 血液中の通常の濃度並びにＴ−ヘルパーとＴ−
サプレツサー細胞とからの商は、次の範囲内に存
在する： Ｔ−リンパ球（総）
細胞0.5〜1.5×106／血液（ml） Ｔ−サプレツサー
細胞0.15〜0.45×106／血液（ml） Ｔ−ヘルパー 細胞0.3〜0.9×106／血液（ml） Ｔ−ヘルパー／Ｔ−サプレツサー 1.2〜3.9 種々の病気は、Ｔ−細胞亜集団の組成を変える
作用をし、この際、１集団の生産は低減又は強化
される。これらの変動は、疾病経過の非常に早期
に現われる。この例には次のものがある： − 複合リウマチ病、自己免疾病（例えばリウマ
チ性関節炎、系統的紅斑性狼瘡）、 − 伝染性疾病（例えばAIDS、ウイルス性及び
真菌性伝染病）、 − 悪性Ｔ−細胞疾病（例えば白血病、リンパ
腫）。 従つて、免疫状態即ち、Ｔ−リンパ球の総数及
びＴ−ヘルパー及びＴ−サプレツサー細胞の相対
分の検査は、著るしい診断上の発展をもたらす。 細胞集団及び亜集団に関する従来の測定法は、
主として蛍光物質で標識されている相応する特異
性の抗体での細胞の着色及び蛍光顕微鏡下でのそ
の計測よりなつている。この方法は非常に経費が
かかり、人集約的方法であり、主観的評価のみを
可能とすることは公知のことである。 この原理は、蛍光活性化セルソーター
〔fluorescent activated cell sorter（FACS）〕を
用いて機械化し、可視化することができる。この
方法では、機械的計測は排除される。しかしなが
ら、この方法は多大な装置経費を伴ない、熟練者
の取扱いが必要である。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、細胞集団の総数並びに特定の
亜集団のそれを測定することのできる簡単な方法
を提供することであつた。 問題点を解決するための手段 この課題は本発明方法により解決される。 本発明の目的は、細胞集団もしくは亜集団を定
量する方法であり、これは、 特定の細胞集団を有する試料を被測定細胞集団の
特性的表面抗原に特異的に結合しうる標識付抗体
と共にインキユベートし、 既知の種々の粒子濃度を有する１種以上の標準物
を同じ標識付抗体と共に同様にインキユベートし
（この際、この標準溶液は、その沈殿特性が被測
定細胞のそれに匹敵し、標識付抗体もしくはその
一部分に対して特異的に対向している分子を有し
ている粒子よりなる）、 試料溶液の細胞並びに標準溶液の粒子から過剰の
標識付抗体を分離除去し、細胞上並びに粒子上の
標識量を測定し、試料からの測定値と標準溶液か
らの測定値を比較することにより、試料中の被測
定細胞の数を確認することよりなる。 本発明の方法は、一般に、細胞集団もしくは亜
集団を定量するために使用可能である。特に、血
液細胞殊にリンパ球の定量のための方法が好適で
ある。特に、この方法はＴ−細胞及びＴ−ヘルパ
ー及びＴ−サプレツサー亜集団の総数の測定時に
有利であることが立証された。これにより、診断
及び治療経過管理のための現時点での免疫状態に
関する信用しうるかつ正確な報告を得ることがで
きる。 被測定細胞集団を特性付ける抗原（細胞表面抗
原）に結合しうる抗体として、ポリクロナール抗
体もモノクロナール抗体も使用できる。完全抗体
も抗体フラグメントも使用できる。モノクロナー
ル抗体が特に有利である。 使用抗体の標識付けのために、当業者にとつて
は、種々の公知法が提供される。この際、すべて
の慣用の標識物質例えばラジオアイソトープ、染
料、蛍光染料又は酵素を使用することができる。
本発明においては、特に酵素での標識付けが有利
である。標識酵素としては、例えばペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスフアターゼ、グルコースオキ
シダーゼ又は特に有利にβ−ガラクトシダーゼを
使用することができる。 この試験は、有利に抗体結合試験、有利に固相
免疫検定として実施される。固定相として被測定
細胞もしくは細胞と類似の大きさ、密度もしくは
類似の沈澱特性を有する標準物の粒子を使用す
る。 リンパ球の特性をまねることのできる標準物を
見つける試験開発には特別な困難があつたので、
リンパ球をこれで代えることができる。この標準
物は、天然リンパ球−標準物の利点を有すべきで
あるが、次のようなその欠点を有すべきではな
い： − リンパ球は必要な範囲で提供可能でない、 − リンパ球は、バツチ毎の不充分な再現性をも
たらす不均一性である、 − リンパ球は充分に安定ではなく、これがリン
パ球標準物の保持性に関する問題をもたらす。 これらのすべての欠点は、人工粒子を有する標
準物により克服できた。 このような粒子としては、ガラス又はプラスチ
ツクから成つていてよい小さい球が有利である。
特にプラスチツク粒子殊にメタクリレートを基礎
として構成されているラテツクス粒子が有利であ
る。これらの粒子は、有利に、 １〜20μm有利に７〜13μmの直径を有すべきであ
る。 この標準粒子には、標識付抗体もしくはその一
部分に結合しうる分子（蛋白質）が結合されてい
る。この際、これは、被測定細胞上の表面抗原と
同じ作用を有する蛋白質であつてよい。しかしな
がら、この粒子は標識付抗体特にこの抗体のFc
一部に結合している抗−抗体を有していてもよ
い。最後に、この粒子上には、標識付け例えば酵
素標識付けの場合にその酵素を特異的に認識する
抗体も存在していてよい。 本発明のもう１つの目的物は、細胞集団もしく
は亜集団を定量するための、標準物であり、これ
は、被測定細胞のそれと同じで、標識付抗体もし
くはその一部に結合しうる分子を有する粒子を含
有する。 この標準物の製造のために、粒子をまず例えば
過沃素酸ナトリウムで活性化する。引続き、この
活性化された粒子の一部を非特異的抗体例えば羊
−IgGと公知方法でカツプリングさせる。この活
性化された粒子の他の部分を標識付抗体もしくは
その一部分に特異的に結合しうる分子と結合させ
る。この双方の異なる種類の標識された粒子の
種々の分の混合により、その粒子数に関して一定
であるが、結合した特異的分子に関しては変動す
る標準溶液が製造される。 特定の標準物中の特異的分子の正確な濃度は、
免疫蛍光での慣用の計数又はセルソーター
（Zellsorter）を用いて確認することのできる既
知リンパ球濃度との比較により測定することがで
きる。このように検定された粒子の結合性は被測
定細胞集団もしくは亜集団の測定数に相当する。 この標準物は溶液又は凍結乾燥ものとして存在
しうる。この凍結乾燥物は使用前に適当な溶剤例
えば再蒸溜水中に再懸濁させるべきである。 本発明の目的は、更に、本発明方法を実施する
ための試薬キツトであり、これは、被測定細胞集
団に対して特異的に結合しうる標識付抗体、１種
以上の標準物、標識物質測定のための適当な検出
系並びに場合により必要な他の助剤を含有する。 この助剤としては、緩衝剤、安定剤例えば牛血
清アルブミン及び保存剤例えばアジ化ナトリウム
等が挙げられる。 個々の成分も、有利に、凍結乾燥形で存在す
る。これらは、使用前に適当な溶剤例えば再蒸溜
水中に再懸濁させるべきである。 実施例 本発明を次の実施例につき詳述する。 例 １ Ｔ−リンパ球の総数の測定 １ 溶液の製造 ａ 標準溶液 メタクリレートを基礎とするラテツクス粒子
（西ドイツ特許出願公開第3048883号明細書の記載
により製造）をPH5.0で過沃素酸ナトリウムで活
性化する。この活性化されたラテツクス粒子を２
分する。１方の半分を非特異的な羊−IgGと、他
の半分を羊−IgG−抗−マウス−IgGとカツプリ
ングさせる。この双方のバツチの種々の特定割合
で混合することにより、細胞0.45×106、1.56×
106もしくは3.36×106／mlのリンパ球濃度に相当
する３種の標準溶液を製造する。この溶液を凍結
乾燥させると、この形で長時間保存可能である。
その使用前に、この標準物を再蒸溜水中に再懸濁
させる（較正標準懸濁液ａ，ｂ及びｃ）。 ｂ 洗浄−緩衝液 燐酸水素二ナトリウム（Na2HPO4・2H2Ｏ）
1.47ｇ 燐酸二水素ナトリウム（NaH2PO4・H2Ｏ）
0.27ｇ及び塩化ナトリウム 8.77ｇ を再蒸留水中に溶かし、水を充填して１にす
る。この溶液に牛血清アルブミン0.2％（ｗ／ｖ）
及びアジ化ナトリウム0.1％（ｗ／ｖ）を添加す
る。貯蔵のために、凍結乾燥させる。使用前に、
この凍結乾燥物を再蒸留水中に再懸濁させる。 ｃ 抗体−接合体 モノクロナール抗体CD6（Ｍ−T411、P.Rieber
等によるLeucocyte typing；A.Bernard u.a.
Ed.1984、303〜311頁、Springer Verlag，
Berlin，New York中で詳細に特定されている）
を、β−Ｄ−ガラクトシダーセとカツプリングさ
せ、凍結乾燥させる。１回の測定当り、0.025
を洗浄緩衝液中に溶かして使用する。 ｄ 基質溶液 クロルフエノールレツド−β−Ｄ−ガラクトシ
ド60mgを、基質−緩衝液〔HEPES−緩衝液（PH
7.1）100mモル／、アスパラギン酸マグネシウ
ム2mモル／、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）
及びアジ化ナトリウム0.1％（ｗ／ｖ）〕30ml中に
溶かす。 ２ 試料準備 血液試料をエチレンジアミン四酢酸−２ナトリ
ウム塩（EDTA−Na2・2H2Ｏ）と混合する。こ
の新製EDTA−血液7.5mlをリーゼ−緩衝液 （Lyse−Puffer；塩化アンモニウム 155mモル／、炭酸水素カリウム 10mモル／、EDTA−Na2 0.1mモル／）
15mlと混合する。混合物を室温で７〜10分間放置
させ、この際２〜３回注意深く旋回させる。その
後、300ｇで10分間遠心分離する。凍結乾燥した
赤血球を有する上澄みを吸引濾過する（パスツー
ル−ピペツト、真空ポンプ）。 白血球−沈澱を回転混合させ（Vortex−
Mischer）、残留白血球の溶解のために、再度、
リーゼ緩衝液２mlで再懸濁させる。この懸濁液を
５分間放置し、この際場合により振り回す。その
後、PBS（燐酸塩緩衝食塩水）溶液（塩化ナトリ
ウム150mモル／、燐酸ナトリウム−緩衝液
（PH7.3）10mモル／）４mlを加える。これを改
めて300ｇで10分間遠心分離する。上澄みを吸引
濾過する。 細胞沈澱を回転混合させ、それぞれ、PBS−
溶液５mlで２回洗浄する。改めて遠心分離した
後、上澄みを注意深く吸引濾過する。沈澱を回転
混合し、再懸濁−緩衝液（PBS−溶液、牛血清
アルブミン0.2％（ｗ／ｖ）、牛血清免疫グロブリ
ン１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウム0.1％（ｗ／
ｖ）より成る）２ml中に入れる。この細胞懸濁液
を直ちに引き続く操作に使用する。 ３ 測定の実施 波 長：578nm 温 度：室温 半マイクロキユベツト：層厚 １cm 測定量：１ml；試薬空値に対する測定 円錐形底を有する遠心管中に次のものをピペツ
ト導入する：
【表】
300ｇで10分遠心分離する。上澄みを注意深く
吸引濾過する。沈澱を回転混合し、次のようにピ
ペツト導入する。
吸引濾過する。沈澱を回転混合し、次のようにピ
ペツト導入する。
【表】
これを充分に混合し、室温（20〜25℃）で45分
間インキユベートし、15分間隔で激しく振出す
る。その後各々２mlの洗浄緩衝液を加え、改めて
混合し、300ｇで10分間遠心する。上澄みを注意
深く吸引濾過し、沈澱を回転混合する。それぞれ
洗浄緩衝液２mlと数回混合し、300ｇで10分間遠
心分離する。上澄みを再び注意深く吸引濾過し、
沈澱を回転混合する。引続きそれぞれ基質溶液１
mlでクロルフエノールレツド−β−ガラクトシド
を再懸濁させる。充分に混合し、室温（20〜25
℃）で30分間インキユベートし、この際、15分後
及び30分後にそれぞれ激しく振出し、700ｇで５
分間遠心する。澄明な上澄みの抽出は、試薬空値
としての基質溶液に比べて測定する。 ４ 評価 測定した較正標準値及び相応する濃度を用い
て、較正曲線を得る。これから、測定値に相当す
る試料の細胞値を直接読みとる。 例 ２ Ｔ−ヘルパー亜集団の測定 試料の準備、測定の実施及び評価を例１に記載
の方法で行なう。較正標準懸濁液ａ，ｂ及びｃと
して、細胞0.20×106、0.60×106もしくは2.08×
106／mlのＴ−ヘルパー濃度に相当する懸濁液を
使用する。更に、抗体接合体として、Ｔ−ヘルパ
ー亜集団にとつて特徴的である表面抗原に特異的
に結合しうるモノクロナール抗体CD4（Ｍ−
T151、詳細は前記文献参照）とβ−ガラクトシ
ダーゼとからの接合体を使用する。各測定のため
に、抗体0.05Uを使用する。 測定較正標準値から、試料に関する測定値に相
応する細胞値を直接読み取ることのできる較正直
線を得ることができる。 例 ３ Ｔ−サプレツサー亜集団の測定 試料準備及び測定の実施を例１と同様に実施す
る。単に、抗体接合体としてのβ−ガラクトシダ
ーゼと特異的にＴ−サプレツサー細胞の表面抗原
に結合しうる抗体CD8（Ｍ−T811、詳細は前記文
献参照）とからの接合体を使用する。各々の測定
のために抗体0.025Uを使用する。更に、較正標
準懸濁液ａ，ｂ及びｃとして、細胞0.29×106、
0.62×106もしくは1.17×106／のＴ−サプレツ
サー濃度に相当する３種の異なる濃度の懸濁液を
使用する。 本発明の試薬を用い、本発明によるELISA−
法で得られる結果は、従来の慣用の、非常に経費
のかかる機械的計測法で得られる値と非常に良好
な相関関係を示す（第１図、第２図及び第３図参
照）。
間インキユベートし、15分間隔で激しく振出す
る。その後各々２mlの洗浄緩衝液を加え、改めて
混合し、300ｇで10分間遠心する。上澄みを注意
深く吸引濾過し、沈澱を回転混合する。それぞれ
洗浄緩衝液２mlと数回混合し、300ｇで10分間遠
心分離する。上澄みを再び注意深く吸引濾過し、
沈澱を回転混合する。引続きそれぞれ基質溶液１
mlでクロルフエノールレツド−β−ガラクトシド
を再懸濁させる。充分に混合し、室温（20〜25
℃）で30分間インキユベートし、この際、15分後
及び30分後にそれぞれ激しく振出し、700ｇで５
分間遠心する。澄明な上澄みの抽出は、試薬空値
としての基質溶液に比べて測定する。 ４ 評価 測定した較正標準値及び相応する濃度を用い
て、較正曲線を得る。これから、測定値に相当す
る試料の細胞値を直接読みとる。 例 ２ Ｔ−ヘルパー亜集団の測定 試料の準備、測定の実施及び評価を例１に記載
の方法で行なう。較正標準懸濁液ａ，ｂ及びｃと
して、細胞0.20×106、0.60×106もしくは2.08×
106／mlのＴ−ヘルパー濃度に相当する懸濁液を
使用する。更に、抗体接合体として、Ｔ−ヘルパ
ー亜集団にとつて特徴的である表面抗原に特異的
に結合しうるモノクロナール抗体CD4（Ｍ−
T151、詳細は前記文献参照）とβ−ガラクトシ
ダーゼとからの接合体を使用する。各測定のため
に、抗体0.05Uを使用する。 測定較正標準値から、試料に関する測定値に相
応する細胞値を直接読み取ることのできる較正直
線を得ることができる。 例 ３ Ｔ−サプレツサー亜集団の測定 試料準備及び測定の実施を例１と同様に実施す
る。単に、抗体接合体としてのβ−ガラクトシダ
ーゼと特異的にＴ−サプレツサー細胞の表面抗原
に結合しうる抗体CD8（Ｍ−T811、詳細は前記文
献参照）とからの接合体を使用する。各々の測定
のために抗体0.025Uを使用する。更に、較正標
準懸濁液ａ，ｂ及びｃとして、細胞0.29×106、
0.62×106もしくは1.17×106／のＴ−サプレツ
サー濃度に相当する３種の異なる濃度の懸濁液を
使用する。 本発明の試薬を用い、本発明によるELISA−
法で得られる結果は、従来の慣用の、非常に経費
のかかる機械的計測法で得られる値と非常に良好
な相関関係を示す（第１図、第２図及び第３図参
照）。
第１図は、総Ｔ−リンパ球（ｔ−pan）に関す
るFACS（蛍光活性化セルソーター）と本発明方
法による細胞計測結果を示す相関関係図、第２図
はＴ−ヘルパー亜集団（ｔ−ヘルパー）に関する
FACSと本発明方法による細胞計測結果を示す相
関関係図、第３図はＴ−サプレツサー亜集団（ｔ
−サプレツサー）に関するFACSと本発明方法に
よる細胞計測結果を示す相関関係図である。
るFACS（蛍光活性化セルソーター）と本発明方
法による細胞計測結果を示す相関関係図、第２図
はＴ−ヘルパー亜集団（ｔ−ヘルパー）に関する
FACSと本発明方法による細胞計測結果を示す相
関関係図、第３図はＴ−サプレツサー亜集団（ｔ
−サプレツサー）に関するFACSと本発明方法に
よる細胞計測結果を示す相関関係図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 細胞集団もしくは亜集団を定量するために、
被測定細胞集団を有する試料を、被測定細胞集団
の特性的表面抗原に特異的に結合しうる標識付抗
体と共にインキユベートし、既知に種々の粒子濃
度を有する１種以上の標準物を、同じ標識付抗体
と共に同様にインキユベートし、この際、標準溶
液は、その沈殿特性が被測定細胞のそれに匹敵
し、標識付抗体もしくはその一部分に結合しうる
分子に結合している粒子より成り、 試料溶液の細胞並びに被覆溶液の粒子から過剰の
標識付抗体を分離除去し、 細胞及び粒子上の標識量を測定し、試料からの測
定値と標準溶液からの測定値を比較することによ
つて、試料中の被測定細胞の数を確認することを
特徴とする、 細胞集団もしくは亜集団の定量法。 ２ 標識付抗体として、Ｔ−リンパ球もしくはＴ
−ヘルパー又はＴ−サプレツサー亜集団の表面抗
原に結合しうる標識付モノクロナール抗体を使用
する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 標識付けをラジオアイソトープ、染料、蛍光
染料又は酵素により行う、特許請求の範囲第１項
又は第２項記載の方法。 ４ 標識酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスフアターゼ、グルコースオキシダーゼ又はβ
−ガラクトシダーゼを使用する、特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ５ 被測定細胞集団を有する試料を、被測定細胞
集団の特性的表面抗原に特異的に結合しうる標識
付抗体と共にインキユベートし、既知の種々の粒
子濃度を有する１種以上の標準物を、同じ標識付
抗体と共に同様にインキユベートし、試料溶液の
細胞並びに標準溶液の粒子から過剰の標識付抗体
を分離除去し、細胞及び粒子上の標識量を測定
し、比較することにより試料中の被測定細胞の数
を確定する方法で細胞集団もしくは亜集団を測定
するため測定するための標準物において、これ
は、その沈殿特性が被測定細胞のそれに匹敵し、
標識付抗体もしくはそのその一部分に結合しうる
分子に結合している粒子を含有することを特徴と
する、細胞集団もしくは亜集団を定量するための
標準物。 ６ 粒子は、ガラス又はプラスチツクより成る、
特許請求の範囲第５項記載の標準物。 ７ プラスチツク粒子は、メタクリレートを基礎
とするラテツクス粒子より成る、特許請求の範囲
第６項記載の標準物。 ８ 粒子は、被測定細胞上の表面抗原と同じ抗原
作用を有する蛋白質、標識付抗体に結合しうる坑
−抗体又は標識を特異的に認識する抗体を有して
いる、特許請求の範囲第５項から第７項までのい
ずれか１項記載の標準物。 ９ 被測定細胞集団を有する試料を、被測定細胞
集団の特性的表面抗原に特異的に結合しうる標識
付き抗体と共にインキユベートし、既知の種々の
粒子濃度の１種以上の標準物を同じ標識付抗体と
共に同様にインキユベートし、試料溶液の細胞並
びに標準溶液の粒子から過剰の標識付抗体を分離
除去し、細胞及び粒子上の標識量を測定し、比較
することにより試料中の被測定細胞の数を確定す
る方法で細胞集団もしくは亜集団を測定する方法
を実施するための試薬キツトにおいて、これは、
被測定細胞集団に特異的に結合しうる標識付抗
体、沈殿特性が被測定細胞のそれに匹敵する標識
付抗体もしくはその一部分に結合しうる分子を有
する粒子を含有する標準物１種以上、標識物質を
測定するのに好適な検出系並びに場合により必要
な他の助剤を含有することを特徴とする、細胞集
団もしくは亜集団を定量するための試薬キツト。 １０ 抗体はβ−ガラクトシダーゼにより標識付
けられており、検出系はβ−ガラクトシダーゼの
検出に必要な試薬を含有している、特許請求の範
囲第９項記載の試薬キツト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3541033.7 | 1985-11-19 | ||
| DE19853541033 DE3541033A1 (de) | 1985-11-19 | 1985-11-19 | Verfahren zur quantifizierung von zellpopulationen bzw. subpopulationen sowie hierfuer geeignetes reagenz |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62121361A JPS62121361A (ja) | 1987-06-02 |
| JPH0521508B2 true JPH0521508B2 (ja) | 1993-03-24 |
Family
ID=6286390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61273082A Granted JPS62121361A (ja) | 1985-11-19 | 1986-11-18 | 細胞集団もしくは亜集団を定量するための方法及び標準物並びに試薬キット |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4876189A (ja) |
| EP (1) | EP0224134B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62121361A (ja) |
| KR (1) | KR870005249A (ja) |
| AT (1) | ATE50647T1 (ja) |
| AU (1) | AU574281B2 (ja) |
| CA (1) | CA1278258C (ja) |
| DE (2) | DE3541033A1 (ja) |
| IL (1) | IL80655A0 (ja) |
| ZA (1) | ZA868569B (ja) |
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