JPH05219946A - 薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマ - Google Patents
薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマInfo
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- JPH05219946A JPH05219946A JP3309471A JP30947191A JPH05219946A JP H05219946 A JPH05219946 A JP H05219946A JP 3309471 A JP3309471 A JP 3309471A JP 30947191 A JP30947191 A JP 30947191A JP H05219946 A JPH05219946 A JP H05219946A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 本発明によるモノクローナル抗体生産性ハイ
ブリドーマは、ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２のアド
リアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫したマ
ウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞との細胞
融合により作成されたものである。 【効果】 上記ハイブリドーマにより生産されたモノク
ローナル抗体は多剤交叉耐性を示す癌細胞を選択的に増
殖阻害するか、あるいはその薬物に対する感受性を高め
る能力を有している。
ブリドーマは、ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２のアド
リアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫したマ
ウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞との細胞
融合により作成されたものである。 【効果】 上記ハイブリドーマにより生産されたモノク
ローナル抗体は多剤交叉耐性を示す癌細胞を選択的に増
殖阻害するか、あるいはその薬物に対する感受性を高め
る能力を有している。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、薬剤耐性癌細胞に関す
るモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマに関す
る。
るモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマに関す
る。
【０００２】癌を化学療法により治療していく際に、抗
癌剤に対する耐性を有する癌細胞が選択されて出現して
くる現象がみられ、重大な問題となっている。この耐性
を克服するためには抗癌剤の投与量を増やすことが考え
られよう。しかし、投与量の増大は正常細胞に対する障
害という副作用で患者を不必要に苦しめることになる。
耐性克服のための他の手段として他の種類の抗癌剤を使
用することが考えられよう。しかし、この場合では、一
旦一つの薬剤に対し耐性となった癌細胞はしばしばいわ
ゆる「多剤交叉耐性（pleiotropic drug resistance ）
を示すことがあって効果が少ないことが多い。
癌剤に対する耐性を有する癌細胞が選択されて出現して
くる現象がみられ、重大な問題となっている。この耐性
を克服するためには抗癌剤の投与量を増やすことが考え
られよう。しかし、投与量の増大は正常細胞に対する障
害という副作用で患者を不必要に苦しめることになる。
耐性克服のための他の手段として他の種類の抗癌剤を使
用することが考えられよう。しかし、この場合では、一
旦一つの薬剤に対し耐性となった癌細胞はしばしばいわ
ゆる「多剤交叉耐性（pleiotropic drug resistance ）
を示すことがあって効果が少ないことが多い。
【０００３】従って、こうした癌細胞の薬剤耐性を克服
するため、副作用が少なくて、選択性の高い、かつ多剤
交叉耐性を示す癌細胞に対して有効な薬剤あるいは方法
の確立は重要な課題となっている。
するため、副作用が少なくて、選択性の高い、かつ多剤
交叉耐性を示す癌細胞に対して有効な薬剤あるいは方法
の確立は重要な課題となっている。
【０００４】
【従来の技術】多剤交叉耐性を示す癌細胞に選択性を有
するモノクローナル抗体は既に作成されている〔ジャー
ナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（J. Clin. Onc
ology）、第３巻、第３１１〜３１５頁（１９８５
年）〕。これは、多剤交叉耐性を示す癌細胞の細胞膜上
に特異的に出現する分子量１７万〜１８万ダルトンの糖
蛋白質に反応するモノクローナル抗体である。しかし、
このモノクローナル抗体を作成する際に用いた耐性細胞
株は、ヒトではなくてチャイニーズハムスター由来のも
のであり、またこのモノクローナル抗体により耐性癌細
胞の薬剤に対する感受性については何ら報告されていな
い。
するモノクローナル抗体は既に作成されている〔ジャー
ナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（J. Clin. Onc
ology）、第３巻、第３１１〜３１５頁（１９８５
年）〕。これは、多剤交叉耐性を示す癌細胞の細胞膜上
に特異的に出現する分子量１７万〜１８万ダルトンの糖
蛋白質に反応するモノクローナル抗体である。しかし、
このモノクローナル抗体を作成する際に用いた耐性細胞
株は、ヒトではなくてチャイニーズハムスター由来のも
のであり、またこのモノクローナル抗体により耐性癌細
胞の薬剤に対する感受性については何ら報告されていな
い。
【０００５】従って、この先行技術に係るモノクローナ
ル抗体は、ヒト薬剤耐性癌細胞の選択的治療に用いるこ
とができないであろうと解される。
ル抗体は、ヒト薬剤耐性癌細胞の選択的治療に用いるこ
とができないであろうと解される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、癌細胞の薬剤耐性を克服するため、副作用
が少なくて、選択性の高い、かつ多剤交互耐性を示す癌
細胞に対して有効な薬剤を提供することである。
する課題は、癌細胞の薬剤耐性を克服するため、副作用
が少なくて、選択性の高い、かつ多剤交互耐性を示す癌
細胞に対して有効な薬剤を提供することである。
【０００７】
＜要 旨＞本発明者らは、アドリアマイシン耐性腫瘍
細胞で免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを
融合させて得られたハイブリドーマにより生産されるモ
ノクローナル抗体が多剤交叉耐性を示す癌細胞を選択的
に増殖阻害するかあるいはその薬物に対する感受性を高
めることを見出して本発明を完成した。
細胞で免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを
融合させて得られたハイブリドーマにより生産されるモ
ノクローナル抗体が多剤交叉耐性を示す癌細胞を選択的
に増殖阻害するかあるいはその薬物に対する感受性を高
めることを見出して本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明によるモノクローナル抗
体生産性ハイブリドーマは、ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ
５６２のアドリアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭによ
り免疫したマウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫
細胞との細胞融合により作成されたものである。ただ
し、このモノクローナル抗体は、下記の（イ）〜（ニ）
によって定義されるものである。
体生産性ハイブリドーマは、ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ
５６２のアドリアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭによ
り免疫したマウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫
細胞との細胞融合により作成されたものである。ただ
し、このモノクローナル抗体は、下記の（イ）〜（ニ）
によって定義されるものである。
【０００９】（イ） ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２
のアドリアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫
されたマウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞
とを融合させて作成したハイブリドーマにより生産され
るものであること。 （ロ） アドリアマイシン耐性株と反応するがアドリア
マイシン感受性株とは実質上反応しないこと。 （ハ） アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害する
かあるいはその細胞のビンクリスチンまたはアクチノマ
イシンＤに対する感受性を高める能力があること。 （ニ） ＩｇＧイソタイプに属するものであること。
のアドリアマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫
されたマウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞
とを融合させて作成したハイブリドーマにより生産され
るものであること。 （ロ） アドリアマイシン耐性株と反応するがアドリア
マイシン感受性株とは実質上反応しないこと。 （ハ） アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害する
かあるいはその細胞のビンクリスチンまたはアクチノマ
イシンＤに対する感受性を高める能力があること。 （ニ） ＩｇＧイソタイプに属するものであること。
【００１０】＜効 果＞前記したように、また後記実
験例から明らかなように、本発明によるハイブリドーマ
により生産されたモノクローナル抗体は多剤交叉耐性を
示す癌細胞を選択的に増殖阻害するか、あるいはその薬
物に対する感受性を高める能力を有している。
験例から明らかなように、本発明によるハイブリドーマ
により生産されたモノクローナル抗体は多剤交叉耐性を
示す癌細胞を選択的に増殖阻害するか、あるいはその薬
物に対する感受性を高める能力を有している。
【００１１】従って、本発明によるハイブリドーマによ
り生産されるモノクローナル抗体は、副作用が少なくて
選択性の高いかつ多剤交叉耐性を示す癌細胞に対して有
効な薬剤あるいは方法の確立という重要な課題に対する
一つの解決手段となりうるものである。
り生産されるモノクローナル抗体は、副作用が少なくて
選択性の高いかつ多剤交叉耐性を示す癌細胞に対して有
効な薬剤あるいは方法の確立という重要な課題に対する
一つの解決手段となりうるものである。
【００１２】 〔発明の具体的説明〕本発明は、モノクローナル抗体生
産性ハイブリドーマに関するものである。このハイブリ
ドーマについて、その生産物であるモノクローナル抗体
と共に説明すれば下記の通りである。
産性ハイブリドーマに関するものである。このハイブリ
ドーマについて、その生産物であるモノクローナル抗体
と共に説明すれば下記の通りである。
【００１３】細胞融合法を含めてモノクローナル抗体の
製造に関しては既に綜説ないし成書がいくつか知られて
いるので、本発明の一具体例についての下記の説明以外
に必要な情報に関してはそれらの文献を参照されたい。
適当な文献のいくつかを挙げれば、たとえば、ガルフレ
およびミルステイン：「メソッヅ・イン・エンザイモロ
ジー」（G.Galfre,C. Milstein: Methods Engymol.）第
７３巻、第３‐４６頁（１９８１）およびゴーディン
グ：「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプ
ルズ・アンド・プラクチス」（アカデミック・プレス刊
１９８３）（J.W.Goding:Monoclonal Antibodies:Princ
iples and Practice,Academic Press,1983）がある。
製造に関しては既に綜説ないし成書がいくつか知られて
いるので、本発明の一具体例についての下記の説明以外
に必要な情報に関してはそれらの文献を参照されたい。
適当な文献のいくつかを挙げれば、たとえば、ガルフレ
およびミルステイン：「メソッヅ・イン・エンザイモロ
ジー」（G.Galfre,C. Milstein: Methods Engymol.）第
７３巻、第３‐４６頁（１９８１）およびゴーディン
グ：「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプ
ルズ・アンド・プラクチス」（アカデミック・プレス刊
１９８３）（J.W.Goding:Monoclonal Antibodies:Princ
iples and Practice,Academic Press,1983）がある。
【００１４】ハイブリドーマ／モノクローナル抗体の製造 （１） アドリアマイシン耐性癌細胞の選択と確立 本発明者らによって、すでに、ビンカアルカロイド系の
抗ガン剤であるビンクリスチン耐性のヒト骨髄性白血病
細胞株（Ｋ５６２／ＶＣＲ）が選択確立されているが、
この耐性株は、アンスラサイクリン系の抗ガン剤である
アドリアマイシンに対してもすでに軽度の交叉耐性を示
している〔「癌（Gann）」）第７４巻、第７５１〜７５
８頁（１９８３）〕。本発明の具体例では、この株を出
発の細胞株として用いている。この株は、（財）癌研究
会・癌化学療法センター（東京都豊島区上池袋１−３７
−１）から自由に入手することができる。
抗ガン剤であるビンクリスチン耐性のヒト骨髄性白血病
細胞株（Ｋ５６２／ＶＣＲ）が選択確立されているが、
この耐性株は、アンスラサイクリン系の抗ガン剤である
アドリアマイシンに対してもすでに軽度の交叉耐性を示
している〔「癌（Gann）」）第７４巻、第７５１〜７５
８頁（１９８３）〕。本発明の具体例では、この株を出
発の細胞株として用いている。この株は、（財）癌研究
会・癌化学療法センター（東京都豊島区上池袋１−３７
−１）から自由に入手することができる。
【００１５】最初にビンクリスチン耐性細胞株Ｋ５６２
／ＶＣＲを、ＩＣ５０である３ｎＭのアドリアマイシン
を含むＲＰＭＩ１６４０（１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ））で培養し、成育してきた細胞について以下順次約
３倍の比率でアドリアマイシンの濃度を増量させること
により、高濃度の薬剤耐性株を選択していく。耐性株が
成育しうる最高濃度の薬剤存在下に、選択した薬剤耐性
株を約１年間成育させ、その後薬剤を含まない培地にて
培養しても耐性の性質を失わない安定した細胞株を得
る。
／ＶＣＲを、ＩＣ５０である３ｎＭのアドリアマイシン
を含むＲＰＭＩ１６４０（１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ））で培養し、成育してきた細胞について以下順次約
３倍の比率でアドリアマイシンの濃度を増量させること
により、高濃度の薬剤耐性株を選択していく。耐性株が
成育しうる最高濃度の薬剤存在下に、選択した薬剤耐性
株を約１年間成育させ、その後薬剤を含まない培地にて
培養しても耐性の性質を失わない安定した細胞株を得
る。
【００１６】（２） 免疫化動物脾細胞の調製 得られたアドリアマイシン耐性ヒト骨髄白血病細胞株Ｋ
５６２／ＡＤＭを、一匹のマウスにつき１０7 細胞とな
るよう０．５mlのハンクスのバランス緩衝生理食塩水
（以下、ＨＢＢＳという）にて一回洗浄のあと、同量の
ＨＢＢＳに懸濁させ、４〜６週令のメスのＢａｌｂ／ｃ
マウスに腹腔内投与する。同様に週に一回の割合で抗体
価が充分上昇するまで投与を続け、細胞融合の３日前に
１０6 細胞を０．１mlに懸濁させてブースターとして静
脈内に投与する。このようして得た免疫化動物より無菌
的に脾臓を採取する。取り出した脾臓はシャーレ上でピ
ンセットを用いて無菌的にほぐし、その一部をとって、
得られた細胞数を算出する。
５６２／ＡＤＭを、一匹のマウスにつき１０7 細胞とな
るよう０．５mlのハンクスのバランス緩衝生理食塩水
（以下、ＨＢＢＳという）にて一回洗浄のあと、同量の
ＨＢＢＳに懸濁させ、４〜６週令のメスのＢａｌｂ／ｃ
マウスに腹腔内投与する。同様に週に一回の割合で抗体
価が充分上昇するまで投与を続け、細胞融合の３日前に
１０6 細胞を０．１mlに懸濁させてブースターとして静
脈内に投与する。このようして得た免疫化動物より無菌
的に脾臓を採取する。取り出した脾臓はシャーレ上でピ
ンセットを用いて無菌的にほぐし、その一部をとって、
得られた細胞数を算出する。
【００１７】抗体価の測定のためには、抗アドリアマイ
シン耐性株抗体価を以下に示す固相法による酵素免疫測
定法で調べる。 プレートの前処理： ファルコンプレート ３９１
２に、１ウェルあたり、５０μｌのポリ‐Ｌ‐リジン
０．００１％溶液を加え、室温で３０分間反応させた
後、水をきり、風乾させる。
シン耐性株抗体価を以下に示す固相法による酵素免疫測
定法で調べる。 プレートの前処理： ファルコンプレート ３９１
２に、１ウェルあたり、５０μｌのポリ‐Ｌ‐リジン
０．００１％溶液を加え、室温で３０分間反応させた
後、水をきり、風乾させる。
【００１８】 細胞のプレートへの結合： Ｋ５６２
親株およびＫ５６２／ＡＤＭ耐性株をそれぞれ２００万
個・細胞／mlの濃度で懸濁し、調製したものを１ウェル
あたり５０μｌ（細胞数にして１０万個）づつ、それぞ
れのウェルに分注し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心す
ることによりウェルに結合させる。その後、０．５％の
グルタルアルデヒドを１ウェルあたり５０μｌずつ加え
ることで結合をより完全にする。
親株およびＫ５６２／ＡＤＭ耐性株をそれぞれ２００万
個・細胞／mlの濃度で懸濁し、調製したものを１ウェル
あたり５０μｌ（細胞数にして１０万個）づつ、それぞ
れのウェルに分注し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心す
ることによりウェルに結合させる。その後、０．５％の
グルタルアルデヒドを１ウェルあたり５０μｌずつ加え
ることで結合をより完全にする。
【００１９】 ブロッキング： 余分な結合基をマス
クするために、ＲＰＭＩ１６４０中に３％になるよう溶
解したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ウェルあたり
２００μｌ加え、３０分間室温で処理する。
クするために、ＲＰＭＩ１６４０中に３％になるよう溶
解したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ウェルあたり
２００μｌ加え、３０分間室温で処理する。
【００２０】 測定サンプルの添加： 抗体価を測定
するサンプルは、１ウェルあたり５０μｌずつ、一種類
のサンプルについて、Ｋ５６２とＫ５６２／ＡＤＭのそ
れぞれのウェルに加え、室温あるいは３７℃にて２時間
反応させる。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
にて、４回洗浄する。
するサンプルは、１ウェルあたり５０μｌずつ、一種類
のサンプルについて、Ｋ５６２とＫ５６２／ＡＤＭのそ
れぞれのウェルに加え、室温あるいは３７℃にて２時間
反応させる。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
にて、４回洗浄する。
【００２１】 二次抗体の添加： 二次抗体としてヤ
ギのペルオキシダーゼ結合‐抗マウスＩｇ抗体のＦ（ａ
ｂ′）２フラグメント〔米国カッペル（Cappel）社製〕
を、１５００倍ＰＢＳ中にて希釈した溶液を各ウェルに
加え、さらに２時間室温で反応させる。
ギのペルオキシダーゼ結合‐抗マウスＩｇ抗体のＦ（ａ
ｂ′）２フラグメント〔米国カッペル（Cappel）社製〕
を、１５００倍ＰＢＳ中にて希釈した溶液を各ウェルに
加え、さらに２時間室温で反応させる。
【００２２】 判定： ペルオキシダーゼの基質とし
てオルトフェニレンジアミンを各ウェルに加え、反応を
硫酸で停止させた後、Ｋ５６２とＫ５６２／ＡＤＭの間
の発色の有無と差違を、肉眼あるいはオートリーダーに
より判定する。
てオルトフェニレンジアミンを各ウェルに加え、反応を
硫酸で停止させた後、Ｋ５６２とＫ５６２／ＡＤＭの間
の発色の有無と差違を、肉眼あるいはオートリーダーに
より判定する。
【００２３】（３） マウス骨髄腫細胞の調製 骨髄細胞株としては、たとえば、マウス由来の８‐アザ
グアニン耐性骨髄腫細胞株Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８・６５
３〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Imm
unology ）第１２３巻第 １５４８〜１５５０頁（１９
７９）〕を用いる。融合当日２×１０7 以上の細胞数を
つかえるようにしておく。この株は、米国メリーランド
州のアメリカン・タイプ・カルチァー・コレクション
（AmericanType Culture Collection）にＣＲＬ‐１５
８０として登録されており、同所あるいは米国フロー・
ラボラトリー・インコーポレーテッド（Flow Laborator
y Inc.）から自由に入手することができる。
グアニン耐性骨髄腫細胞株Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８・６５
３〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Imm
unology ）第１２３巻第 １５４８〜１５５０頁（１９
７９）〕を用いる。融合当日２×１０7 以上の細胞数を
つかえるようにしておく。この株は、米国メリーランド
州のアメリカン・タイプ・カルチァー・コレクション
（AmericanType Culture Collection）にＣＲＬ‐１５
８０として登録されており、同所あるいは米国フロー・
ラボラトリー・インコーポレーテッド（Flow Laborator
y Inc.）から自由に入手することができる。
【００２４】（４） 細胞融合 (2) で免疫した動物より得られる脾細胞と(3) で得られ
る骨髄腫細胞とを、細胞数が脾細胞：骨髄腫細胞＝７：
１となるよう混合し、ポリエチレングリコール４０００
とジメチルスルホキシドをそれぞれ４３％と１３％含む
ＲＰＭＩ‐１６４０培地中で細胞融合させる。
る骨髄腫細胞とを、細胞数が脾細胞：骨髄腫細胞＝７：
１となるよう混合し、ポリエチレングリコール４０００
とジメチルスルホキシドをそれぞれ４３％と１３％含む
ＲＰＭＩ‐１６４０培地中で細胞融合させる。
【００２５】融合した細胞は、９６ウェルプラスチック
プレートにて、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン（以下ＨＡＴと略す）を含むＲＰＭＩ‐１６４
０培地中で７日間、さらにＨＡＴを含まない培地中で成
育させる。この間、３〜５日ごとに培地の交換をおこな
う。
プレートにて、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン（以下ＨＡＴと略す）を含むＲＰＭＩ‐１６４
０培地中で７日間、さらにＨＡＴを含まない培地中で成
育させる。この間、３〜５日ごとに培地の交換をおこな
う。
【００２６】融合後約２週間目に、生き残った細胞につ
いて、その培養上清中の、Ｋ５６２／ＡＤＭに選択的に
結合する抗体の有無を、上記(2) で示した酵素免疫測定
法により検索する。陽性のウェルについては２０％の牛
胎児血清を含むＲＰＭＩ‐１６４０を希釈液として、限
界希釈法をくりかえすことにより、陽性細胞のクローン
ニングを行なう。
いて、その培養上清中の、Ｋ５６２／ＡＤＭに選択的に
結合する抗体の有無を、上記(2) で示した酵素免疫測定
法により検索する。陽性のウェルについては２０％の牛
胎児血清を含むＲＰＭＩ‐１６４０を希釈液として、限
界希釈法をくりかえすことにより、陽性細胞のクローン
ニングを行なう。
【００２７】（５） モノクローナル抗体の調製 プリスタンを、あらかじめ一匹あたり０．５ml腹腔内に
投与することにより前処理したマウスに、目的とする抗
体の産生ハイブリドーマ細胞を一匹あたり１０7 個腹腔
内投与する。投与後、約２週間でハイブリドーマは腹水
癌化するので、この貯留した腹水を採取し、蓄積した抗
体の有無を上記の(2) の酵素免疫測定法により調べる。
投与することにより前処理したマウスに、目的とする抗
体の産生ハイブリドーマ細胞を一匹あたり１０7 個腹腔
内投与する。投与後、約２週間でハイブリドーマは腹水
癌化するので、この貯留した腹水を採取し、蓄積した抗
体の有無を上記の(2) の酵素免疫測定法により調べる。
【００２８】腹水を保存する場合は、遠心分離後の上清
を小分けして−７０℃で凍結保存する。
を小分けして−７０℃で凍結保存する。
【００２９】抗体をさらに精製するために、腹水を４５
％飽和の硫安により４℃で塩析し、さらにセファクリル
‐４００（スウェーデン国ファルマシア社製）を用いて
ゲル濾過する。タンパク質の定量はローリー法によりお
こなう。
％飽和の硫安により４℃で塩析し、さらにセファクリル
‐４００（スウェーデン国ファルマシア社製）を用いて
ゲル濾過する。タンパク質の定量はローリー法によりお
こなう。
【００３０】モノクローナル抗体の性質 上記のようにして得られるモノクローナル抗体のクラス
は、ウサギの抗マウスＩｇ各クラスの抗体（米国カッペ
ル社製）を用いて判定することができる。また、細胞に
おける抗原の局在は、蛍光発色基であるＦＩＴＣが結合
したヤギ抗マウスＩｇ抗体（米国カッペル社製）を用い
て蛍光を顕微鏡下で観察することによって知ることがで
きる。
は、ウサギの抗マウスＩｇ各クラスの抗体（米国カッペ
ル社製）を用いて判定することができる。また、細胞に
おける抗原の局在は、蛍光発色基であるＦＩＴＣが結合
したヤギ抗マウスＩｇ抗体（米国カッペル社製）を用い
て蛍光を顕微鏡下で観察することによって知ることがで
きる。
【００３１】薬物耐性株のＫ５６２／ＡＤＭに対する選
択性は、親株であるＫ５６２を対照として(2) の酵素免
疫測定法によるものの他に、それぞれの細胞株に対する
細胞増殖の阻害の程度を測定して調べることができる。
また、薬物耐性株の薬剤に対する感受性のモノクローナ
ル抗体による変化も種々の濃度の薬剤の存在下でモノク
ローナル抗体と共存させることにより、その細胞増殖の
阻害の程度を測定して調べることができる。
択性は、親株であるＫ５６２を対照として(2) の酵素免
疫測定法によるものの他に、それぞれの細胞株に対する
細胞増殖の阻害の程度を測定して調べることができる。
また、薬物耐性株の薬剤に対する感受性のモノクローナ
ル抗体による変化も種々の濃度の薬剤の存在下でモノク
ローナル抗体と共存させることにより、その細胞増殖の
阻害の程度を測定して調べることができる。
【００３２】本発明によるモノクローナル抗体の具体例
は、イソタイプがＩｇＧ３であるもの、ＩｇＧ２ａであ
るものおよびＩｇＧ１であるもの等である。本発明で
は、これらを、それぞれＭＲＫ４、ＭＲＫ１６およびＭ
ＲＫ１７と名付けている。これらのうちで、代表的なの
は、ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７である。モノクローナ
ル抗体ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７は、薬剤耐性ヒト癌
細胞に対して選択的な増殖阻害作用ないし対薬剤感受性
増加作用を有する（実施例II参照）。
は、イソタイプがＩｇＧ３であるもの、ＩｇＧ２ａであ
るものおよびＩｇＧ１であるもの等である。本発明で
は、これらを、それぞれＭＲＫ４、ＭＲＫ１６およびＭ
ＲＫ１７と名付けている。これらのうちで、代表的なの
は、ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７である。モノクローナ
ル抗体ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７は、薬剤耐性ヒト癌
細胞に対して選択的な増殖阻害作用ないし対薬剤感受性
増加作用を有する（実施例II参照）。
【００３３】
【実施例】実施例Ｉ モノクローナル抗体の作成 ａ） アドリアマイシン耐性株の選抜および確立 アドリアマイシン耐性細胞株Ｋ５６２／ＡＤＭの選抜の
ために、同じ親株のヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２か
ら作成されていたビンクリスチン耐性細胞株Ｋ５６２／
ＶＣＲを出発の細胞株とした。
ために、同じ親株のヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２か
ら作成されていたビンクリスチン耐性細胞株Ｋ５６２／
ＶＣＲを出発の細胞株とした。
【００３４】最初に、Ｋ５６２／ＶＣＲをこの細胞株の
ＩＣ５０（細胞増殖を５０％阻害する濃度）であるアド
リアマイシン１５ｎＭを含有するＲＰＭＩ‐１６４０
（牛胎児血清を１０％含む）培地で一週間培養の後、成
育してくる細胞を選抜した。次にアドリアマイシンの薬
物濃度を約３倍の５０ｎＭに増量し、一週間培養ののち
得られた耐性細胞について、さらに３倍量である１５０
ｎＭと段階的に薬物濃度を増量していき、最終的に４５
０ｎＭのアドリアマイシン存在下でも生育しうるアドリ
アマイシン耐性細胞を得ることができた。
ＩＣ５０（細胞増殖を５０％阻害する濃度）であるアド
リアマイシン１５ｎＭを含有するＲＰＭＩ‐１６４０
（牛胎児血清を１０％含む）培地で一週間培養の後、成
育してくる細胞を選抜した。次にアドリアマイシンの薬
物濃度を約３倍の５０ｎＭに増量し、一週間培養ののち
得られた耐性細胞について、さらに３倍量である１５０
ｎＭと段階的に薬物濃度を増量していき、最終的に４５
０ｎＭのアドリアマイシン存在下でも生育しうるアドリ
アマイシン耐性細胞を得ることができた。
【００３５】このアドリアマイシン耐性細胞は、この薬
剤を５００ｎＭ含有する培地中で約１年間培養し続ける
ことにより、その後約３ヵ月間アドリアマイシンを含ま
ない培地中で培養してもその耐性を失わない安定した耐
性株となった。本発明者らは、これをＫ５６２／ＡＤＭ
と名づけた。
剤を５００ｎＭ含有する培地中で約１年間培養し続ける
ことにより、その後約３ヵ月間アドリアマイシンを含ま
ない培地中で培養してもその耐性を失わない安定した耐
性株となった。本発明者らは、これをＫ５６２／ＡＤＭ
と名づけた。
【００３６】ｂ） マウスの免疫および細胞融合 ａ）で得られたＫ５６２／ＡＤＭについて、一匹あたり
１０7 個細胞となる量を０．５mlのＨＢＢＳにて浮遊さ
せ、一度洗浄の後、４〜６週令のメスのＢａｌｂ／ｃマ
ウスに腹腔内投与した。同様にして、毎週一回、６週間
にわたり連続して投与をくりかえし、最後の週に、追加
免疫（ブースター）として１０6 細胞を０．１mlのＨＢ
ＳＳに浮遊させて静脈内に投与し、その３日後に無菌的
に脾臓をとりだした。脾臓細胞は、マウス一匹あたり
１．４〜３×１０8 個得られた。脾臓はピンセットでほ
ぐして懸濁液とした。
１０7 個細胞となる量を０．５mlのＨＢＢＳにて浮遊さ
せ、一度洗浄の後、４〜６週令のメスのＢａｌｂ／ｃマ
ウスに腹腔内投与した。同様にして、毎週一回、６週間
にわたり連続して投与をくりかえし、最後の週に、追加
免疫（ブースター）として１０6 細胞を０．１mlのＨＢ
ＳＳに浮遊させて静脈内に投与し、その３日後に無菌的
に脾臓をとりだした。脾臓細胞は、マウス一匹あたり
１．４〜３×１０8 個得られた。脾臓はピンセットでほ
ぐして懸濁液とした。
【００３７】細胞の融合は、ケーラーおよびミルスティ
ン両氏の方法に従って実施した。すなわち、この脾細胞
１．４×１０8 個を、４３％のポリエチレングリコール
４０００と、１３％のジメチルスルホキシドを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地中にて２×１０7 個のＰ３・６３・Ａ
ｇ８・６５３骨髄腫細胞と融合させた。
ン両氏の方法に従って実施した。すなわち、この脾細胞
１．４×１０8 個を、４３％のポリエチレングリコール
４０００と、１３％のジメチルスルホキシドを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地中にて２×１０7 個のＰ３・６３・Ａ
ｇ８・６５３骨髄腫細胞と融合させた。
【００３８】ｃ） ハイブリドーマの選択 細胞の融合の後、９６ウェルのプラスチックプレート上
でＨＡＴ培地中で７日間、さらにＨＡＴを含まない培地
中で７日間、生育させた。一匹のマウスあたり３００〜
４００ウェルの培養をおこない、そのうちの約７５％の
ウェルで、細胞の生育がみられた。これらのウェルの培
養上清について、酵素免疫測定法により、Ｋ５６２とＫ
５６２／ＡＤＭに対する反応をみたところ、約３分の２
ウェルではＫ５６２とＫ５６２／ＡＤＭの両方に同程度
の陽性の発色がみられ、残りの３分の１のウェルでは両
方ともに反応しなかった。さらに、一匹のマウスに由来
する３００〜４００ウェルあたり０〜３個のＫ５６２と
Ｋ５６２／ＡＤＭに反応するが、明らかにＫ５６２／Ａ
ＤＭにより強く反応するウェルがみつかった。
でＨＡＴ培地中で７日間、さらにＨＡＴを含まない培地
中で７日間、生育させた。一匹のマウスあたり３００〜
４００ウェルの培養をおこない、そのうちの約７５％の
ウェルで、細胞の生育がみられた。これらのウェルの培
養上清について、酵素免疫測定法により、Ｋ５６２とＫ
５６２／ＡＤＭに対する反応をみたところ、約３分の２
ウェルではＫ５６２とＫ５６２／ＡＤＭの両方に同程度
の陽性の発色がみられ、残りの３分の１のウェルでは両
方ともに反応しなかった。さらに、一匹のマウスに由来
する３００〜４００ウェルあたり０〜３個のＫ５６２と
Ｋ５６２／ＡＤＭに反応するが、明らかにＫ５６２／Ａ
ＤＭにより強く反応するウェルがみつかった。
【００３９】全部で１８匹のマウスを用いて約６０００
ウェルのスクリーニングを行なって、同様にＫ５６２＜
Ｋ５６２／ＡＤＭの反応性を持つ２５個のウェルがみつ
かった。
ウェルのスクリーニングを行なって、同様にＫ５６２＜
Ｋ５６２／ＡＤＭの反応性を持つ２５個のウェルがみつ
かった。
【００４０】ｄ） ハイブリドーマのクローニング ｃ）で選択された２５個のウェルについて、限界希釈法
によって、反応陽性細胞のクローニングを行なった。希
釈液としては２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ‐１６
４０を用い、１個のウェルに０．５〜５個の細胞が分配
されるように希釈して培養を行なった。各々のウェルに
ついて、酵素免疫測定法により、培養上清中の抗体の有
無および性質を調べ、陽性度の強いウェルについては、
さらに限界希釈法によるクローニングをくりかえして、
２５個の安定したハイブリドーマのクローンを得ること
ができた。
によって、反応陽性細胞のクローニングを行なった。希
釈液としては２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ‐１６
４０を用い、１個のウェルに０．５〜５個の細胞が分配
されるように希釈して培養を行なった。各々のウェルに
ついて、酵素免疫測定法により、培養上清中の抗体の有
無および性質を調べ、陽性度の強いウェルについては、
さらに限界希釈法によるクローニングをくりかえして、
２５個の安定したハイブリドーマのクローンを得ること
ができた。
【００４１】ｅ） 抗体の産生および精製 ｄ）で得られた２５個のハイブリドーマのうち１６個の
クローンについて、マウス腹腔内に一匹あたり１０7 個
の投与を行なって、腹水癌を発生させ、２週間後に一匹
あたり５〜１０mlの腹水を得た。残りの９個のクローン
は凍結保存（−７０℃にて）した。腹水中の総タンパク
量は、５〜１５mg／mlであった。これらの腹水を、４５
％飽和硫安で塩析の後に、セファクリル‐４００（スウ
ェーデン国ファルマシア社製）でゲル濾過することによ
り抗体を精製した。
クローンについて、マウス腹腔内に一匹あたり１０7 個
の投与を行なって、腹水癌を発生させ、２週間後に一匹
あたり５〜１０mlの腹水を得た。残りの９個のクローン
は凍結保存（−７０℃にて）した。腹水中の総タンパク
量は、５〜１５mg／mlであった。これらの腹水を、４５
％飽和硫安で塩析の後に、セファクリル‐４００（スウ
ェーデン国ファルマシア社製）でゲル濾過することによ
り抗体を精製した。
【００４２】実施例II モノクローナル抗体ＭＲＫ‐１
６およびＭＲＫ‐１７の性質 ａ） 抗体のイソタイプ 得られたモノクローナル抗体１６種類について、米国カ
ッペル社製ウサギ抗マウスＩｇ各イソタイプの抗体を用
いるキットにより、そのイソタイプを判定した。その結
果、ＩｇＧ３が１個（ＭＲＫ４）、ＩｇＧ２ａが１個
（ＭＲＫ１６）およびＩｇＧ１が１個（ＭＲＫ１７）得
られ、他は全てＩｇＭイソタイプに属していることが明
らかとなった。
６およびＭＲＫ‐１７の性質 ａ） 抗体のイソタイプ 得られたモノクローナル抗体１６種類について、米国カ
ッペル社製ウサギ抗マウスＩｇ各イソタイプの抗体を用
いるキットにより、そのイソタイプを判定した。その結
果、ＩｇＧ３が１個（ＭＲＫ４）、ＩｇＧ２ａが１個
（ＭＲＫ１６）およびＩｇＧ１が１個（ＭＲＫ１７）得
られ、他は全てＩｇＭイソタイプに属していることが明
らかとなった。
【００４３】ｂ） 蛍光抗体法による抗原の所在の判定 ＦＩＴＣ結合のヤギ抗マウスＩｇ抗体（カッペル社）を
用いて、ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７各々のモノクロー
ナル抗体とＫ５６２／ＡＤＭ細胞上の抗原との結合部位
を調べたところ、両方とも細胞膜表面上にリング状に分
布する蛍光の発色がみられた。すなわち、いずれの抗体
もＫ５６２／ＡＤＭ細胞の膜に局在する抗原を認識して
いた。対照として親株のＫ５６２に同様の処置をおこな
っても、このような蛍光の発色は全くみられず、ＭＲＫ
１６、ＭＲＫ１７ともに、Ｋ５６２／ＡＤＭに強い選択
性を有することが明らかとなった。また、放射性同位元
素免疫定量法によってもＭＲＫ１６とＭＲＫ１７はＫ５
６２細胞には反応せず、耐性株であるＫ５６２／ＡＤＭ
に非常に高い選択性をもって反応することが明らかとな
った（図１参照）。すなわち、１０6 個の細胞をそれぞ
れＭＲＫ１６および同１７の腹水希釈液と反応させ、細
胞を洗浄後、１２５Ｉでラベルした羊の抗マウスＩｇの
Ｆ（ａｂ′）２フラグメント（英国アマーシャム社製）
と４℃で３０分間反応させ、洗浄後、細胞と反応したＭ
ＲＫ１６および同１７の反応性（ｃｐｍ）を測定した結
果は、図１に示す通りであった。
用いて、ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７各々のモノクロー
ナル抗体とＫ５６２／ＡＤＭ細胞上の抗原との結合部位
を調べたところ、両方とも細胞膜表面上にリング状に分
布する蛍光の発色がみられた。すなわち、いずれの抗体
もＫ５６２／ＡＤＭ細胞の膜に局在する抗原を認識して
いた。対照として親株のＫ５６２に同様の処置をおこな
っても、このような蛍光の発色は全くみられず、ＭＲＫ
１６、ＭＲＫ１７ともに、Ｋ５６２／ＡＤＭに強い選択
性を有することが明らかとなった。また、放射性同位元
素免疫定量法によってもＭＲＫ１６とＭＲＫ１７はＫ５
６２細胞には反応せず、耐性株であるＫ５６２／ＡＤＭ
に非常に高い選択性をもって反応することが明らかとな
った（図１参照）。すなわち、１０6 個の細胞をそれぞ
れＭＲＫ１６および同１７の腹水希釈液と反応させ、細
胞を洗浄後、１２５Ｉでラベルした羊の抗マウスＩｇの
Ｆ（ａｂ′）２フラグメント（英国アマーシャム社製）
と４℃で３０分間反応させ、洗浄後、細胞と反応したＭ
ＲＫ１６および同１７の反応性（ｃｐｍ）を測定した結
果は、図１に示す通りであった。
【００４４】ｃ） 他の薬剤耐性株の識別 これまで、ヒトの腫瘍細胞株ではアドリアマイシン耐性
株は数が少ないとされ、唯一利用できたヒト卵巣カルシ
ノーマ細胞株２７８０のアドリアマイシン耐性株２７８
０ADについて、ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７との反応性
を放射性同位元素免疫定量法を用いて調べたところ、両
方のモノクローナル抗体とも親株の２７８０に比較して
耐性株の２７８０ADに強く反応した（図２参照）。すな
わち、３×１０5 個の細胞をディッシュにまき、細胞が
ディッシュに接着した２４時間後に、第１図に示した場
合と同様にしてＭＲＫ１６と同１７の反応性（ｃｐｍ）
を測定した結果は、図２に示す通りであった。
株は数が少ないとされ、唯一利用できたヒト卵巣カルシ
ノーマ細胞株２７８０のアドリアマイシン耐性株２７８
０ADについて、ＭＲＫ１６およびＭＲＫ１７との反応性
を放射性同位元素免疫定量法を用いて調べたところ、両
方のモノクローナル抗体とも親株の２７８０に比較して
耐性株の２７８０ADに強く反応した（図２参照）。すな
わち、３×１０5 個の細胞をディッシュにまき、細胞が
ディッシュに接着した２４時間後に、第１図に示した場
合と同様にしてＭＲＫ１６と同１７の反応性（ｃｐｍ）
を測定した結果は、図２に示す通りであった。
【００４５】ｄ） ＭＲＫ１７のＫ５６２／ＡＤＭに対
する選択的細胞増殖阻害 耐性株のＫ５６２／ＡＤＭとその親株Ｋ５６２ならびに
比較のために別の細胞株に属する耐性株の２７８０ADと
その親株２７８０について、それぞれモノクローナル抗
体ＭＲＫ１７を含む腹水を段階的に希釈してその細胞増
殖に対する阻害効果を調べた（図３参照）。すなわち、
２×１０4 個のＫ５６２およびＫ５６２／ＡＤＭ細胞、
ならびに６×１０4 個の２７８０および２７８０AD細胞
をＭＲＫ１７の腹水希釈液と共にインキュベートし、７
２時間後の細胞数を測定して増殖阻害パーセントを計算
して得た結果は図３に示した通りであった。
する選択的細胞増殖阻害 耐性株のＫ５６２／ＡＤＭとその親株Ｋ５６２ならびに
比較のために別の細胞株に属する耐性株の２７８０ADと
その親株２７８０について、それぞれモノクローナル抗
体ＭＲＫ１７を含む腹水を段階的に希釈してその細胞増
殖に対する阻害効果を調べた（図３参照）。すなわち、
２×１０4 個のＫ５６２およびＫ５６２／ＡＤＭ細胞、
ならびに６×１０4 個の２７８０および２７８０AD細胞
をＭＲＫ１７の腹水希釈液と共にインキュベートし、７
２時間後の細胞数を測定して増殖阻害パーセントを計算
して得た結果は図３に示した通りであった。
【００４６】その結果、それぞれの感受性の親株である
Ｋ５６２または２７８０に対しては４００分の１希釈ま
で抗体の濃度を増やしてもほとんど阻害は見られなかっ
たのに対し、薬剤耐性株である２７８０ADでは同じ抗体
濃度で約３０％の増殖阻害がみられ、Ｋ５６２／ＡＤＭ
に至っては８０％の増殖阻害が、また１００分の１の希
釈抗体では９０％以上の増殖阻害が見られた（トリプリ
ケートデータＳＤ＜４％）。
Ｋ５６２または２７８０に対しては４００分の１希釈ま
で抗体の濃度を増やしてもほとんど阻害は見られなかっ
たのに対し、薬剤耐性株である２７８０ADでは同じ抗体
濃度で約３０％の増殖阻害がみられ、Ｋ５６２／ＡＤＭ
に至っては８０％の増殖阻害が、また１００分の１の希
釈抗体では９０％以上の増殖阻害が見られた（トリプリ
ケートデータＳＤ＜４％）。
【００４７】同様の実験をＭＲＫ１６を用いて行なった
ところ、Ｋ５６２／ＡＤＭに対し、最高で約１２％の軽
度の増殖阻害が見られた。すなわち、ＭＲＫ１７の大き
な特徴は、薬物耐性株に選択的な強い増殖阻害作用を有
していることであるといえる。
ところ、Ｋ５６２／ＡＤＭに対し、最高で約１２％の軽
度の増殖阻害が見られた。すなわち、ＭＲＫ１７の大き
な特徴は、薬物耐性株に選択的な強い増殖阻害作用を有
していることであるといえる。
【００４８】ｅ） ＭＲＫ１６によるＫ５６２／ＡＤＭ
の薬剤感受性に対する効果 ＭＲＫ１６は上記ｄ）で、薬物耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭ
に対する直接の増殖阻害効果は軽度であったが、この実
験率にビンクリスチンを０．５μｇ／mlの濃度で添加し
たところ、ＭＲＫ１６の共存により、最大約７５％まで
の耐性株の増殖阻害が観察された（図４参照）。すなわ
ち、２×１０4 個のＫ５６２／ＡＤＭ細胞をビンクリス
チン（ＶＣＲ）５００ng／mlの存在下および非存在下に
ＭＲＫ１６の腹水希釈液と共にインキュベートし、７２
時間後の増殖阻害パーセントを測定して得た結果は、図
４に示す通りであった。
の薬剤感受性に対する効果 ＭＲＫ１６は上記ｄ）で、薬物耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭ
に対する直接の増殖阻害効果は軽度であったが、この実
験率にビンクリスチンを０．５μｇ／mlの濃度で添加し
たところ、ＭＲＫ１６の共存により、最大約７５％まで
の耐性株の増殖阻害が観察された（図４参照）。すなわ
ち、２×１０4 個のＫ５６２／ＡＤＭ細胞をビンクリス
チン（ＶＣＲ）５００ng／mlの存在下および非存在下に
ＭＲＫ１６の腹水希釈液と共にインキュベートし、７２
時間後の増殖阻害パーセントを測定して得た結果は、図
４に示す通りであった。
【００４９】ビンクリスチンを用いて、Ｋ５６２／ＶＣ
Ｒ細胞内での蓄積に対するＭＲＫ１６の効果をみたとこ
ろ、抗体無添加の対照実験に比べて約６０〜７０％の増
加が見られた（図５参照）。すなわち、２×１０5 個の
Ｋ５６２／ＶＣＲ細胞をＭＲＫ１６（腹水１：２００希
釈液）存在下および非存在下に、〔３Ｈ〕ＶＣＲ（１０
０ｎＭ）と共にインキュベートし、細胞にとり込まれた
ビンクリスチンを定量した結果は図５に示す通りであっ
た。
Ｒ細胞内での蓄積に対するＭＲＫ１６の効果をみたとこ
ろ、抗体無添加の対照実験に比べて約６０〜７０％の増
加が見られた（図５参照）。すなわち、２×１０5 個の
Ｋ５６２／ＶＣＲ細胞をＭＲＫ１６（腹水１：２００希
釈液）存在下および非存在下に、〔３Ｈ〕ＶＣＲ（１０
０ｎＭ）と共にインキュベートし、細胞にとり込まれた
ビンクリスチンを定量した結果は図５に示す通りであっ
た。
【００５０】すなわち、ＭＲＫ１６は、耐性株において
亢進している細胞内薬物の細胞外へのくみ出しに関与す
る作用点を認識している可能性をもっている。ここで、
Ｋ５６２／ＡＤＭ以外の耐性株の２７８０ADを用いて、
ビンクリスチンに対する感受性の変化をみたところ、そ
のＩＣ５０値で２０〜３０％の減少、すなわち薬物に対
する感受性の増加、がみられた。
亢進している細胞内薬物の細胞外へのくみ出しに関与す
る作用点を認識している可能性をもっている。ここで、
Ｋ５６２／ＡＤＭ以外の耐性株の２７８０ADを用いて、
ビンクリスチンに対する感受性の変化をみたところ、そ
のＩＣ５０値で２０〜３０％の減少、すなわち薬物に対
する感受性の増加、がみられた。
【００５１】ＭＲＫ１６は、また、ビンクリスチン以外
に、アクチノマイシンＤに対するＫ５６２／ＡＤＭの感
受性も約３倍強めることができた（図６参照）。すなわ
ち、２×１０4 個のＫ５６２／ＡＤＭ細胞をＭＲＫ１６
（腹水１：１０００希釈液）の存在下および非存在下
に、種々の濃度のアクチノマイシンＤと共に３７℃でイ
ンキューベートし、７２時間後の増殖阻害パーセントを
測定して得た結果は、図６に示す通りであった。
に、アクチノマイシンＤに対するＫ５６２／ＡＤＭの感
受性も約３倍強めることができた（図６参照）。すなわ
ち、２×１０4 個のＫ５６２／ＡＤＭ細胞をＭＲＫ１６
（腹水１：１０００希釈液）の存在下および非存在下
に、種々の濃度のアクチノマイシンＤと共に３７℃でイ
ンキューベートし、７２時間後の増殖阻害パーセントを
測定して得た結果は、図６に示す通りであった。
【００５２】これらの結果から、ＭＲＫ１６は、多くの
抗ガン剤耐性株に選択的に働き、その薬物に対する感受
性を高めることができる抗体であるといえる。
抗ガン剤耐性株に選択的に働き、その薬物に対する感受
性を高めることができる抗体であるといえる。
【００５３】
【発明の効果】本発明によるハイブリドーマにより生産
されたモノクローナル抗体は、多剤交叉耐性を示す癌細
胞を選択的に増殖阻害するか、あるいはその薬物に対す
る感受性を高める能力を有しているものであることは、
「課題を解決する手段」の項において前記したところで
ある。
されたモノクローナル抗体は、多剤交叉耐性を示す癌細
胞を選択的に増殖阻害するか、あるいはその薬物に対す
る感受性を高める能力を有しているものであることは、
「課題を解決する手段」の項において前記したところで
ある。
【図１】（Ａ）および（Ｂ）は、放射性同位元素免疫定
量法によるＭＲＫ１６（Ａ）およびＭＲＫ１７（Ｂ）の
ヒト骨髄性白血病細胞Ｋ５６２およびそのアドリアマイ
シン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭ細胞に対する反応性を示す
グラフである。
量法によるＭＲＫ１６（Ａ）およびＭＲＫ１７（Ｂ）の
ヒト骨髄性白血病細胞Ｋ５６２およびそのアドリアマイ
シン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭ細胞に対する反応性を示す
グラフである。
【図２】（Ａ）および（Ｂ）は、放射性同位元素免疫定
量法によるＭＲＫ１６（Ａ）およびＭＲＫ１７（Ｂ）の
ヒト卵巣癌細胞２７８０およびそのアドリアマイシン耐
性株２７８０ADに対する反応性を示すグラフである。
量法によるＭＲＫ１６（Ａ）およびＭＲＫ１７（Ｂ）の
ヒト卵巣癌細胞２７８０およびそのアドリアマイシン耐
性株２７８０ADに対する反応性を示すグラフである。
【図３】ＭＲＫ１７による細胞増殖阻害を示すグラフで
ある。
ある。
【図４】ＭＲＫ１６とビンクリスチンの併用による細胞
阻害を示すグラフである。
阻害を示すグラフである。
【図５】ＭＲＫ１６によるビンクリスチンのとり込み上
昇を示すグラフである。
昇を示すグラフである。
【図６】ＭＲＫ１６によるアクチノマイシンＤの効果増
強を示すグラフである。
強を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２のアドリ
アマイシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫したマウ
スから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞との細胞融
合により作成されたモノクローナル抗体生産性ハイブリ
ドーマ。ただし、このモノクローナル抗体は、下記の
（イ）〜（ニ）によって定義されるものである。 （イ） ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２のアドリアマ
イシン耐性株Ｋ５６２／ＡＤＭにより免疫されたマウス
から得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させ
て作成したハイブリドーマにより生産されるものである
こと。 （ロ） アドリアマイシン耐性株と反応するがアドリア
マイシン感受性株とは実質上反応しないこと。 （ハ） アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害する
かあるいはその細胞のビンクリスチンまたはアクチノマ
イシンＤに対する感受性を高める能力があること。 （ニ） ＩｇＧイソタイプに属するものであること。 - 【請求項２】ハイブリドーマＭＲＫ１６またはハイブリ
ドーマＭＲＫ１７である、請求項１記載のハイブリドー
マ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3309471A JPH0661264B2 (ja) | 1991-11-25 | 1991-11-25 | 薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3309471A JPH0661264B2 (ja) | 1991-11-25 | 1991-11-25 | 薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60201445A Division JPS6261596A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | 薬剤耐性癌に関するモノクロ−ナル抗体およびその製造 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219946A true JPH05219946A (ja) | 1993-08-31 |
| JPH0661264B2 JPH0661264B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=17993393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3309471A Expired - Fee Related JPH0661264B2 (ja) | 1991-11-25 | 1991-11-25 | 薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0661264B2 (ja) |
-
1991
- 1991-11-25 JP JP3309471A patent/JPH0661264B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0661264B2 (ja) | 1994-08-17 |
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