JPH05219960A - キメラポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】ＣＤ４（ヒトＣＤ４分子）を土台としたキメラ
ポリペプチドを提供する。 【構成】各サブ配列が互いに独立してヒト受容体のリガ
ンド結合部位、抗原結合部位またはヒト受容体のリガン
ドをコードする２つのＤＮＡサブ配列から成り、場合に
より免疫グロブリンκまたはλ−Ｌ鎖の定常部またはそ
の一部をコードする第三のＤＮＡサブ配列をさらに含む
ＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を含むベクター、前記ベク
ターで形質転換された原核または真核宿主細胞、前記Ｄ
ＮＡ配列によりコードされるポリペプチド、前記ポリペ
プチドの生産方法、前記ポリペプチドを含む医薬組成
物、医薬組成物（特にエイズ治療用組成物）を調製する
ための前記ポリペプチドの使用、並びに疾病（特にエイ
ズ）を治療するための前記ポリペプチドの使用に関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、各サブ配列が互いに独
立してヒト受容体のリガンド結合部位、抗原結合部位ま
たはヒト受容体のリガンドをコードする２つのＤＮＡサ
ブ配列から成り、場合により免疫グロブリンκまたはλ
−Ｌ鎖の定常部またはその一部をコードする第三のＤＮ
Ａサブ配列をさらに含むＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を
含むベクター、前記ベクターで形質転換された原核また
は真核宿主細胞、前記ＤＮＡ配列によりコードされるポ
リペプチド、前記ポリペプチドの生産方法、前記ポリペ
プチドを含む医薬組成物、医薬組成物（特にエイズ治療
用組成物）を調製するための前記ポリペプチドの使用、
並びに病気（特にエイズ）を治療するための前記ポリペ
プチドの使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−
Ｉ）がその受容体として細胞表面ＣＤ４分子を利用する
ことが認識されて以来、このウイルスを殺すために可溶
性形態のヒトＣＤ４分子（ｓＣＤ４）が製造されてきた
(1-4) 。最初のタイプのｓＣＤ４分子は基本的にこのタ
ンパク質の細胞外部分またはその末端切断型だけを含
み、従って遊離のウイルスを中和することはできたが、
ウイルス感染細胞を殺すことができなかった(5-9) 。そ
の後の研究開発はＣＤ４−毒素(10)およびＣＤ４−Ｉｇ
（免疫グロブリン鎖）(11,12) に類似した分子へ導き、
これらの分子は毒素の直接作用により、あるいはＦｃ媒
介免疫エフェクター機能により感染細胞を破壊するため
に構築された。

【０００３】ＣＤ４を土台としたこの種の分子は種々の
特許出願の主題となっており、例えば Dana-Faber がん
研究所が出願したＷＯ８９／０３２２２、ニューヨーク
市コロンビア大学の受託者が出願したＷＯ８８／０１３
０４、Biogen社が出願したＷＯ８９／０１９４０、Gene
ntech 社が出願したＷＯ８９／０２９２２および欧州特
許出願公開番号（ＥＰＡ）３１４３１７、General Hosp
ital Corporationが出願したＥＰＡ３２５２６２、並び
に Hoffmann-La Rocheが出願したＥＰＡ３９４８２７な
どがある。

【０００４】

【発明の具体的説明】本発明の目的は、ＣＤ４を土台と
した新規なキメラポリペプチドを提供することである。
これらのポリペプチドは完全なリガンド結合活性を有す
るヒトＣＤ４分子の最初の２つのドメインまたはその断
片と、細胞障害性Ｔ細胞のヒトＴ細胞受容体複合体（Ｃ
Ｄ３分子）を認識する抗原結合部位を含み、場合により
あらゆる起源（好ましくは哺乳類、例えばマウスやラッ
ト）のものであり得る免疫グロブリンκまたはλ−Ｌ鎖
の定常部またはその一部をさらに含む。本明細書におい
て、“抗原結合部位”（Ｆｖ）という表現は、抗体のＬ
鎖とＨ鎖の可変部の結合部分とこれらの２つの結合部分
間のスペーサーから成るアミノ酸配列を意味する。結合
部分は抗体のＬ鎖またはＨ鎖の可変部の少なくとも一
部、好ましくは抗体のＬ鎖またはＨ鎖の可変部の全部か
ら成るアミノ酸配列を意味し、かくしてＬ鎖とＨ鎖のこ
れらの結合部分が両方とも分子中に存在する場合は対応
する抗原がまだ結合されるだろう。本発明の特定の実施
態様において、結合部分は抗体のＨ鎖の全可変部とその
Ｎ末端の前に結合された数個（好ましくは４個）の追加
のアミノ酸（例えばＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）
とから成るアミノ酸配列を意味する。スペーサーのアミ
ノ酸の数および種類は、Huston et al(16)によって示さ
れた考えに基づいて、当業者が選択しうる。最後に、
“ＦｖＸ”の形の略語は、本明細書においては、抗
“Ｘ”抗体の抗原結合部位を意味し、例えば“ＦｖＣＤ
３”は抗ＣＤ３抗体の抗原結合部位を意味する。

【０００５】この種のキメラペプチドは、ＦｖＣＤ３の
ほかに、ヒトＣＤ４分子の最初の２つのドメイン、好ま
しくは次のアミノ酸配列（アミノ酸は標準一文字表記で
示す）：

【０００６】

【化１】

【０００７】を有するもの、を含むことが好適である。
さらに好適な本発明のポリペプチドは、ＦｖＣＤ３部分
がハイブリドーマ“ＴＲ６６”により分泌された抗ＣＤ
３抗体から誘導された、上記のようなＣＤ４を土台とし
たキメラポリペプチドである(15)。このようなＣＤ４を
土台としたキメラポリペプチドは、それらがＨＩＶ−Ｉ
ウイルス感染細胞をより強力に死滅させることができ、
また活性化Ｔ細胞が感染部位へこれらの分子を効率的に
輸送しうるので、既知のＣＤ４−毒素またはＣＤ４−Ｉ
ｇ構築物と比べてかなり有利である。さらに、それらの
単純な構造（例えば、低分子量）のために、それらは原
核細胞による発現に適している〔例えば、Tai et al (3
4)を参照されたい〕。

【０００８】細胞障害性Ｔ細胞による他の標的細胞の直
接殺傷を仲介するために、上記分子のＣＤ４部分は標的
細胞特異的表面タンパク質を認識する他の分子と置き換
えることができる。このような他の標的細胞を認識する
分子は、ヒト受容体のリガンド結合部位、例えばＣＤ４
の場合のような受容体の可溶性部分、または標的細胞に
特異的なヒト受容体のリガンド、例えばＩＬ−７受容体
陽性細胞のためのＩＬ−７またはヒト幹細胞のためのヒ
ト幹細胞因子、あるいは標的細胞に特異的な抗原を認識
する他の抗原結合部位、例えばＦｖクラスII（クラスII
陽性細胞に特異的）、あるいはＦｖｏｖｃａ（卵巣がん
細胞から誘導される抗原）の場合のような腫瘍細胞特異
的抗原を認識する抗原結合部位、またはウイルス特異的
表面抗原を認識する抗原結合部位、例えばマウスのモロ
ニー白血病ウイルス表面タンパク質“ｇｐ７０”をそれ
らの対応抗原として認識するＦｖｍｏｌでありうる。
“ヒト受容体のリガンド結合部位”という表現は、本明
細書中では、例えば当分野で習熟した者には理解される
ように、対応するヒト受容体のリガンドが“受容体の可
溶性部分”により結合されうる状態に折りたたまれてい
るアミノ酸配列を意味する。

【０００９】しかしながら、目的とする標的細胞に細胞
障害性Ｔ細胞による殺傷のほかに別の活性を向けるため
に、ＦｖＣＤ３部分はこのような活性をもたらす又は仲
介する細胞あるいは分子を認識する他の分子と置き換え
ることができる。再度、この種の認識分子は対象細胞の
表面タンパク質を認識する受容体の可溶性部分、このよ
うな細胞に特異的なヒト受容体のリガンド、目的とする
細胞に特異的な抗原を認識する抗原結合部位、あるいは
希望する活性をもたらす又は仲介する分子でありうる。
例えば、ウイルスの表面タンパク質を認識する部分（前
記部分は例えばＦｖｍｏｌのような抗原結合部位の形で
ある）と目的とする標的細胞を認識するキメラポリペプ
チドの他の部分（前記他の部分は例えばヒト幹細胞因子
（ＳＣＦ；ｃｋｉｔのリガンド）のような標的細胞に特
異的な受容体のリガンドの形である）から成るキメラポ
リペプチドが構築される。このような方法で、外来ＤＮ
Ａにより形質転換されたウイルスは身体の遺伝子療法の
ために対象の細胞、この場合は幹細胞、へ導入すること
ができる。従って、本発明の他の目的はこのようなキメ
ラポリペプチドを提供することである。

【００１０】上記のキメラポリペプチドはいくつかの面
で、特にキメラポリペプチドが２つの異なる抗原結合部
位を含む場合には、二重特異性抗体のような挙動をとり
うるので、本発明のキメラポリペプチドはこのような二
重特異性抗体と同じ目的のために使用されることが理解
されよう。しかしながら、本発明のキメラポリペプチド
は、機能的な匹敵する二重特異性抗体と比べて、少なく
とも次のような利点を示す。二重特異性抗体を生成する
通常の手法は、希望する抗体特異性を生ずる２つのハイ
ブリドーマ細胞株を融合させることである(17)。ＩｇＨ
およびＬ鎖のランダムな取り合わせのために、これらの
ハイブリドーマは可能な１０種類の異なる抗体分子の混
合物を産生する。かくして、二重特異性抗体は目的産物
の収量をかなり低下させる煩雑な手順に従って精製しな
ければならない。本発明の場合には、キメラポリペプチ
ドは一本鎖分子として生産される。さらに、この種の分
子は二重特異性抗体よりはるかに低分子量である。この
ことは原核細胞によるそれらの生産にとって有利であ
り、さらに治療または診断目的で使用する場合に標的領
域への透過に有利である。

【００１１】ＣＤ４−Ｈγ３（ＥＰＡ３９４８２７に記
載される）の形の１つのモノマーとＦｖＣＤ３−Ｈγ３
の形のもう１つのモノマーから成るＣＤ４−Ｈγ３のダ
イマー二重特異性類縁体（ＣＤ４−Ｈγ３／ＦｖＣＤ３
−Ｈγ３）も本発明の目的である。ＣＤ４部分および／
またはＦｖＣＤ３が受容体のリガンド結合部位、ＦｖＣ
Ｄ３以外の他の抗原結合部位、またはヒト受容体のリガ
ンドと置き換えられて、ＣＤ４−Ｈγ３が除外されるこ
の種の分子も本発明の目的である。それらの構造特性に
よれば、この種の分子は二重特異性Ｈγ３構築物として
作製する（上記参照）のがより煩雑である二重特異性抗
体と機能的に類似している（二重特異性抗体の場合の１
０種類の異なる抗体分子の代わりに、たった３種類の抗
体分子が生成される）。

【００１２】従って、本発明の目的は、各サブ配列が互
いに独立してヒト受容体のリガンド結合部位、抗原結合
部位またはヒト受容体のリガンドをコードする２つのＤ
ＮＡサブ配列から成り、場合により免疫グロブリンκま
たはλ−Ｌ鎖の定常部またはその一部をコードする第三
のＤＮＡサブ配列をさらに含むＤＮＡ配列を提供するこ
とであり、より詳細には、２つのＤＮＡサブ配列の一方
がヒト受容体のリガンド結合部位、好ましくはヒトＣＤ
４分子の最初の２つのドメインまたはリガンドとまだ結
合するその断片をコードし、他方のＤＮＡサブ配列は抗
原結合部位をコードするこの種のＤＮＡ配列を提供する
ことである。特に好適なこの種のＤＮＡ配列は、ヒトＣ
Ｄ４分子の最初の２つのドメインまたはリガンドとまだ
結合するその断片をコードするＤＮＡサブ配列（ヒトＣ
Ｄ４分子の最初の２つのドメインをコードする配列が好
適である）およびヒトＣＤ３分子を認識する抗原結合部
位をコードする第二のＤＮＡサブ配列から成る。ヒトＣ
Ｄ４分子の最初の２つのドメインの部分に関しては、次
の組み合わせが可能である： （ａ）第二ドメインの一部と組み合わせた完全な第一ド
メイン、または（ｂ）第一ドメインの一部と組み合わせ
た完全な第二ドメイン、あるいは（ｃ）各々のドメイン
の一部の組み合わせ。

【００１３】さらに、本発明の目的は、同一または異な
る抗原特異性を有する抗原結合部位をコードする２つの
ＤＮＡサブ配列（異なる抗原特異性を有する抗原結合部
位が好適であり、特に一方の抗原結合部位がヒトＣＤ３
分子を認識する）から成り、場合によりすでに定義した
第三のＤＮＡサブ配列をさらに含むこの種のＤＮＡ配列
を提供することである。

【００１４】さらに、本発明の目的は、ヒト受容体のリ
ガンドをコードするＤＮＡサブ配列および抗原結合部位
（特にヒトＣＤ３分子を認識する部位）をコードするＤ
ＮＡサブ配列から成り、場合によりすでに定義した第三
のＤＮＡサブ配列をさらに含むこの種のＤＮＡ配列を提
供することである。さらに、本発明の目的は、上記のＤ
ＮＡ配列を含むベクター、特に原核宿主細胞内での複製
および真核宿主細胞内での発現が可能なベクターを提供
することである。さらに、本発明の目的は、このような
ベクターで形質転換された原核または真核宿主細胞を提
供することである。

【００１５】さらにまた、本発明の目的は、上記のＤＮ
Ａ配列によりコードされるキメラポリペプチド、特に治
療活性物質としての、例えばエイズを治療するためのキ
メラポリペプチドを提供することである。また、本発明
の目的は、上記の形質転換宿主細胞を適当な培地で培養
し、前記ポリペプチドを単離することから成る、前記ポ
リペプチドの生産方法を提供することである。このよう
な方法に従って生産される本発明のポリペプチドも本発
明の目的である。

【００１６】さらに、少なくとも１種の本発明ポリペプ
チドと治療上許容しうる担体物質を含む医薬組成物、こ
のような医薬組成物（特に、種々の病気、例えばエイズ
を治療するための組成物）を調製するための本発明ポリ
ペプチドの使用、並びに診断・治療用途のための本発明
ポリペプチドの使用も本発明の目的である。本発明は、
添付の図面を参照するとき、以下の詳細な説明に基づい
てより一層理解しやすくなるだろう。

【００１７】図１及び図２は、最終プラスミドｐＦｖＣ
Ｄ３−Ｈγ３、ｐＣＤ４−ＦｖＣＤ３−ＣκおよびｐＣ
Ｄ４−ＦｖＣＤ３（それぞれ“Ｃ”、“Ｅ”および
“Ｅ′”で部分的に表される）の構築のフローチャート
を示す。対応する発現産物ＣＤ４−Ｈγ３／ＦｖＣＤ３
−Ｈγ３、ＣＤ４−ＦｖＣＤ３−ＣκおよびＣＤ４−Ｆ
ｖＣＤ３、並びにそれらのリガンドＣＤ３およびｇｐ１
２０は右側に模式図で示す。免疫グロブリン可変部間に
“スペーサー”を含まない中間体プラスミドｐＣＤ４−
Ｈγ３、ｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３、並びにｐＨＴ４−ＹＫ
１２はそれぞれ“Ａ”、“Ｂ”および“Ｄ”で部分的に
表される。ボックスはコード領域を表し；濃厚な点入り
ボックスはモノクローナル抗体“ＴＲ６６”のＨ鎖の可
変部（“ＶＨ”）を表し；“Ｌ”で示した斜線入りボッ
クス（左上から右下の斜線）は抗体“ＳＰ６”由来のリ
ーダー配列の２つの部分を表し；“ＶＬ”と関連した希
薄な点入りボックスはモノクローナル抗体“ＴＲ６６”
のＬ鎖の可変部を表し；“Ｈ”、“ＣＨ２”および“Ｃ
Ｈ３”で示した比較的濃厚な点入りボックスは、ヒトＩ
ｇＧ３免疫グロブリンのＨ鎖〔“Ｈγ３”〕のヒンジ部
と第二および第三定常部を表し；ＣＤ４と関連して
“Ｌ”、“１”、“２”、“３”、“４”で示したオー
プンボックスはヒトＣＤ４分子のリーダー配列および対
応するドメインを表し；斜線入りボックス（左下から右
上の斜線）は２つの免疫グロブリン可変部間のリンカー
“Ｓ”を表し；“Ｃκ”で示した点ボックスはマウスκ
−Ｌ鎖の定常部を表す。黒丸は“ＨＣ−ｅｎｈ．”の場
合が免疫グロブリンＨ鎖エンハンサーを、“Ｋｅｎ
ｈ．”の場合が免疫グロブリンκ−Ｌ鎖エンハンサーを
表す。“ＰＣＲ１”および“ＰＣＲ２”は対応するＰＣ
Ｒ反応の結果を表す。“ｏｌｉｇｏ”はオリゴヌクレオ
チドを表し、“ＳＤ”および“ｓｔｏｐ”はそれぞれス
プライス供与部位および停止コドンを表す。“Ｓｓｔ
Ｉ”、“ＳａｌＩ”、“ＢａｍＨＩ”および“Ｈｉｎｄ
III ”は対応する制限部位（標準略号）を意味する。

【００１８】図３は、ｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３の略図を示
し、ここで“Ｋ−プロモーター”は免疫グロブリンκ−
Ｌ鎖プロモーターを表し、“ａｍｐ”はアンピシリン耐
性遺伝子を、“ｇｐｔ”は大腸菌のキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、そして
“ＫｐｎＩ”、“ＸｈｏＩ”、“ＣｌａＩ”、“Ｘｂａ
Ｉ”および“ＥｃｏＲＩ”は標準略号で示した対応する
制限部位を表す。他のすべての略号および記号は図１及
び図２において特定した通りである。

【００１９】図４は、ｐＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃκの略
図を示し、ここで略号および記号は図１、図２または図
３において特定した通りである。図５は、実施例３に詳
述した検定の結果として、ｎｇ／ｍｌで示したＣＤ４−
ＦｖＣＤ３−Ｃκの量に依存したＣｒ⁵¹放出のパーセン
トを示す。白丸は非感染細胞を、黒丸はＨＩＶ−Ｉ感染
ジャーカット細胞を表す。

【００２０】抗原結合部位をコードするＤＮＡ配列は、
出発ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの細胞源としての所望
の特異性抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系列から、
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの形で調製することができ
る。このようなハイブリドーマ細胞系列は公的寄託機
関、例えば米国メリーランド州ロックビルのアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、例
えば抗ＣＤ３抗体を分泌するハイブリドーマ“ＯＫＴ
３”（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ８００１）の場合、または英
国ソールズベリー、ポートンダウンのヨーロピアン・コ
レクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズから
得られる。特定のハイブリドーマ細胞系列が入手できな
い場合は、当分野で知られた、例えば Harlow and Lane
(27) に記載される方法により、対象の抗原を土台にし
てこの種の細胞系列を作ることができる。例えば、ＣＤ
３受容体分子を担うヒト細胞障害性Ｔ細胞は当分野で知
られた、例えば Moretta et al., J. Expt. Med. 157,
743-754 (1983) に記載される方法により単離でき、細
胞自体またはその膜画分を使って抗ＣＤ３抗体産生ハイ
ブリドーマ細胞系列を作ることができる。ゲノムＤＮＡ
またはｍＲＮＡの供給源としての特定のハイブリドーマ
細胞系列から出発して、例えば、ゲノムＤＮＡ配列の場
合は Oi et al. (28) または Ochi et al. (29) に記載
されるように、ｃＤＮＡ配列の場合は Neuberger (30)
に記載されるようにして、免疫グロブリンＨまたはＬ鎖
の可変部をコードするＤＮＡ配列を作製できる。免疫グ
ロブリンの２つの可変部の一方をコードするばかりでな
く、１本鎖分子の形で両方を一緒にコードするＤＮＡ配
列は、例えば米国特許第４，９４６，７７８号、Orland
i etal. (18) に記載されるようにして、または Huston
et al. (16) の概念に基づいて実施例１で本発明の特
定の実施態様について詳述した以下の方法により作製で
きる。このために、当分野で知られた方法(26)、または
例えば Chomczynski and Sacchi (22)に記載される方法
を使って、上で特徴づけたハイブリドーマ細胞からｍＲ
ＮＡを調製する。第一鎖ｃＤＮＡの合成は標準方法(26)
により作製できる。第二鎖の合成は免疫グロブリンのＨ
鎖の可変部（Ｖ_H ）をコードするＤＮＡ配列の５′末端
に特異的なプライマーと、免疫グロブリンのＬ鎖の可変
部（Ｖ_L）をコードするＤＮＡ配列の５′末端に特異的
なプライマーを使って行うことができる。マウス由来の
免疫グロブリンのＨ鎖とκＬ鎖の可変部をコードするＤ
ＮＡ配列が関係する場合は、Orlandi et al. (18) に記
載される５′末端プライマーを使用できる。他の動物、
例えばラット、ウサギ、ヒツジ由来のλＬ鎖またはＨ鎖
およびκＬ鎖の可変部をコードするＤＮＡ配列のための
５′末端プライマーは、例えば Kabat et al. (31)に開
示される配列情報に基づいて、あるいは例えば Orlandi
et al. (18)に記載される方法で既知配列データバンク
（以下参照）のいずれかに基づいて、デザインすること
ができる。その後、このようなプライマーと対応する動
物由来のγＨＣおよびＣκ−遺伝子に相補的なオリゴヌ
クレオチドを用いて、ポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション（ＰＣＲ）による最終増幅を行う〔Kabat et al.
(31) または既知配列データバンク（以下参照）〕。こ
のようなＤＮＡ配列を真核細胞発現・分泌（特にハイブ
リドーマ細胞での発現・分泌）のためのベクターへ組み
込もうとするとき、しかもこの種のベクターが適当な分
泌シグナルをコードするリーダー配列（Ｌ−領域）を含
まない場合は、分泌タンパク質をコードする適当な真核
細胞遺伝子から、その既知配列に基づいてＰＣＲ用の適
当なオリゴヌクレオチドにより前記リーダー配列を作製
できる。例えば、Ｓｐ６−ＨＣ遺伝子からのＬ−領域
は、ドイツ国ブンデスレプブリク、ブラウンシュワイク
のドイチェ・サムルング・フュア・ミクロオーガニスメ
ン・ウント・ツェルクルツレンＧｍｂＨ（Deutsche Sam
mlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ）
に寄託されたプラスミドｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３から実施
例１に示したオリゴヌクレオチドにより簡単に増幅でき
る。その後、これらのＤＮＡ配列はすべて、部分ＤＮＡ
配列の増幅のためにすでに使用された、あるいは結合す
べきＤＮＡ断片の標準方法(26)による部分ＤＮＡシーク
エンシングにより得られた情報に基づいて既知方法(26)
により簡単にデザインしうる、適当なジョイニングおよ
びフランキングオリゴヌクレオチドプローブを使って、
例えば Horton et al. (24) に記載されるような１回の
ＰＣＲサイクルで一緒に連結することができる。フラン
キングオリゴヌクレオチドは、キメラポリペプチド発現
用の本発明の他のＤＮＡ配列と共に、得られたＤＮＡ配
列を適当なベクターに挿入するための適当な制限部位を
作るようにデザインされる。同じ方法で、適当なスペー
サーをコードするＤＮＡ配列を組み込むための制限部位
を、Ｖ_H およびＶ_L ドメインをコードするＤＮＡ配列間
に作製できる。このようなＤＮＡ配列は例えばHuston e
t al. (16) に記載されるようにデザインされ、当分野
で知られた方法(26)により作製される。

【００２１】ヒト受容体のリガンド結合部位、例えばヒ
ト受容体の可溶性部分、をコードするＤＮＡ配列、また
は対象の受容体のヒトリガンドをコードするＤＮＡ配列
は、既知の部分または全体のアミノ酸もしくは核酸配列
情報に基づいて標準方法(26)により、好ましくは既知の
ＰＣＲ法により作製できる〔例えば、実施例１で示した
文献または“PCR Protocols ”eds. M.A.Innis, D.H.Ge
lfand, J.J.Sninsky and T.J.White, Academic Press,
San Diego を参照されたい〕。このような配列情報は原
則的にあらゆる配列データベースから、例えば GenBank
（米国カリフォルニア、Intelligenetics ) 、EMBL (ド
イツ、ハイデルベルク) 、NBRF (米国ワシントンDC、ジ
ョージタウン大学、メディカルセンター) および Vecba
se (米国ウィスコンシン、マディソン、ウィスコンシン
大学、バイオテクノロジーセンター) から得ることがで
きる。より詳細には、例えばヒトＣＤ４分子に関しては
Maddon et al. (13) から、ヒトＩＬ−７に関しては N
amen et al. (35)から、そしてヒト幹細胞因子に関して
は Martin et al. (32) から得ることができる。ヒトＣ
Ｄ４分子の最初の２つのドメインをコードするＤＮＡ配
列、または対応リガンドとまだ結合するその断片は、上
に記載したように、より詳細にはＥＰＡ３９４８２７
（ここには、ＤＳＭに寄託されたプラスミドも記載され
ており、この種のＤＮＡ配列の供給源として使用でき
る）に記載されるように作製することができる。

【００２２】その後、上記のようにして得られた本発明
のＤＮＡ配列は、当分野でよく知られた方法(26)に従っ
て適当なベクターに組み込まれる。本発明のＤＮＡ配列
は異なる起源の部分、すなわちｃＤＮＡの部分とゲノム
由来の部分、を含んでいてもよいことが理解されよう。
これらも本発明に包含されるものである。本発明を実施
するのに適したベクターは当分野で知られたベクター、
特に真核宿主細胞内でのポリペプチドの発現のために使
用しうるベクター、例えばｐＳＶ２誘導ベクター〔例え
ば、“DNA Cloning ”(14)中で German, C. が開示した
もの〕、例えばｐＳＶ２−ｃａｔ〔ＡＴＣＣ番号３７１
５５〕、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ〔ＡＴＣＣ番号３７１４
６〕、ｐＳＶ２−ｎｅｏ〔ＡＴＣＣ番号３７１４９〕ま
たはｐＳＶ２−ｇｐｔ〔ＡＴＣＣ番号３７１４５〕、あ
るいはｐＳＶ２−ｇｐｔ誘導ベクター、例えばｐＨＴ４
−Ｙ１、ｐＣＤ４−Ｍγ２ａ、ｐＣＤ４−Ｍμ、ｐＣＤ
４−Ｈμ、ｐＣＤ４−Ｈγ１およびｐＣＤ４−Ｈγ３で
あり、後のほうの５つのベクターは１９８９年１月２６
日付けでドイツ国ブラウンシュワイクのドイチェ・サム
ルング・フォン・ミクロオーガニスメン・ウント・ツェ
ルクルツレンＧｍｂＨ（ＤＳＭ）にそれぞれ寄託番号Ｄ
ＳＭ５１７３、ＤＳＭ５１７４、ＤＳＭ５３１５、ＤＳ
Ｍ５３１４およびＤＳＭ５５２３として寄託され、ＥＰ
Ａ３９４８２７に記載されている。特に好適なｐＳＶ２
−ｇｐｔ誘導ベクターはｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３とｐＣＤ
４−ＦｖＣＤ３−Ｃκであり、これらは特許に関するプ
ダペスト条約のもとに１９９１年２月１８日付けでドイ
ツ国ブラウンシュワイクのＤＳＭにそれぞれ寄託番号Ｄ
ＳＭ６３７０およびＤＳＭ６３６９として寄託された。

【００２３】原核宿主細胞（例えば大腸菌）内でのポリ
ペプチドの発現のために使用しうるベクターはさらに好
適である。このためには、本発明のＤＮＡ配列を大腸菌
のような原核宿主細胞内での発現に適するようにするた
めに、それらを当分野で知られた方法(26)により修飾し
なければならない。大腸菌発現用の適当なベクターは、
例えば Sambrook et al. (26) または Fiers et al.,
“Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium ” Soc.
Franc. de Microbiol., Paris, (Durand et al.,eds.),
pp.680-697(1988)〕に述べられており、あるいはｐＤ
Ｓファミリーのベクターである〔Bujard et al., Metho
ds in Enzymology, eds. Wu and Grossmann, Academic
Press, Inc. Vol.155, 416-433 (1987);“大腸菌での高
レベル生産系および組み換えタンパク質の迅速精製：エ
ピトープマッピング、抗体生産および構造機能分析への
応用”Stuber et al., Immunological Methods, Vol.I
V, Lefkovits and Pernis (eds.), Academic Press, Ne
w York （印刷中）〕。

【００２４】その後、原核または真核宿主細胞を前記の
ようなベクターで形質転換する。このための適当な原核
宿主細胞は当分野で習熟した者によく知られており、大
腸菌のような細菌、特に大腸菌Ｋ１２株、例えばＭ１５
〔Villarejo et al. (20) にはＤＺ２９１として記載〕
やＨＢ１０１〔ＡＴＣＣ番号３３６９４〕が含まれる。

【００２５】適当な真核宿主細胞も当分野で習熟した者
によく知られており、脊椎動物、酵母または他の起源の
細胞が含まれ、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８〔ＡＴＣＣ番号
ＴＩＢ９〕のような骨髄腫細胞系列が好適である。本発
明の実施の際に使用する特定の宿主細胞に応じて、当分
野でよく知られた方法(26)により宿主細胞の形質転換に
使用するプラスミド中に適当なプロモーター要素、例え
ばＩｇＨ鎖プロモーターまたはＩｇκプロモーター（実
施例１参照）、および所望により適当なエンハンサー要
素、例えばＩｇＨ鎖エンハンサーまたはＩｇＬ鎖エンハ
ンサー（実施例１参照）、を組み込むことができる。

【００２６】上記ベクターによる宿主細胞の形質転換は
慣用方法(26)により、あるいは以下にまたは実施例２に
記載する特定方法により実施できる。宿主細胞が大腸菌
のような原核細胞である場合、ＤＮＡ取り込みが可能な
コンピテント細胞は指数的増殖期後に収穫した細胞から
調製し、続いて既知のＣａＣｌ₂ 法に従って処理する。

【００２７】使用する宿主が真核細胞である場合、次の
トランスフェクション法、例えばリン酸カルシウム沈
降、ＤＥＡＥ−デキストラン法〔C. Gorman,“DNA Clon
ing ”(14)を参照〕、通常の機械的手段、例えばマイク
ロインジェクション、赤血球宿主またはリポソーム中に
封入されたプラスミドの挿入、リゾホスファチジルコリ
ンのような物質による細胞の処理、ウイルスベクターま
たはプロトプラスト融合の使用を本発明の実施において
採用することができ、プロトプラスト融合が好適な方法
である（実施例２参照）。

【００２８】その後、形質転換された宿主を選別し、当
分野でよく知られた方法に従って培養する。例えば、ホ
スホトランスフェラーゼをコードする“neo ”遺伝子を
もつベクターで形質転換された細胞は薬物Ｇ４１８の存
在下で培養することができ、また“gpt ”遺伝子を保有
するベクターの場合はキサンチンとマイコフェノール酸
を含む特殊な培地で形質転換細胞を増殖させることがで
きる（Gorman, “DNACloning ”,Vol. II、上記参
照）。

【００２９】上で述べた形質転換細胞により生産された
本発明のキメラポリペプチドはタンパク質・ペプチド化
学の分野で知られた適当な方法、例えば硫酸アンモニウ
ム沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過またはイオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、ア
フィニティークロマトグラフィー、例えばイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどを使って回
収することができ、特にアフィニティークロマトグラフ
ィーが好適である。例えば、受容体結合部位を含む本発
明キメラポリペプチドはアフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製することができ、この場合は当分野で
知られた方法に従って対応リガンドを適当なマトリック
スに固定する〔例えば、スウェーデン、ウプサラのPhar
macia 社から発行されたアフィニティークロマトグラフ
ィーに関するガイドを参照されたい〕。また、キメラポ
リペプチドがリガンド自体を含む逆の場合は、対応する
受容体結合部位を固定させたアフィニティーマトリック
スによって精製することができる。キメラポリペプチド
が少なくとも１つの抗原結合部位を含む場合には、対応
抗原を使用するアフィニティークロマトグラフィーによ
って精製が可能である。最終的に、このようなポリペプ
チドはイムノアフィニティークロマトグラフィーによっ
て簡単に精製することができる。例えば、ヒトＣＤ４分
子の一部を含むキメラポリペプチドはｇｐ１２０−アフ
ィニティークロマトグラフィー、または当分野で知られ
るようにこのような目的で適当なマトリックスに結合し
うる抗ＣＤ４抗体〔スイス、バーゼル、 Becton Dickin
son AG〕を使用するイムノアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製できる〔例えば、スウェーデン、ウ
プサラのPharmacia 社から発行されたアフィニティーク
ロマトグラフィーに関するガイドを参照されたい〕。本
発明のキメラポリペプチドがκＬ鎖のマウス定常部を含
む場合、この種のポリペプチドはマウス免疫グロブリン
のκＬ鎖の定常部に対する抗体を使用するイムノアフィ
ニティークロマトグラフィーによって精製できる〔Yelt
on et al. (19)参照〕。また、この種のポリペプチドが
Ｈγ３を含む場合は、プロテインＧ−クロマトグラフィ
ー〔スウェーデン、ウプサラ、Pharmacia 〕あるいは対
応する骨髄腫細胞系列〔ＡＴＣＣ番号ＨＢ６０〕から標
準方法(27)により単離しうる抗ヒト免疫グロブリンＧＨ
鎖抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィ
ーによって単離できる。

【００３０】本発明のキメラポリペプチドは次の方法で
特性決定を行うことができる。ポリペプチドがヒトＣＤ
４分子の最初の２つのドメインまたはリガンドにまだ結
合するその断片を含む場合、それらは当分野で知られ
た、ＥＰＡ３９４８２７に記載された方法により、ＨＩ
Ｖ−Ｉウイルスの表面タンパク質“ｇｐ１２０”へのそ
れらの結合に従って同定できる。さらにＦｖＣＤ３を含
むポリペプチドは当分野で知られた方法によりＣＤ３⁺
細胞へ結合するそれらの能力により同定され、例えばこ
の種のキメラポリペプチドと（ＣＤ３⁺ ，ＣＤ４^- ）−
Ｔ細胞または細胞系列〔例えば、Lanzavecchia and Sch
eidegger (15) を参照〕をインキュベートし、洗浄し、
さらに抗ＣＤ４抗体次いでＦＩＴＣ標識抗免疫グロブリ
ン抗体（ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシアネー
ト）とインキュベートし、そして蛍光活性化細胞選別機
で分析する。一般に、ＦｖＣＤ３および別の抗原結合部
位、またはヒト受容体のリガンド結合部位もしくは特定
の標的細胞のリガンドを含む本発明ポリペプチドは、細
胞障害性Ｔ細胞仲介標的細胞死を測定する検定法、例え
ば“ｇｐ１２０”（これに分子のＣＤ４部分が結合す
る）を発現するＨＩＶ感染標的細胞に対するＣＤ４−Ｆ
ｖＣＤ３−Ｃκの場合における実施例３に記載する検定
法により同定することができる。このような検定法で
は、例えば Moretta et al. （前掲）に従って単離可能
なヒト細胞障害性Ｔ細胞またはＴ細胞系列が使用され
る。さらに、前記検定には公知のジャーカット細胞系列
のほかにもＨＩＶウイルス感染ヒト細胞または細胞系列
を使用することができる。しかしながら、例えばＨ９細
胞のような一部のヒト腫瘍細胞は本発明のキメラポリペ
プチドの不在下で細胞障害性Ｔ細胞により直接認識され
て、培養下で殺傷されると思われ、従ってこの検定には
使用できないことに留意すべきである。原理的には、感
染後にｇｐ１２０分子を発現する所定の標的細胞を感染
する能力をもつＨＩＶ−Ｉウイルス単離物、例えば当分
野で知られた方法または Popovic et al. (21)に記載さ
れる方法により感染Ｈ９細胞系列（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ
８５４３）から得ることができるＨＴＬＶ−III Ｂ、ま
たはＬＡＶ（ＣＮＣＭ番号Ｉ−２３２）、をこのような
検定で使用することができる。細胞または細胞系列のＨ
ＩＶ−Ｉ単離物による感染は当分野で知られた方法によ
り行われる。図５に示すように、ＨＩＶ−Ｉ感染ジャー
カット細胞の効果的な殺傷には、ほんのｎｇ量のＣＤ４
−ＦｖＣＤ３−Ｃκで十分であった。より高濃度（約１
μｇ／ｍｌ）では、これらの濃度でＣＤ４−ＦｖＣＤ３
−ＣκがＣκ成分のために２量体化し始めるので非感染
細胞をも殺してしまった。実際、２量体ＣＤ４−ＦｖＣ
Ｄ３−Ｃκは細胞障害性Ｔ細胞クローンのＣＤ３分子を
ジャーカット細胞のＣＤ３分子へ架橋し、非感染細胞の
死滅を引き起こす。より高濃度のＣＤ４−ＦｖＣＤ３−
Ｃκを希望する場合は、ＣＤ４−ＦｖＣＤ３−ＣκをＣ
Ｄ４−ＦｖＣＤ３と置き換えることができる。

【００３１】本発明によれば、本発明の新規なキメラポ
リペプチドを種々の疾病の治療に使用することができ
る。例えば、ヒトＣＤ４分子の最初の２つのドメインま
たはその断片からなるキメラポリペプチド（例えば、Ｃ
Ｄ４−ＦｖＣＤ３−ＣκまたはＣＤ４−ＦｖＣＤ３）を
エイズの治療に使用することができる。一般に、ＦｖＣ
Ｄ３を含む全てのこのようなポリペプチドは、例えばキ
メラ分子の第二部分が癌細胞を認識する場合に、その癌
細胞のような、望ましくない影響を人体に及ぼす標的細
胞を殺すために用いることができる。例えばＦｖＣＤ３
−Ｆｖｏｖｃａは卵巣癌細胞の殺傷に使用される。本発
明のキメラポリペプチドがＦｖＣＤ３以外の抗原を含む
場合は、ヘルパーＴ細胞が相応する抗原特異的Ｂ細胞に
集中し、それ故このようなキメラポリペプチドは“超免
疫原”としてふるまうであろう。マウスのモロニー白血
病ウイルスの表面タンパク質を認識することができるＦ
ｖｍｏｌを含むキメラポリペプチドの場合は、このよう
なウイルスに組込むことができるいずれのＤＮＡ配列も
（J.R. McLachlin et al. in Progress in Nucl. Acd.
Res. and Mol. Biol., eds. W.E. Cohn and K. Moldav
e, Vol.38, Academic Press, San Diego ）、キメラ分
子の第二部分により認識される標的細胞に形質転換する
ことができ、Ｆｖｍｏｌ−ＳＣＦに対する幹細胞の場合
と同様に、体細胞遺伝子療法に使用できる。

【００３２】このようなキメラポリペプチドは薬学的に
許容しうる形態、特に注射剤の形態で投与できる。投与
方法および用量は、類似の構造および／または機能を有
する既知のポリペプチドの臨床用途において現在使用さ
れているものと同様である。医薬組成物は、製剤学的に
許容しうる固体または液体の担体物質と共に、少なくと
も１種の本発明のキメラポリペプチドを含むことができ
る。いずれの慣用担体物質も利用できる。さらに、医薬
組成物は他の薬学的に活性な物質を含んでいてもよく、
当分野で知られた方法を使って調製することができる。

【００３３】本発明を一般的に記載してきたが、以下の
特定の実施例を参照することにより本発明の理解がさら
に深まるであろう。実施例は本発明を説明するためのも
のであり、特に明記しない限り本発明を限定するもので
はない。

【００３４】

【実施例】実施例１ プラスミドの構築 プラスミドの構築は、以下のパラグラフに記載したよう
に実施した。特定の文献または調製法の細部が示されて
いないときは、Sambrook et al. (26)による標準方法を
使用した。

【００３５】ハイブリドーマ“ＴＲ６６”（15) に由来
する、抗ヒトＣＤ３抗体（ＦｖＣＤ３）のＨ鎖とＬ鎖の
可変部（“Ｖ_H とＶ_L ”）と、ヒト免疫グロブリンＧ３
のＨ鎖の最初の定常部以外の全てのドメインをコードす
るＤＮＡ配列からなるプラスミドｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３
（図１・２、“Ｃ”；図３）を以下の方法で構築した。

【００３６】抗ＣＤ３ハイブリドーマＴＲ６６のＶ_L −
とＶ_H −ドメインをコードする最初のＤＮＡ配列は、以
下の修正を加えた既定のＰＣＲ法(18)を使用してリーダ
ー（Ｌ）配列なしで増幅した。ＴＲ６６細胞からＲＮＡ
をグアニジンチオシアネート法(22)を用いて抽出し、第
一鎖ｃＤＮＡ合成をＭ−ＭＬＶ（BRL Life Technolgie
s, Gaithersburg, MD, USA ）逆転写酵素とオリゴｄＴ
プライマーを用いて標準条件下に行った。第二鎖の合成
は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとＶ_H 配列に対して５′オ
リゴヌクレオチド“１５７０”を、Ｖ_L 配列に対して
“１５６９”(18)を用いて、部位特異的突然変異誘発に
ついて記載される条件（Muta-Gene-Protocol, Bio-Rad,
Richmond, CA, USA）下で実施した。次いで、製造業者
により推奨される標準ＰＣＲ条件（３０サイクル）（Ge
ne Amp. DNA amplification Kit, Perkin Elmer Cetus
）で、上記オリゴヌクレオチドと、それぞれマウスγ
ＨＣ（免疫グロブリン−γ−Ｈ鎖）とＣκ（免疫グロブ
リンκ−Ｌ鎖の定常部）遺伝子に相補的な３′オリゴヌ
クレオチド“１３５４”と“１３２９”を用いて最終増
幅を達成した。小イントロンを含むＳｐ６ＨＣ遺伝子
〔(23)；EMBL Gene Bank、受託番号Ｘ５６９３６〕のＬ
領域（開始コドンと真核細胞分泌のためのリーダー配
列）は、５′オリゴヌクレオチド“１６０９”と、その
５′末端でオリゴヌクレオチド“１５７０”（すなわち
増幅Ｖ_H 断片の最初の部分）と相補的（２０ｐｂ）であ
る３′オリゴヌクレオチド“１６１０”を用いて増幅し
た。増幅Ｖ_H およびＶ_L 断片の部分ＤＮＡ配列決定によ
り、それらはそれぞれＪＨ２とＪκ５領域（Ｈ２の場合
はＨ鎖の、κ５の場合はＬ鎖の免疫グロブリンＪ領域）
を含むことが分かった。この情報に基づき適当なジョイ
ニングおよびフランキングオリゴヌクレオチドをデザイ
ンし、ＳＰ６からのＬ領域、Ｖ_H およびＶ_L 断片を１回
の３５サイクルＰＣＲ反応(24)で連結させるのに用い
た：フランキング５′および３′オリゴヌクレオチド
は、それぞれ“１６０９”と“２７６８”であり、後者
はマウスＪκ５配列の末端と相補性（２４ｐｂ）を有し
ていた。Ｖ_H 断片とＶ_L 断片を連結するオリゴヌクレオ
チド“２１３９”は、ＪＨ２配列の末端とオリゴヌクレ
オチド“１５６９”（つまりＶ_L 配列の５′末端）とに
２０ｐｂの相補性を有していた。さらに、ＳａｌＩ制限
部位をこれらの相補性領域の間にデザインした。ＰＣＲ
反応においては、フランキングオリゴヌクレオチドをリ
ンキングオリゴヌクレオチドに対して５０倍過剰にし、
全ての増幅断片（Ｓｐ６−Ｌ、Ｖ_H 、Ｖ_L ）を等モル比
で混合した。一次増幅で既に相補性末端となっているの
で、Ｓｐ６ＬとＶ_H 断片の間にはリンキングオリゴヌク
レオチドは不必要であったことに注目されたい。次いで
全長生産物（図１、ＰＣＲ１）を単離し、ＳｓｔＩ制限
酵素（フランキングオリゴヌクレオチドは末端ＳｓｔＩ
部位を含んでいた）で消化し、同様に消化したｐＣＤ４
−Ｈγ３（図１、“Ａ”）〔ＤＳＭ５５２３；ＥＰＡ３
９４８２７に記載〕にクローニングした。最後に、Ｖ_H
およびＶ_L ドメイン間のリンキングペプチドに相当する
ＳａｌＩ適合末端（オリゴヌクレオチド“２１１９”お
よび“２１２０”）をもつＤＮＡの合成片をこの中間プ
ラスミドのＳａｌＩ部位にクローニングし（図１、
“Ｂ”）、プラスミドｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３を得た。最
終タンパク質中のＶ_H とＶ_L ドメインの間に、このよう
に導入された余分のアミノ酸はアミノ酸配列：ＶＥＧＧ
ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤ（標準一文字表記によ
る）を有している。

【００３７】ヒトＣＤ４の最初の２つのドメイン、Ｆｖ
ＣＤ３および免疫グロブリンκＬ鎖の定常部（Ｃκ）を
コードするＤＮＡ配列からなるプラスミドｐＣＤ４−Ｆ
ｖＣＤ３−Ｃκ（図２、“Ｅ”；図４）を以下の方法で
構築した。ＦｖＣＤ３をコードするＤＮＡは、オリゴヌ
クレオチド対“２７３３”（適合ＢａｍＨＩ制限部位を
導入する）と“２７６７”（スプライス供与部位を導入
する）を用いて、ｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３からＰＣＲ手法
により増幅した。次いでこの断片（図２；“ＰＣＲ
２”）を図２に示したように、ｐＨＴ４−ＹＫ１２（図
２、“Ｄ”）〔(12)；ＥＰＡ３９４８２７も参照〕にク
ローニングしてプラスミドｐＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃκ
を得た。

【００３８】ヒトＣＤ４分子の最初の２つのドメインと
ＦｖＣＤ３をコードするプラスミドｐＣＤ４−ＦｖＣＤ
３（図２、“Ｅ′”）を、プラスミドｐＣＤ４−ＦｖＣ
Ｄ３−Ｃκと同様の方法で構築した。しかしながら、オ
リゴヌクレオチド“２７６７”の代わりに、停止コドン
を生成するオリゴヌクレオチド“２７６８”を使用し
た。

【００３９】以下のオリゴヌクレオチドを上記のプラス
ミドの構築に使用した（制限部位は相当するオリゴヌク
レオチドの上または下に標準略号で示してあり；“Ｓ
Ｄ”はスプライス供与部位を表し；“Ｓｔｏｐ”は停止
コドンを表す）：

【００４０】

【化２】

【００４１】実施例２ キメラポリペプチドの発現と精製 動物細胞と細胞系列の維持、クローニング法、選別手順
およびクローン化細胞の増殖は、Freshney, R.I.によっ
て“Culture of animal cells: A manual of basic tec
hnique”(25)に記載されている標準方法を使用して実施
した。

【００４２】Ｊ５５８Ｌ細胞〔Oi et al. (28)〕は、Oi
et al. (28)に記載されるプロトプラスト融合法により
プラスミドｐＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃκを用いて、安定
してトランスフェクトされた。トランスフェクト細胞
は、Traunecker et al. (33)に従って、基本培地（ダル
ベッコの修飾イーグル培地、１０％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、５ｘ１０^-5Ｍ ２−メルカプトエタノール）に、
５μｇ／ｍｌのマイコフェノール酸と２５０μｇ／ｍｌ
のキサンチンを加えることにより選別した。トランスフ
ェクション効率は１０^-5−１０^-4の範囲内であった。

【００４３】分泌されたＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃκは、
抗Ｃκモノクローナル抗体〔Yeltonet al. (19)〕を使
用して、イムノアフィニティークロマトグラフィー（ス
ウェーデン、ウプサラの Pharmacia社により編集された
“Affinity Chromatography”を参照）により１工程で
精製し、還元および非還元条件下で７％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、それぞれ約５２
ｋＤまたは５８ｋＤの分子量を示した。実施例３ キメラポリペプチドの特性決定 ＨＩＶ−Ｉ(12)感染または非感染ジャーカット細胞を標
準条件下で培養し、当分野で公知のように⁵¹Ｃｒラベル
し、種々の濃度のＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃκの存在下で
細胞障害性Ｔ細胞クローン（ＣＤ３⁺ ）(15)とインキュ
ベートした。５時間⁵¹Ｃｒ放出検定を、Lanzavecchia a
nd Scheidegger (15) に記載されるようにＥ：Ｔ比１０
で実施した。この検定結果を図５に示す。文献 １．Dalgleish, A.G. et al. Nature 321, 763-766(19
84). ２．Klatzmann, D. et al. Nature 312, 767-768(198
4). ３．McDougal, J.S. et al. J. Immunol. 135, 3151-31
62(1985). ４．Maddon, P.J. et al. Cell 47, 333-348(1986). ５．Smith, D.H. et al. Science 238, 1704-1707(198
7). ６．Fisher, R.A. et al. Nature 331, 76-78(1988). ７．Hussey, R.E. et al. Nature 331, 78-81(1988). ８．Deen, K.C. et al. Nature 331, 82-84(1988). ９．Traunecker, A. et al. Nature 331, 84-86(1988). 10. Chaudhary, V.K. et al. Nature 335, 369-372(198
8). 11. Capon, D.J. et al. Nature 337, 525-531(1989). 12. Traunecker, A. et al. Nature 339, 68-70(1989). 13. Maddon et al., Cell 42, 93-104(1985). 14. "DNA Clonding", Vol. II.,ed. by Glover, D.M.,
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74). 21. Popovic et al., Science 224, 497-499(1984). 22. Chomczynski, P.& Sacchi, N. Analytical Biochem
istry 162, 156-159(1987). 23. K¹hler, G. et al. Med. Oncol. Tumor Pharmacoth
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(1988). 28. Oi, V.T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,
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0). 35. Namen, A. et al., J. Exp. Med. 167, 988(1988).

【図面の簡単な説明】

【図１】最終プラスミドｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３の構築を
示す流れ図。

【図２】最終プラスミドｐＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃκ、
およびｐＣＤ４−ＦｖＣＤ３の構築を示す流れ図。

【図３】プラスミドｐＦｖＣＤ３−Ｈγ３を示す模式
図。

【図４】プラスミドｐＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃκを示す
模式図。

【図５】ＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃκの量（ｎｇ／ｍｌ）
に対するＣｒ⁵¹放出パーセントを示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/13 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (72)発明者 アントニオ ランザヴェッチア スイス国 ＣＨ−4051 バーゼル， アウ グスティネルガッセ 17 (72)発明者 アンドレ トルネッカー フランス国 Ｆ−68450 ウォッシュウィ ラ， ルデュムリン 11

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 各サブ配列が互いに独立してヒト受容体
   のリガンド結合部位、抗原結合部位またはヒト受容体の
   リガンドをコードする２つのＤＮＡサブ配列から成り、
   場合により免疫グロブリンκまたはλ−Ｌ鎖の定常部ま
   たはその一部をコードする第三のＤＮＡサブ配列をさら
   に含むＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 ２つのＤＮＡサブ配列の一方はヒト受容
   体のリガンド結合部位をコードし、他方のＤＮＡサブ配
   列は抗原結合部位をコードする、請求項１のＤＮＡ配
   列。
3. 【請求項３】 ２つのＤＮＡサブ配列は同一または異な
   る抗原特異性を有する抗原結合部位をコードする、請求
   項１のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 ２つのＤＮＡサブ配列の一方はヒト受容
   体のリガンドをコードし、他方のＤＮＡサブ配列は抗原
   結合部位をコードする、請求項１のＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 受容体のリガンド結合部位はヒトＣＤ４
   分子の最初の２つのドメイン、またはリガンドとまだ結
   合するその断片により表される、請求項２のＤＮＡ配
   列。
6. 【請求項６】 抗原結合部位はヒトＣＤ３分子を認識す
   る、請求項４または５のＤＮＡ配列。
7. 【請求項７】 ２つの抗原結合部位の一方はヒトＣＤ３
   分子を認識する、請求項３のＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】 請求項１−７のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡ配列を含むベクター。
9. 【請求項９】 発現ベクターである、請求項８のベクタ
   ー。
10. 【請求項１０】 請求項８または９に記載のベクターで
    形質転換された原核または真核宿主細胞。
11. 【請求項１１】 請求項１−７のいずれか１項に記載の
    ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチド。
12. 【請求項１２】 治療活性物質としての請求項１１のポ
    リペプチド。
13. 【請求項１３】 エイズに対する治療活性物質としての
    請求項５または６に記載のＤＮＡ配列によりコードされ
    るポリペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の形質転換宿主細胞
    を適当な培地で培養し、ポリペプチドを単離することか
    ら成る、請求項１１−１３のいずれか１項に記載のポリ
    ペプチドの生産方法。
15. 【請求項１５】 少なくとも１種の請求項１１に記載の
    ポリペプチドと治療上許容しうる担体物質を含む医薬組
    成物。
16. 【請求項１６】 医薬組成物を調製するための、請求項
    １１−１３のいずれか１項に記載のポリペプチドの使
    用。
17. 【請求項１７】 エイズ治療用の医薬組成物を調製する
    ための、請求項１３に記載のポリペプチドの使用。
18. 【請求項１８】 請求項１４に記載の方法により生産さ
    れる、請求項１１のポリペプチド。