JPH05227914A

JPH05227914A - 醤油の製造法

Info

Publication number: JPH05227914A
Application number: JP4038080A
Authority: JP
Inventors: Takanao Matsudo; 隆直松戸; Mitsutatsu Aoki; 光達青木; Takayoshi Abe; 敬悦阿部; Nami Fukuda; 菜美福田; Takeshi Higuchi; 猛樋口; Masaoki Sasaki; 正興佐々木; Kinji Uchida; 金治内田
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1992-02-25
Filing date: 1992-02-25
Publication date: 1993-09-07

Abstract

(57)【要約】【構成】ペディオコッカス属に属し、アルギニン・デ
イミナーゼ経路を有しない微生物を選択し、これを醤油
乳酸菌として使用する醤油の製造法である。【効果】醤油製造において使用する醤油乳酸菌が、た
とえバクテリオファージに感染、溶菌しても、カルバミ
ン酸エチルを実質的に含有しない醤油を製造することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、醤油の製造法、特に、
有害なカルバミン酸エチルを実質的に含有しない醤油の
製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】各種酒類には極微量ながら有害なカルバ
ミン酸エチル（ウレタン）の存在が認められている。そ
して該物質は、酒類の醸造工程中で生じた尿素とエタノ
ールとが火入処理や貯蔵中に反応して生成することが知
られている。この対策として、例えば製成した酒類への
ウレアーゼ添加、尿素低生産性酵母の使用などにより前
駆物質となる尿素を減少させて、カルバミン酸エチルの
生成を抑制する方法などが採用されている。

【０００３】ところで、近年、醤油の一部にも、酒類中
の含有量よりも更に微量ながら、カルバミン酸エチルが
存在していることが報告された。しかしながら、そのよ
うな醤油におけるその生成機作については勿論のこと、
その解決策については全く知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
一部の醤油に存在するカルバミン酸エチルを殆ど又は全
く含有しない醤油の製造法を提供することを目的として
なされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために種々研究を重ねた結果、先ず、醤油の
場合には、酒類とは異なって、尿素の含有量は約５ｐｐ
ｍ以下と実質的には存在せず、これが前駆物質となるカ
ルバミン酸エチルの生成はないことの知見を得た。そし
て、更に研究の結果、醤油中に著量含有するアルギニン
がアルギニン・デイミナーゼ経路を有する醤油乳酸菌に
よって資化される際に、該乳酸菌がバクテリオファージ
に感染すると、溶菌が起きて醤油中にシトルリンが蓄積
し、これが前駆物質となって醤油中のエタノールと火入
工程で反応し、カルバミン酸エチルが生成すること、こ
のことから醤油乳酸菌としてアルギニン・デイミナーゼ
経路を有しないものを用いれば、たとえ該乳酸菌がバク
テリオファージに感染しても、カルバミン酸エチルを数
ｐｐｂ以下と実質的に含有しない醤油を製造することが
できることの新知見を得、この知見に基づいて本発明を
完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明の醤油の製造法は、ペディオ
コッカス属に属し、アルギニン・デイミナーゼ経路を有
しない微生物を選択し、これを醤油乳酸菌として使用す
ることを特徴とするものである。以下、本発明について
詳細に説明する。本発明において醤油乳酸菌として使用
される乳酸菌としては、ペディオコッカス(Pediococcu
s) 属に属し、アルギニン・デイミナーゼ経路を有しな
いものであればいかなる菌株でもよい。

【０００７】なお、ここで、このアルギニン・デイミナ
ーゼ経路について説明すると、該経路は、例えばラクト
コッカス(Lactococcus) 属、シュードモナス(Pseudomon
as)属に属する細菌において知られていて、模式的に示
せば次のごとくである［レイモンド・クーニンら(Raymo
nd Cunin et al.)、マイクロバイオロジカル・レビュー
(Microbiol. Rev.) 、第５０巻、第３１４−３５２頁
（１９８６年）参照］。

【０００８】

【化１】

【０００９】即ち、アルギニン・デイミナーゼ経路にお
いて、アルギニンはアルギニン・デイミナーゼ（ＡＤ
Ｉ）によってシトルリンに変換され、更にこのシトルリ
ンはＯＴＣａｓｅによってオルニチンとカルバモイル−
リン酸となる。本発明者らは、醤油中におけるカルバミ
ン酸エチルの生成原因につき鋭意検討した結果、前記の
ごとく、アルギニン・デイミナーゼ経路を有する醤油乳
酸菌がバクテリオファージに感染すると、溶菌して、醤
油中に著量含有するアルギニンがシトルリン、更にオル
ニチンとカルバモイル−リン酸へと順次代謝されず、シ
トルリンの段階で蓄積することになり、そして該シトル
リンが醤油の火入工程でエタノールと反応してカルバミ
ン酸エチルが生成することの新知見を得た。

【００１０】本発明においては、醤油乳酸菌として、バ
クテリオファージに感染、溶菌してもカルバミン酸エチ
ルの前駆物質となるシトルリンを生成蓄積しない菌、即
ちアルギニン・デイミナーゼ経路を有しない乳酸菌を使
用するのであるが、該菌の選択は、次のようにして行わ
れる。［アルギニン・デイミナーゼ経路を有しない乳酸菌の選
択法］アルギニン・デイミナーゼ経路の有無は、「アル
ギニンからオルニチンへの変換能（変換率）」により判
定し、それが５％以下であるときを「有しない」と判定
する。そして、このアルギニンからオルニチンへの変換
能（変換率）は、下記表に記載の培地で３０℃、５日間
静置培養し、そしてその培養物中のアルギニン及びオル
ニチンの含有量を日立製高速アミノ酸分析計（生体液分
析計）Ｌ−８５００形によって定量し、この定量値より
求められる。

【００１１】表酵母エキス０．３ｇ／１００ｍＬポリペプトン０．５ｇ／１００ｍＬリン酸水素二カリウム０．５ｇ／１００ｍＬチオグリコール酸ナトリウム０．１ｇ／１００ｍＬ塩化ナトリウム５．０ｇ／１００ｍＬグルコース０．２３ｇ／１００ｍＬＬ−アルギニン（塩酸塩）０．３２ｇ／１００ｍＬそして、このようにして選択されたペディオコッカス属
に属し、アルギニン・デイミナーゼ経路を有しない乳酸
菌としては、例えばペディオコッカス・ハロフィルス(P
ediococcus halophilus)Ｘ−１６０などが挙げられる。

【００１２】なお、ペディオコッカス・ハロフィルスＸ
−１６０は醤油諸味より検索して分離した野性株であ
り、その菌学的性質は、以下に示すとおりである。な
お、菌学的性質は、バージェイズ・マニュアル・オブ・
ディターミネイティブ・バクテリオロジー(Bergey's Ma
nual of Determinative Bacteriology) 、１９７４年、
第８版に記載の方法に準拠した。

【００１３】ペディオコッカス・ハロフィルスＸ−１６
０の菌学的性質（ａ）形態［肉汁培地に、更にキシロース１．０％（ｗ
／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）及び食塩５％
（ｗ／ｖ）を添加した培地を用いて温度３０℃で７２時
間静置培養］（１）細胞の形及び大きさ：球菌で直径０．６〜０．８
μ、テトラッド(Tetrad)を作り、二連状のものも有り。

【００１４】（２）細胞の多形性の有無：− （３）運動性の有無：− （４）胞子の有無：− （５）グラム染色性：＋（６）抗酸性：なし（ｂ）次の各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養：表面には生育せずに、内部に
生育し、白色ピンヘッドコロニーを形成する。色素は生
成せず。

【００１５】（２）肉汁寒天斜面培養：表面には生育せ
ず。（３）肉汁液体培養：生育をはじめると全体が一様に濁
り、次いで、白色の沈渣を形成する。なお、液表面には
生育せず。（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺孔に沿って一様に生
育し、ゼラチンは液化しない。

【００１６】（５）リトマス・ミルク：中性。一時的に
脱色する。（ｃ）生理的性質（１）硝酸塩の還元：− （２）脱窒反応：− （３）ＭＲテスト：− （４）ＶＰテスト：− （５）インドールの生成：− （６）硫化水素の生成：− （７）デンプンの加水分解：− （８）クエン酸の利用：− （９）無機窒素源の利用：− （１０）色素の生成：− （１１）ウレアーゼ：− （１２）オキシダーゼ：− （１３）カタラーゼ：− （１４）生育の範囲：ｐＨ５．５〜９．０の範囲で生育
し、最適ｐＨは７．０、温度は２０〜３０℃でよく生育
し、４５℃以上では生育しない。（１５）酸素に対する態度：通性嫌気性で、むしろ嫌気
的条件を好む。（１６）Ｏ−Ｆテスト（イーストエキス添加）：発酵型（ｄ）その他の諸性質（１）糖類の分解生成物：乳酸及び酢酸を生成する。

【００１７】（２）アルギニンの分解：分解しない。（３）塩化ナトリウムの耐性：塩化ナトリウム５〜６％
で最もよく生育し、塩化ナトリウム２０％を含む培地で
も生育し、強い耐塩性を有する。分離して得られた本菌株は、塩化ナトリウムに対し強い
耐性を有すること、及びｐＨ５．５〜９．０の範囲で生
育することなどより、ペディオコッカス・ハロフィルス
に属するものと認められる。

【００１８】しかしながら、本菌株は、キシロース、ア
ラビノースなどのペントースとグルコースの共存下で該
ペントース及びグルコースの両者を同時に資化できるこ
とより、従来のペディオコッカス・ハロフィルスに属す
る菌株とは異なものと判断される。なお、本ペディオコ
ッカス・ハロフィルスＸ−１６０は、工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研条寄第７０１号（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−７０１）として寄託されている。

【００１９】このようにして選択された、ペディオコッ
カス属に属し、アルギニン・デイミナーゼ経路を有しな
い乳酸菌を常法により培養し、この培養物を常法に従っ
て醤油製造における醤油乳酸菌として使用することによ
り、カルバミン酸エチルを数ｐｐｂ以下と実質的に含有
しない醤油を製造することができる。本発明方法におい
て使用する、ペディオコッカス属に属し、アルギニン・
デイミナーゼ経路を有しない乳酸菌の培養については特
に制限はなく、通常の乳酸菌を培養するための培地及び
培養法が用いられる。

【００２０】その培地の窒素源としては、利用可能な窒
素化合物又はこれを含有するものであればよく、例えば
酵母エキス、ペプトン、肉エキス、ゼラチン、コーンス
チープリカー、アミノ酸、大豆あるいは小麦麹の浸出液
などの１種以上の窒素源が用いられる。上記窒素源にマ
ンガン、リン酸、カリウム、マグネシウム、カルシウム
などの適当な無機塩類の１種以上を適宜加え、必要によ
り菌の生育に必要な炭素源、例えば糖類、各種の有機
物、無機物、ビタミンなどを添加したものが培地として
好適に用いられ、食塩０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の含有
培地が好ましい。また、通常の醤油製造法における仕込
初期の諸味液汁を適宜希釈し、食塩濃度を調整したもの
を用いてもよい。

【００２１】培養は液体培養法が好ましく、静置培養を
行うのがよい。そして、培養温度は通常２０〜３５℃、
好ましくは２５〜３０℃であり、培養時間は２〜５日が
適当である。また、培養時のｐＨは６．５〜８が適当で
ある。このようにして培養した乳酸菌の醤油製造におけ
る添加時期については、特に制限はなく、常法に従えば
よいが、殊に麹、又は仕込初期の諸味に添加するのが好
適である。

【００２２】例えば麹に添加する場合は、製麹が殆ど完
了した出麹間際がよく、諸味に添加する場合は、仕込時
ないし６０日前後の間で酵母によるアルコール生成以前
がよい。そして、該乳酸菌の添加量は、通常のごとく１
０²〜１０⁶個／諸味１ｇ程度となるようにするのが好ま
しい。

【００２３】その後の乳酸発酵管理、酵母発酵管理など
の諸味管理についても何ら制限はなく、通常の醤油製造
における諸味管理に従えばよい。そして、こうして得ら
れた諸味は常法により圧搾、製成、火入して、製品醤油
とする。以下、実施例により本発明を更に具体的に説明
するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００２４】なお、以下の実施例において、カルバミン
酸エチルの分析は次の方法によった。１．分析用サンプルの調製 B. J. Canas らの方法［B. J. Canas et al., J. Asso
c. Off. Anal. Chem.,71(3), 509(1988)］に準じ、以下
の方法により行った。

【００２５】アルミナ１０ｇ、その上に硫酸ナトリウム
４０ｇを詰めたガラス製クロマト管の上部に、醤油１５
ｇとセライト１５ｇを混合したものを充填する。次に、
これにジクロルメタン１００ｍＬを注ぎ、採取した溶出
液に酢酸エチル１ｍＬを加えて１．０ｍＬに減圧濃縮す
る。これに、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフ直結質量
分析計）分析時の内部標準物質として、１００ｐｐｍ濃
度のＮ−メチルカルバミン酸エチル溶液を１０μＬ加
え、ＧＣ／ＭＳ分析用サンプルとする。２．ＧＣ／ＭＳ分析条件（１）ＧＣ：カラム；Supercowax 10 、φ０．２５ｍｍ×６０ｍ、膜
厚０．２５μｍ（スパルコ社製）キャリア・ガス；Ｈｅ、１．３８ｍＬ／ｍｉｎカラム恒温槽温度；４０℃、５℃／ｍｉｎ、１６０℃、
３℃／ｍｉｎ、２００℃ 注入口温度；１８０℃ サンプル注入量；１．０μＬ（２）ＭＳ：イオン化電圧；７０ｅＶ検出モード；ＳＩＭモニター質量数；ｍ／ｚ６２、７５また、シトルリンの定量は、日立製高速アミノ酸分析計
（生体液分析法）Ｌ−８５００形を用いて行った。

【００２６】

【実施例】

［本発明の方法（Ａ）］脱脂大豆２００ｋｇ、小麦２２
５ｋｇを常法により製麹して得た醤油麹に食塩１８０ｋ
ｇを含む塩水８００Ｌを加えて２０００Ｌ容密閉仕込タ
ンクに仕込んだ。

【００２７】一方、上記と同様に仕込んで得た仕込後２
２日目の醤油諸味液汁を食塩１５％に調整し、無菌濾過
して培地（ｐＨ６）とし、これに、前記した方法により
選択して得たアルギニン・デイミナーゼ経路を有しない
乳酸菌ペディオコッカス・ハロフィルスＸ−１６０（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−７０１）（アルギニンからオルニチンへ
の変換率＝０％）を接種し、３０℃で、１２０時間静置
培養し、これを醤油乳酸菌とした。

【００２８】そして、上記仕込と同時に該醤油乳酸菌を
生菌数が諸味１ｇ当たり１×１０⁵個となるように添加
した。仕込後、時々攪拌し、仕込後１５日目より加温
し、仕込後５０日目にチゴサッカロミセス・ルキシーＡ
ＴＣＣ１３３５６を添加し、６か月間通常の諸味管理を
行って熟成諸味を得た。これを常法により圧搾した後、
ＮａＣｌ１６．６０％（ｗ／ｖ）、Ｔ．Ｎ．１．５７％
（ｗ／ｖ）に調整し、８０℃で１６時間の火入を行い、
火入醤油を得た。こうして得た火入醤油のカルバミン酸
エチルの含有量は２．３６ｐｐｂであった。［本発明の方法（Ｂ）］アルギニン・デイミナーゼ経路
を有しない乳酸菌ペディオコッカス・ハロフィルスＸ−
１６０（ＦＥＲＭＢＰ−７０１）の添加と同時に、下
記バクテリオファージΦＫ１６０のバクテリオファージ
液５ｍＬを加える以外は、上記本発明の方法（Ａ）と同
様にして火入醤油を得た。こうして得た火入醤油のカル
バミン酸エチルの含有量は２．５０ｐｐｂであった。な
お、熟成諸味液汁にはシトルリンは認められなかった。［参考例］前記した方法により、アルギニン・デイミナ
ーゼ経路を有する乳酸菌ペディオコッカス・ハロフィル
スＩＡＭ１６９３（ＩＦＯ１２１７２）（アルギ
ニンからオルニチンへの変換率＝９８％）をＬ−アルギ
ニン（塩酸塩）２．４％（ｗ／ｖ）となるように含有さ
せた培地に培養する以外は、上記と同様にして醤油乳酸
菌の培養物を得た。

【００２９】そして、この培養物を添加すること、及び
この培養物の添加と同時に下記バクテリオファージΦＫ
１６９３のバクテリオファージ液５ｍＬを加えること以
外は上記本発明の方法（Ａ）と同様にして火入醤油を得
た。この火入醤油のカルバミン酸エチルの含有量は４６
ｐｐｂであった。なお、熟成諸味液汁にはシトルリンが
０．７％（ｗ／ｖ）含有されていた。

【００３０】以上のことから、本発明の方法により得ら
れた火入醤油（製品醤油）は、たとえ使用した乳酸菌が
バクテリオファージに感染、溶菌しても、カルバミン酸
エチルを実質的に含有しない優れたものであることがわ
かる。（バクテリオファージΦＫ１６０のバクテリオファージ
液）バクテリオファージΦＫ１６０は、次に示す方法に
よって分離採取されたものである。

【００３１】即ち、野性乳酸菌が豊富に生育していると
思われる天然仕込み醤油諸味を濾過して諸味液汁を得、
これを孔径０．２μｍのメンブランフィルターで濾過し
て微生物を完全に除去し、バクテリオファージ含有無菌
濾過液を得た。次いで、これを１５％（ｗ／ｖ）食塩水
で多段に希釈し、その０．５ｍＬと宿主（指示菌）のペ
ディオコッカス・ハロフィルスＸ−１６０（ＦＥＲＭ
ＢＰ−７０１）の培養液０．５ｍＬとを混ぜ、この混合
液１００μＬを予め調製した食塩１５％（ｗ／ｖ）及び
寒天１．５％（ｗ／ｖ）を含有するＭＲＳ培地（ Difco
社製０８８１−０１−３）の平板上に一様に塗布し、
通常の乳酸菌の寒天培養法に従い、嫌気的条件下［Gas
Pak(Becton-Dickson社製）法］で、２５℃で４日間培養
すると、希釈の段階に応じて溶菌斑が現われたので、釣
菌して分離した。

【００３２】これを再度上記宿主と混ぜて３０℃、３日
間液体静置培養すると、完全に溶菌するので、この溶菌
液を孔径０．２μｍのメンブランフィルターで濾過し、
微生物を完全に除去してバクテリオファージ含有無菌濾
過液を得、これをΦＫ１６０のバクテリオファージ液と
した。なお、こうして分離されたバクテリオファージΦ
Ｋ１６０のプラーク形態は、径１〜３ｍｍ、透明であっ
た。

【００３３】（バクテリオファージΦＫ１６９３のバク
テリオファージ液）宿主（指示菌）としてペディオコッ
カス・ハロフィルスＩＡＭ１６９３（ＩＦＯ１２
１７２）を用いること以外は、上記と同様にしてバクテ
リオファージΦＫ１６９３を分離し、バクテリオファー
ジ液とした。こうして分離されたバクテリオファージΦ
Ｋ１６９３のプラーク形態は径３〜５ｍｍ、透明であっ
た。

【００３４】

【発明の効果】本発明の方法に従えば、ペディオコッカ
ス属に属し、アルギニン・デイミナーゼ経路を有しない
乳酸菌を醤油乳酸菌として使用することにより、たとえ
バクテリオファージに感染したとしても、カルバミン酸
エチルを数ｐｐｂ以下と実質的に含有しない醤油を容易
に製造することができ、本発明は産業上有意義である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者福田菜美千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内 (72)発明者樋口猛千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内 (72)発明者佐々木正興千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内 (72)発明者内田金治千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ペディオコッカス属に属し、アルギニン
・デイミナーゼ経路を有しない微生物を選択し、これを
醤油乳酸菌として使用することを特徴とする醤油の製造
法。