JPH05227970A - ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体 - Google Patents

ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体

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JPH05227970A
JPH05227970A JP4032084A JP3208492A JPH05227970A JP H05227970 A JPH05227970 A JP H05227970A JP 4032084 A JP4032084 A JP 4032084A JP 3208492 A JP3208492 A JP 3208492A JP H05227970 A JPH05227970 A JP H05227970A
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Masayuki Tsuchiya
政幸 土屋
Isao Sato
功 佐藤
Maagaretsuto Bendeitsugu Mearii
マーガレット ベンディッグ メアリー
Taren Jiyoonzu Suteiibun
タレン ジョーンズ スティーブン
Uiriamu Sarudana Hose
ウィリアム サルダナ ホセ
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒ
トＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノク
ローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んでＬ鎖Ｖ領域、を含ん
で成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域を含んで成る
Ｈ鎖；を含んで成るヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成され
た抗体。 【効果】 本発明はヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト
化抗体を提供し、この抗体においては、ヒト抗体のＶ領
域のＣＤＲがヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている。この再構
成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてマウス
ＣＤＲは抗原性が低いから、本発明の再構成ヒト抗体は
ヒトに対する抗原性が低く、そしてそれ故に療法用とし
て期待される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインターロイキン
−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するマウスモノクローナ
ル抗体の可変領域（Ｖ領域）、ヒトＩＬ−６Ｒに対する
ヒト／マウスキメラ抗体、ヒトライト鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域
及びヒトヘビー鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）がヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
抗体のＣＤＲにより置き換えられている再構成（ｒｅｓ
ｈｅｐｅｄ）ヒト抗体に関する。
【０００２】本発明はさらに、上記の抗体又はその部分
をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前記
ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、並び
に該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本発
明はさらに、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体の製造
方法、及びヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体の製
造方法を提供する。
【０００３】
【従来の技術】インターロイキン−６（ＩＬ−６）は一
連の細胞により生産される多機能サイトカインである。
このものは免疫応答、急性期反応及び造血を調節し、そ
して宿主防御機構において中心的役割を演ずる。このも
のは広範な組織に作用して、標的細胞の性質に応じて成
長誘導効果、成長阻害効果及び分化誘導効果を発揮す
る。
【０００４】ＩＬ−６に対する特異的レセプター（ＩＬ
−６Ｒ）は、ＩＬ−６の多機能性に従ってリンパ系細胞
及び非リンパ系細胞上で発現される。ＩＬ−６遺伝子の
異常発現が種々の疾患、特に自己免疫疾患、メサンジウ
ム細胞増殖性糸球体腎炎、及び形質細胞腫／骨髄腫の発
病に関与することが示唆されている（Ｈｉｒａｎｏら、
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１１，４４３−４４９，
１９９０の総説を参照のこと）。
【０００５】ヒト骨髄腫細胞はＩＬ−６を生産しそして
ＩＬ−６Ｒを発現することが観察される。実験におい
て、ＩＬ−６に対する抗体が骨髄腫細胞の試験管内での
増殖を阻害し、そしてそれ故にヒト骨髄腫の発癌におい
てオートクリン調節ループが機能していることが示され
た（Ｋａｗａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８３，１
９８８）。
【０００６】ＩＬ−６Ｒは種々の動物細胞の表面に存在
し、そしてＩＬ−６に特異的に結合し、そして細胞表面
上のＩＬ−６Ｒ分子の数が報告されている（Ｔａｇａ
ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，９６７，１９８
７）。さらに、ヒトＩＬ−６ＲをコードするｃＤＮＡが
クローン化され、そしてＩＬ−６Ｒの一次構造が報告さ
れている（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
１，８２５，１９８８）。
【０００７】マウスのモノクローナル抗体はヒトにおい
て高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があ
り、そしてこの理由のため、ヒトにおけるそれらの療法
的価値は制限される。ヒトにおけるマウス抗体の半減期
は比較的短い。さらに、ヒト抗マウス抗体は、予定され
た効果を妨害するのみならず、患者における不都合なア
レルギー応答の危険をもたらす免疫応答を惹起すること
なくして頻回投与することはできない。
【０００８】これらの問題を解決するため、ヒト型化
（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。
マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。
より簡単な方法は、可変領域がもとのマウスモノクロー
ナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由
来するキメラ抗体を作製する方法である。得られるキメ
ラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、
そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に
結合することを期待することができる。
【０００９】さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来す
る蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そしてそ
れ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想
される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性
が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ず
る可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４２２０−４
２２４，１９８９）。
【００１０】マウス抗体をヒト型化するための第二の方
法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免
疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法
においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領
域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をヒト可変領域に移
植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト可変領域を
作製する。
【００１１】次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト
定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型抗体
のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲと極く
一部のフレームワーク（ＦＲ）のみである。ＣＤＲは超
可変蛋白質配列により構成されている。これらは種特異
的配列を示さない。これらの理由のため、マウスＣＤＲ
を担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含有す
る天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずであ
る。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】前記のごとく、再構成
ヒト抗体は療法目的のために有用であると予想される
が、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体は知られて
いない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法であって任
意の特定の抗体に普遍的に適用し得る方法は存在しな
い。従って、特定の抗原に対する十分に活性な再構成ヒ
ト抗体を作製するためには種々の工夫が必要である。
【００１３】ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体、すなわちＰＭ１およびＭＴ１８は作製されて
おり（特願平２−１８９４２０）、そして本発明者らは
ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体ＡＵ
Ｋ１２−２０、ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５
を調製しているが、本発明者らはヒトＩＬ−６Ｒに対す
る再構成ヒト抗体の作製を示唆する文献を知らない。
【００１４】さらに、ヒト骨髄腫細胞株が移植されたヌ
ードマウスに、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロ
ーナル抗体が注射された時腫瘍の増殖が顕著に阻害され
ることを、本発明者らは見出した。このことは、骨髄腫
の治療のための療法剤として抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体が有
用であることを示唆している。従って本発明はヒトＩＬ
−６Ｒに対する、免疫原性の低い抗体を提供しようとす
るものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明はヒトＩ
Ｌ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体を提供する。本発明は
また、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用なヒト／マ
ウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒ
ト抗体の部分、並びに再構成ヒト抗体及びその部分並び
にキメラ抗体の製造のための発現系を提供する。さらに
具体的には、本発明は、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウス
モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域；並びにヒトＩＬ−６
Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を提
供する。
【００１６】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、
及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体
のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに（２）ヒトＨ鎖
Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；を含んで成
る、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体を提供する。本
発明はさらに、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；並びにヒトＩＬ−６
Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣ
ＤＲを提供する。
【００１７】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域の
フレームワーク領域（ＦＲ）、及び（２）ヒトＩＬ−６
Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣ
ＤＲ、を含んで成る、ヒトＩＲ−６Ｒに対する抗体の再
構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦ
Ｒ、及び（２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで成る、ヒト
ＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を提供
する。
【００１８】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、
並びに（２）ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマ
ウスモノクローナル抗体のＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領
域、を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構
成ヒトＬ鎖；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモ
ノクローナル抗体のＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を
含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒト
Ｈ鎖を提供する。
【００１９】本発明はさらにまた、 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＬ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖；を含んで成る、ヒ
トＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体を提供する。本発
明はまた、前記種々の抗体構成ポリペプチド、又はその
部分をコードするＤＮＡに関する。
【００２０】本発明はまた、上記ＤＮＡを含んで成るベ
クター、例えば発現ベクターに対する。本発明はさら
に、上記ベクターにより形質転換された宿主を提供す
る。本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメ
ラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成
ヒト抗体の製造方法を提供する。
【００２１】
【具体的な説明】マウスＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング さらに詳しくは、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノク
ローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡをクローン化
するためには、遺伝子源として、ヒトＩＬ−６Ｒに対す
るモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製
することが必要である。この様なハイブリドーマとし
て、特願平２−１８９４２０号明細書にはモノクローナ
ル抗体ＰＭ１を生産するマウスハイブリドーマＰＭ１及
び該抗体の性質が記載されている。
【００２２】本明細書の参考例２にハイブリドーマＰＭ
１の作製方法を記載する。本発明者らは、それぞれがヒ
トＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマＡＵＫ１２−２０、ＡＵＫ６４−７
及びＡＵＫ１４６−１５を作製している。これらのハイ
ブリドーマの作製方法は本明細書の参考例３に記載され
ている。
【００２３】マウスモノクローナル抗体の可変領域をコ
ードする目的のＤＮＡをクローン化するためハイブリド
ーマ細胞を破壊し、そしてＣｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，５２９４，１９７７に記載
されている常法により全ＲＮＡを得る。次に、この全Ｒ
ＮＡを用いて、Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４，１９８９に記載されて
いる方法を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００２４】次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法
を用いて前記ｃＤＮＡの有意義な部分の特異的増幅を行
う。マウスモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ
領域の増幅のため、配列番号：１〜１１に示す１１種の
オリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐ
ａ Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に
示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａ
ｐｐａ Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′−
末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用す
る。
【００２５】前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイ
ズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズす
る。マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のた
め、配列番号：１３〜２２に示す１０種のオリゴヌクレ
オチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｖａｒｉ
ａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２３に示すオリゴヌ
クレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ ＨｅａｖｙＣｏｎ
ｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー
及び３′−末端プライマーとして使用する。
【００２６】なお、５′−末端プライマーはその５′−
末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提供する配列Ｇ
ＴＣＧＡＣを含有し、そして３′−末端プライマーはそ
の５′−末端近傍に制限酵素Ｘｍａｌ切断部位を提供す
るヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有する。これらの
制限酵素切断部位は可変領域をコードする目的のＤＮＡ
断片をクローニングベクターにサブクローニングするた
めに用いられる。
【００２７】次に増幅生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＸ
ｍａＩで切断させて、マウスモノクローナル抗体の目的
とする可変領域をコードするＤＮＡ断片を得る。他方、
プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクローニングベク
ターを同じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩにより切断さ
せ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を連結することに
より、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域
をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。クロ
ーン化されたＤＮＡの配列決定は任意の常法に従って行
うことができる。目的とするＤＮＡのクローン化及びそ
の配列決定を実施例１〜３に具体的に記載する。
【００２８】相補性決定領域（ＣＤＲ） 本発明はさらに、本発明の各Ｖ領域の超可変又は相補性
決定領域（ＣＤＲ）を提供する。Ｌ鎖及びＨ鎖の各対の
Ｖ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこ
の領域は同様の全般的構造を有しそして各領域は配列の
比較的保存された４個のフレームワーク領域を含み、そ
れらは３個の超可変領域又はＣＤＲにより連結されてい
る（Kabat,E.A.ら、「Sequences of Proteins of Immun
ological Interest 」, US Dept. Health and Human Se
rvices 1983 ）。
【００２９】前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の
多くの部分はβ−シート構造をとり、ＣＤＲはループを
形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部
分を形成することもある。ＣＤＲはＦＲによって非常に
近い位置に保持され、そして他の領域のＣＤＲと共に抗
原結合部位の形成に寄与する。
【００３０】本発明は、ヒト型化抗体の素材として有用
なこれらのＣＤＲ、及びそれをコードするＤＮＡをも提
供する。これらのＣＤＲ領域は、Ｖ領域の既知アミノ酸
配列と照合することによって、Kabat,E.A.ら、「Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest 」の経験
則から見出すことができ、実施例４において具体的に説
明する。
【００３１】キメラ抗体の作製 ヒトＩＲ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計
するに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域
を形成することを確かめる必要がある。この目的のた
め、キメラ抗体を作製した。さらに実施例１及び２に記
載される４種類のモノクローナル抗体のクローン化され
たＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒ
トＩＬ−６Ｒ抗体のアミノ酸配列を相互に、及び既知の
マウス及びヒトの抗体のＶ領域と比較した。
【００３２】４種類のモノクローナル抗体のそれぞれに
ついて、１セットの典型的な機能的マウスＬ及びＨ鎖Ｖ
領域がクローニングされた。しかしながら、４種類すべ
てのマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体は比較的異なるＶ領域
を有していた。４種類の抗体は相互に単に微小な相違で
はなかった。クローン化されたマウスＶ領域を用いて４
種類のキメラ抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体を作製した。
【００３３】キメラ抗体を作製するための基本的な方法
は、ＰＣＲ−クローン化ｃＤＮＡに見られるようなマウ
スリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベク
ター中にすでに存在するヒトＣ領域をコードする配列に
連結することを含んで成る。前記４種類のモノクローナ
ル抗体の内、モノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０から
のキメラ抗体の作製を実施例５に記載する。
【００３４】モノクローナル抗体ＰＭ−１からのキメラ
抗体の作製を実施例６に記載する。マウスＰＭ−１κＬ
鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒ
トＬ鎖Ｃ領域をコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する
発現ベクターにＰＣＲ法を用いてクローン化した。マウ
スＰＭ−１抗体（単に「ＰＭ−１抗体」又は「ＰＭ」と
いう場合もある）のＨ鎖リーダー及びＶ領域をコードす
るｃＤＮＡを、ヒトγ−１Ｃ領域をコードするゲノムＤ
ＮＡを含有する発現ベクターにＰＣＲ法を用いてサブク
ローン化した。
【００３５】特に設計されたＰＣＲプライマーを用い
て、マウスＰＭ−１のＶ領域をコードするｃＤＮＡをそ
れらの５′−及び３′−末端において適当な塩基配列を
導入して（１）それらが発現ベクターに容易に挿入され
るように、且つ（２）それらが該発現ベクター中で適切
に機能するようにした。次に、これらのプライマーを用
いてＰＣＲにより増幅して得たマウスＰＭ−１のＶ領域
を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＣＭＶ発現ベ
クター（図１）に挿入した。これらのベクターは、種々
の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体の一過性
（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安定な発現のために適
当である。
【００３６】マウスＰＭ−１抗体中に存在するＶ領域と
同じＶ領域を有するキメラＰＭ−1抗体（バージョン
ａ）の作製に加えて、キメラＰＭ−１抗体の第二のバー
ジョン（バージョンｂ）を作製した。キメラＰＭ−１抗
体（バージョンｂ）においては、Ｌ鎖Ｖ領域中の位置１
０７のアミノ酸がアスパラギンからリジンに変えられて
いる。マウスＰＭ−１抗体からのＬ鎖Ｖ領域と他のマウ
スＬ鎖Ｖ領域との比較において、位置１０７におけるア
ルギニンの存在は異常であることが注目された。
【００３７】マウスκＬ鎖Ｖ領域においては、位置１０
７の最も典型的アミノ酸はリジンである。マウスＰＭ−
１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置１０７に非典型的なアミノ
酸であるアルギニンを有することの重要性を評価するた
め、位置１０７を典型的なアミノ酸であるリジンに変え
た。この変更は、ＰＣＲ−変異誘発法（Ｍ．Ｋａｍｍａ
ｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８７）１
７：５４０４）を用いてＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
配列中に必要な変更を行うことにより達成された。
【００３８】キメラＰＭ−１抗体バージョン（ａ）はヒ
トＩＬ−６Ｒに結合する活性を示した。キメラＰＭ−１
抗体バージョン（ｂ）もバージョン（ａ）と同様にヒト
ＩＬ−６Ｒに結合する。同様に、他の２種類のモノクロ
ーナル抗体ＡＵＫ６４─７及びＡＵＫ１４６−１５から
キメラ抗体を作製した。４種類すべてのキメラ抗体はヒ
トＩＬ−６Ｒによく結合し、機能的測定において、正し
いマウスＶ領域がクローン化されそして配列が決定され
ていたことが示された。
【００３９】４種類のマウス抗−ヒトＩＬ−６Ｒ抗体か
ら、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体の設計及び
作製のための第一の候補としてマウスＰＭ−１抗体を選
択した。マウスＰＭ−１抗体の選択は主として、ヌード
マウスに移植されたヒト骨髄腫細胞に対するマウス抗ヒ
トＩＬ−６Ｒ抗体及びキメラ化抗体の効果を研究して得
られた結果に基く。４種類のマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗
体の内、ＰＭ−１抗体が最も強い抗腫瘍細胞活性を示し
た。又、キメラ化ＰＭ−１抗体はキメラ化ＡＵＫ１２−
２０抗体よりも強い抗腫瘍性を示した。
【００４０】マウスモノクローナル抗体ＰＭ−１のＶ領
域と既知のマウス及びヒトの抗体のＶ領域との比較 マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒトモノクローナ
ル抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するため
には、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒトモノクロ
ーナル抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが
望ましい。従って、マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖
のＶ領域を、ＯＷＬ（ｏｒ Ｌｅｅｄｓ）ｄａｔａｂａ
ｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓに見
出されるすべての既知マウス及びヒトのＶ領域と比較し
た。
【００４１】マウス抗体のＶ領域に関しては、ＰＭ−１
抗体のＬ鎖Ｖ領域はマウス抗体ｍｕｓｉｇｋｃｋｏ（Ｃ
ｈｅｎ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
８７）２６２：１３５７９−１３５８３）のＬ鎖Ｖ領域
と最も類似しており、９３．５％の同一性（ｉｄｅｎｔ
ｉｔｙ）が存在した。ＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域はマウ
ス抗体ｍｕｓｉｇｖｈｒ２（Ｆ．Ｊ．Ｇｒａｎｔら、Ｎ
ｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８７）１５：５４９
６）のＨ鎖Ｖ領域に最も類似しており、８４．０％の同
一性が存在した。
【００４２】マウスＰＭ−１のＶ領域は既知マウスＶ領
域に高比率の同一性を示し、マウスＰＭ−１のＶ領域が
典型的なマウスＶ領域であることが示される。このこと
はさらに、クローン化されたＤＮＡ配列が正しいという
間接的な証明を与える。一般に、Ｈ鎖Ｖ領域間に比べて
Ｌ鎖Ｖ領域間の方がより高い比率の同一性が存在する。
これはおそらく、Ｈ鎖Ｖ領域に比べてＬ鎖Ｖ領域におい
て一般的に観察されるより少ない量の多様性のためであ
ろう。
【００４３】ヒト抗体のＶ領域に関しては、マウスＰＭ
−１抗体のＬ鎖Ｖ領域は、ＲＥＩとも称されるヒト抗体
ｋｌｈｕｒｅ（Ｗ．Ｐａｌｍら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．（１９７５）３５６：１６７−１９１）のＬ鎖Ｖ
領域に最も類似しており、７２．２％の同一性が存在す
る。ＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域は、ヒト抗体ｈｕｍｉｇ
ｈｖａｐ（ＶＡＰ）（Ｈ．Ｗ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：７９１−７９３）
に最も類似しており、７１．８％の同一性が存在する。
【００４４】マウスＰＭ−１抗体からの再構成抗体をい
かに設計するかを考えるためにヒトＶ領域との比較が最
も重要である。ヒトＶ領域への同一性の比率はマウスＶ
領域への同一性の比率より低い。これはマウスＰＭ−１
抗体のＶ領域がマウスＶ領域に類似しており、そしてヒ
トＶ領域には類似していないことの間接的証明である。
この証明にまた、ヒト患者における免疫原性の問題を解
決するためにマウスＰＭ−１のＶ領域をヒト型化する
（ｈｕｍａｎｉｚｅ）ことが最善であることを示す。
【００４５】マウスＰＭ−１抗体のＶ領域をさらに、E.
A. Kabatら、（1987）Sequences ofProteins of Immuno
logical Interest, Forth Edition, U.S. Department o
f Health and Human Services, U.S. Government Print
ing Officeにより定義される、ヒトＶ領域の異なるサブ
グループについてのコンセンサス配列と比較した。Ｖ領
域のＦＲ間で比較を行った。その結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】マウスＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域のＦＲはヒト
Ｌ鎖Ｖ領域のサブグループＩ（ＨＳＧＩ）のコンセンサ
ス配列からのＦＲに最も類似しており、７０．１％の同
一性が存在する。マウスＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域のＦＲは
ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループII（ＨＳＧII）のコンセ
ンサス配列からのＦＲに最も類似しており、５２．９％
の同一性が存在する。これらの結果は、既知のヒト抗体
との比較から得られた結果を支持している。ヒトＲＥＩ
中のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩに属
し、そしてヒトＶＡＰ中のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域
のサブグループIIに属する。
【００４８】ヒト抗体中のＶ領域とのこれらの比較か
ら、再構成ヒトＰＭ−１Ｖ領域の設計の基礎となるヒト
Ｖ領域を選択することが可能である。再構成ヒトＰＭ−
１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（Ｓ
ＧＩ）に属するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成
ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグル
ープII（ＳＧII）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を用いる
のが最善であろう。
【００４９】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の設計 再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の設計における第一段階
は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択することで
あった。マウスＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のＦＲは、サ
ブグループＩに属するヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のＦＲに最
も類似していた（表１）。前記のごとく、マウスＰＭ−
１抗体のＬ鎖Ｖ領域と既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較
において、それはヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの１
構成員であるヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩに最も類似してい
た。従って、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計
においてＲＥＩからのＦＲを使用した。また、再構成ヒ
トＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料とし
てＲＥＩのＦＲを使用した。
【００５０】ＲＥＩに基くこれらのヒトＦＲ中には、も
とのヒトＲＥＩに比べて５個の相違が存在する（ｋａｂ
ａｔら、１９８７、によれば位置３９，７１，１０４，
１０５及び１０７；表２を参照のこと）。ＦＲ４中の３
個の変化（位置１０４，１０５及び１０７）は他のヒト
κＬ鎖からのＪ領域に基いており、そしてそれ故にヒト
からの逸脱を成すものではない（Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３２２：２１−２
５）。位置３９及び７１における２個の変化はラットＣ
ＡＭＰＡＴＨ−１のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ中に存在するアミ
ノ酸にもどる変化であった（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１
９８８）。
【００５１】再構成ヒトＭＩ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つ
のバージョンを設計した。第一のバージョン（バージョ
ン「ａ」）においては、ヒトＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰ
ＡＴＨ−１Ｈ中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃ
ｈｍａｎｎら、１９８８）と同一であり、そしてマウス
ＣＤＲはマウスＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同じ
であった。第二のバージョン（バージョン「ｂ」）はバ
ージョン「ａ」に基き、ヒトＦＲ３中の位置７１におけ
るアミノ酸１個のみを異にする。
【００５２】Ｃ．Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．（１９８７）１９６：９０１−９１７により定義
されるように、残基７１はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１の標準
的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の部分である。この位置
のアミノ酸はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１ループの構造に直接
影響すると予想され、そしてそれ故に抗体結合に大きく
影響するであろう。マウスＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域におい
て、位置７１はチロシンである。
【００５３】再構成ヒトＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のバ
ージョン「ａ」の設計に使用した修飾されたＲＥＩのＦ
Ｒにおいては位置７１はフェニルアラニンであった。再
構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ｂ」に
おいては、位置７１のフェニルアラニンがマウスＰＭ−
１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中に見出されるようにチロシンに変え
られている。表２は、マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領
域、再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中での使用の
ために修飾されたＲＥＩのＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
ら、１９８８）及び再構成ヒトＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領
域の２種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を
示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】注：ＲＥＩのＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡ
ＴＨ−１Ｈ抗体中に見出されるものである（Ｒｉｅｃｈ
ｍａｎｎら、１９８８）。ＲＥＩのＦＲ中の５個の下線
を付したアミノ酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列（Ｐｌａ
ｍら、１９７５；０．Ｅｐｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ（１９７５）１４：４９４３−４９５２）から異な
るアミノ酸である。
【００５６】マウスＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＦＲ
はサブグループIIに属するヒトＨ鎖Ｖ領域に最も類似し
ている( 表１）。前記のごとく、マウスＰＭ−１抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域と既知のヒトＨ鎖Ｖ領域との比較において、
これはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIの１構成員であ
るヒトＨ鎖Ｖ領域ＶＡＰに最も類似していた。ヒトＨ鎖
Ｖ領域のサブグループIIの他の構成員であるヒトＨ鎖Ｖ
領域ＮＥＷを、再構成ヒトＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域の
作製のための出発材料として、及び再構成ヒトＰＭ−１
抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計のための基礎として用いた。
【００５７】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の６種
類のバージョンを設計した。６種類のバージョンのすべ
てにおいて、ヒトＦＲは再構成Ｄ１．３中に存在するＮ
ＥＷＦＲに基いており、そしてマウスＣＤＲはマウスＰ
Ｍ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同じである。ヒトＦ
Ｒ中の７個のアミノ酸残基（位置１，２７，２８，２
９，３０，４８及び７１；表３参照）は抗原結合に不都
合な影響を与える可能性を有するものと同定されてい
る。
【００５８】マウスＰＭ−１抗体のＶ領域のモデルにお
いて、Ｈ鎖Ｖ領域中の残基１はＣＤＲループの近くに位
置する表面残基である。残基２７，２８，２９，及び３
０は、Ｃ．Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８
９）３４：８７７−８８２により推定されるようにＨ鎖
Ｖ領域のＣＤＲ１の標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造
の部分であり、そして／又はＨ鎖Ｖ領域の第一構造ルー
プの部分を構成するマウスＰＭ−１抗体Ｖ領域のモデル
において観察される（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７）。
【００５９】残基４８はマウスＰＭ−１抗体のＶ領域の
モデルにおいて埋った（ｂｕｒｉｅｄ）残基として観察
された。埋った（ｂｕｒｉｅｄ）残基の変化はＶ領域及
びその抗原結合部位の全体構造を破壊する可能性があ
る。残基７１は、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）により
予想されるようにＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ２の標準（ｃａｎ
ｏｎｉｃａｌ）構造の部分である。再構成ヒトＰＭ−１
抗体の６種類のバージョンはヒトＮＥＷのＦＲ中のこれ
ら７つの位置のアミノ酸の変化の異る組合わせを含む
（表３及び表４を参照のこと）。
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】注：ＮＥＷのＦＲには再構成ヒトＣＡＭＰ
ＡＴＨ−１Ｈ抗体の第一バージョン（Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎら、１９８８）中に見出されるものである。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の作製 再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれ
の第一バージョンを新規なＰＣＲ利用法を用いて作製し
た。要約すれば、適当なヒトＦＲをすでに含有する再構
成ヒトＶ領域をコードするプラスミドをＰＣＲプライマ
ーを用いて修飾し、出発ヒトＶ領域中に存在するＣＤＲ
をマウスＰＭ−１抗体からのＣＤＲにより置換した。
【００６３】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製
のための出発材料は、再構成ヒトＤ１．３Ｌ鎖Ｖ領域を
含有するプラスミドＤＮＡであった。この再構成ヒトＤ
１．３Ｌ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩ中に存在する
ＦＲに基いて作製された。再構成ヒトＰＭ−１Ｈ鎖Ｖ領
域の作製のための出発材料は再構成ヒトＤ１．３Ｈ鎖Ｖ
領域であった。この再構成ヒトＤ１．３Ｈ鎖Ｖ領域はヒ
トＨ鎖Ｖ領域ＮＥＷ（Ｗ．Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４−１５３６）
中に存在するＦＲに基いて作製された。
【００６４】所望のヒトＦＲを含有する出発プラスミド
ＤＮＡを選択した後、マウスＤ１．４ＣＤＲに代るマウ
スＰＭ−１抗体ＣＤＲの置換を可能にするようにＰＣＲ
プライマーを設計しそして合成した。各再構成ヒトＰＭ
−１抗体Ｖ領域につき、３種類のプライマーはマウスＰ
Ｍ−１抗体ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を含有し、そ
して２種類のプライマーは再構成ヒトＶ領域をコードす
る全体ＤＮＡ配列を挟むように設計されている。
【００６５】一連のＰＣＲ反応における５種類のＰＣＲ
プライマーの使用が、出発再構成ヒトＶ領域中に存在す
るヒトＦＲ及びマウスＰＭ−１抗体Ｖ領域中に存在する
ＣＤＲから成る（実施例７、並びに図７及び図８を参照
のこと）。ＰＣＲ生成物をクローン化し、そして配列決
定して、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域の
バージョン「ａ」の全体ＤＮＡ配列が正しいアミノ酸配
列をコードしていることを確認した。再構成ヒトＰＭ−
１Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の配列を配列番号５５に
示す。
【００６６】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の他のバー
ジョンは、公表されているＰＣＲ−変異誘発法（Ｋａｍ
ｍａｎら、１９８９）にわずかな変更を加えた方法を用
いて作製した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の設計に
関して記載したように、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ
領域の１つの追加のバージョン（バージョン「ｂ」）を
作製し、そして再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の５
種類の追加のバージョン（バージョン「ｂ」、「ｃ」、
「ｄ」、「ｅ」、及び「ｆ」を作製した。
【００６７】これらの追加のバージョンは、第一バージ
ョンからの一連の微細な変化を含む。アミノ酸配列のこ
れらの微細な変化はＰＣＲ変異誘発を用いてＤＮＡ配列
の微細な変更を行うことにより達成された。ＤＮＡ配列
に必要な変化を導入するＰＣＲプライマーが設計され
た。一連のＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ生成物をクローン
化し、そして配列決定してＤＮＡ配列中の変化が計画通
りに起っていることを確認した。再構成ヒトＰＭ−１Ｈ
鎖Ｖ領域バージョン「ｆ」の配列を配列番号５４に示
す。
【００６８】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の種々のバ
ージョンのＤＮＡ配列を配列決定により確認した後、再
構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域を、ヒトＣ領域をすでに含
有する哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングし
た。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ鎖Ｌ領域をヒトＬ鎖Ｃ領
域をコードするＤＮＡ配列に連結した。再構成ヒトＰＭ
−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をヒトγ−１Ｃ領域をコードするＤ
ＮＡ配列に連結した。
【００６９】再構成ヒトＰＭ−１抗体のより高レベルの
発現を達成するため、図１に示すようなＨＣＭＶ発現ベ
クターを修飾して、ＨＣＭＶプロモーター・エンハンサ
ー領域をヒトエロンゲーションファクター（ｈｕｍａｎ
ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ；ＨＦＦ−１
α）プロモーター・エンハンサーにより置き換えた（図
１５を参照のこと）。
【００７０】次に再構成Ｌ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）
と、Ｈ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）〜（ｆ）のすべての組
合せをヒトＩＬ−６Ｒへの結合について試験し、そして
その結果、実施例１１に詳細に記載するように、Ｌ鎖バ
ージョン（ａ）とＨ鎖バージョン（ｆ）とを含んで成る
再構成ヒト抗体がキメラＰＭ−１抗体（ａ）と同じレベ
ルでＩＬ−６Ｒに結合する能力を示した。
【００７１】発現のレベルを改良するための、再構成ヒ
トＰＭ−１抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの変更 ＣＯＳ 細胞中で生産される再構成ヒトＰＭ−１抗体の発
現レベルの検討において、再構成ヒトＨ鎖の発現が常
に、再構成ヒトＬ鎖又はキメラＬ鎖もしくはＨ鎖の発現
レベルに比べて約１０分の１であることが明らかになっ
た。低レベルの発現を生じさせる問題点は再構成ヒトＨ
鎖Ｖ領域にあるようであった。低レベルの発現が低レベ
ルの転写の結果であるか否かを特定するため、再構成ヒ
トＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクターによ
り同時形質転換されたＣＯＳ細胞からＲＮＡを調製し
た。
【００７２】マウスＰＭ−１抗体Ｖ領域のＰＣＲクロー
ニングについて記載したようにして第一本鎖ｃＤＮＡを
合成した。再構成ヒトＬ鎖又はＨ鎖Ｖ領域をコードする
ＤＮＡ配列の両端挟むように設計されたＰＣＲプライマ
ーを用いて、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域又は再構成Ｈ鎖Ｖ領
域に対応する前記ｃＤＮＡからＰＣＲ生成物を生成せし
めた。
【００７３】再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域について、２種類の
ＰＣＲ生成物が存在し、一方は予想通り４０８bpの長さ
を有し、他方はより短い２９９bpのＰＣＲ生成物であっ
た。正しいサイズのＰＣＲ生成物はＰＣＲ生成物の全生
成量の約９０％を占め、そして短いＰＣＲ生成物は全生
成量の約１０％を占めた。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域につい
てもやはり２種類のＰＣＲ生成物が存在し、一方は予想
通り４４４bpの長さを有し、そして他方は３７０bpの長
さの短いＰＣＲ生成物であった。
【００７４】しかしながらこの場合、正しくない短い方
のＰＣＲ生成物がＰＣＲ生成物の全生成量の大部分、す
なわち約９０％を占めた。正しいサイズのＰＣＲ生成物
はＰＣＲ生成物の全生成量の約１０％に過ぎなかった。
これらの結果は、再構成ヒトＶ領域をコードするＲＮＡ
の幾らかが欠失を含むことを示した。
【００７５】どの配列が除去されたかを決定するため、
短い方のＰＣＲ生成物をクローニングし、そして配列決
定した。ＤＮＡ配列から、Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のいずれ
についてもＤＮＡの特定の部分が欠けていることが明ら
かになった。除去された配列を挟むＤＮＡ配列の検討に
より、これらの配列はスプライスドナー−アクセプター
配列のコンセンサス配列（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ．Ｒ
ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）５
０：３４９−３８３）に相当することが明らかとなっ
た。
【００７６】再構成ヒトＨ鎖の低い発現レベルは、再構
成ヒトＨ鎖Ｖ領域の設計が、どちらかと言えば効果的な
スプライスドナー−アクセプター部位を不注意に形成さ
せたためであると説明された。さらに、再構成ヒトＬ鎖
Ｖ領域の設計はどちらかと言えば非効果的なスプライス
ドナー−アクセプター部位を不注意に形成させたようで
あった。これらのスプライスドナー−アクセプター部位
を除去するため、ヒトＰＭ−１Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそ
れぞれバージョン「ａ」及び「ｆ」をコードするＤＮＡ
配列のわずかな変更を前記のＰＣＲ−変異誘発法を用い
て行った。
【００７７】低下したレベルの発現の他の可能性ある原
因は、再構成ヒトＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域（配列番号：５４
及び５５）の両者のリーダー配列中のイントロンの存在
であると考えられた。これらのイントロンはもともと、
再構成ヒトＤ１．３のＶ領域（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、
１９８８）の作製において使用されたマウスμＨ鎖リー
ダー配列（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ（１９８５）３１４：２６８−２７０）に由来する。
【００７８】再構成ヒトＤ１．３は、マウス免疫グロブ
リンプロモーターを用いる哺乳類細胞ベクターにおいて
発現されたためマウスリーダーイントロンの存在が重要
であった。リーダーイントロンは免疫グロブリンプロモ
ーターからの発現のためには重要であるが、しかしＨＣ
ＭＶのごときウィルスプロモーターからの発現のために
は重要でない（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８８）１６：６７１３
−６７２４）配列を含有している。再構成ヒトＰＭ−１
Ｌ鎖及びＨ鎖が免疫グロブリンプロモーター以外のプロ
モーターを用いるベクターにおいて発現される場合、リ
ーダー配列中のイントロンは、再構成ヒトＶ領域をコー
ドするｃＤＮＡのＰＣＲ−クローニングにより除去され
た（実施例１２を参照のこと）。
【００７９】低下した発現レベルの他の可能性ある原因
は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域とヒトγ−１Ｃ
領域との間のイントロン内の約１９０bpの非機能的ＤＮ
Ａの存在であると考えられた。再構成ヒトＢＩ−８Ｈ鎖
Ｖ領域（Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８
６）３２１：５２２−５２５）にもともと由来するＤＮ
Ａ配列から再構成ヒトＰＭ−１Ｈ鎖Ｖ領域を作製した。
【００８０】この最初の再構成ヒトＶ領域はマウスＮＰ
のＨ鎖Ｖ領域（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔ
ｕｒｅ；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＥＭＢＯ
Ｊ．（１９８３）２：１３７３−１３７８）から作製さ
れた。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域と、発現ベクターに再構成
ヒトＶ領域を連結するためのＢａｍＨＩ部位との間のイ
ントロン中に存在する約１９０bpのこのストレッチは、
再構成ヒトＶ領域をコードするｃＤＮＡのＰＣＲクロー
ニングの過程で除去された。
【００８１】発現レベルを改良するために変形された再
構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域の最終バージ
ョンのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号：５７及
び５６に示す。これらのＤＮＡ配列は、表２に示した再
構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」、
並びに表３及び表４に示した再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ
鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」をコードする。ＨＥＦ−１
α発現ベクター（図１５）に挿入された場合、これらの
ベクターはトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中で約２
μｇ／mlの抗体を一過性に生産する。
【００８２】より多量の再構成ヒトＰＭ−１抗体を安定
的に生産させるため、ｄｈｆｒ遺伝子を組み込んだ新し
いＨＥＦ−１α発現ベクターを作製した（実施例１０，
図１１を参照のこと）。欠陥のある（ｃｒｉｐｐｌｅ
ｄ）ＳＶ４０プロモーターを連結したｄｈｆｒ遺伝子
を、ヒトγ−１Ｈ鎖を発現するＨＣＭＶベクターについ
て記載したのと同様にして、ヒトγ−１Ｈ鎖を発現する
ＨＥＦ−１αベクターに導入した。再構成ヒトＰＭ−１
抗体Ｌ鎖を発現するＨＥＦ−１αベクター及び再構成ヒ
トＰＭ−１抗体Ｈ鎖を発現するＨＥＦ−１α−ｄｈｆｒ
ベクターをＣＨＯｄｈｆｒ（−）細胞に同時形質転換し
た。
【００８３】安定に形質転換されたＣＨＯ細胞系を、ヌ
クレオシドを含有せず１０％のＦＣＳ及び５００μｇ／
mlのＧ４１８を含有するＡｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ
Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）中で選択した。遺伝子増幅
工程に先立って、ＣＨＯ細胞系は１０μｇ／１０6 細胞
／日までの再構成ヒトＰＭ−１抗体を生産することが観
察された。
【００８４】ヒトＩＬ−６Ｒに対する本発明のキメラ抗
体又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例
えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳
類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細
胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用するこ
とができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構
成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞
中で発現される。
【００８５】これらの場合、哺乳類細胞での発現のため
に有用な常用のプロモーターを用いることができる。例
えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ
ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが
好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクタ
ーの例には、ＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 、ＨＣＭＶ−Ｖ
L −ＨＣK 、ＨＣＭＶ−１２ｈ−g γ1 、ＨＣＭＶ−１
２κ−ｇκ等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの
（図１を参照のこと）が含まれる。
【００８６】本発明のために有用なプロモーターの他の
具体例はヒト・エロンゲーション・ファクター１α（Ｈ
ＥＦ−１α）プロモーターである。このプロモーターを
含有する発現ベクターにはＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１及び
ＨＥＦ−１２ｋ−ｇκ（図８及び図９）、並びにＨＥＦ
−ＶH −ｇγ１及びＨＥＦ−ＶL −ｇκ（図１５）が含
まれる。
【００８７】宿主細胞系中での遺伝子増幅のため、発現
ベクターはさらにｄｈｆｒ遺伝子を含有することができ
る。ｄｈｆｒ遺伝子を含有する発現ベクターは例えばＤ
ＨＦＲ−ΔＥ−ＰＭｈ−ｇγ1 （図１０）、ＤＨＦＲ−
ΔＥ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆ（図１１）等である。
【００８８】要約すれば、本発明はまず、ヒトＩＬ−６
Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域及び
Ｈ鎖Ｖ領域、並びに該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及
びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを提供する。これら
は、ヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト／マウスキメラ抗体及
び再構成ヒト抗体の作製のために有用である。モノクロ
ーナル抗体は、例えばＡＵＫ１２−２０、ＰＭ−１、Ａ
ＵＫ６４−７、及びＡＵＫ１４６−１５である。Ｌ鎖Ｖ
領域は例えば配列番号：２４，２６，２８又は３０に示
すアミノ酸配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域は例えば配列
番号：２５，２７，２９，又は３１に示すアミノ酸配列
を有する。これらのアミノ酸配列は例えばそれぞれ配列
番号：２４〜３１に示すヌクレオチド配列によりコード
されている。
【００８９】本発明はまた、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域及び
マウスＬ鎖Ｖ領域；並びに（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域及びマ
ウスＨ鎖Ｖ領域：を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対す
るキメラ抗体に関する。マウスＬ鎖Ｖ領域及びマウスＨ
鎖Ｖ領域並びにこれらをコードするＤＮＡは前記の通り
である。前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域で
あることができ、そして例えばヒトＣκである。前記ヒ
トＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることがで
き、そして例えばＣγ１である。
【００９０】キメラ抗体の製造のためには２種類の発現
ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のご
とき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域
及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発
現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のご
とき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ
鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター
を作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類
細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転
換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養して
キメラ抗体を製造する。
【００９１】あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖
Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及び
ヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクタ
ーに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質
転換し、次にこの形質転換された宿主をインビボ又はイ
ン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させ
る。
【００９２】本発明はさらに、 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＬ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を含んで成
るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成
るＨ鎖；を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成
ヒト抗体を提供する。
【００９３】好ましい態様においては、前記Ｌ鎖ＣＤＲ
は配列番号２４，２６，２８及び３０のいずれかに示さ
れるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の範囲が表
６において定義されるアミノ酸配列を有し；前記Ｈ鎖Ｃ
ＤＲは配列番号２５，２７，２９及び３１に示されるア
ミノ酸配列であって該アミノ酸配列の範囲が表６におい
て定義されるアミノ酸配列を有し；前記ヒトＬ鎖ＦＲが
ＲＥＩに由来するものであり；前記ヒトＨ鎖ＦＲはＮＥ
Ｗに由来するものであり；前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトκ
Ｃ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトγ−１
Ｃである。
【００９４】好ましい態様においては、Ｌ鎖Ｖ領域は表
２においてＲＶL ａとして示されるアミノ酸配列を有
し、Ｈ鎖Ｖ領域は表３及び表４にＲＶH ａ、ＲＶH ｂ、
ＲＶHｃ、ＲＶH ｄ、ＲＶH ｅ又はＲＶH ｆとして示さ
れるアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列ＲＶH ｆが最
も好ましい。
【００９５】再構成抗体の製造のためには、２種類の発
現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系の
ごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再
構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベク
ター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現
制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコード
するＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製
する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞
のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転
換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して
再構成ヒト抗体を生産せしめる。
【００９６】あるいは、再構成Ｌ鎖をコードするＤＮＡ
及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベ
クターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形
質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビ
ボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗
体を生産せしめる。
【００９７】
【実施例】次に、本発明を下記の実施例により具体的に
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。実施例１ ．ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナ
ル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン化 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可
変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローン化し
た。
【００９８】１．全ＲＮＡの調製 ハイブリドーマＡＵＫ１２−２０からの全ＲＮＡを、Ｃ
ｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，
５２９４（１９７９）により記載されている方法に従っ
て調製した。すなわち、２．１×１０8 個のハイブリド
ーマＡＵＫ１２−２０の細胞を２０mlの４Ｍグアニジン
チオシアネート（Ｆｕｌｋａ）中で完全にホモジナイズ
させた。ホモジネートを遠心管中の５．３Ｍ塩化セシウ
ム溶液層上に重層し、次にこれをＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ
４０ローター中で３１，０００rpm にて２０℃で２４時
間遠心分離することによりＲＮＡを沈澱させた。
【００９９】ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにより洗
浄し、そして１mM ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳを含有
する10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）１５０μｌ中
に溶解し、そしてそれにＰｒｏｔｅｎａｓｅ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ）を０．５mg／mlとなるように添加した
後、３７℃にて２０分間インキュベートした。混合物を
フェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡを
エタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１mM
ＥＤＴＡを含有する10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５）２００μｌに溶解した。
【０１００】２．一本鎖ｃＤＮＡの合成 Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，７，９３４（１９８９）により記載されている方法
に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように
して調製した全ＲＮＡの約５μｇを40mM ＫＣｌ, 6mM
ＭｇＣｌ2 ，１０mMジチオスレイトール、０．５mM ｄ
ＡＴＰ，０．５mM ｄＧＴＰ，０．５mMｄＣＴＰ，０．
５mM ｄＴＴＰ，３５μＭ ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマ
ー（Ａｍｅｒｓｈａｍ），４８ユニットのＲＡＶ−２逆
転写酵素（ＲＡＶ−２：Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄ ｖｉｒｕｓ２；Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び２５ユニッ
トのヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）を含有する５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）緩
衝液１０μｌに溶解し、そしてこの反応混合物を３７℃
にて６０分間インキュベートしそして次のポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）法のために直接使用した。
【０１０１】３．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰ
ＣＲ法による増幅 Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＰＨＣ−
２（Ｔｅｃｈｎｅ）を用いてＰＣＲ法を行った。
【０１０２】（１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝
子の増幅 ＰＣＲ法に使用するプライマーは、配列番号：１〜１１
に示すＭＫＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｖａｒｉａｂ
ｌｅ）プライマー（マウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列と
ハイブリダイズする）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）、及び配
列番号：１２に示すＭＫＣ（ＭｏｕｓｅＫａｐｐａ Ｃ
ｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（マウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領
域とハイブリダイズする）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）であ
った。
【０１０３】まず、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．
３）, ５０mM ＫＣｌ ０．１mMｄＡＴＰ，０．１mM
ｄＧＴＰ，０．１mM ｄＣＴＰ，０．１mM ｄＴＴＰ，
１．５mM ＭｇＣｌ2 ，2.5 ユニットのＤＮＡポリメラ
ーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ），０．２５μＭのそれぞれのＭＫＶプライマ
ー、３μＭのＭＫＣプライマー及び一本鎖ｃＤＮＡ合成
の反応混合物１μｌを含有するＰＣＲ溶液１００μｌを
９４℃の初期温度にて１．５分間そして次に９４℃にて
１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間、この
順序で加熱した。この温度サイクルを２５回反復した
後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキュー
ベートした。
【０１０４】（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤ
ＮＡの増幅 ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１３〜２２
に示すＭＨＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｖａｒｉａｂ
ｌｅ）プライマー１〜１０（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）、及
び配列番号：２３に示すＭＨＣ（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖ
ｙ Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅ
ｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９
１）を使用した。前記３．（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺
伝子の増幅について記載したのと同じ方法により増幅を
行った。
【０１０５】４．ＰＣＲ生成物の精製および断片化 前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を
ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ生成物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ
Ｉｎｃ．ＵＳ）を用いて精製し、そして１０mM Ｍｇ
Ｃｌ2 及び１５０mM ＮａＣｌを含有する１００mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）中で１０ユニットの制限酵
素ＳａｌＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて３７℃にて
３時間消化した。
【０１０６】この消化混合物をフェノール及びクロロホ
ルムで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱により回
収した。次に、ＤＮＡ沈澱物を１０ユニットの制限酵素
ＸｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
により３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮＡ断
片を、低融点アガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ，米国）を用いるアガロースゲル電気泳動により
分離した。
【０１０７】約４５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するア
ガロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せし
め、そしてこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び２００mM
ＮａＣｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロ
ホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈
澱により回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。こうし
て、マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子を
含んで成るＤＮＡ断片、及びマウスＨ鎖可変領域をコー
ドする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片を得た。上記ＤＮ
Ａ断片はいずれもその５′−末端にＳａｌＩ接着末端を
有しそしてその３′−末端にＸｍａＩ接着末端を有す
る。
【０１０８】５．連結及び形質転換 上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域を
コードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩＤＮ
Ａ断片約０．３μｇを、プラスミドｐＵＣ１９をＳａｌ
Ｉ及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１
９ベクター約０．１μｇと、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．４），１０mM ＭｇＣｌ2 ，１０mMジチオスレ
イトール、１mMスペルミジン、１mM ＡＴＰ，０．１μ
ｇ／mlのウシ血清アルブミン及び２ユニットＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
を含有する反応混合物中で、１６℃にて１６時間反応さ
せ連結した。
【０１０９】次に、７μｌの上記連結混合物を大腸菌Ｄ
Ｈ５αのコンピテント細胞２００μｌに加え、そしてこ
の細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び
氷上で１分間静置した。次いで８００μｌのＳＯＣ培地
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を加え、３７℃にて１
時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）上にこの大腸菌をまき、３７℃
にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０１１０】この形質転換体を、５０μｇ／mlのアンピ
シリンを含有する２×ＹＴ倍地５ml中で３７℃にて一夜
培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ，１９８９）に従ってプラスミドＤＮＡを調製し
た。
【０１１１】こうして得られた、ハイブリドーマＡＵＫ
１２−２０に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコー
ドする遺伝子を含有するプラスミドをｐ１２−ｋ２と命
名した。上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＡＵ
Ｋ１２−２０に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする
遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩ Ｄ
ＮＡ断片から作成し、そしてｐ１２−ｈ２と命名した。
【０１１２】実施例２．マウスモノクローナル抗体のＶ
領域をコードするＤＮＡのクローン化 実施例１に記載したのと実質上同じ方法をハイブリドー
マＰＭ１，ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５に適
用して下記のプラスミドを得た：ハイブリドーマＰＭ１
由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有す
るプラスミドｐＰＭ−ｋ３；ハイブリドーマＰＭ１由来
のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミド
ｐＰＭ−ｈ１；ハイブリドーマＡＵＫ６４−７由来のカ
ッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラス
ミドｐ６４−ｋ４；ハイブリドーマＡＵＫ６４−７由来
のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミド
ｐ６４−ｈ２；ハイブリドーマＡＵＫ１４６−１５由来
のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプ
ラスミドｐ１４６−ｋ３；及びハイブリドーマＡＵＫ１
４６−１５由来のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有
するプラスミドＰ１４６−ｈ１。
【０１１３】なお、上記プラスミドを含有する大腸菌株
は、National Collections of Industrial and Marine
Bacteria Limitedに、ブダペスト条約に基づいて、１９
９１年２月１１日に寄託され、そして表５に示す受託番
号を有する。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】実施例３．ＤＮＡの塩基配列の決定 前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列
を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ TMＶｅｒｓｉｏｎ２．０キット
（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ、米国）
を用いて決定した。まず、前記のようにして得られたプ
ラスミド約３μｇを０．２Ｎ ＮａＯＨにより変性し、
配列決定用プライマーとアニールさせ、そしてキット添
付の処方に従って35Ｓ−ｄＡＴＰより標識した。次に、
標識されたＤＮＡを、８Ｍ尿素を含有する６％ポリアク
リルアミドゲルにて電気泳動した後、ゲルを１０％メタ
ノール及び１０％酢酸により固定し、乾燥し、そしてオ
ートラジオグラフィーにかけることにより塩基配列を決
定した。各プラスミドのｃＤＮＡコード領域の塩基配列
を配列番号：２４〜３１に示す。
【０１１６】実施例４．ＣＤＲの決定 Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を
有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つ
の超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連
結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較
的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸
配列の変異性は極めて高い（Kabat, E.A. ら、「Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest 」US Dep
t. Health and Human Services, 1983）。この様な事実
に基づき、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナ
ル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより
作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあては
めて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表６に示
す如く決定した。
【０１１７】
【表６】
【０１１８】実施例５．クローン化されたｃＤＮＡの発
現の確認（１）発現プラスミドの作製 ＰＣＲ法によりクローン化されたＡＵＫ１２−２０のカ
ッパ型Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードするｃＤＮＡから
キメラＬ鎖／Ｈ鎖を作製した。マウスＡＵＫ１２−２０
のＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒトサイトメガロウ
イルス（ＨＣＭＶ）のエンハンサー及びプロモーターを
含有する哺乳類細胞発現ベクター（ＨＣＭＶ発現ベクタ
ーと称する）（図１．実施例８）中でヒトＣ領域をコー
ドするＤＮＡに容易に連結するためには、ＡＵＫ１２−
２０のＶ領域をコードするマウスｃＤＮＡ配列の５′−
末端及び３′−末端に便利な制限酵素切断部位を導入す
ることが必要であった。
【０１１９】５′−末端及び３′−末端へのこれらの修
飾はＰＣＲ法を用いて行った。２セットのＰＣＲプライ
マーを設計しそして合成した。マウスＬ鎖Ｖ領域及びＨ
鎖Ｖ領域の両方について、リーダー配列の始めをコード
するＤＮＡにハイブリダイズし、効率的な翻訳のために
必須のＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１９６：９４７−９５０，１９８７）を維持し
そしてＨＣＭＶ発現ベクターへのクローニングのための
ＨｉｎｄIII 部位を形成するために、Ｌ鎖Ｖ領域後方プ
ライマー（配列番号：３２）、及びＨ鎖Ｖ領域後方プラ
イマー（配列番号：３３）を調製した。
【０１２０】前方ＰＣＲ−プライマーは、Ｊ領域の末端
をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、Ｃ領域へのス
プライシングのために必須のＤＮＡ配列を維持しそして
ＨＣＭＶ発現ベクターでのヒトＣ領域への連結のための
ＢａｍＨＩ部位を形成するように、Ｌ鎖Ｖ領域前方プラ
イマー（配列番号３４）、及びＨ鎖Ｖ領域前方プライマ
ー（配列番号３５）を調製した。
【０１２１】ＰＣＲによる増幅に続き、ＰＣＲ生成物を
ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、ヒトκ鎖又
はγ−１鎖Ｃ領域ＤＮＡを含有するＨＣＭＶベクターに
クローン化し、そして塩基配列を決定してＰＣＲ法によ
る増幅中にエラーが生じなかったことを確認した。得ら
れる発現ベクターをＨＣＭＶ−１２ｋ−ｇｋ及びＨＣＭ
Ｖ−１２ｈ−ｇγ１と称する。ＨＣＭＶ発現ベクターの
構造を図１に示す。プラスミドＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣ K
において、ＶL 領域は任意のマウスＬ鎖Ｖ領域コード配
列であることができる。この例において、ＡＵＫ１２−
２０κＬ鎖Ｖ領域を挿入することによりＨＣＭＶ１２ｋ
−ｇｋを得た。プラスミドＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１に
おいて、ＶH 領域は任意のマウスＨ鎖Ｖ領域コード配列
であることができる。この例においてはＡＵＫ１２−２
０のＨ鎖Ｖ領域を挿入してＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１を
得た。
【０１２２】ＣＯＳ細胞での一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎ
ｔ）発現 キメラＡＵＫ１２−２０抗体のＣＯＳ細胞での一過性発
現を見るため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において
試験した。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒ装置（ＢｉｏＲａ
ｄ）を用いる電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）によりＤＮＡをＣＯＳ細胞に導入した。すなわ
ち、ＣＯＳ細胞を１×１０7 個／mlになるようにｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢ
Ｓ）に懸濁し、この細胞浮遊液０．８mlにＤＮＡ（各プ
ラスミドについ１０μｇ）を加えた。１，９００ボルト
（Ｖ）、２５マイクロファラッド（μＦ）の電気容量に
てパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、
エクレトロポレーションした細胞を、１０％のウシ胎児
血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）８mlに加え
た。７２時間のインキュベーションの後、培養上清を集
め、遠心分離して細胞破片を除去し、そして無菌条件下
で４℃にて短時間、又は−２０℃にて長時間貯蔵した。
【０１２３】酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるキメ
ラ抗体の定量 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培養上清をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていること
を確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤ
ギの抗−ヒトＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）
（Ｓｉｇｍａ）によりコートした。ブロックした後、Ｃ
ＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウエルに
加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリホ
スファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的、
Ｓｉｇｍａ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止しそして４０５nmにおける吸光度を測定した。
標準として精製ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【０１２４】ヒトＩＬ−６Ｒへの結合能を確認するため
の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ） トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培地をＥＬＩ
ＳＡにより測定して、生産されたキメラ抗体が抗原に結
合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のた
め、プレートをＭＴ１８マウスモノクローナル抗体（参
考例１）でコートした。１％ＢＳＡでブロックした後、
可溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加えた。
洗浄した後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈し、
そして各ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄
の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ
を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝
液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、
そして４０５nmにおける吸光度を測定した。
【０１２５】この結果を図２に示した。キメラ抗体ＡＵ
Ｋ１２−２０をコードする遺伝子のＣＯＳ細胞へのトラ
ンスフェクションを実施した。このＣＯＳ細胞の培養上
清サンプルは、ＩＬ−６Ｒに対する強い結合能を示し、
図２に○（オープンサークル）で示す如く、サンプルの
希釈度（抗体の濃度）依存的に４０５nmにおける吸光度
が変化し、サンプル中にＩＬ−６Ｒレセプターに対する
抗体が含まれていることが確認された。
【０１２６】ヒトＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害す
る能力の測定 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培養上清を測
定して培地中に存在する抗体が、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６
との結合を阻害するか否かを調べるために、ビオチン化
ＩＬ−６との競合的結合阻害能を調べた。プレートをＭ
Ｔ１８マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコート
した。ブロッキングの後、可溶性組換ヒトＩＬ−６Ｒ
（ＳＲ３４４）を加えた。洗浄した後、ＣＯＳ細胞から
のサンプルを段階希釈し、そしてビオチン化ＩＬ−６と
共に各ウエルに加えた。
【０１２７】洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合
ストレプトアビジンを加えた。インキュベーション及び
洗浄の後基質緩衝液を加えた。インキュベーションの
後、反応を停止し、そして吸光度を４０５nmにて測定し
た。精製マウスＡＵＫ１２−２０モノクローナル抗体を
陽性対照として用いた。無関係の抗体を発現するＣＯＳ
細胞からの培地を陰性対照として用いた。
【０１２８】この結果を図３に示した。キメラ抗体ＡＵ
Ｋ１２−２０をコードする遺伝子でトランスフェクトし
たＣＯＳ細胞の培養上清は、最高、及び２番目に高いサ
ンプル濃度でＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害した。
すなわち、図３に●で示す如く、サンプル希釈度（抗体
の濃度）依存的に４０５nmにおける吸光度が変化し、サ
ンプル中の抗体がＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害し
ていることが認められた。これは陽性対照の吸光度の抗
体濃度依存的変化（○）にほぼ一致することからも確認
出来た。なお、陰性対照（△）は阻害活性が全く認めら
れなかった。
【０１２９】実施例６．クローン化ｃＤＮＡの発現の確
認（２）（キメラＰＭ−１抗体の作製） 発現ベクターの作製 キメラＰＭ−１抗体を発現するベクターを作製するた
め、それぞれマウスＰＭ−１κＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコ
ードするｃＤＮＡクローンｐＰＭ−ｋ３及びｐＰＭ−ｈ
１をＰＣＲ法により変形し、そしてＨＣＭＶ発現ベクタ
ー（図１を参照のこと）に導入した。
【０１３０】Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーｐｍｋ
−ｓ（配列番号：３８）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プ
ライマーｐｍｈ−ｓ（配列番号：４０）を、リーダー配
列の最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫ
ｏｚａｋコンセンサス配列及びＨｉｎｄIII 制限部位を
有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライ
マーｐｍｋ−ａ（配列番号：３６）及びＨ鎖Ｖ領域のた
めの前方プライマーｐｍｈ−ａ（配列番号：３９）を、
Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズ
し且つスプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限部位を
有するように設計した。
【０１３１】κＬ鎖Ｖ領域のため、２種類の前方プライ
マーを合成した。ほとんどのκＬ鎖においては、位置１
０７のリジンが保存されているが、マウスＰＭ−１κＬ
鎖においては位置１０７がアスパラギンである。キメラ
ＰＭ−１抗体の抗原結合活性に対するこの変化の効果を
検討するため、前方プライマーｐｍｋ−ｂ（配列番号：
３７）を、位置１０７がアスパラギンからリジンに変る
ように設計した。
【０１３２】ＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ生成物を精製
し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＵ
Ｃ１９ベクター（Ｙａｎｉｓｈｅ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇ
ｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１０９）にサブクロ
ーニングした。ＤＮＡ配列決定の後、ＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨＩ断片を切出し、そしてＨ鎖Ｖ領域については発
現ベクターＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１にクローン化して
ＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１を得、そしてＬ鎖Ｖ領域につ
いてはＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣκにクローン化してＨＣＭ
Ｖ−ＰＭｋａ−ｇｋ及びＨＣＭＶ−ＰＭｋｂ−ｇｋを得
た。
【０１３３】ＣＯＳ細胞のトランスフェクション キメラＰＭ−１抗体の一過性発現を観察するため、前記
発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＣＭＶ
−ｐｍｈ−ｇγ１と、ＨＣＭＶ−ｐｍｋａ−ｇｋ又はＨ
ＣＭＶ−ｐｍｋｂ−ｇｋのいずれかとを、Ｇｅｎｅ Ｐ
ｕｌｇｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポ
レーションによりＣＯＳ細胞に同時形質転換した。ＤＮ
Ａ（プラスミド当り１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×１０7
細胞／mlの０．８mlのアリコートに加え、１，９００
Ｖ，２５μＦの容量にてパルスを与えた。
【０１３４】室温にて１０分間の回復期間の後、エレク
トロポレーション処理された細胞を、１０％のγ−グロ
ブリン不含有ウシ胎児血清を含有するＤｕｌｂｅｃｃ
ｏ′ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ
（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）に加えた。７２時間のイン
キュベーションの後、培養上済を集め、遠心分離により
細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃にて短期間
貯蔵し、又は−２０℃にて長期間貯蔵した。
【０１３５】キメラＰＭ−１抗体の発現及び分析 ３日間の一過性発現の後、ＣＯＳ細胞からの培地を集
め、そしてキメラＰＭ−１抗体について試験した。培地
をまずＥＬＩＳＡにより分析して、トランスフェクトさ
れたＣＯＳ細胞によりヒト様抗体が生産されたか否かを
決定した。このアッセイにおいて標準として既知量の精
製ヒトＩｇＧを用いることにより、ＣＯＳ細胞からの培
地中に存在するヒト様抗体（この場合、キメラＰＭ−１
抗体）の量を推定することが可能である。
【０１３６】ヒト抗体の検出のため、プレートをヤギ抗
−ヒトＩｇＧ（全体分子、Ｓｉｇｍａ）によりコートし
た。ブロッキングの後、ＣＯＳ細胞からのサンプルを段
階希釈し、そして各ウェルに加えた。インキュベーショ
ン及び洗浄の後、アルカリホスフェターゼ結合ヤギ抗−
ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）を加えた。イン
キュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。イ
ンキュベーションの後、反応を停止し、そして４０５nm
での吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧ（Ｓ
ｉｇｍａ）を加えた。
【０１３７】キメラＰＭ−１抗体をコードする遺伝子を
担持するベクターによりトランスフェクトされたＣＯＳ
細胞からの培地はヒト様抗体の発現について陽性であ
り、そしておよその量が上記のようにして測定された。
次に、キメラＰＭ−１抗体をコードする遺伝子を担持す
るベクターによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞か
らの同じ培地をヒトＩＬ−６Ｒに結合する能力について
測定した。抗原への結合の測定のため、プレートを、ヒ
トＩＬ−６Ｒに対する抗体であるＭＴ１８マウスモノク
ローナル抗体（参考例１）によりコートした。ブロッキ
ングの後、可溶性ヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加え
た。
【０１３８】洗浄した後、サンプルを段階希釈し、そし
て各ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ
（γ鎖特異的；Ｓｉｇｍａ）を添加した。インキュベー
ション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベ
ーションの後、反応を停止し、そして４０５nmでの吸光
度を測定した。この測定のために標準品は存在しなかっ
た。２個のサンプルの内の１つは、マウスＰＭ−１抗体
中に見られるＶ領域と同一のＶ領域を有するキメラ抗体
（キメラＰＭ−１ａ抗体、図４）をコードする遺伝子に
よるトランスフェクトからのサンプルであった。他の１
つのサンプルはＬ鎖Ｖ領域中の位置１０７に前記のよう
な１個のアミノ酸変化を有するキメラ抗体（キメラＰＭ
−１ｂ抗体、図４）をコードする遺伝子によるトランス
フェクションからのものであった。
【０１３９】いずれのサンプルも、サンプルの希釈によ
り減少するＩＬ−６Ｒに対する強い結合を示した。すな
わち、作製されたキメラＰＭ−１抗体は機能的であり、
そしてその抗原によく結合することができる。最も重要
なことは、機能的キメラＰＭ−１抗体の証明は、正しい
マウスＰＭ−１Ｖ領域がクローン化されそして配列決定
されたことの直接の証拠である。Ｌ鎖Ｖ領域中の位置１
０７にいずれのアミノ酸を有するキメラ抗体も抗原ＩＬ
−６Ｒによく結合した。
【０１４０】マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置
１０７は抗原結合のためにあまり重要ではなく、そして
この位置におけるアスパラギン及びリジンのいずれも満
足に機能するようである。マウスＰＭ−１抗体はそのＬ
鎖Ｖ領域のこの位置にアスパラギンを有するので、キメ
ラＰＭ−１抗体を用いるその後のすべての研究は、マウ
スＰＭ−１抗体に見出されるそれと同じバージョンａを
用いて行った。より多量のＰＭ−１抗体を安定に生産す
るために、ｄｈｆｒ遺伝子を含有する新たなＨＣＭＶ発
現ベクターを作製した。キメラＰＭ−１抗体のより高い
発現レベルを達成するための第一段階は、ベクターＨＣ
ＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 （図１）を変形して、このベクタ
ーが欠陥のある（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）ＳＶ４０ブロモー
ターエンハンサーにより発現されるｄｈｆｒ遺伝子を含
有するようにすることであった。
【０１４１】ＳＶ４０エンハンサー要素をｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒベクター（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８１）１：８５４−８６
４）から除去し、そしてＳＶ４０プロモーターによって
発現されるｎｅｏ遺伝子の代りに「欠陥のある」ＳＶ４
０プロモーターにより発現されるｄｈｆｒ遺伝子をＨＣ
ＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 に挿入した。次に、この新しいＨ
ＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1−ｄｈｆｒベクターにマウスＰ
Ｍ−１Ｖ領域を挿入した。この改良された発現ベクター
の作製を実施例１０に詳細に記載する。ＣＨＯ ｄｈｆ
ｒ（−）細胞（Ｇ．Ｖｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：４２
１６−４２２０）を２種類のプラスミドＤＮＡすなわち
キメラＰＭ−１ａＬ鎖を発現するためのＨＣＭＶ−ＶL
−ＨＣκベクター（ＨＣＭＶ−ＰＭｋａ−ｇｋ）及びキ
メラＰＭ−１ Ｈ鎖を発現するためのＨＣＭＶ−ＶH −
ＨＣγ1 −ｄｈｆｒベクター（ＤＨＦＲ−△Ｅ−ＰＭｈ
−ｇγ１；実施例１０）により同時形質転換した。
【０１４２】ＤＮＡ（各プラスミドにつき１０μｇ／m
l）をＰＢＳ中１×１０7 細胞／mlの０．８mlのアリコ
ートに加えた。１９００Ｖの電圧２５μＦの電気容量で
パルスを与えた。周囲温度にて１０分間の回復期間の
後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ヌクレ
オシド及び１０％ＦＣＳを含有するＡｌｐｈａ Ｍｉｎ
ｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ培地（α
−ＭＥＭ）１０mlに加えた。
【０１４３】一夜のインキュベーションの後、培地を、
ヌクレオシドを含有せず１０％ＦＣＳ及び５００μｇ／
mlのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ）を含有するα−ＭＥＭに変
えて、ｄｈｆｒ+ 及びｎｅｏ+ 形質転換細胞の選択を行
った。選択の後、選択されたクローンを用いて遺伝子増
幅を行った。２×１０-8Ｍメソトレチャート（ＭＴＸ）
中での１ラウンドの増幅の後、約３．９μｇ／１０6 細
胞／日のキメラＰＭ−１ａの抗体を生産する細胞系（Ｐ
Ｍ１ｋ３−７）を選択した。
【０１４４】ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害
するキメラ抗体の能力についてのＥＬＩＳＡ測定 トランスフェクトされたＣＯＳ細胞において又は安定な
ＣＨＯ細胞系において生産された抗体を測定して、それ
らが、ＩＬ−６Ｒへのビオチン化ＩＬ−６の結合と競争
するか否かを決定した。プレートをマウス抗体ＭＴ１８
によりコートした。ブロッキングの後、可溶性組換えヒ
トＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加えた。洗浄の後、ＣＯ
Ｓ細胞からのサンプルを段階希釈し、そしてビオチン化
ＩＬ−６と一緒に各ウエルに加えた。洗浄の後、アルカ
リホスファターゼ結合ストレプトアビジンを加えた。イ
ンキュベーション及び洗浄後、基質緩衝液を加えた。イ
ンキュベーションの後、反応を停止させ、そして４０５
nmにおける吸光度を測定した。結果を図５に示す。
【０１４５】実施例７．再構成ヒトＰＭ−１抗体の作製 より迅速に且つより効率的にＣＤＲ移植を達成するた
め、ＰＣＲによる逐次ＣＤＲ移植法を開発した。この方
法はＰＣＲ変異誘発法（Ｋａｍｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄ．Ｒｅｓ．１７：５４０４，１９８９）に基く。
ＣＤＲ移植のための選択されたヒトＦＲを含有する鋳型
ＤＮＡを調製するために、適当な再構成ヒトＶ領域を便
利なベクターに再クローニングする必要があった。プラ
スミドａｌｙｓ１１及びＦ１０のＤＮＡはそれぞれ再構
成ヒトＤ１．３のＬ鎖及びＨ鎖をコードしており、ヒト
ＲＥＩからのＦＲ及びＮＥＷからのＦＲをそれぞれ含有
する。再構成ヒトＤ１．３のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡ配列を含有する約５００bpのＮｃｏＩ−ＢａｍＨ１
断片をａｌｙｓ１１から切り出し、そしてＨｉｎｄIII
及びＢａｍＨＩで開裂されたｐＢＲ３２７にサブクロー
ニングしてプラスミドＶｌ−ｌｙｓ−ｐＢＲ３２７を得
た。
【０１４６】このＶｌ−ｌｙｓ−ｐＢＲ３２７からのＨ
ｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片を、ＨｉｎｄIII 及びＢａ
ｍＨＩにより開裂されたｐＵＣ１９に挿入してプラスミ
ドＶｌ−ｌｙｓ−ｐＵＣ１９を得た。再構成ヒト１．３
のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列を含有する約７０
０ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をＦ１０から切り出
し、そしてＨｉｎｄIII −ＮｃｏＩアダプターを用いて
ｐＢＲ３２７のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位にサブク
ローニングし、Ｖｈ−ｌｙｓ−ｐＢＲ３２７を得た。次
に、このプラスミドからＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片
を切り出し、そしてＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより
開裂されたｐＵＣ１９にサブクローニングしてＶｈ−ｌ
ｙｓ−ｐＵＣ１９を得た。
【０１４７】なお、プラスミドａｌｙｓ１１及び再構成
ヒトＤ１．３のＬ鎖Ｖ領域ＦＲをコードするＤＮＡ配列
はヒト型化ＣＡＭＰＡＴＨ１Ｈ抗体（Ｎａｔｕｒｅ ３
３２：３２３−３２７（１９８８))のそれと同じであ
る。鋳型として使用した、プラスミドＦ１０中の再構成
ヒトＤ１．３のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列は、
Ｖ．Ｖｅｒｈｏｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：１５３
４−１５３６（１９８８）のＦｉｇ．２に記載されてい
る。図６は、再構成ヒトＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域の第一バ
ージョンの作製のために使用されたプライマー及びＰＣ
Ｒ反応を模式的に示す。後方プライマーＡ（ＡＰＣＲ
１；配列番号：４１）及び前方プライマーＥ（ＡＰＣＲ
４；配列番号：４２）は、このベクター上のＤＮＡ配列
にハイブリダイズする。ＡＰＣＲ１及びＡＰＣＲ４はｐ
ＵＣ１９ベクターのために特に設計されたが、ユニバー
サルＭ１３配列プライマーを使用することもできる。
【０１４８】ＣＤＲ１移植／変異誘発プライマーＢ（ｐ
ｈｖ−１；配列番号：４３）、ＣＤＲ２移植プライマー
Ｃ（ｐｈｖ−２；配列番号：４４）、及びＣＤＲ３移植
プライマーＤ（ｐｈｖ−３；配列番号：４５）は４０〜
６０ｂｐの長さを有し、マウスＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域の
ＣＤＲ及び該ＣＤＲを挟む鋳型ＤＮＡ中のヒトＦＲをコ
ードするＤＮＡ配列から成る。第一のＰＣＲ反応におい
て前方プライマーＡＰＣＲ４及び後方プライマーＤを用
いた。マウスＰＭ−１のＣＤＲ３配列を含有する第一Ｐ
ＣＲ生成物を精製し、そして第二ＰＣＲ反応において後
方プライマーとしてのプライマーＣと共に前方プライマ
ーとして使用した。
【０１４９】同様にして、マウスＰＭ−１のＣＤＲ２及
びＣＤＲ３を含有する第二ＰＣＲ生成物、並びにマウス
ＰＭ−１の３個すべてのＣＤＲを含有する第三ＰＣＲ生
成物をそれぞれ次のＰＣＲ段階のプライマーとして使用
した。完全な再構成ヒトＰＭ−１ Ｈ鎖Ｖ領域を有する
第四ＰＣＲ生成物を精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨ
Ｉにより消化し、そしてさらに分析するためにｐＵＣ１
９にサブクローニングした。
【０１５０】再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製
のために３種類の変異誘発プライマーｐｈｖ−１，ｐｈ
ｖ−２及びｐｈｖ−３を合成した。これらは８Ｍ尿素を
含有する１２％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。
変異誘発プライマーｐｈｖ−１は、マウスＰＭ−１のＣ
ＤＲ１の移植のためのみならずヒトＦＲ１中の位置２７
及び３０におけるそれぞれのＳｅｒからＴｙｒへ、及び
ＳｅｒからＴｈｒへの変異のために設計された。
【０１５１】各１００μｌのＰＣＲ反応物は典型的には
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mM ＫＣ
ｌ，１．５mM ＭｇＣｌ2 ，２５０μＭ ｄＮＴＰ，５
０ngの鋳型ＤＮＡ（Ｖｈ−ｌｙｓ−ｐＵＣ１９），２．
５ｕのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ），及びプライマーを含有した。１μＭずつ
のｐｈｖ−３プライマー及びＡＰＣＲ４プライマーを含
む第一のＰＣＲ反応を行い、９４℃にて１．５分間の最
初の変性の後、９４℃にて１分間、３７℃にて１分間及
び７２℃にて１分間の３０サイクルを反復した。アニー
リング段階と合成段階の間の変温時間は２．５分間であ
った。最終サイクルの完了の後、７２℃にて１０分間の
最終伸長反応を行った。５２３ｂｐのＰＣＲ生成物を
１．６％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そして
次に第二のＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用し
た。
【０１５２】第二のＰＣＲ反応において約１μｇの精製
された第一ＰＣＲ生成物及び２５ｐｍｏｌｅの変異誘発
プライマーｐｈｖ−２をプライマーとして使用した。Ｐ
ＣＲ条件は第一のＰＣＲ反応について記載したのと同じ
であった。同様にして、第二のＰＣＲ反応からの６６５
ｂｐのＰＣＲ生成物をプライマーｐｈｖ−１と共に第三
のＰＣＲ反応において使用し、そして第三のＰＣＲ反応
からの７３７ｂｐのＰＣＲ生成物をプライマーＡＰＣＲ
１と共に第四のＰＣＲ反応において使用した。第四のＰ
ＣＲ反応からの１．１７２kbのＰＣＲ生成物を精製し、
ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そして次に再構
成ヒトＰＭ−１ Ｈ鎖Ｖ領域を含有する約７００ｂｐの
断片をｐＵＣ１９ベクターにザブクローニングした。配
列決定した４個のクローンの内２個が正しいアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列を有しており、そしてｐＵＣ
−ＲＶｈ−ＰＭ１ａと命名した。
【０１５３】再構成ＰＭ−１ Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージ
ョンを作製するため５種類の変異誘発ＰＣＲプライマー
を合成した。各ＰＣＲ反応は前記の反応条件と本質的に
同じ条件下で行われた。バージョン「ｂ」のため、変異
誘発プライマーｐｈｖ−ｍ４（Ｖａｌ−７１→Ａｒｇ−
７１）（番号はＫａｂａｔらによる；表４参照）（配列
番号：４６）及びＡＰＣＲ４を、鋳型ＤＮＡとしてのｐ
ＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ａと共に第一ＰＣＲ反応において
使用した。この第１ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精
製し、そしてプライマーＡＰＣＲ１と共に第二ＰＣＲ反
応における前方プライマーとして使用した。第二ＰＣＲ
反応からのＰＣＲ生成物を１．６％低融点アガロースゲ
ルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより
消化し、そしてｐＵＣ１９にてサブクローニングしてｐ
ＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを得た。
【０１５４】同様にして、変異誘発プライマーｐｈｖ−
ｎｍ（Ａｓｐ−１→Ｇｌｎ−１）（配列番号：４７）及
び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを用いてバージョン
「ｃ」（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ）を得、変異誘発プ
ライマーｐｈｖ−ｍ６（Ｉｌｅ−４８→Ｍｅｔ−４８）
（配列番号：４８）及び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ
を用いてバージョン「ｄ」（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１
ｄ）を得、変異誘発プライマーｐｈｖ−ｎｍ及び鋳型ｐ
ＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｃを用いてバーション「ｅ」（ｐ
ＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ）を得、そして変異誘発プライ
マーｐｈｖ−ｍ７（Ｔｈｒ−２８→Ｓｅｒ−２８、及び
Ｐｈｅ−２９→Ｉｌｅ−２９）（配列番号：４９）及び
鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを用いてバージョン
「ｆ」（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ）を得た。再構成Ｈ
鎖Ｖ領域バーション「ｆ」のアミノ酸配列及びそれをコ
ードするヌクレオチド配列を配列番号５４に示す。
【０１５５】図７は、再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖Ｖ領域
の第一バージョンの作製において使用したプライマー及
びＰＣＲ反応を模式的に示す。再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ
鎖Ｖ領域の第一バージョンの作製のため、ＣＤＲ１移植
プライマーｐｋｖ−１（配列番号：５０）、ＣＤＲ２移
植プライマーｐｋｖ−２（配列番号：５１）及びＣＤＲ
３移植プライマーｐｋｖ−３（配列番号：５２）を合成
し、そして８Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリルアミ
ドゲル上で精製した。
【０１５６】前記のようにしてＰＣＲ反応を行った。第
一ＰＣＲ反応物は1 μＭずつのｐｋｖ−３プライマー及
びＡＰＣＲ４プライマーを含有した。第一ＰＣＲ反応か
らの３５０ｂｐのＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロ
ースゲルを用いて精製し、そして第三ＰＣＲ反応におけ
る前方プライマーとして使用した。第二ＰＣＲ反応から
のＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII
で消化し、そしてＣＤＲ３が移植されたＤＮＡを含有す
る５００ｂｐ断片をＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９
ベクターにサブクローニングした。
【０１５７】正しい配列を有するプラスミドＤＮＡを同
定し、そして次のＰＣＲ反応における鋳型ＤＮＡとして
使用した。第三ＰＣＲ反応において２５ｐｍｏｌｅの変
異誘発プライマーｐｋｖ−２及びＡＰＣＲ４を使用し
た。第二ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そし
てプライマーｐｋｖ−１と共に第四ＰＣＲ反応における
プライマーとして使用した。同様にして、第四ＰＣＲ反
応からのＰＣＲ生成物をＡＰＣＲ１プライマーと共に第
五ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。
【０１５８】第五ＰＣＲ反応からの９７２ｂｐのＰＣＲ
生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消
化し、そしてＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９にサブ
クローニングした。ＣＤＲ２領域において問題点が認識
され、さらに２回のＰＣＲ反応が必要であった。第六Ｐ
ＣＲ反応及び第七ＰＣＲ反応において、ｐＵＣ１９ベク
ターにクローニングされた第五ＰＣＲ反応からのＰＣＲ
生成物を鋳型ＤＮＡをして使用した。第六ＰＣＲ反応に
おいてプライマーはｐｋｖ−２及びＡＰＣＲ４であっ
た。第六ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そし
てＡＰＣＲ１プライマーと共に第七ＰＣＲ反応における
プライマーとして使用した。第七ＰＣＲ反応からのＰＣ
Ｒ精製物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により
消化し、そして５００ｂｐＤＮＡ断片をＤＮＡ配列決定
のためにｐＵＣ１９にサブクローニングした。配列決定
した５個のクローンの内２個のクローンが正しいＤＮＡ
配列を有していた。このクローンをｐＵＣ−ＲＶ１−Ｐ
Ｍ１ａと称する。この配列を配列番号：５５に示す。
【０１５９】再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖Ｖ領域の他のバ
ージョンの作製のため、変異誘発プライマーｐｖｋ−ｍ
１（配列番号：５３）を合成した。ＰＣＲ反応は本質的
に前記の通りであった。第一ＰＣＲ反応において、変異
誘発プライマーｐｋｖ−ｍ１（Ｐｈｅ−７１→Ｔｙｒ−
７１）及びＡＰＣＲ４プライマーを鋳型ＤＮＡとしての
ｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａと共に使用した。第一ＰＣＲ
反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そしてＡＰＣＲ１プ
ライマーと共に第二ＰＣＲプライマーにおけるプライマ
ーとして使用した。第二ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物
を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化し、
そしてＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９にサブクロー
ニングした。このクローンをｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ｂ
と命名した。
【０１６０】実施例８．遺伝子操作された抗体を哺乳類
細胞中で、発現させるためのヒトサイトメガロウイルス
前期（ＨＣＭＶ）プロモーターを用いるベクターの作製
（図１） キメラＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断
片及びキメラＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡ断片を、それぞれ、哺乳類細胞中でヒトκＬ鎖又は
ヒトγ−１ Ｈ鎖を発現するように設計されたＨＣＭＶ
発現ベクター（図１を参照のこと）ＨＣＭＶ−ＶL −Ｋ
Ｃκ及びＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１にまず挿入した。
【０１６１】該ＨＣＭＶ発現ベクターの作製のための詳
細な記載は、Ｍａｅｄａら、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９１）
２：１２４−１３４；Ｃ．Ａ．Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕ
ｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ（１
９９１）４：７７３−７８３に公表されている。両ベク
ターはｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１
９８２）１：３２７−３４１）に基礎を置き、そして免
疫グロブリンＬ鎖又はＨ鎖の高レベルの転写のためにヒ
トサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及び
エンハンサー（Ｍ．Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９
８５）４１：５２１−５３０）を含有する。
【０１６２】Ｌ鎖発現ベクターはヒトκＣ領域（Ｔ．
Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓら、Ｃａｒｒ．ＴＯＰ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４）１１４：１
６６−１７１）をコードするゲノムＤＮＡを含有し、そ
してＨ鎖発現ベクターはヒトγ−１Ｃ領域（Ｎ．Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ（１９８２）２９：６７１−
６７９）をコードするゲノムＤＮＡを含有する。これら
のＨＣＭＶ発現ベクターは多能であり、そして種々の哺
乳類細胞タイプにおける一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）
発現及び安定な発現のために使用することができる。
【０１６３】実施例９．遺伝子操作された抗体を哺乳類
細胞中で発現させるためのヒトエロンゲーションファク
ター１α（ＨＥＦ−１α）プロモーターを使用するベク
ターの作製（図８及び図９） ヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・フ
アクター１α（ＨＥＦ−１α）は最も豊富な蛋白質の１
つである。これはほとんどの細胞で発現される。ヒトＥ
Ｆ−１αプロモーター−エンハンサーの転写活性はＳＶ
４０前期プロモーター−エンハンサーのそれに比べて約
１００倍である（Ｄ．Ｗ．Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ（１９９
０）９１：２１７−２２３；及びＴ．Ｕｅｔｓｕｋｉ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：５
７９１−５７９８）。
【０１６４】２．５kbのＨＥＦ−１αプロモーター−エ
ンハンサー領域は、該遺伝子の５′−末端に接する約
１．５kbのＤＮＡ、第一エクソン中の３３ｂｐ、第一イ
ントロン中の９４３ｂｐ、及び第二エクソンの最初の部
分の１０ｂｐから成る。この後２．５kbのＨｉｎｄIII
−ＥcoＲＩ断片をプラスミドｐＥＦ３２１−ＣＡＴ
（Ｄ．Ｗ．Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ（１９９０）９１：２１
７−２２３；及びＴ．Ｕｅｔｓｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：５７９１−５７９
８）から切り出し、そしてｐｄＫＣＲベクター（Ｍ．Ｔ
ｓｕｃｈｉｙａら，Ｅｍｂｏ Ｊ．（１９８７）６：６
１１−６１６）、Ｋ．Ｏ′Ｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．７８，Ｎ
ｏ．３，１５２７−１５３１，（１９８１）、（Ｒ．Ｆ
ｕｋｕｎａｇａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ Ｖａｌ．８１，５０８６−５０９０（１
９８４))にクローニングして、ＳＶ４０前期プロモータ
ー−エンハンサーを含有する約３００ｂｐのＨｉｎｄII
I −ＥcoＲＩ断片を置き換えてｐＴＥＦ−１を得た。
【０１６５】ｐＴＥＦ−１をＥcoＲＩで消化し、Ｋｌｅ
ｎｏｗポリメラーゼでフィルーインし、そしてＨｉｎｄ
III リンカーに連結した。次に、この修飾されたＰＴＥ
Ｆ−１ベクターＤＮＡから約１．６kbのＨｉｎｄIII −
ＳｍａＩ断片を切り出した。ＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１
をＥｃｏＲＩにより部分消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラ
ーゼによりフィルーインし、そして自己連結することに
より、実施例５において作製したＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇ
γ１からプラスミドＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１（ΔＥ
２）を作製した。
【０１６６】プラスミドＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１（Δ
Ｅ２）をＥcoＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ
でフィルーインし、そしてＨｉｎｄIII で消化した。ヒ
トα−１Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列を含有する約７
kbの断片を、ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサー
を含有する前記の１．６kb ＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ断
片に連結してＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１を得た。このベク
ター中のＨＥＦ−１αプロモーター・エンハンサー領域
は、５′−領域に接する３８０ｂｐのＤＮＡを除き、ｐ
ＴＥＦ−１中のそれと同一であった。ＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨＩ断片として存在するこのＨ鎖Ｖ領域は、他のＨ
鎖Ｖ領域と容易に交換することができる。
【０１６７】再構成Ｈ鎖Ｖ領域を含有するＨｉｎｄIII
−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片をｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ａ，
ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１
ｃ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ
１ｅ及びｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ（実施例７）から切
り出し、そして前記のプラスミドＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ
１のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入して、それぞ
れ発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，
ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ，ＲＶｈ−ＰＭ１
ｅ，及びＲＶｈ−ＰＭ１ｆを得た。発現ベクターＲＶｈ
−ＰＭ１ａ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，Ｒ
Ｖｈ−ＰＭ１ｅ，及びＲＶｈ−ＰＭ１ｆ、並びにＨＥＦ
−ＰＭｈ−ｇγ１は、それぞれ再構成ヒトＰＭ−１ Ｈ
鎖Ｖ領域バージョン「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，
「ｅ」及び「ｆ」、並びにマウスＰＭ−１ Ｈ鎖Ｖ領域
を有する。
【０１６８】Ｌ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋを
作製するため、ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサ
ー領域を含有する約３．０kbのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII
断片をＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１ら切り出し、そして実施
例５において作製したＨＣＭＶ−Ｌ鎖発現ベクターＨＣ
ＭＶ−１２ｋ−ｇｋからの約７．７kbのＰｖｕＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片に連結してＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋを得た。
Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１の場合と同様
に、ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片として存在するＨＥ
Ｆ−１２ｋ−ｇｋ中のＬ鎖Ｖ領域は他のＬ鎖Ｖ領域と容
易に交換することができる。なお、プラスミドＨＥＦ−
ＰＭｈ−ｇγ１は、ＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１（図８）の
ＥＦ１αプロモーター領域（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断
片）によりＨＣＭＶ−ｐｍｈ−ｇγ１のＨＣＨＶプロモ
ーター領域（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片）を置き換え
ることにより作製したものである。
【０１６９】再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域を含有するＨｉｎｄ
III −ＢａｍＨＩＤＮＡ断片をｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１
ａ及びｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ｂ（実施例７）から切り
出し、そしてＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋのＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨＩ部位に挿入し、それぞれ発現ベクターＲＶ１−
ＰＭ１ａ及びＲＶ１−ＰＭ１ｂを得た。発現ベクターＲ
Ｖ１−ＰＭ１ａ及びＲＶ１−ＰＭ１ｂ、並びにＨＥＦ−
ＰＭＫ−ｇｋはそれぞれ再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域「ａ」及
び「ｂ」、並びにマウスＰＭ−１ Ｌ鎖Ｖ領域を有す
る。なお、プラスミドＨＥＦ−ＰＭＫ−ｇｋは、ＨＥＦ
−１２ｋ−ｇｋ（図９）のＥＦ１αプロモーター領域
（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片) によりＨＣＭＶ−ｐｍ
ｋａ−ｇｋのＨＣＭＶプロモーター領域（ＰｖｕＩ−Ｈ
ｉｎｄIII 断片）を置き換えることにより作製したもの
である。
【０１７０】実施例１０．遺伝子操作された抗体をＣＨ
Ｏ細胞中で高レベルで発現させるための、欠陥ＳＶ４０
プロモーター−エンハンサー配列に連結されたジヒドロ
フォレートレラクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を用いるベ
クターの作製（図１０及び図１１） ＳＶ４０前期プロモーターからエンハンサー配列を除去
するため、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｓ．Ｓｕｂ
ｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９
８１）１：８５４−８６４）（ＡＴＣＣ３３６９４）を
ＳｐｈＩ及びＰｖｕIIで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラ
ーゼでフィルーインし、そして自己連結してｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ−ΔＥを得た（図１０）。ＨＣＭＶプロモータ
ー、Ｈ鎖Ｖ領域及びヒトγ−１Ｃ領域を含有する約３．
７kbのＥcoＲＩ断片を、ＥcoＲＩによる部分消化により
ＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１らか切り出した。この断片
を、ＥcoＲＩ−消化ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ΔＥに連結し
てＤＨＦＲ−ΔＥ−ＰＭｈ−ｇγ１を得た。
【０１７１】ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサー
を用いるＨ鎖発現ベクターに基いて類似のベクターを作
製した（図１１を参照のこと）。ＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇ
γ１に由来する約３．７kbのＥcoＲＩ断片を、ＥcoＲＩ
−消化ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ΔＥと連結してＤＨＦＲ−
ΔＥ−１２ｈ−ｇγ１を得た。ＤＨＦＥ−ΔＥ−１２ｈ
−ｇγ１中のｄｈｆｒ配列に続くＢａｍＨＩ部位を、Ｂ
ａｍＨＩによる部分消化、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼに
よるフィルーイン及び自己連結により除去した。ｄｈｆ
ｒ ｃＤＮＡを含有する約４kbのＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩ
断片をこの修飾されたＤＨＦＲ−ΔＥ−１２ｈ−ｇγ１
から切り出し、そして実施例１２において作製したＲＶ
ｈ−ＰＭ１ｆ−４からの約３kbのＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩ
断片に連結してＤＨＦＲ−ΔＥ−ＲＶｈ−ＰＭｌｆを得
た。上記の改良されたプラスミドは本発明の再構成ヒト
ＰＭ−１抗体の製造のために使用することができる。
【０１７２】実施例１１．再構成ヒトＰＭ−１抗体の種
々のバージョンの発現及び分析 再構成ヒトＰＭ−１のＬ鎖及びＨ鎖を発現する各ＨＥＦ
−１αベクターをＣＯＳ細胞に同時形質転換（ｃｏ−ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔ）した。標準対照としてキメラＰＭ−
１抗体のＬ鎖及びＨ鎖を発現する各ＨＥＦ−１αベクタ
ーもＣＯＳ細胞に同時形質転換した。３日後，形質転換
されたＣＯＳ細胞からの培地を集め、そしてＥＬＩＳＡ
により（１）上清中に存在するヒトＩｇＧ抗体の量につ
いて、及び（２）ＩＬ−６Ｒに結合するそのＩｇＧの能
力について分析した。次に、同じサンプルをさらに、Ｅ
ＬＩＳＡにより、ヒトＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結
合を阻害する該抗体の能力について試験した。
【０１７３】再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖を発現する２種
類のベクターの一方（ＲＶ１−ＰＭ１ａ又はＲＶ１−Ｐ
Ｍ１ｂ）及びキメラＰＭ−１ Ｈ鎖を発現するベクター
（ＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１）によりＣＯＳ細胞を同時
形質転換することにより、再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖Ｖ
領域の２種類のバージョンの評価を行った。細胞をま
た、キメラＰＭ−１ Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクタ
ー（ＨＣＭＶ−ＰＭｋａ−ｇｋ及びＨＣＭＶ−ＰＭｈ−
ｇγ１）により同時形質転換した。未精製のＣＯＳ細胞
上消を用いるデーターは、ＩＬ−６Ｒへの結合について
の測定において、再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖のバージョ
ン「ａ」がキメラＰＭ−１ Ｌ鎖と同等であることを示
した。しかしながら、再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖のバー
ジョン「ｂ」はＩＬ−６Ｒへの結合能を実質的に保持し
なかった。これらの結果から、ＦＲ３中の位置７１のフ
ェニルアラニン（ＣＡＭＰＡＨＴＨ−１Ｈのために修飾
されたヒトＲＥＩ中に存在する）からチロシン（天然ヒ
トＲＥＩ及びマウスＰＭ−１中に存在する）への変化は
機能的抗原結合部位の形成に対して非常に有害であるこ
とが結論された。
【０１７４】再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」
が、ＩＬ−６Ｒの結合するその能力においてマウスＰＭ
−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域と同等であることが明らかになった
ので、再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖Ｖ領域の更なるバージ
ョンの設計及び作製は行わなかった。再構成ヒトＰＭ−
１ Ｈ鎖Ｖ領域の種々のバージョンを評価する次の実績
において、再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖Ｖ領域のバージョ
ン「ａ」を常に用いた。
【０１７５】再構成ヒトＰＭ−１ Ｈ鎖の発現する６種
類のベクターの１つ（ＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ＲＶｈ−ＰＭ
１ｂ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ，ＲＶｈ−
ＰＭ１ｅ又はＲＶｈ−ＰＭ１ｆ）及び再構成ヒトＰＭ−
１ Ｌ鎖のバージョン「ａ」を発現するベクター（ＲＶ
１−ＰＭ１ａ）によりＣＯＳ細胞を同時形質転換するこ
とにより、再構成ヒトＰＭ−１ Ｈ鎖Ｖ領域の６種類の
バージョンを評価した。細胞を、キメラＰＭ−１ Ｌ鎖
及びＨ鎖を発現する各ベクター（ＨＥＦ−ＰＭｋ−ｇｋ
及びＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１）によっても同時形質転換
した。未精製のＣＯＳ細胞上清を用いた予備データーが
示すところによれば、ＩＬ−６Ｒへの結合についての測
定において、再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖のバージョン
「ａ」及び再構成ヒトＰＭ−１ Ｈ鎖のバージョン
「ｆ」は、キメラＰＭ−１ Ｌ鎖及びＨ鎖と同等であっ
た。キメラＰＭ−１抗体との比較において、再構成ヒト
ＰＭ−１Ｈ鎖の他の５種類のバージョン＋再構成ヒトＰ
Ｍ−１ Ｌ鎖のバージョン「ａ」は種々の程変で低下し
たＩＬ−６Ｒへの結合を示した。
【０１７６】この予備データーを確認するため、キメラ
ＰＭ−１抗体及び再構成ヒトＰＭ−１抗体をＣＯＳ細胞
上清から濃縮そしてプロテインＡを用いて精製した。す
なわち、ＣＯＳ細胞からの培地を１００ｋｄカットオフ
限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。濃縮
した培地をプロテインＡアガロース（ＡｆｆｉＧｅｌＰ
ｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳIIキット、ＢｉｏＲａｄ）
を用いて精製した。要約すれば、濃縮された培地を、５
ベッドボリウムの結合緩衝液により平衡化されたプロテ
インＡアガロースカラムに適用した。カラムを１５ベッ
ドボリウムの結合緩衝液で洗浄し、そして次に５ベッド
ボリウムの溶出緩衝液を適用した。溶出液を濃縮し、そ
してマイクロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
１０，Ａｍｉｃｏｎ）を用いて緩衝液をＰＢＳに変え
た。精製された抗体を更なる分析のために用いた。
【０１７７】キメラＰＭ−１抗体、及び再構成ヒトＬ鎖
Ｖ領域のバージョン「ａ」と再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域のバ
ージョン「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」又は
「ｆ」とから成る再構成ヒトＰＭ−１抗体の精製された
サンプルの分析を行った。Ｌ鎖の「ａ」バージョン＋Ｈ
鎖の「ｆ」バージョンが明らかに最良の再構成ヒトＰＭ
−１抗体であった。このものは、キメラＰＭ−１抗体と
同様にＩＬ−６Ｒに結合する（図１３）。これはまた、
マウス抗体及びキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−６がＩ
Ｌ−６Ｒに結合するのを阻害する（図１４）。再構成ヒ
トＬ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」との組合せにおいて、
再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域のバージョン「ｂ」及び「ｅ」は
ＩＬ−６Ｒとの良好な結合を示すが、それらの結合にお
いてキメラＰＭ−１抗体と同等ではない。再構成ヒトＬ
鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」との組合せにおいて、バー
ジョン「ｃ」及び「ｄ」はＩＬ−６Ｒとの中程度の結合
を示し、そして再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域のバージョン
「ａ」はＩＬ−６Ｒとの貧弱な結合を示す。
【０１７８】実施例１２．発現レベルを改良するための
再構成ヒトＰＭ−１Ｖ領域の修正 再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域（配列番
号：５４及び５５）のリーダー配列をコードするＤＮＡ
配列内のイントロンを除去するため、Ｖ領域をコードす
るｃＤＮＡをＰＣＲプライマーを用いて再クローニング
した。Ｌ鎖及びＨ鎖の発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ及
びＲＶｈ−ＰＭ１ｆをＣＯＳ細胞に同時形質転換した。
４８時間後、全ＲＮＡを調製し（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８：５２９４
−５２９９）、そしてマウス抗体Ｖ領域のＰＣＲクーロ
ニングについて記載したようにして一本ｃＤＮＡ合成の
ために５μｇの全ＲＮＡを用いた。３種類のＰＣＲプラ
イマーを設計し、そして合成した。ＬＥＶ−Ｐ１（配列
番号：６０）及びＨＥＶ−Ｐ１（配列番号：５８）はス
プライスドナー配列及びＢａｍＨＩ部位を含有し、そし
てそれぞれＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域のための前方プライマ
ーとして使用した。
【０１７９】ＨＥＶ−Ｐ２（配列番号：５９）はＨｉｎ
ｄIII 部位及びＡＴＧ開始コドンの前のＫｏｚａｋコン
センサス配列を含有し、そしてＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域の
ための後方プライマーとして使用した。１００μｌずつ
のＰＣＲ反応物は２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
８），１０mM ＫＣｌ，１０mM（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，２
mMＭｇＳＯ4 ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，
０．１μｇのＢＳＡ，２５０μＭ ｄＮＴＰ，２．５ｕ
のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ．Ｌａｂｓ，
Ｕ．Ｋ．）、５０％の一本ｃＤＮＡ合成反応物並びに１
００ｐｍｏｌｅずつの前方プライマー及び後方プライマ
ーを含有した。各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆
い、そして９４℃にて１．５分間の最初の変性の後、９
４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分
間のサイクル反応を３０回行い、そして次に７２℃にて
１０分間インキュベートした。Ｌ鎖Ｖ領域を含有する４
０８ｂｐのＰＣＲ生成物及びＨ鎖Ｖ領域を含有する４４
４ｂｐのＰＣＲ生成物を、２．０％低融点アガロースゲ
ルを用いて精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII
により消化し、そしてｐＵＣ１９ベクターにサブクロー
ニングし、それぞれｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ−３及び
ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−３を得た。
【０１８０】再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領
域のＤＮＡ配列は不適切なスプライスドナー部位及びア
クセプター部位を含有することが明らかになった（配列
番号：５４及び５５を参照のこと）。Ｌ鎖Ｖ領域内のこ
れらの部位は高頻度には使用されない（ｍＲＮＡの約１
０％）が、Ｈ鎖Ｖ領域内のこれらの部位は高頻度で使用
される（ｍＲＮＡの約９０％）。この異常なスプライシ
ングが再構成ヒトＰＭ−１抗体の低レベルの発現をもた
らした。Ｖ領域の異常なスプライシングを回避するた
め、スプライス−ドナー部位をＰＣＲ法により除去し
た。Ｈ鎖Ｖ領域について、後方プライマーＮＥＷ−ＳＰ
１（配列番号：６１）及び前方プライマーＮＥＷ−ＳＰ
２（配列番号６２）を合成した。このプライマーはＤＮ
Ａ配列ＴＧＧＧＴＧ ＡＧＡをＤＮＡ配列ＴＧＧ ＧＴ
Ｔ ＣＧＣに変える。ＰＣＲ反応の条件はｃＤＮＡのク
ローニングについて前記した通りであったが、鋳型ＤＮ
Ａは５０ngのｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−３であり、そ
してプライマーはＨＥＶ−Ｐ２とＮＥＷ−ＳＰ２、又は
ＨＥＦ−Ｐ１とＮＥＷ−ＳＰ１のいずれかであった。
【０１８１】２個のＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を２
％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてＰＣＲ
連結反応において使用した。０．５μｇの第一ＰＣＲ生
成物を含有する９８μｌのＰＣＲ反応物及び５ユニット
のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを９４℃にて２分間、
５０℃にて２分間及び７２℃にて５分間インキュベート
し、そして次に１００ｐｍｏｌｅずつのＨＥＶ−Ｐ１プ
ライマー及びＨＥＶ−Ｐ２プライマーを加えた。ＰＣＲ
チューブを３０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１
分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間の２５サ
イクルのＰＣＲにかけ、そして次に７２℃にて１０分間
インキュベートした。
【０１８２】同様にして、再構成ヒトＰＭ−１ Ｌ鎖Ｖ
領域中のスプライス−ドナー領域をＰＣＲプライマーＲ
ＥＩ−ＳＰ１（配列番号：６３）及びＲＥＩ−ＳＰ２
（配列番号：６４）を用いて除去した。該プライマーは
ＤＮＡ配列ＣＡＧ ＧＴＡ ＡＧＧをＤＮＡ配列ＣＡＧ
ＧＡＡ ＡＧＧに変える。両ＰＣＲ生成物、すなわち
Ｌ鎖Ｖ領域についての４０８ｂｐのＤＮＡ断片及びＨ鎖
Ｖ領域についての４４４ｂｐのＤＮＡ断片を２．０％低
融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及び
ＢａｍＨＩにより消化し、そして配列決定のためｐＵＣ
１９にサブクローニングした。ＲＶｈ−ＰＭ１ｆのＨｉ
ｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片を、ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１
ｆ−４のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ領域と置き換えるこ
とにより、ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−４を得た。再構成ヒトＰ
Ｈ−１Ｌ鎖Ｖ領域のイントロンが除去されたバージョン
「ａ」の配列を配列番号５７に示し、再構成ヒトＰＭ−
１Ｈ鎖Ｖ領域のイントロンが除去されたバージョン
「ｆ」の配列を配列番号５６に示す。
【０１８３】
【参考例】本発明において使用される出発ハイブリドー
マは次の様にして作製された。参考例１ ．ハイブリドーマ ＭＴ１８の作製 ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを作製するため、免疫原として、細胞表
面にヒトＩＬ−６Ｒを発現するマウスＴ細胞を次の様に
して作製した。すなわち、Ｙ．Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１４３，２９００−２９０６
（１９８９）に開示されているプラスミドｐＺｉｐｎｅ
ｏ ＩＬ−６Ｒを常法に従ってマウスＴ細胞系ＣＴＬＬ
−２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２１４）にトランスフェクト
し、生ずる形質転換体を常法に従ってＧ４１８を用いて
スクリーニングすることにより細胞あたり約３０，００
０個のＩＬ−６Ｒを発現する細胞系を得た。この細胞系
をＣＴＢＣ３と称する。
【０１８４】ＣＴＢＣ３細胞を常法に従ってＲＰＭＩ１
６４０中で培養し、そして培養細胞をＰＢＳ緩衝液によ
り４回洗浄し、そして１×１０7 個の細胞をＣ５７ＢＬ
／６マウスに腹腔内注射して免疫感作した。この免疫感
作は１週間に１回６週間にわたって行った。この免疫感
作されたマウスから脾臓細胞を得、そして常法に従って
ポリエチレングリコールを用いて骨髄腫Ｐ３Ｕ１細胞を
融合せしめ、そして融合した細胞を次の様にしてスクリ
ーニングした。ＩＬ−６Ｒ陰性ヒトＴ細胞系ＪＵＲＫＡ
Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８１６３）を、プラスミドｐＺ
ｉｐｎｅｏ ＩＬ−６Ｒにより同時トランスフェクト
し、そして形質転換された細胞をスクリーニングして、
細胞当り約１００，０００個のＩＬ−６Ｒを発現する細
胞系を得た。この細胞系をＮＪＢＣ８と命名した。
【０１８５】ＮＰ−４０で細胞溶解したＮＪＢＣ８を認
識するがしかしＮＰ−４０で細胞溶解したＪＵＲＫＡＴ
を認識しない抗体を生産するハイブリドーマ細胞系をク
ローン化しそしてＭＴ１８と命名した。ハイブリドーマ
ＭＴ１８は、工業技術院微生物工業技術研究所にブダペ
スト条約のもとに１９９０年７月１０日に微工研条寄第
２９９９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９９９）として寄託さ
れた。
【０１８６】参考例２．ハイブリドーマＰＭ１の作製 ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを作製するため、抗原として、ヒトＩＬ
−６Ｒを次の様にして抽出した。３×１０9 個のヒト骨
髄腫細胞（ＩＬ−６Ｒ生産細胞）を１mlの１％ジギトニ
ン、１０mMトリエタノールアミン緩衝液（pH７．４），
０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１mMＰＭＳＦ（フェニルメチ
ルスルホニルフルオリド；和光純薬）中で溶解した。他
方、参考例１において調製したハイブリドーマＭＴ１８
により生産されたＭＴ１８抗体を、ブロムシアンで活性
化されたセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に常
法に従って結合させた。
【０１８７】このＭＴ１８抗体結合セファロース４Ｂを
前記の細胞溶解物を混合することにより、セファロース
４Ｂ上のＭＴ１８抗体に前記可溶化したＩＬ−６Ｒを結
合させた。セファロース４Ｂに非特異的に結合した物質
を洗浄除去し、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＢにＭＴ１
８抗体を介して結合したＩＬ−６Ｒを免疫原として使用
した。前記の免疫原を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを１週
間に１回４週間にわたり腹腔内に免疫感作した。次に、
この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そして常
法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞
Ｐ３Ｕ１と融合せしめた。融合した細胞を次のようにし
てスクリーニングした。まず、培養上清及び０．０１ml
のＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を混合して上清中の免疫グロブリンをＰｒｏｔｅｉ
ｎＧセファロースに吸着せしめた。
【０１８８】他方、35Ｓ−メチオニンにより内部標識さ
れた１０11個のＵ２６６細胞を溶解し、そしてＭＴ１８
結合セファロース４Ｂを用いてＩＬ−６Ｒをアフィニテ
ィ精製した。次に、35Ｓ−メチオニンで標識されたＩＬ
−６Ｒを、免疫グロブリンが結合している上記のＰｒｏ
ｔｅｉｎＧセファロースにより免疫沈降せしめ、そして
沈澱をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。その結果、Ｉ
Ｌ−６Ｒに特異的に結合する抗体を生産する１個のハイ
ブリドーマクローンを単離し、そしてＰＭ１と命名し
た。ハイブリドーマＰＭ１は工業技術院微生物工業技術
研究所にブダペスト条約のもとに１９９０年７月１０日
に、微工研条寄第２９９８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９９
８）として寄託された。
【０１８９】参考例３．ハイブリドーマＡＵＫ１２−２
０，ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５の作製 免疫原として可溶性ＩＬ−６Ｒ（ＳＲ ３４４）を、Ｙ
ａｓｕｋａｗａ，Ｋ．らの、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０
８，６７３−６７６，１９９０、に記載されている方法
に従って調製した。すなわち、Ｎ−末端から３４５番目
のコドンが終止コドンにより置換されているＩＬ−６Ｒ
をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＣＥｄ
ｈｆｒ３４４をＣＨＯ（５Ｅ２７）細胞にトランスフェ
クトし、そのトランスフェクトされた細胞を無血清培地
（ＳＦ−０培地、三光純薬）中で培養し、そして得られ
る上清をＨＦ−Ｌａｂｌ系（東ソー）により濃縮しそし
てＢｌｕｅ−５ＰＷカラム及びＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷカ
ラムにより精製した。精製された可溶性ＩＬ−６ＲはＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示した。
【０１９０】雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊマウス（日
本クレア）に、１回の免疫原量を１０μｇ／マウスとし
てＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（Ｂａｃｔｏ Ａｄ
ｊｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｈ３７Ｒａ，Ｄｉｆ
ｃｏ）と共に皮下注射し、そしてそれぞれ最初の注射の
２週間及び３週間後に、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバ
ント（Ｂａｃｔｏ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｉｎｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ，Ｄｉｆｃｏ）と共に同量の免疫
原を第二回及び第三回追加免疫として皮下注射した。
【０１９１】最終免疫感作（第四回注射）は第三回注射
の１週間後に、アジュバントを使わないで尾静脈内に行
った。免疫感作されたマウスから血清試料を採取し、希
釈緩衝液により段階的に希釈し、そしてＧｏｌｄｓｍｉ
ｔｈ，Ｐ．Ｋ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｙ，１１７，５３−６０，１９８１、に記載さ
れている方法に従ってＥＬＩＳＡ法により分析した。す
なわち、ＳＲ３４４（０．１μｇ／ml）によりコートさ
れたプレートを１％ＢＳＡによりブロックし、そして前
記の希釈された試料をそれに加えた。ＳＲ３４４に結合
したマウスＩｇＧをヤギの抗−マウスＩｇＧ／アルカリ
ホスファターゼ（Ａ／Ｐ）（ＺＹＭＥＤ）及びアルカリ
ホスファターゼ用基質（Ｓｉｇｍａ−１０４）を用いて
測定した。血清中の抗−ＳＲ３４４抗体の増加を確認し
た後、最終免疫感作から３日後に、５匹のＢＡＬＢ／ｃ
マウスから脾臓細胞を得た。脾臓細胞及び骨髄細胞株
（Ｐ３Ｕ１）を２５：１の比率で混合し、ＰＥＧ１５０
０を用いて融合し、そして２０００個のウエル中で０．
７〜１．１×１０6 細胞／ウエルの細胞濃度で培養し
た。
【０１９２】ウエルからの上清を、ＳＲ３４４に結合す
るそれらの能力について（Ｒ３４４認識アッセイと称す
る第一次スクリーニング）、及びＳＲ３４４とＩＬ−６
Ｒとの結合を阻害するそれらの能力について（１Ｌ−６
／ｓ１Ｌ６Ｒ結合阻害アッセイ（ＲＢＩＡ）による）ス
クリーニングした。第一次スクリーニングが２４０個の
陽性ウエルをもたらし、そして第二次スクリーニングが
３６個の陽性ウエルをもたらした。上記のＳＲ３４４認
識アッセイは次の様にして行った。ヤギの抗マウスＩｇ
（Ｃａｐｐｅｌ）（１μｇ／ml）によりコートされたプ
レート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）を１％ＢＳＡに
よりブロックし、そして１００μｌ／ウエルのハイブリ
ドーマ培養上清をそれに添加し、次に室温にて１時間イ
ンキュベートした。プレートを洗浄した後、２０ｎｇ／
mlのＳＲ３４４をウエルに加え、そして室温にて１時間
インキュベーションを行った。
【０１９３】上清に由来する固定化された抗体により捕
捉されたＳＲ３４４の量を、ラビット抗ＳＲ３４４Ｉｇ
Ｇ（＃２，５μｇ／ml）、ヤギの抗ラビットＩｇＧ−ア
ルカリホスファターゼ（Ａ／Ｐ）（１：３０００，Ｔａ
ｇｏ）及び基質（１mg／ml，Ｓｉｇｍａ−１０４）の添
加、並びにそれに続く４０５−６００nmでの吸光度の測
定により定量した。前記のＲＢＩＡは次の様にして行っ
た。ＭＴ１８抗体でコートしたプレートを１００ｎｇ／
mlのＳＲ３４４（１００μｌ／ウエル）で満たし、そし
て室温にて１時間インキュベーョンを行った。プレート
を洗浄した後、５０μｌ／ウエルのハイブリドーマ培養
上清及び５０μｌ／ウエルのビオチン−ＩＬ−６結合体
（２０ｎｇ／ml）をそれぞれのウエルに同時に加え、そ
してウエルを室温にて１時間インキュベートした。
【０１９４】ストレプトアビジン−Ａ／Ｐ（１：７００
０，ＰＩＥＲＣＥ）及び対応する基質（Ｓｉｇｍａ−１
０４）を添加し、４０５−６００nmでの吸光度を測定す
ることにより、ＳＲ３４４に結合したビオチン−ＩＬ−
６の量を測定した。最後に、限界希釈法を２回反復する
ことにより陽性クローンを純化し、そしてＳＲ３４４と
ＩＬ−６との結合を阻害する３個のハイブリドーマクロ
ーン、すなわちＡＵＫ１２−２０，ＡＵＫ１４６−１５
及びＡＵＫ６４−７；並びにＳＲ３４４とＩＬ−６との
結合を阻害しないハイブリドーマクローンＡＵＫ１８１
−６を得た。
【０１９５】
【発明の効果】本発明はヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成
ヒト抗体を提供し、この抗体においてはヒト抗体のＶ領
域のＣＤＲがヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロー
ナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている。この再構
成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてマウス
ＣＤＲは抗原性が低いから、本発明の再構成ヒト抗体は
ヒトに対する抗原性が低く、そしてそれ故に療法用とし
て期待される。
【０１９６】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40
【０１９７】配列番号：2 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39
【０１９８】配列番号：３ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40
【０１９９】配列番号：４ 配列の長さ：43 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43
【０２００】配列番号：５ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40
【０２０１】配列番号：６ 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37
【０２０２】配列番号：７ 配列の長さ：41 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41
【０２０３】配列番号：８ 配列の長さ：41 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41
【０２０４】配列番号：９ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35
【０２０５】配列番号：10 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37
【０２０６】配列番号：11 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38
【０２０７】配列番号：12 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27
【０２０８】配列番号：13 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37
【０２０９】配列番号：14 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36
【０２１０】配列番号：15 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37
【０２１１】配列番号：16 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35
【０２１２】配列番号：17 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40
【０２１３】配列番号：18 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37
【０２１４】配列番号：19 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36
【０２１５】配列番号：20 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33
【０２１６】配列番号：21 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40
【０２１７】配列番号：22 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37
【０２１８】配列番号：23 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28
【０２１９】配列番号：24 配列の長さ：393 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p12-k2 特徴： 1..60 sig peptide 61..393 mat peptide
【０２２０】 配列 ATG GAG TCA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 GGT TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACA CAG TCT CCT GCT TCC TTA GGT 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Gly 1 5 10 GTA TCT CTG GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCA TGC AGG GCC AGC AAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 15 20 25 GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA 192 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 GGA CAG ACA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CTT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240 Gly Gln Thr Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC 288 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT 336 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 CAG CAC AGT AGG GAG AAT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG 384 Gln His Ser Arg Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 GAA ATA AAA 393 Glu Ile Lys 110
【０２２１】配列番号：25 配列の長さ：405 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p12-h2 特徴： 1..57 sig peptide 58..405 mat peptide
【０２２２】 配列 ATG GGA TGG AGC GGG ATC TTT CTC TTC CTT CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Gly Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly -15 -10 -5 GTC CAC TCT GAG ATC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG ATG AAG 96 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys -1 5 10 CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 15 20 25 ACT AGC TAT TAC ATA CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT 192 Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATT GGA TAT ATT GAT CCT TTC AAT GGT GGT ACT AGC TAC AAC 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 CAG AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAA TCT TCC AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAT CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCA AGG GGG GGT AAC CGC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 95 100 105 ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 405 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115
【０２２３】配列番号：26 配列の長さ：381 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：pPM-k3 特徴： 1..60 sig peptide 61..381 mat peptide
【０２２４】 配列 ATG GTG TCC TCA GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA 48 Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln -20 -15 -10 -5 GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 1 5 10 GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 15 20 25 ATT AGC AGT TAT TTA AAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GAT GGA ACT ATT 192 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile 30 35 40 AAA CTC CTG ATC TAC TAC ACA TCA AGA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AAC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn 65 70 75 AAC CTG GAG CAA GAA GAC ATT GCC ACT TAC TTT TGC CAA CAG GGT AAC 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 80 85 90 ACG CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAT 381 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 95 100 105
【０２２５】配列番号：27 配列の長さ：411 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖鎖 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：pPM-h1 特徴： 1..54 sig peptide 55..411 mat peptide
【０２２６】 配列 ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGG CTG TTC ACA GCC TTT CCT GGT ATC 48 Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile -15 -10 -5 CTG TCT GAT GTG CAG CTT CAG GAG TCG GGA CCT GTC CTG GTG AAG CCT 96 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro -1 5 10 TCT CAG TCT CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC ACT GGC TAC TCA ATC ACC 144 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 15 20 25 30 AGT GAT CAT GCC TGG AGC TGG ATC CGG CAG TTT CCA GGA AAC AAA CTG 192 Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45 GAG TGG ATG GGC TAC ATA AGT TAC AGT GGT ATC ACT ACC TAC AAC CCA 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro 50 55 60 TCT CTC AAA AGT CGA ATC TCT ATC ACT CGA GAC ACA TCC AAG AAC CAG 288 Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 TTC TTC CTA CAG TTG AAT TCT GTG ACT ACT GGG GAC ACG TCC ACA TAT 336 Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ser Thr Tyr 80 85 90 TAC TGT GCA AGA TCC CTA GCT CGG ACT ACG GCT ATG GAC TAC TGG GGT 384 Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 95 100 105 110 CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 411 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
【０２２７】配列番号：28 配列の長さ：393 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p64-k4 特徴： 1..60 sig peptide 61..393 mat peptide
【０２２８】 配列 ATG GAG TCA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 GGT TCC ACA GGT GAC ATT GTG TTG ATC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala -1 5 10 GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 15 20 25 GTT GAT AGT TAT GGC AAT AGT TTT ATG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA 192 Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 GGG ATC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAC TTC ACC 288 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 65 70 75 CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT TAC TGT 336 Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 80 85 90 CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG 384 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 95 100 105 GAG CTG AAA 393 Glu Leu Lys 110
【０２２９】配列の番号：29 配列の長さ：417 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p64-h2 特徴： 1..57 sig peptide 58..417 mat peptide
【０２３０】 配列 ATG GGA TGG AGC GGG GTC TTT ATC TTC CTC CTG TCA GTA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly -15 -10 -5 GTC CAC TCC CAG GTT CAA TTG CAG CAG TCT GGA GCT GAG TTG ATG AAG 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys -1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATC TCC TGC AAG GCT ACT GGC TAC ACA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 AGT AGT TAT TGG ATA GTG TGG ATA AAG CAG AGG CCT GGA CAT GGC CTT 192 Ser Ser Tyr Trp Ile Val Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATT GGA GAG ATT TTA CCT GGA ACC GGT AGT ACT AAC TAC AAT 240 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn 50 55 60 GAG AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTC ACT GCA GAT ACA TCT TCC AAC 288 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCC GTC 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCA AGT CTA GAC AGC TCG GGC TAC TAT GCT ATG GAC TAT 384 Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 95 100 105 TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 417 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 120
【０２３１】配列の番号：30 配列の長さ：381 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p146-k3 特徴： 1..60 sig peptide 61..381 mat peptide
【０２３２】 配列 ATG GTG TCC ACA CCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG ATC TGT TTT CAA 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Ile Cys Phe Gln -20 -15 -10 -5 GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser -1 5 10 GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 15 20 25 ATT AGT AAT TAT TTA AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAT GGA ACT GTT 192 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 30 35 40 AAA CTC CTG ATC TAC TAT ACA TCA AGA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AGC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 AAC CTG GAG CAA GAA GAT ATT GCC AGT TAC TTT TGC CAA CAG GGT TAT 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 80 85 90 ACG CCT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG TTG GAA ATC AAA 381 Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 95 100 105
【０２３３】配列番号：31 配列の長さ：402 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 直接の起源 クローン：p146-h1 特徴： 1..51 sig peptide 52..402 mat peptide
【０２３４】 配列 ATG GAG CTG GAT CTT TAT CTT ATT CTG TCA GTA ACT TCA GGT GTC TAC 48 Met Glu Leu Asp Leu Tyr Leu Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly Val Tyr -15 -10 -5 TCA CAG GTT CAG CTC CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTG GCA AGA CCT GGG 96 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly -1 5 10 15 GCT TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT ACT AAC 144 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 20 25 30 TAC TGG GTG CAG TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG GAA TGG 192 Tyr Trp Val Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 ATT GGG TCT ATT TAT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG AAC ACT CAG AAG 240 Ile Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Asn Thr Gln Lys 50 55 60 TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAT AAA TCC TCC ATC ACA GCC 288 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala 65 70 75 TAC ATG CAA CTC ACC AGC TTG GCA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC 336 Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 80 85 90 95 TGT GCA AGA TCG ACT GGT AAC CAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC 384 Cys Ala Arg Ser Thr Gly Asn His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ACT CTC ACA GTC TCC TCA 402 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
【０２３５】配列番号：32 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACAAAGCTTC CACCATGGAG TCAGACACAC TCCTG 35
【０２３６】配列番号：33 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGCTAAGCTT CCACCATGGG ATGGAGCGGG ATCTTT 36
【０２３７】配列番号：34 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAGCT TGGTC 35
【０２３８】配列番号：35 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTTGGATCCA CTCACCTGCA GAGACAGTTA CCAGAG 36
【０２３９】配列番号：36 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTGGATCCA CTCACGATTT ATTTCCAGCT TGGTC 35
【０２４０】配列番号：37 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAGCT TGGTC 35
【０２４１】配列番号：38 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACAAAGCTTC CACCATGGTG TCCTCAGCTC AGTTCC 36
【０２４２】配列番号：39 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGTTAGATCT ACTCACCTGA GGAGACAGTG ACTGAGGTT 39
【０２４３】配列番号：40 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTCTAAGCTT CCACCATGAG AGTGCTGATT CTTTTG 36
【０２４４】配列番号：41 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TACGCAAACC GCCTCTC 17
【０２４５】配列番号：42 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAGTGCACCA TATGCGGT 18
【０２４６】配列番号：43 配列の長さ：55 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACCGTGTCTG GCTACACCTT CACCAGCGAT CATGCCTGGA GCTGGGTGAG ACAGC 55
【０２４７】配列番号：44 配列の長さ：63 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGAGTGGATT GGATACATTA GTTATAGTGG AATCACAACC TATAATCCAT CTCTCAAATC CAG 63
【０２４８】配列番号：45 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TATTATTGTG CAAGATCCCT AGCTCGGACT ACGGCTATGG ACTACTGGGG TCAA 54
【０２４９】配列番号：46 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTGACAATGC TGAGAGACAC CAGCAAG 27
【０２５０】配列番号：47 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTGTCCACT CCGATGTCCA ACTG 24
【０２５１】配列番号：48 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTCTTGAGT GGATGGGATA CATTAGT 27
【０２５２】配列番号：49 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTGTCTGGCT ACTCAATTAC CAGCATCAT 29
【０２５３】配列番号：50 配列の長さ：48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGTAGAGCCA GCCAGGACAT CAGCAGTTAC CTGAACTGGT ACCAGCAG 48
【０２５４】配列番号：51 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCTACTACA CCTCCAGACT GCACTCTGGT GTGCCAAGCA GA 42
【０２５５】配列番号：52 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ACCTACTACT GCCAACAGGG TAACACGCTT CCATACACGT TCGGCCAAGG 50
【０２５６】配列番号：53 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCGGTACCG ACTACACCTT CACCATC 27
【０２５７】配列番号：54 配列の長さ：706 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：pUC-RVh-PMlf
【０２５８】特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM
-1抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン(f)及びそれをコードす
る遺伝子 アミノ酸 -19−-1：leader アミノ酸 １−30：FR1 アミノ酸 31−36：CDR1 アミノ酸 37−50：FR2 アミノ酸 51−66：CDR2 アミノ酸 67−98：FR3 アミノ酸 99−108:CDR3 アミノ酸 109−119:FR4 ヌクレオチド １−６ Hind III 部位 ヌクレオチド 54−135 intron ヌクレオチド 258−348 intron/aberrant splicing ヌクレオチド 505−706 intron ヌクレオチド 701−706 Bam HI 部位
【０２５９】 配列 AAGCTTC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT 49 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala -15 -10 ACA G GTAAGGGGCT CACAGTAGCA GGCTTGAGGT CTGGACATAT ATATGGGTGA 103 Thr -5 CAATGACATC CACTTTGCCT TTCTCTCCAC AG GT GTC CAC TCC CAG GTC CAA 155 Gly Val His Ser Gln Val Gln 1 CTG CAG GAG AGC GGT CCA GGT CTT GTG AGA CCT AGC CAG ACC CTG AGC 203 Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser 5 10 15 CTG ACC TGC ACC GTG TCT GGC TAC TCA ATT ACC AGC GAT CAT GCC TGG 251 Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp 20 25 30 35 AGC TGG GTG AGA CAG CCA CCT GGA CGA GGT CTT GAG TGG ATT GGA TAC 299 Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr 40 45 50 ATT AGT TAT AGT GGA ATC ACA ACC TAT AAT CCA TCT CTC AAA TCC AGA 347 Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg 55 60 65 GTG ACA ATG CTG AGA GAC ACC AGC AAG AAC CAG TTC AGC CTG AGA CTC 395 Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu 70 75 80 AGC AGC GTG ACA GCC GCC GAC ACC GCG GTT TAT TAT TGT GCA AGA TCC 443 Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 85 90 95 CTA GCT CGG ACT ACG GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGC AGC CTC GTC 491 Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val 100 105 110 115 ACA GTC TCC TCA G GTGAGTCCTT ACAACCTCTC TCTTCTATTC AGCTTAAATA 544 Thr Val Ser Ser GATTTTACTG CATTTGTTGG GGGGGAAATG TGTGTATCTG AATTTCAGGT CATGAAGGAC 604 TAGGGACACC TTGGGAGTCA GAAAGGGTCA TTGGGAGCCC GGGCTGATGC AGACAGACAT 664 CCTCAGCTCC CAGACTTCAT GGCCAGAGAT TTATAGGGAT CC 706
【０２６０】配列番号：55 配列の長さ：506 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：pUC-RVl-PMla
【０２６１】特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM
-1抗体のＬ鎖Ｖ領域バージョン(a)及びそれをコードす
る遺伝子 アミノ酸 -19−-1：leader アミノ酸 １−23：FR1 アミノ酸 24−34：CDR1 アミノ酸 35−49：FR2 アミノ酸 50−56：CDR2 アミノ酸 57−88：FR3 アミノ酸 89−97：CDR3 アミノ酸 98−117:FR4 ヌクレオチド １−６ : Hind III 部位 ヌクレオチド 54−135: intron ヌクレオチド 268−376: intron/aberrant splicing ヌクレオチド 469−506: intron ヌクレオチド 501−506: Bam HI 部位
【０２６２】 配列 AAGCTTC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT 49 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala -15 -10 ACA G GTAAGGGGCT CACAGTAGCA GGCTTGAGGT CTGGACATAT ATATGGGTGA 103 Thr -5 CAATGACATC CACTTTGCCT TTCTCTCCAC AG GT GTC CAC TCC GAC ATC CAG 155 Gly Val His Ser Asp Ile Gln 1 ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG 203 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 5 10 15 ACC ATC ACC TGT AGA GCC AGC CAG GAC ATC AGC AGT TAC CTG AAT TGG 251 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 20 25 30 35 TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TAC ACC 299 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr 40 45 50 TCC AGA CTG CAC TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC 347 Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 55 60 65 GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC 395 Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile 70 75 80 GCT ACC TAC TAC TGC CAA CAG GGT AAC ACG CTT CCA TAC ACG TTC GGC 443 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly 85 90 95 CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C GTGAGTAGAA TTTAAACTTT 488 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 GCTTCCTCAG TTGGATCC 506
【０２６３】配列番号：56 配列の長さ：438 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：pUC-RVh-PMlf-4
【０２６４】特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM
-1抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン(f)及びそれをコードす
る遺伝子であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸 -19−-1：leader アミノ酸 １−30：FR1 アミノ酸 31−36：CDR1 アミノ酸 37−50：FR2 アミノ酸 51−66：CDR2 アミノ酸 67−98：FR3 アミノ酸 99−108:CDR3 アミノ酸 109−119:FR4 ヌクレオチド １−６ : Hind III 部位 ヌクレオチド 432−438: Bam HI 部位
【０２６５】 配列 AAGCTTCCAC C ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA 50 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr -15 -10 GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTG CAG GAG AGC GGT CCA GGT 98 Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly -5 1 5 10 CTT GTG AGA CCT AGC CAG ACC CTG AGC CTG ACC TGC ACC GTG TCT GGC 146 Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 15 20 25 TAC TCA ATT ACC AGC GAT CAT GCC TGG AGC TGG GTT CGC CAG CCA CCT 194 Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro 30 35 40 GGA CGA GGT CTT GAG TGG ATT GGA TAC ATT AGT TAT AGT GGA ATC ACA 242 Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr 45 50 55 ACC TAT AAT CCA TCT CTC AAA TCC AGA GTG ACA ATG CTG AGA GAC ACC 290 Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr 60 65 70 AGC AAG AAC CAG TTC AGC CTG AGA CTC AGC AGC GTG ACA GCC GCC GAC 338 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 75 80 85 90 ACC GCG GTT TAT TAT TGT GCA AGA TCC CTA GCT CGG ACT ACG GCT ATG 386 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met 95 100 105 GAC TAC TGG GGT CAA GGC AGC CTC GTC ACA GTC TCC TCA G GTGAGTGGAT 436 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 CC 438
【０２６６】配列番号：57 配列の長さ：402 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン：pUC-RVl-PMla
【０２６７】特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM
-1抗体のＬ鎖Ｖ領域バージョン(a)及びそれをコードす
る遺伝子であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸 -19−-1:leader アミノ酸 １−23：FR1 アミノ酸 24−34：CDR1 アミノ酸 35−49：FR2 アミノ酸 50−56：CDR2 アミノ酸 57−88：FR3 アミノ酸 89−97：CDR3 アミノ酸 98−107:FR4 ヌクレオチド １−６ : Hind III 部位 ヌクレオチド 397−402: Bam HI 部位
【０２６８】 配列 AAGCTTCCAC C ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA 50 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr -15 -10 GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 98 Ala Thr Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser -5 1 5 10 CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AGA GCC AGC 146 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 15 20 25 CAG GAC ATC AGC AGT TAC CTG AAT TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG 194 Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 30 35 40 GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TAC ACC TCC AGA CTG CAC TCT GGT GTG 242 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val 45 50 55 CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC 290 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 60 65 70 ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAA CAG 338 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 75 80 85 90 GGT AAC ACG CTT CCA TAC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC 386 Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 AAA C GTGAGTGGAT CC 402 Lys
【０２６９】配列番号：58 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAGGATCCA CTCACCTGAG GAGACTGTGA CGAGGC 36
【０２７０】配列番号：59 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCAAGCTTC CACCATGGGA TGGAGCTGTA TC 32
【０２７１】配列番号：60 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATGGATCCA CTCACGTTTG ATTTCCACCT 30
【０２７２】配列番号：61 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CATGCCTGGA GCTGGGTTCG CCAGCCACCT GGA 33
【０２７３】配列番号：62 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCAGGTGGC TGGCGAACCC AGCTCCAGGC ATG 33
【０２７４】配列番号：63 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGCAGAAGC CAGGAAAGGC TCCAAAGCTG 30
【０２７５】配列番号：64 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGCTTTGGA GCCTTTCCTG GCTTCTGCTG 30
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の抗体ペプチドの発現のために
有用な、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモ
ーター／エンハンサー系を含んで成る発現ベクターを示
す。
【図２】図２は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する本発明のキ
メラ抗体ＡＵＫ１２−２０の能力の確認のためのＥＬＩ
ＳＡの結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を
阻害する本発明のキメラ抗体ＡＵＫ１２−２０の能力の
確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＩＬ−６Ｒへの本発明のキメラ抗体Ｐ
Ｍ１ａ及びＰＭ１ｂの結合についてのＥＬＩＳＡの結果
を示すグラフである。
【図５】図５は、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害
する本発明のキメラ抗体ＰＭ１ａ及びＰＭ１ｂの能力を
試験するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の
第一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグ
ラムである。
【図７】図７は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の
第一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグ
ラムである。
【図８】図８は、Ｈ鎖の発現のために有用な、ヒト・エ
ロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）プロ
モーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＨ
ＥＦ−１２ｈ−ｇγ１の作製の過程を示す。
【図９】図９は、Ｈ鎖の発現のために有用な、ＨＥＦ−
１αプロモーター／エンハンサー系を含んで成る発現プ
ラスミドＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋの作製の過程を示す。
【図１０】図１０は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅
のための欠陥ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー配列
に連結されたジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆ
ｒ）及びＨＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含んで
成る発現プラスミドＤＨＦＲ−ＰＭｈ−ｇγ１の作製の
過程を示す。
【図１１】図１１は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅
のための欠陥ＳＶ４０−プロモーター／エンハンサー配
列に連結されたｄｈｆｒ遺伝子及びＥＦ１αプロモータ
ー／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＤＨＦＲ
−ΔＥ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆの作製の過程を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＩＬ−６Ｒへの結合について
の再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン
「ａ」及び「ｂ」の能力を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ヒトＩＬ−６Ｒへの結合について
の再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン
「ｆ」＋再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」の能力を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＩＬ−６Ｒへの再構成ヒトＰＭ−
１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」＋再構成ヒトＰＭ
−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の結合を阻害する
ヒトＩＬ−６の能力を示すグラフである。
【図１５】図１５は、それぞれＬ鎖及びＨ鎖の発現のた
めに有用な、ヒトＥＦＩ−αプロモーター／エンハンサ
ーを含んで成る発現プラスミドＨＥＦ−ＶL −ｇｋ及び
ＨＥＦ−ＶH −ｇγ１を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ // Ｃ０７Ｋ 15/28 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 メアリー マーガレット ベンディッグ イギリス国， ロンドン エヌダブリュ６ １ティーエックス，ウエスト ハンプス テッド， ソレント ロード 64 (72)発明者 スティーブン タレン ジョーンズ イギリス国， ハートフォードシャイヤー ダブリューディー７ ８エイチエー， ラッドレット， ザ クローズ 10 (72)発明者 ホセ ウィリアム サルダナ イギリス国， ミドルセックス イーエヌ １ １ティーイー，エンフィールド， リ ンカーン ウェイ 22

Claims (49)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトインターロイキン−６受容体（ＩＬ
    −６Ｒ）に対するマウスモノクローナル抗体のライト鎖
    （Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）。
  2. 【請求項２】 配列番号２４，２６，２８及び３０のい
    ずれかに示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載
    のＬ鎖Ｖ領域。
  3. 【請求項３】 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロ
    ーナル抗体のヘビー鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域。
  4. 【請求項４】 配列番号２５，２７，２９及び３１のい
    ずれかに示されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載
    のＨ鎖Ｖ領域。
  5. 【請求項５】 （１）ヒトＬ鎖定常領域（Ｃ領域）、及
    びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の
    Ｌ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに （２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマ
    ウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ
    鎖；を含んで成るキメラ抗体。
  6. 【請求項６】 前記マウスＬ鎖Ｖ領域が配列番号２４，
    ２６，２８及び３０のいずれかに示されるアミノ酸配列
    を有し、そして前記マウスＨ鎖Ｖ領域が配列番号２５，
    ２７，２９及び３１のいずれかに示されるアミノ酸配列
    を有する、請求項５に記載のキメラ抗体。
  7. 【請求項７】 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロ
    ーナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）。
  8. 【請求項８】 配列番号２４，２６，２８及び３０のい
    ずれかに示されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列
    の範囲が表６により定義される、請求項７に記載のＣＤ
    Ｒ。
  9. 【請求項９】 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクロ
    ーナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ。
  10. 【請求項１０】 配列番号２５，２７，２９及び３１の
    いずれかに示されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配
    列の範囲が表６により定義される、請求項９に記載のＣ
    ＤＲ。
  11. 【請求項１１】 表３及び表４にＲＶH ａ，ＲＶH ｂ，
    ＲＶH ｃ，ＲＶH ｄ，ＲＶH ｅ，又はＲＶH ｆとして示
    されるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のＣＤ
    Ｒ。
  12. 【請求項１２】 （１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワー
    ク領域（ＦＲ）、及び（２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマ
    ウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含ん
    で成るヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成（ｒｅｓｈ
    ａｐｅｄ）ヒトＬ鎖Ｖ領域。
  13. 【請求項１３】 前記ＣＤＲが配列番号２４，２６，２
    ８及び３０のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、
    該アミノ酸配列の範囲が表６により定義される、請求項
    １２に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域。
  14. 【請求項１４】 前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩに由来す
    る、請求項１２に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域。
  15. 【請求項１５】 （１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
    （２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗
    体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで成る、ヒトＩＬ−６
    Ｒに対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
  16. 【請求項１６】 前記ＣＤＲが配列番号２５，２７，２
    ９及び３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、
    該アミノ酸配列の範囲が表６により定義される、請求項
    １５に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
  17. 【請求項１７】 前記ＦＲがヒト抗体ＮＥＷに由来す
    る、請求項１５に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
  18. 【請求項１８】 表３及び表４にＲＶH ａ，ＲＶH ｂ，
    ＲＶH ｃ，ＲＶH ｄ，ＲＶH ｅ，又はＲＶH ｆとして示
    されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の再構
    成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
  19. 【請求項１９】 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
    （２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウ
    スモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ
    領域、を含んで成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
    Ｒ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル
    抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成
    るＨ鎖；を含んで成るヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒ
    ト抗体。
  20. 【請求項２０】 前記Ｌ鎖ＣＤＲが配列番号２４，２
    ６，２８及び３０のいずれかに示されるアミノ酸配列を
    有し；該アミノ酸配列の範囲が表６に定義される通りで
    あり；Ｈ鎖ＣＤＲが配列番号２５，２７，２９及び３１
    のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸
    配列の範囲が表６において定義される通りであり；ヒト
    Ｌ鎖ＦＲがＲＥＩに由来し；前記ヒトＨ鎖ＦＲがＮＥＷ
    に由来し、前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトγ−ＩＣ領域であ
    り；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトκＣ領域である、
    請求項１９に記載の再構成ヒト抗体。
  21. 【請求項２１】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が表３及び表４にＲＶ
    H ａ，ＲＶH ｂ，ＲＶH ｃ，ＲＶH ｄ，ＲＶH ｅ，又は
    ＲＶH ｆとして示されるアミノ酸配列を有する、請求項
    １９に記載の再構成ヒト抗体。
  22. 【請求項２２】 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノク
    ローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号２４，２
    ６，２８及び３０のいずれかに示されるアミノ酸配列を
    有する、請求項２２に記載のＤＮＡ。
  24. 【請求項２４】 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノク
    ローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
  25. 【請求項２５】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号２５，２
    ７，２９及び３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を
    有する、請求項２４に記載のＤＮＡ。
  26. 【請求項２６】 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノク
    ローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮ
    Ａ。
  27. 【請求項２７】 前記ＣＤＲが配列番号２４，２６，２
    ８及び３０のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、
    該アミノ酸配列の範囲が表３及び表４に定義される請求
    項２６に記載のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
  28. 【請求項２８】 ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノク
    ローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮ
    Ａ。
  29. 【請求項２９】 前記ＣＤＲが配列番号２５，２７，２
    ９及び３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、
    該アミノ酸配列の範囲が表６において定義される、請求
    項２８に記載のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
  30. 【請求項３０】 前記ＣＤＲが表３及び表４においてＲ
    ＶH ａ，ＲＶH ｂ，ＲＶH ｃ，ＲＶH ｄ，ＲＶH ｅ，又
    はＲＶH ｆとして示されるアミノ酸配列を有する、請求
    項２８に記載のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
  31. 【請求項３１】 （１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
    （２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗
    体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで成る、ヒトＩＬ−６
    Ｒに対する抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤ
    ＮＡ。
  32. 【請求項３２】 前記ＣＤＲが配列番号２４，２６，２
    ８及び３０のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、
    該アミノ酸配列の範囲が表６に定義される、請求項３１
    に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
  33. 【請求項３３】 前記ＦＲがＲＥＩに由来する、請求項
    ３１に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮ
    Ａ。
  34. 【請求項３４】 （１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
    （２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗
    体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで成る、ヒトＩＬ−６
    Ｒに対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤ
    ＮＡ。
  35. 【請求項３５】 前記ＣＤＲが配列番号２５，２７，２
    ９及び３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、
    該アミノ酸配列の範囲が表６に定義される、請求項３４
    に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
  36. 【請求項３６】 前記ＦＲがＮＥＷに由来する、請求項
    ３４に記載の再構成Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
  37. 【請求項３７】 前記ＦＲが表３及び表４にＲＶH ａ，
    ＲＶH ｂ，ＲＶH ｃ，ＲＶH ｄ，ＲＶH ｅ，又はＲＶH
    ｆとして示されるアミノ酸配列を有する、請求項３４に
    記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
  38. 【請求項３８】 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに （２）ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモ
    ノクローナル抗体のＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域；を
    含んで成るヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＬ
    鎖をコードするＤＮＡ。
  39. 【請求項３９】 （１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに （２）ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモ
    ノクローナル抗体のＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域；を
    含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒト
    Ｈ鎖をコードするＤＮＡ。
  40. 【請求項４０】 請求項２２，２４，２６，２８，３
    １，３４，３８及び３９のいずれか１項に記載のＤＮＡ
    を含んで成るベクター。
  41. 【請求項４１】 請求項２２，２４，２６，２８，３
    １，３４，３８及び３９のいずれか１項に記載のＤＮＡ
    を含んで成るベクターにより形質転換された宿主細胞。
  42. 【請求項４２】 配列番号５７に示されるヌクレオチド
    配列を有する請求項３１に記載のＤＮＡ。
  43. 【請求項４３】 配列番号５６に示されるヌクレオチド
    配列を有する請求項３４に記載のＤＮＡ。
  44. 【請求項４４】 前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号５７に示さ
    れるヌクレオチド配列を有する請求項３８に記載のＤＮ
    Ａ。
  45. 【請求項４５】 前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号５６に示さ
    れるヌクレオチド配列を有する請求項３９に記載のＤＮ
    Ａ。
  46. 【請求項４６】 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；及び （２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗
    体のＬ鎖Ｖ領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対す
    る抗体のキメラＬ鎖をコードするＤＮＡ。
  47. 【請求項４７】 （１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；及び （２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗
    体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する
    抗体のキメラＨ鎖をコードするＤＮＡ。
  48. 【請求項４８】 ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体の
    製造方法であって、 請求項４６に記載のＤＮＡを含んで成る発現ベクター及
    び請求項４７に記載のＤＮＡを含んで成る発現ベクター
    により同時形質転換された宿主細胞を培養し、そして目
    的とする抗体を回収する、 段階を含んで成る方法。
  49. 【請求項４９】 ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗
    体の製造方法であって、 請求項３８に記載のＤＮＡを含んで成る発現ベクター及
    び請求項３９に記載のＤＮＡを含んで成る発現ベクター
    により同時形質転換された宿主細胞を培養し、そして目
    的とする抗体を回収する、ことを含んで成る方法。
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NL300383C NL300383I2 (nl) 1991-04-25 2009-04-02 Geconstitueerd menselijk antilichaam tegen menselijke interleukine 6-receptor
LU91556C LU91556I2 (fr) 1991-04-25 2009-04-24 Anticorps humains reconstitués dirigés contre un récepteur de l'interleukine 6 humaine - TOCILIZUMAB

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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005090405A1 (ja) * 2004-03-24 2005-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha インターロイキン－６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ
WO2007119623A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-25 Riken Ｇ蛋白質共役型受容体およびそのリガンドの新規用途
WO2008018472A1 (fr) 2006-08-08 2008-02-14 Kyoto University Nouvel anticorps monoclonal et son utilisation
JP2008297315A (ja) * 1994-10-21 2008-12-11 Chuzo Kishimoto Ｉｌ−６産生に起因する疾患の治療剤
JP2009539349A (ja) * 2006-06-02 2009-11-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体
WO2010079850A2 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Agent for prophylaxis or treatment of cancer
WO2010098166A1 (ja) 2009-02-24 2010-09-02 国立大学法人宮崎大学 細胞接着阻害剤およびその用途
WO2012090895A1 (ja) 2010-12-27 2012-07-05 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 ヒトパピローマウィルス（hpv）ｌ２蛋白質を認識するモノクローナル抗体とそれを使用したhpv中和抗体価測定法
JP2017019799A (ja) * 2009-10-26 2017-01-26 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft グリコシル化された免疫グロブリンの調製方法
US10744201B2 (en) 2003-04-28 2020-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating rheumatoid arthritis with a human IL-6 receptor antibody and methotrexate
WO2021006212A1 (ja) 2019-07-08 2021-01-14 テルモ株式会社 ハイブリドーマおよびその製造方法、並びにモノクローナル抗体およびその製造方法

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008297315A (ja) * 1994-10-21 2008-12-11 Chuzo Kishimoto Ｉｌ−６産生に起因する疾患の治療剤
US10744201B2 (en) 2003-04-28 2020-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating rheumatoid arthritis with a human IL-6 receptor antibody and methotrexate
US8734800B2 (en) 2004-03-24 2014-05-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
US9902777B2 (en) 2004-03-24 2018-02-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
JPWO2005090405A1 (ja) * 2004-03-24 2008-04-17 中外製薬株式会社 インターロイキン−６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ
US8398980B2 (en) 2004-03-24 2013-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
WO2005090405A1 (ja) * 2004-03-24 2005-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha インターロイキン－６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ
WO2007119623A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-25 Riken Ｇ蛋白質共役型受容体およびそのリガンドの新規用途
JP2009539349A (ja) * 2006-06-02 2009-11-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体
WO2008018472A1 (fr) 2006-08-08 2008-02-14 Kyoto University Nouvel anticorps monoclonal et son utilisation
WO2010079850A2 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Agent for prophylaxis or treatment of cancer
WO2010098166A1 (ja) 2009-02-24 2010-09-02 国立大学法人宮崎大学 細胞接着阻害剤およびその用途
JP2017019799A (ja) * 2009-10-26 2017-01-26 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft グリコシル化された免疫グロブリンの調製方法
JP2019001796A (ja) * 2009-10-26 2019-01-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ グリコシル化された免疫グロブリンの調製方法
US10501769B2 (en) 2009-10-26 2019-12-10 Hoffmann-La Roche Inc. Method for the production of a glycosylated immunoglobulin
US11021728B2 (en) 2009-10-26 2021-06-01 Hoffmann-La Roche Inc. Method for the production of a glycosylated immunoglobulin
US11136610B2 (en) 2009-10-26 2021-10-05 Hoffmann-La Roche Inc. Method for the production of a glycosylated immunoglobulin
US11377678B2 (en) 2009-10-26 2022-07-05 Hoffman-La Roche Inc. Method for the production of a glycosylated immunoglobulin
WO2012090895A1 (ja) 2010-12-27 2012-07-05 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 ヒトパピローマウィルス（hpv）ｌ２蛋白質を認識するモノクローナル抗体とそれを使用したhpv中和抗体価測定法
WO2021006212A1 (ja) 2019-07-08 2021-01-14 テルモ株式会社 ハイブリドーマおよびその製造方法、並びにモノクローナル抗体およびその製造方法

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