JPH05229913A - 鞘翅類に対して活性のある新規なバシラス・チューリンゲンシス単離体、及び鞘翅類に活性の毒素をコード化した遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は新規な微生物及び鞘翅目昆虫の害虫
に対し活性のある新規な毒素蛋白質をコ−ドした遺伝子
に関する。 【構成】 鞘翅目の害虫は作物、例えばトウモロコシに
大きな被害を与える。本発明の新規なバシラス・チュー
リンゲンシス微生物はB.t.ＰＳ５０Ｃと呼ばれる。この
微生物又はその突然変異菌の胞子又は結晶は種々の環境
で鞘翅類の害虫を抑制するのに有用である。本発明の新
規な遺伝子はその新規な毒素蛋白質を表現できる種々の
宿主を形質転換するのに使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

【０００１】本発明は鞘翅類に対して活性のある新規な
バシラス・チューリンゲンシス単離体、及び鞘翅類に活
性の毒素をコード化した遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】バシラス・チューリンゲンシス(Bacillu
s thuringiensis)(B.t.)はδ-エンドトキシンと呼ばれ
る昆虫毒素を生産する。これはB.t.胞子形成細胞によっ
て合成される。この毒素はこれに感受性のある昆虫の幼
虫に結晶型で摂取されると、昆虫の腸液プロテアーゼに
よって生物学的に活性の部分に転換される。一次標的は
昆虫の腸上皮細胞であり、これが急速に破壊される。

【０００３】B.t.の報告された活性スペクトルは、鱗翅
目（Lepidoptera）内の昆虫種を包含し、その多くは農
林業の主要害虫である。活性スペクトルはまた、蚊とブ
ヨを含む双翅目(Diptera)の昆虫を包含している。コウ
チ・ティー・エル(Couch, T.L.)(1980年)「バシラス・チ
ューリンゲンシス・バラエティ・イスラエレンシス(B.t
huringiensis var. israelensis)の蚊病原性」Developm
ents in Industrial Microbiology(工業微生物学の発
展)22巻61-76頁；ビーグル・シー・シー(Beegle,C.C.)
(1978年)「農業生態系における昆虫体内細菌の使用」De
velopments in Industrial Microbiology(工業微生物学
の発展)20巻97-104頁を参照のこと。クレイグ等、Z.an
g.Ent.(1983) 96:500-508は、鞘翅目(Coleoptera)に於
ける二つの甲虫に対し活性であると報告されているバシ
ラス・チューリンゲンシス var. テネブリオニスと命名
されるB.t.単離体を記載している。これらはコロラドポ
テトビ−トル、レプチノタルサ デセムリネアタ（Lepti
notarsa decemlineata）及びアゲラスティカ アルニ（A
gelastica alni）である。

【０００４】ヨ−ロッパ特許出願0 202 739に鞘翅類に
活性の新規なB.t.単離体が開示されている。これはバシ
ラス・チューリンゲンシスvar.サンジエゴ(B.t.sd.）と
して知られる。米国特許4,966,765は鞘翅類に活性のバ
シラス・チューリンゲンシス単離体B.t.ＰＳ８６Ｂ１を
開示している。ヨ−ロッパ特許出願0 337 604も鞘翅類
に対し活性の新規なB.t.単離体を開示している。この単
離体はB.t.ＰＳ４３Ｆである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】鞘翅類に活性の菌株、
例えばB.t.sd.、B.t.ＰＳ８６Ｂ１及びB.t.ＰＳ４３Ｆ
は葉を食べる甲虫を抑制するのに使用できる。例えば、
コロラドポテトビ−トル（Leptinotarsa decemlineat
a）はB.t.sd.のδ-エンドトキシンに感受性であり、処
理された葉上の胞子／結晶製剤の十分な投与量を食べる
と幼虫が殺される。

【０００６】幾つかの作物がノミ甲虫によって攻撃され
る。これらの甲虫はクリソメリダエ（Chrysomelidae）
科、デセムリネアタ（decemlineata）に属する。成虫は
葉を食べることによって広範な被害を生じ得る。

【０００７】

【課題を解決する手段】本発明は新規なバシラス・チュ
ーリンゲンシス（B.t.）単離体及び新規な鞘翅類に対し
活性の蛋白質をコ−ドしているそれからのクロ−ン化さ
れた遺伝子に関する。新規なB.t.単離体はここでバシラ
ス・チューリンゲンシスＰＳ５０Ｃ（B.t.ＰＳ５０Ｃ）
として知られ、これまでコロラドポテトビ−トル（Lept
inotarsadecemlineata）に対して活性であることが示さ
れている。本発明の新規なδ-エンドトキシン遺伝子は
≒130 kDa(およそ130キロダルトン)の蛋白質をコ−ドす
る。遺伝子のヌクレオチド配列（オ−プンリ−ディング
フレ−ムのみ）は配列ＩＤNo.１に示されている。毒素
の予測ペプチド配列は配列ＩＤ No.２に示されている。

【０００８】本発明はまたB.t.ＰＳ５０Ｃと同じ殺虫性
を実質的に有しているB.t.ＰＳ５０Ｃの突然変異菌を含
んでいる。突然変異菌の製造手順は微生物技術で良く知
られている。紫外線光及びニトロソグアニジンがこの目
的に広く使用されている。

【０００９】更に本発明は実質的に無傷のB.t.ＰＳ５０
Ｃ細胞の処理及び本発明の遺伝子を含有する組替え細胞
を含んでおり、実質的に無傷の細胞が標的害虫の環境に
適用されたとき、殺虫活性を長期化させる。そのような
処理は、この技術が殺虫剤の性質に悪影響を与えず、殺
虫剤を保護する細胞の能力を消失させない限りに於いて
は、化学的又は物理的な手段によるものであり得るか、
又は化学的及び物理的手段の組合せであり得る。処理さ
れた細胞は殺虫毒素に対する保護被膜として作用する。
毒素は、標的昆虫によって摂取されると、そのまま作用
するべく利用出来る。

【００１０】配列の簡単な記載 配列ＩＤ No.１は新規は本発明の遺伝子のヌクレオチド
配列（オ−プンリ−ディングフレ−ムのみ）である。配
列ＩＤ No.２は毒素の予想ペプチド配列である。

【００１１】本発明の開示の詳細 本発明のバシラス・チューリンゲンシス単離体は、生物
学的に純粋な形態で以下の特性をもつ。

【００１２】B.t.ＰＳ５０Ｃの特徴 集落形態--B.t.に典型的な、大集落で表面はくすんでい
る。 増殖期の細胞形態--B.t.に典型的。 培養方法--B.t.に典型的な方法。 鞭毛の血清型--ＰＳ５０Ｃはセロタイプ１８，クマモト
エンシスに属する。 結晶の形態--球。 ＲＦＬＰ分析--全ＤＮＡのサザンハイブリダイゼ−ショ
ンにより、ＰＳ５０ＣはB.t.sd.及び他のB.t.単離体と
区別される。 アルカリ可溶性蛋白質--ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動(SDS-PAGE)は130キロダルトンのダブレットの
蛋白質を示す。

【００１３】バシラス・チューリンゲンシスＰＳ５０Ｃ
（B.t.ＰＳ５０Ｃ）の性質を、既知のB.t.菌株である、
バシラス・チューリンゲンシスvar.サンジエゴ（B.t.s
d.）、バシラス・チューリンゲンシスＰＳ８６Ｂ１（Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８２９９）、及びバシラス・チューリン
ゲンシスvar.クルスタキ（ＨＤ−１）の性質に対して比
較したものを表１に示す。

【００１４】 表１ B.t.ＰＳ５０Ｃ、B.t.ＰＳ８６Ｂ１、B.t.sd.及びB.t.ＨＤ−１の比較 B.t.PS50C B.t.PS86B1 B.t.sd. B.t.HD-1 血清型 クマモトエンシス モリソニ トルウォ-スィ クルスタキ 封入物の型 球 四角 平坦、 両錐形 ウエハ− とがり楕円 ＋sm.封入物 SDS-PAGEによる 130kDa 72,000 75,000 130,000 アルカリ可溶性 タ゛フ゛レット 64,000 68,000 68,000 蛋白の大きさ 61,000宿主範囲 鞘翅類 鞘翅類 鞘翅類 鱗翅類

【００１５】本出願に開示される培養基はアメリカ合衆
国６１６０４イリノイ州ペオリア、ノ−スユニバ−シテ
ィ−ストリ−ト１８１５のノ−ザンリ−ジョナルリサ−
チセンタ−，アグリカルチュラルリサ−チサ−ビスパテ
ントカルチャ−コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託されて
いる。 培養基 寄託番号 寄託日 バシラス・チューリンゲンシスＰＳ５０Ｃ NRRL B-18746 1991年1月9日 大腸菌ＮＭ５２２［ｐＭＹＣ１６３８］ NRRL B-18751 1991年1月11日

【００１６】本培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の
下に特許庁長官が権原ありと認める者が本特許出願の係
属中に培養基を入手できることを保証されるという条件
下に寄託された。また、本出願又はその子孫の対応特許
出願が提出されている国々の外国特許法で要求されるな
らば、寄託物は入手できる。しかし、寄託物が入手でき
るからといって、行政行為によって付与された特許権を
損わしめて本発明を実施する権利を構成するものではな
いことを理解すべきである。

【００１７】更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生
物寄託条約の規定に従って保存され、一般の人々に入手
可能とされる。すなわち、寄託物の試料提供に対する最
も最近の請求後少なくとも5年間、かつどんな場合も、
寄託期日から少なくとも30年間か、又は培養基を開示し
て発行される特許の権利行使可能な期間中、これらの寄
託物は、生育可能で汚染されていない状態に保つために
必要なあらゆる配慮をもって保存される。要求を受けた
受託施設が、寄託物の状態のために試料を供給できない
場合には、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるもの
である。本培養基寄託物の一般への入手可能性に関する
すべての制限は、これらを開示した特許が付与されると
永久に取り除かれる。

【００１８】B.t.ＰＳ５０Ｃ，（ＮＲＲＬ Ｂ−１８７
４６）は標準技術の培地及び醗酵技術を用いて培養でき
る。醗酵サイクルの完了後、細菌は、まず、B.t.胞子及
び結晶をこの技術で良く知られた手段で醗酵ブロスから
分離することによって収穫できる。回収されたB.t.胞子
及び結晶は、取扱と、特定の標的害虫への適用を容易に
する、水和剤、液体濃縮物、顆粒へ、又は他の表面活性
剤、分散剤、不活性担体及び他の成分の添加により他の
処方へ処方出来る。これらの処方及び生成物の適用はこ
の分野で良く知られている。

【００１９】B.t.ＰＳ５０Ｃからの毒素遺伝子を含有し
ているプラスミドＤＮＡ（ｐＭＹＣ１６３８）は、大腸
菌ＮＭ５２２［ｐＭＹＣ１６３８］から、良く知られた
標準手順で精製できる。毒素遺伝子は、図２に示される
ように制限酵素によってプラスミドＤＮＡから切出すこ
とができる。

【００２０】処方された製品は植物を食べる甲虫又は幼
虫を抑制するために葉にスプレ−又は適用することが出
来る。

【００２１】行なうことが出来る別の方法は、B.t.ＰＳ
５０Ｃの胞子及び結晶を誘引剤を含有している餌顆粒中
に入れ、これらの顆粒を土壌に生息する鞘翅類を抑制す
る為に土壌に適用することである。また処方されたB.t.
ＰＳ５０Ｃは、種の被覆又は根の処理又は全植物の処理
として適用することも出来る。

【００２２】B.t.ＰＳ５０Ｃ細胞は標的害虫の環境に適
用されるときに殺虫活性を長期化させるように処方前に
処理できる。そのような処理は、これらの技術が殺虫剤
の性質に悪影響を及ぼさず、殺虫剤を保護する細胞の能
力を消失させない限り、化学的又は物理的手段、又は化
学的及び物理的手段の組合せであり得る。化学試薬の例
は、ハロゲン化剤、特に原子番号１７〜８０のハロゲン
である。より詳しくは、ヨウ素は温和な条件下で十分な
時間使用して所望の結果を得ることが出来る。他の適当
な技術には、アルデヒド、例えばホルムアルデヒド及び
グルタルアルデヒド、抗感染剤、例えばゼフィランクロ
ライド、アルコ−ル、例えばイソプロピルアルコ−ル及
びエタノ−ル、種々の細胞学的固定剤、例えばボウイン
(Bouin)の固定剤及びヘリ−(Helly)の固定剤（ヒュ−マ
ソン、グレッチェン.L.，アニマルティッシュテクニッ
ク（Animal Tissue Techniques）、ダブリュ.エッチ.フ
リ−マンアンドカンパニ−,1967を参照）での処理、又
は細胞が標的害虫の環境に適用されたときに、細胞中で
造られる毒素の活性を長期化させる、物理的（熱）及び
化学的試薬の組合せが含まれる。物理手段の例は、短波
長照射、例えばγ-線照射、及びＸ線照射、凍結、紫外
線照射、凍結乾燥等である。

【００２３】本発明の新規な毒素遺伝子はB.t.ＰＳ５０
Ｃと命名される新規な鞘翅類に活性のバシラス・チュー
リンゲンシス（B.t.単離体）から得られる。遺伝子は、
実施例に開示されるように単離される。

【００２４】本発明の毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホ
ストへ導入できる。毒素遺伝子の表現は、直接又は間接
に殺虫剤の細胞内生産と保持をもたらす。適当なホス
ト、例えばシュードモナスの場合、微生物は鞘翅類昆虫
発生位置に施用されると、そこで増殖し、昆虫に摂取さ
れる。その結果、望んでいない昆虫を防除できる。その
代わりに、毒素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつく
られる毒素の活性を持続させるような条件下に処理でき
る。次に処理細胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる
生成物はB.t.毒素の毒性を保持している。

【００２５】B.t.毒素遺伝子が適当なベクターを経て微
生物ホストへ導入されて、このホストが生きている状態
で環境へ施用される場合に、あるホスト微生物を使用す
ることが必須である。微生物ホストは、一つ以上の重要
作物の「植物領域」(葉面、葉領域、根領域、及び/又は根
表面)を占有することが知られたものを選択する。これ
らの微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中
で野性型微生物と順調に競合できるように選ばれ、ポリ
ペプチド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発現
を提供し、望ましくは殺虫剤に対して環境的劣化と不活
性化からの改良された保護を提供する。

【００２６】広範囲の重要作物の葉面(植物の葉の表面)
と根の領域(植物の根の周囲の土壌)に生息する多数の微
生物が知られている。これらの微生物は細菌、藻類及び
真菌類を包含している。特に興味あるものは、細菌、例
えばシュードモナス(Pseudomonas)、エルウィニア(Erwi
nia)、セラティア(Serratia)、クレブシェラ(Klebsiell
a)、キサントモナス(Xanthomonas)、ストレプトミセス
(Streptomyces)、リゾビウム(Rhizobium)、ロードシュ
ードモナス(Rhodopseudomonas)、メチロフィリウス(Met
hylophilius)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、
アセトバクター(Acetobacter)、乳酸杆菌(Lactobacillu
s)、アースロバクター(Arthrobacter)、アゾトバクター
(Azotobacter)、リューコノストック(Leuconost-oc)、
及びアルカリゲネス(Alcaligenes)属の細菌；真菌類、
特に酵母、例えばサッカロミセス(Saccharomyces)、ク
リプトコッカス(Cryptococcus)、クルイベロミセス(Klu
yveromyces)、スポロボロミセス(Sporobolomyces)、ロ
ードトルラ(Rhodotorula)、及びオーレオバシジウム(Au
reobasidium)属などの微生物である。特に重要なもの
は、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringa
e)、シュードモナス・フルオレッセンス、セラティア・
マルケスケンス(Serratia marcescens)、アセトバクタ
ー・キシリヌム(Acetobacter xylinum)、アグロバクテ
リウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacien
s)、ロードシュードモナス・スフェロイデス(Rhodopseu
domonas spheroides)、キサントモナス・カンペストリ
ス(Xanthomonas campestris)、リゾビウム・メリオチ
(Rhizobium melioti)、アルカリゲネス・エントロフス
(Alcaligenes entrophus)、及びアゾトバクター・ヴィ
ンランディ(Azotobacter vinlandii)のような植物領域
の細菌種；及びロードトルラ・ルブラ(Rhodotorula rub
ra)、R.グルチニス(R. glutinis)、R.マリーナ(R. mari
na)、R.オーランティアカ(R.aurantiaca)、クリプトコ
ッカス・アルビダス(Cryptococcus albidus)、C.ジフル
エンス(C. diffluens)、C.ローレンティ(C. laurenti
i)、サッカロミセス・ロゼイ(S. rosei)、S.プレトリエ
ンシス(S. pretoriensis)、S.セレビシエ(S. cerevisia
e)、スポロボロミセス・ロゼウス(Sporobolomyces rose
us)、S.オドルス(S. odorus)、クルイベロミセス・ヴェ
ローナエ(Kluyveromyces veronae)及びオーレオバシジ
ウム・ポルランス(Aureobasidium pollulans)のような
植物領域の酵母種である。特に重要なのは有色素微生物
である。

【００２７】遺伝子の安定な維持及び発現を可能とする
ような条件下に、毒素発現するB.t.遺伝子を微生物ホス
トに導入するには、広範囲の方法が利用できる。毒素遺
伝子発現用の転写翻訳調節信号とその調節制御下の毒素
遺伝子、及び組込みを行なうためのホスト生物内の配列
と相同のＤＮＡ配列、また組込みや安定な保持が起こる
ための、ホスト内で機能的な複製系などを含んだＤＮＡ
構造体を用意することができる。

【００２８】転写開始信号はプロモータと転写開始出発
位置を包含しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を
提供して、毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるよ
うにするのが望ましいこともある。これはオペレータ、
又はアクチベータやエンハンサに結合する領域、によっ
て達成でき、これらは微生物の物理的又は化学的環境の
変化によって誘発できる。例えば、温度感受性調節領域
を使用すると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育で
き、環境へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実
験室で毒素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用
し、一方環境中での栄養培地は毒素発現を可能とするも
のを使用できる。翻訳開始には、リボソーム結合位置と
開始コドンが存在しよう。

【００２９】メッセンジャーＲＮＡの安定性を強化する
配列を使用すると共に、特に活性プロモータを使用して
メッセンジャーの発現を強化するために種々の操作を使
用できる。開始及び翻訳終結領域は停止コドン、終結領
域を包含し、任意付加的にポリアデニル化信号を包含し
てもよい。

【００３０】転写の方向、すなわちコーディング又はセ
ンス配列の5'から3'への方向で、構造体は転写調節領域
(これがある場合)とプロモータ（制御領域はプロモータ
の5'又は3'のいずれかにある)、リボゾーム結合位置、
開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠をもっ
た構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配列
(使用する場合)、及び終結領域を包含しよう。二本鎖と
してのこの配列はそれ自体微生物ホストの形質転換に使
用できるが、通常マーカーを含めたＤＮＡ配列を伴って
おり、この第二のＤＮＡ配列をホストへのＤＮＡ導入中
に毒素発現構造体に結合させることができる。

【００３１】マーカーとは、変更又は形質転換されたホ
ストの選定を行なうための構造遺伝子のことである。マ
ーカーは通常、選択的利点を提供するもので、例えば抗
生物質や重金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素要
求ホストに原栄養性を与える相補性等を提供する。変更
されたホストが選定されるだけでなく、野外で競合的で
あるように、相補性を使用するのが好ましい。構造体の
開発に、またホストの変更に、一つ以上のマーカーを使
用できる。野外で他の野性型微生物に対する競合的利点
を提供することによって、生物を更に変更できる。例え
ば、金属キレート剤、例えばシデロフォア類の発現用遺
伝子を、毒素発現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入
できる。この方法で、シデロフォアの強化された発現が
毒素生産ホストに競合的利点を提供するため、ホストは
野性型微生物と効果的に競合し、環境中で安定した生態
的地位を占めるようになる。

【００３２】機能的な複製系が存在しない場合、構造体
はホスト内の配列と相同な、少なくとも50塩基対(bp)、
好ましくは約100 bp、及び通常約1,000 bpまでの配列を
包含しよう。こうして合法的な組換えの可能性が強化さ
れるため、遺伝子はホストへ組み込まれ、ホストによっ
て安定に保持される。毒素遺伝子が相補性を提供する遺
伝子並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接している
のが望ましい。従って、毒素遺伝子が失われる場合、生
ずる生物は相補性遺伝子及び/又は競合的利点を提供す
る遺伝子も失う可能性が強く、このため無傷の構造体を
保持している遺伝子と環境中で競合できなくなる。

【００３３】細菌、バクテリオファージ、シアノバクテ
リア、藻類、真菌類等のような広範囲の微生物ホストか
ら多数の転写調節領域が入手できる。種々の転写調節領
域は、trp遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及
び右プロモータ、tacプロモータ、及びホスト中で機能
的な場合は毒素遺伝子と関連して天然プロモータを包含
する。例として合衆国特許第4,332,898号、第4,342,832
号、及び第4,356,270号を参照のこと。終結領域は、普
通は転写開始領域と関連する終結領域か、又は異なる転
写開始領域(二つの領域がホスト内で適合的で機能的で
ある限りにおいて)でありうる。

【００３４】安定なエピゾーム保持又は組込みを所望す
る場合は、ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミ
ドが使用されよう。複製系は染色体、ホストや別のホス
ト内に通常存在するエピゾーム要素、又はホスト内で安
定なウイルスの複製系から誘導される。pBR322、pACYC1
84、RSF1010、pRO1614等のような多数のプラスミドが入
手できる。例として、オルソン(Olson)ら、(1982年) J.
Bacteriol. 150巻6069頁、及びバグダサリアン(Bagdasa
rian)ら、(1981年) Gene 16巻237頁、並びに合衆国特許
第4,356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号を
参照のこと。

【００３５】B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にある
ように、転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に
導入できる。この構造体はプラスミドに含有され、プラ
スミドは少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以
上を包含でき、その場合一つの複製系はプラスミドの開
発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最終
ホストでの機能発揮に必要である。更に、すでに述べた
一つ以上のマーカーが存在できる。組込みを望む場合
は、プラスミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが
望ましい。

【００３６】形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生
物が存在する時は、それらに対して所望生物を選定でき
るように、慣用の方法に従って選定手法を使用して単離
できる。次に形質転換体を殺虫活性のために試験でき
る。

【００３７】処理細胞を目標害虫環境に施用する時に、
細胞内毒素の活性を持続させるために、適したホスト細
胞は原核生物か真核生物を包含するが、通常、哺乳類の
ような高等動物に有毒な物質を生じない細胞に限定され
る。しかし、毒素が不安定か、哺乳類ホストへの毒性の
可能性を回避するのに十分な低い施用水準である場合に
は、高等生物に有毒な物質をつくる生物も使用できる。
ホストとして特に興味あるものは、原核生物と、真菌類
のような低級真核生物である。グラム陰性・陽性双方の
原核生物の例はエシェリキア(Escherichia)、エルウィ
ニア(Erwinia)、シゲラ(Shigella)、サルモネラ(Salmon
ella)及びプロテウス(Proteus)のような腸内細菌科(Ent
erobacteriaceae)；バシラス科(Bacillaceae)；リゾビ
ウム(Rhizobium)のようなリゾビウム科(Rhizobiacea
e)；発光細菌、ジモモナス(Zymomonas)、セラティア(Se
rratia)、アエロモナス(Aeromonas)、ビブリオ(Vibri
o)、デスルホビブリオ(Desulfovibrio)、スピリルム(Sp
irillum)のようならせん菌科；乳酸かん菌科;シュード
モナス(Pseudomonas)及びアセトバクター(Acetobacter)
のようなシュードモナス科；アゾトバクター科及びニト
ロバクター科を包含する。真核生物には藻菌類(Phycomy
cetes)と子のう菌類(Ascomycetes)のような真菌類があ
り、これはサッカロミセス(Saccharomyces)とシゾサッ
カロミセス(Schizosaccharomyces)のような酵母、ロー
ドトルラ(Rhodotorula)、オーレオバシジウム(Aureobas
idium)、スポロボロミセス(Sporobolomyces)のような担
子菌類(Basidiomycetes)酵母を包含する。

【００３８】生産目的のためにホスト細胞を選択する上
で特に重要な特性は、B.t.遺伝子のホストへの導入の容
易さ、発現系の入手性、発現効率、ホスト中の殺線虫剤
又は殺吸虫剤の安定性、及び補助的遺伝能力の存在を包
含する。殺虫剤ミクロカプセルとして使用するのに重要
な特性は厚い細胞壁、色素形成、及び細胞内パッケージ
ング又は封入体の形成のような殺虫剤保護性；葉親和
性；対哺乳類毒性の欠如；害虫に摂取させるための誘引
力；毒素に損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含す
る。他の考慮としては、処方と取扱いの容易さ、経済
性、保存安定性等がある。

【００３９】特に重要なホスト生物は、ロードトルラ
種、オーレオバシジウム種、サッカロミセス種、スポロ
ボロミセス種のような酵母；シュードモナス種、エルウ
ィニア種、及びフラボバクテリウム種のような葉面に生
息する生物；又はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス
種等の他の生物を包含する。特定的な生物は、シュード
モナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュ
ードモナス・フルオレッセンス(P.fluorescens)、サッ
カロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、
バシラス・チューリンゲンシス、大腸菌、枯草菌(B.sub
tilis)等を包含する。

【００４０】細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子
型よりも実質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も
使用できる。

【００４１】組替え微生物細胞の処理は前記の様に行な
うことが出来る。一般に処理された細胞は、環境条件に
対する耐性を強化するような、強化された構造安定性を
もつであろう。殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原
体による殺虫剤のプロ型から成熟型への加工を抑制しな
いように、不活性化方法を選定すべきである。例えばホ
ルムアルデヒドはタンパクを架橋し、プロ型ポリペプチ
ド殺虫剤の加工を抑制しうる。不活性化又は殺菌方法
は、毒素の少なくとも実質量の生物学的利用率又は生物
活性を保持する。

【００４２】B.t.毒素遺伝子を含有する細胞ホストは任
意慣用の栄養培地で生育できるが、ＤＮＡ構造体が選択
的利点を提供するときは、細胞の全量又は実質的全量が
B.t.遺伝子を保持するように選択培地となる。次にこれ
らの細胞を慣用方法に従って取り入れる。その代わり
に、細胞を取り入れる前に処理することもできる。

【００４３】B.t.細胞を種々の方法で処方できる。これ
らを種々の不活性材料、例えば、無機鉱物(フィロ珪酸
塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等)又は植物材料(粉末トウ
モロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等)と混合することに
より、水和剤、粒剤又は粉剤として使用できる。処方剤
は展粘着助剤、安定化剤、その他殺虫添加物、又は表面
活性剤を包含できる。液体処方剤は水性基盤又は非水性
基盤のもので、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として
使用できる。成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散
剤又は重合体を包含できる。

【００４４】殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃縮
液か直接使用されるかによって、広範囲にわたる。毒素
は少なくとも1重量%で存在し、100重量%でありうる。乾
燥処方剤は約1-95重量%の毒素をもつが、液体処方剤は
一般に約1-60重量%の固体を液相中にもつであろう。処
方剤は概してmg当たり約10²ないし約10⁴個の細胞をもつ
であろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約50 mg
(液体又は乾燥)ないし1 kg以上の率で投与されよう。

【００４５】処方剤は線虫類又は吸虫類の環境、例えば
植物、土壌、又は水に噴霧、散布、散水等によって施用
できる。

【００４６】

【実施例】以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順
を例示した実施例である。これらの例は限定的に考えら
れてはならない。他に注意がなければ、百分率はすべて
重量、溶媒混合物割合はすべて容量による。

【００４７】実施例１ B.t.ＰＳ50Ｃ，ＮＲＲ
Ｌ Ｂ-18746の培養 B.t.ＰＳ50Ｃ，ＮＲＲＬ Ｂ-18746の二次培養基を使用
して次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・塩培地に
接種した。 バクト・ペプトン 7.5 g/l ブドウ糖 1.0 g/l KH₂PO₄ 3.4 g/l K₂HPO₄ 4.35 g/l 塩溶液 5.0 ml/l CaCl₂溶液 5.0 ml/l 塩溶液(100 ml) MgSO₄・7H₂O 2.46 g MnSO₄・H₂O 0.04 g ZnSO₄・7H₂0 0.28 g FeSO₄・7H₂O 0.40 g CaCl₂溶液(100 ml) CaCl₂・2H₂O 3.66 g pH 7.2

【００４８】塩溶液とCaCl₂溶液を濾過滅菌し、オート
クレーブ処理し調理したブロスに、接種時に添加する。
200 rpmで操作される回転振とう機で、フラスコを30
℃、64時間培養する。

【００４９】上の手順は、この技術で周知の手順によ
り、大発酵装置まで容易に規模拡大できる。

【００５０】上の発酵で得られるB.t.胞子及び結晶は、
この技術で周知の手順により単離できる。しばしば用い
られる手順は、取り入れた発酵液を分離手順、例えば遠
心分離にかけることである。

【００５１】実施例２ B.t.ＰＳ50Ｃ，ＮＲＲ
Ｌ Ｂ-18746の胞子と結晶の試験 B.t.ＰＳ50Ｃ，ＮＲＲＬ Ｂ-18746の胞子と結晶はコロ
ラドポテトビ−トル（ＣＰＢ）に対して毒性がある。コ
ロラドポテトビ−トルに対する検定を以下の様に行なっ
た。

【００５２】ＣＰＢ生物検定 − レプチノタルサ デ
セムリネアタ（Leptinotarsa decemineata）の第二期初
期幼虫を、バシラス・チューリンゲンシス製剤を含有す
る懸濁液に浸漬しておいた馬鈴薯の葉の上に置く。幼虫
を２５℃で４日間培養し、幼虫の死亡率を記録し、プロ
ビット（probit）分析を使用して分析した。

【００５３】実施例３ B.t.単離体ＰＳ50Ｃから
の新規な毒素遺伝子のクローニング 600nmに於ける光学密度1.0に生育したバシラス・チュー
リンゲンシス（B.t.）細胞から、全細胞ＤＮＡを調製し
た。細胞を遠心分離によって回収し、20％庶糖と50 mg/
mlリゾチームを含有するTES緩衝液（30 mMトリス-ＨＣ
l、10 mM EDTA、50 mM NaCl、pH＝8.0）中で原形質を調
製した。原形質をSDS添加によって溶菌し、4％の最終濃
度とした。細胞材料を（最終濃度）100 mMの中性塩化カ
リウム中、4℃で一夜沈殿させた。上澄み液をフェノー
ル/クロロホルム（1:1）で2回抽出した。核酸をエタノ
ール中で沈殿させ、ＤＮＡを塩化セシウム／臭化エチジ
ウム勾配上の密度平衡バンディングによって精製した。

【００５４】B.t. subsp.クマモトエンシス（B.t.ku
m.）単離体ＰＳ５０Ｃからの全細胞ＤＮＡをHindIIIで
消化させ、0.8%(w/v)アガロースゲル-TAE（50 mMトリス
-HCl、20 mM NaOAc、2.5 mM EDTA、pH=8.0）緩衝化ゲル
上の電気泳動によって分画した。ゲルのサザンブロット
を、［³²Ｐ］ラジオ標識オリゴヌクレオチドプロ−ブと
ハイブリッド化した。結果は、ハイブリッド化したＰＳ
５０Ｃ断片が12 kb、及び1.7 kbの大きさにあることを
示した。

【００５５】Ｓau3Ａで部分消化されたＰＳ５０Ｃ全細
胞ＤＮＡからライブラリーを構築し、ゲル電気泳動によ
ってサイズ分画した。ゲルの9-23 kb領域を切り出し、
ＤＮＡを電気溶離し、ELUTIP-d^TMイオン交換カラム（シ
ュライヒャー・エンド・シュエル社、ニューハンプシャ
ー州キーン)を用いて濃縮した。単離されたＳau3Ａ断片
をBamHI消化したラムダ(Lambda)GEM-11^TM（PROMEGA）に
連結した。パッケージにしたファージを大腸菌KW251細
胞（PROMEGA）上で高力価で平板培養し、放射性標識つ
きオリゴヌクレオチドを用いて選定した。ハイブリッド
化プラークを精製し、低プラーク密度で再選定した。プ
ローブとハイブリッド形成させた単一単離精製プラーク
を用いて、ＤＮＡ単離用のファージ調製のため、液体培
養基中で大腸菌KW251細胞に感染させた。ＤＮＡを標準
手順によって単離した。分離量のＤＮＡをXhoIで消化し
（ラムダ配列から挿入ＤＮＡを解放させる為）、そして
0.6％アガロース-TAEゲル上の電気泳動によって分離し
た。大きな断片をイオン交換クロマトグラフィによって
上の様に精製し、XhoI消化脱ホスホリル化pHTBlueII（p
Bluescript s/k［Stratagene］及びレジデントB.t.プラ
スミドからの複製オリジンからなる大腸菌/バシラス・
チューリンゲンシスシャトルベクタ−［Ｄ.レレクラス
等1989, FEMS Microbiology letters 60:211-218］）に
連結した。連結混合物をコンピテント大腸菌NM522細胞
（ＡＴＣＣ４７０００）へ形質転換によって導入し、ア
ンピシリン、イソプロピル-(β)-D-チオガラクトシド
（IPTG）及び5-ブロモ-4-クロロ-4-インドリル-(β)-D-
ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天上にプレートし
た。pHTBlueIIの(β)-ガラクトシダ−ゼ遺伝子中に推定
上の制限断片挿入物を有する白色集落を標準的な急速プ
ラスミド精製手順にかけた。プラスミドをXhoI消化とア
ガロ−スゲル電気泳動で分析した。所望のプラスミド構
築物ｐＭＹＣ１６３８は12 kbのXhoI挿入物を含有して
いた。クロ−ン化された挿入物の部分的な制限地図（図
２）は、毒素遺伝子が殺虫蛋白をコ−ドした他の毒素遺
伝子の地図と比較して新規であることを示している。ヌ
クレオチド配列（オ−プンリ−ディングフレ−ムのみ）
が配列ＩＤ No.１に示されている。毒素の予測されるペ
プチド配列が配列ＩＤ No.２に示されている。プラスミ
ドｐＭＹＣ１６３８はエレクトロポレ−ションによって
非結晶性（acrystalliferous）（Cry^-）B.t.宿主（プル
−ド大学のＡ.アロンソンから得たＨＤ−１ cryＢ）に
導入した。およそ130 kDaの蛋白質の表現がＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥによって追認された。胞子と結晶を含有しているブ
ロスをレピドプレラ デセムリネアタに対する毒素を測
定するのに使用した。

【００５６】B.t.毒素遺伝子を含有しているプラスミド
ｐＭＹＣ１６３８は標準の良く知られた手順を用いて形
質転換された宿主微生物から除くことが出来る。例え
ば、大腸菌ＮＭ５２２［ｐＭＹＣ１６３８］ＮＲＲＬ
Ｂ−１８７５１を透明にした溶菌物の密度勾配平衡手順
などにかけてｐＭＹＣ１６３８を回収する。

【００５７】実施例４ 毒素遺伝子の
植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコー
ドした新規な遺伝子は、アグロバクター・ツメファシエ
ンス(Agrobacter tumefaciens)からのTiプラスミドを使
用して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植物へ
再生させる[ザンブリスキ・ピー(Zambryski, P.)、ジョ
ース・エッチ(Joos, H.)、ジェンテロ・シー(Gentello,
C.)、リーマンス、ジェイ(Leemans, J.)、バン・モン
タギュー・エム(Van Montague, M.)、及びシェル・ジェ
イ(Schell, J.)(1983年)Cell 32巻1033-1043頁]。この
点で、特に有用なベクターはpEND4Kである[クリー・エ
ッチ・ジェイ(Klee, H.J.)、ヤノフスキー・エム・エフ
(Yanofsky, M.F.)及びネスター・イー・ダブリュー(Nes
ter, E.W.)(1985年)Bio/Technology 3巻637-642頁]。こ
のプラスミドは、植物細胞と細菌中で複製でき、パッセ
ンジャー遺伝子に対して複数のクローニング位置をもっ
ている。例えば毒素遺伝子はpEND4KのBamHI位置へ挿入
され、大腸菌中で増殖し、適当な植物細胞へ形質転換さ
れる。

【００５８】実施例５ 新規なB.チューリンゲンシ
ス遺伝子のバクロウイルスへのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォル
ニカ(Autographa californica)核ポリヘドロシスウイル
ス(AcNPV)のようなバクロウイルスへクローン化でき
る。pUC8のような市販のクローニングベクターにクロー
ン化されたAcNPVゲノムを含有するプラスミドを構築で
きる。AcNPVゲノムを変更し、ポリヘドリン遺伝子のコ
ード領域が除かれて、パッセンジャー遺伝子の特異なク
ローニング位置がポリヘドリンプロモータの真後ろに置
かれるようにする。このようなベクターの例はペノック
ら[ペノック・ジー・ディー(Pennock,G.D.)、シューメ
ーカー・シー(Shoemaker, C.)及びミラー・エル・ケイ
(Miller,L.K.)（1984年）Mol.Cell Biol.4巻399-406
頁］に記述されたpGP-B6874、及びスミスら[スミス・ジ
ー・イー(Smith,G.E.)、サマーズ・エム・ディー(Summe
rs, M.D.)及びフレーザー・エム・ジェイ（1983年）Mo
l. Cell Biol.3巻2156-2165頁]に記述されたpAC380であ
る。本発明の新規なタンパク毒素をコードした遺伝子
は、コード領域から上流及び下流の適当な領域で、BamH
Iリンカーによって変更でき、AcNPVベクター類の一つの
もののパッセンジャー位置に挿入できる。

【００５９】配列リスト（１）一般情報 (i) 発明者 ルイス ア−ル フォンセラダ ジュウェル エム． ペイン オウガスト ジェイ． シック (ii) 発明の名称 鞘翅類に対して活性のある新規な
バシラス・チューリンゲンシス単離体、及び鞘翅類に活
性の毒素をコード化した遺伝子 (iii) 配列数 ２ (iv) 通信住所 (A)宛先 ロマン サリワンチク (B)ストリ−ト名 Ｎ．Ｗ．４１st ストリ−ト２４
２１,Ste A-1 (C)シティ−名 ゲインスビル (D)州名 フロリダ州 (E)国名 アメリカ合衆国 (F)ジップコ−ド ３２０６０ (v) 次のコンピュ−タ−から読取り可能 (A)媒体 フロッピ−ディスク (B)コンピュ−タ− ＩＢＭ ＰＣとコンパチブルのも
の (C)ＯＳ ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ (D)ソフトウェア ＰａｔｅｎｔＩｎ レリ−ズ#1.0,
バ−ジョン#1.25 (vi) 現時点の出願デ−タ (A)出願番号 (B)出願日 (C)分類 (viii)代理人情報 (A)氏名 ロマン サリワンチク (ix) テレコミュニケ−ション情報 (A)電話 ９０４−３７５−８１００ (B)ファクス ９０４−３７２−５８００（２）配列ＩＤ No.１に対する情報 (i) 配列の特徴 (A)長さ ３４７１塩基対 (B)種類 核酸 (C)ストランド 二本鎖 (D)トポロジ− 線状 (ii) 分子種類 ＤＮＡ（ゲノミック） (iii) 仮説か？ ノ− (iv) アンチセンス ノ− (vi) 元々の給源 (A)生物 バシラス・チュ−リンゲンシス (B)菌株 クマモトエンシス (C)個々の単離体名 ＰＳ５０Ｃ (vii) すぐの供給源 (A)ライブラリ ＬＡＭＢＤＡＧＥＮ^(TM)−ルイス
フォンセラダの11ライブラリ (B)クロ−ン ５０Ｃ (ix) 配列の記載 配列ＩＤ No.１

【化１】

【化２】 （２）配列ＩＤ No.２に対する情報 (i) 配列の特徴 (A)長さ １１５７アミノ酸 (B)種類 アミノ酸 (C)ストランド 一本鎖 (D)トポロジ− 線状 (ii) 分子種類 蛋白質 (iii) 仮説か？ イエス (iv) アンチセンス ノ− (vi) 元々の給源 (A)生物 バシラス・チュ−リンゲンシス (B)菌株 クマモトエンシス (C)個々の単離体名 ＰＳ５０Ｃ (vii) すぐの供給源 (A)ライブラリ ＬＡＭＢＤＡＧＥＮ^(TM)−ルイス
フォンセラダの11ライブラリ (B)クロ−ン ５０Ｃ (ix) 配列の記載 配列ＩＤ No.２

【化３】

【化４】

【化５】

【図面の簡単な説明】

図１はB.t.ＰＳ５０Ｃ、B.t.sd.及びB.t.ＰＳ８６Ｂ１
の標準ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真で
ある。図２はｐＭＹＣ１６３８の制限地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/32 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 オウガスト ジェイ． シック アメリカ合衆国 92056 カリフォルニア 州 オ−シャンサイド サン ヘレナ ド ライブ 3188 (72)発明者 ジュウェル エム． ペイン アメリカ合衆国 92126 カリフォルニア 州 サンディエゴ ハンプヒル ドライブ 7984

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＮＲＲＬ Ｂ−１８７４６の同定特性を
   有するバシラス・チューリンゲンシスＰＳ５０Ｃ又はそ
   の突然変異菌の昆虫抑制有効量に鞘翅類昆虫の害虫を接
   触させることからなる、鞘翅類昆虫の害虫を抑制する方
   法。
2. 【請求項２】 該バシラス・チューリンゲンシスＰＳ５
   ０Ｃを餌顆粒中に入れ、該昆虫の害虫によって食べられ
   ることが知られている植物の種をまくときに、その顆粒
   を土壌中に入れるか又は土壌の上に置くことによって、
   該昆虫の害虫がバシラス・チューリンゲンシスＰＳ５０
   Ｃの昆虫抑制有効量と接触される請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 （１）バシラス・チューリンゲンシスＰ
   Ｓ５０Ｃ又はその突然変異菌、胞子又は結晶を含む餌顆
   粒を造り、（２）該餌顆粒を土壌の上に置くか又は中に
   入れることからなる、鞘翅目昆虫の害虫を抑制する方
   法。
4. 【請求項４】 該餌の顆粒が、土壌中にトウモロコシの
   種をまくと同時にまかれる請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 実質的に無傷のB.t.ＰＳ５０Ｃ菌体、又
   はその突然変異菌が、標的害虫の環境に適用されるとき
   に殺虫活性を長期化させるように処理される、請求項１
   又は３に記載の方法。
6. 【請求項６】 バシラス・チューリンゲンシスＰＳ５０
   Ｃ又はその突然変異菌、胞子又は結晶を、殺虫剤担体と
   組合せて含んでいる組成物。
7. 【請求項７】 該担体が甲虫の食刺激剤又は誘引剤を含
   んでいる請求項６に記載の組成物。
8. 【請求項８】 種の被膜として適用される処方成分と組
   合されたバシラス・チューリンゲンシスＰＳ５０Ｃ又は
   その突然変異菌を含んでいる組成物。
9. 【請求項９】 鞘翅目昆虫の害虫に対し活性を有する、
   ＮＲＲＬ Ｂ−１８７４６の同定特性を有するバシラス
   ・チューリンゲンシスＰＳ５０Ｃ又はその突然変異菌の
   生物学的に純粋な培養基。
10. 【請求項１０】 鞘翅類の害虫が貯蔵製品上に存在する
    請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 鞘翅類の害虫がコロラドポテトビ−ト
    ルである請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 ＮＲＲＬ Ｂ−１８７４６の同定特性
    を有するバシラス・チューリンゲンシスＰＳ５０Ｃによ
    って製造可能であり、≒ 130kDa（約130キロダルトン）
    の分子量を有し、配列ＩＤ No.２によって示される予想
    ペプチド配列を有する、鞘翅類害虫に対して活性の毒
    素。
13. 【請求項１３】 ≒ 130kDa（約130キロダルトン）の分
    子量を有し、配列ＩＤNo.２によって示される予想ペプ
    チド配列を有する、鞘翅類害虫に対して活性のバシラス
    ・チューリンゲンシス毒素をコ−ドしたＤＮＡ。
14. 【請求項１４】 ≒ 130kDa（約130キロダルトン）の分
    子量を有し、配列ＩＤNo.２によって示される予想ペプ
    チド配列を有する、鞘翅類害虫に対して活性のバシラス
    ・チューリンゲンシス毒素をコ−ドしたＤＮＡを含んで
    いる組替えＤＮＡ運搬ベクタ−。
15. 【請求項１５】 原核又は真核宿主中に於いて形質転換
    され複製される請求項１４に記載のＤＮＡ運搬ベクタ
    −。
16. 【請求項１６】 配列ＩＤ No.１に示されるヌクレオチ
    ド配列を有するＤＮＡ。
17. 【請求項１７】 ≒ 130kDa（約130キロダルトン）の分
    子量を有し、配列ＩＤNo.２によって示される予想ペプ
    チド配列を有する、鞘翅類害虫に対して活性のバシラス
    ・チューリンゲンシス毒素を表現するように形質転換さ
    れた細菌宿主。
18. 【請求項１８】 ≒ 130kDa（約130キロダルトン）の分
    子量を有し、配列ＩＤNo.２によって示される予想ペプ
    チド配列を有する、鞘翅類害虫に対して活性のバシラス
    ・チューリンゲンシス毒素をコ−ドした、バシラス・チ
    ューリンゲンシス毒素遺伝子を含有しているプラスミド
    ベクタ−で形質転換された請求項１７に記載の大腸菌。
19. 【請求項１９】 請求項１７に記載の宿主である大腸菌
    ＮＭ５２２（ｐＭＹＣ１６３８）。
20. 【請求項２０】 シュ−ドモナス、アゼトバクタ−、エ
    ルウィニア、セラチア、クレブシェラ、リゾビウム、バ
    シラス、ストレプトマイセス、ロドシュ−ドモナス、メ
    チロフィルス、アグロバクテリウム、アセトバクタ−又
    はアルカリゲネスの種である請求項１７に記載の微生
    物。
21. 【請求項２１】 該微生物が有色素であり、葉面（phyl
    loplane）付着性である請求項１８に記載の微生物。
22. 【請求項２２】 請求項２０に記載の微生物を昆虫又は
    昆虫の環境に投与することからなる、鞘翅類昆虫を抑制
    する方法。
23. 【請求項２３】 投与がリゾスフェア（rhizosphere）
    （根の領域）に対してである請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 投与が葉面（フィロプレン）に対して
    である請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 投与が水体に対して為される請求項２
    ２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 標的害虫の環境に適用されたときに長
    期化された殺虫活性を有している実質的に無傷の処理さ
    れた細胞を含有している殺虫剤を含んでいる殺虫剤組成
    物であって、該殺虫剤が鞘翅類昆虫に対し毒性のポリペ
    プチドであり、細胞内にあって、鞘翅類害虫に対して活
    性のバシラス・チューリンゲンシス毒素を表現すること
    のできる形質転換された微生物の表現の結果造られるも
    のであって、該毒素が≒ 130kDa（約130キロダルトン）
    の分子量を有し配列ＩＤ No.２によって示される予想ペ
    プチド配列を有するものである殺虫組成物。
27. 【請求項２７】 該処理された細胞が環境に於いて殺虫
    活性を長期化させるように化学的又は物理的手段で処理
    されている請求項２６に記載の殺虫組成物。
28. 【請求項２８】 該細胞が原核細胞又は低級真核細胞で
    ある請求項２７に記載の殺虫組成物。
29. 【請求項２９】 原核細胞がエンテロバクテリアセアエ
    (Enterobacteriaceae)、バシラセアエ(Bacillaceae)、
    リゾビアセアエ(Rhizobiaceae)、スピリラセアエ(Spiri
    llaceae)、ラクトバシラセアエ(Lactobacillaceae)、シ
    ュウドモナダセアエ(Pseudomonadaceae)、アゾトバクテ
    ラセアエ(Azotobacteraceae)、及びニトロバクテラセア
    エ(Nitrobacteraceae)からなる群から選ばれる請求項２
    ８に記載の殺虫組成物。
30. 【請求項３０】 該低級真核細胞が藻状菌、子嚢菌、及
    び担子菌からなる群から選択される請求項２８に記載の
    殺虫組成物。
31. 【請求項３１】 該細胞が有色素細菌、酵母又は真菌類
    である請求項２６に記載の殺虫組成物。
32. 【請求項３２】 ≒ 130kDa（約130キロダルトン）の分
    子量を有し配列ＩＤ No.２によって示される予想ペプチ
    ド配列を有する鞘翅類害虫に対して活性のポリペプチド
    毒素をコ−ドするバシラス・チューリンゲンシス毒素遺
    伝子の表現の結果である細胞内毒素を含有しており、標
    的昆虫の環境に適用されたときに殺虫活性を長期化させ
    る条件下で処理されている、処理された実質的に無傷の
    単細胞微生物細胞。
33. 【請求項３３】 該細胞が環境に於いて殺虫活性を長期
    化させるように化学的又は物理的手段で処理されている
    請求項３２に記載の細胞。
34. 【請求項３４】 該微生物がシュ−ドモナスであり、該
    毒素が≒ 130kDa（約130キロダルトン）の分子量を有
    し、配列ＩＤ No.２によって示される予想ペプチド配列
    を有する、鞘翅類害虫に対して活性のバシラス・チュー
    リンゲンシス毒素である請求項３２に記載の細胞。
35. 【請求項３５】 該細胞がヨウ素で処理されている請求
    項３４に記載のシュ−ドモナス細胞。
36. 【請求項３６】 シュ−ドモナス フルオレスセンスで
    ある請求項３５に記載の細胞。
37. 【請求項３７】 ｐＭＹＣ１６３８と命名されるプラス
    ミド。
38. 【請求項３８】 根をコロニ−化する細菌である請求項
    １７に記載の細菌宿主。
39. 【請求項３９】 微生物が根をコロニ−化する細菌であ
    る請求項２２に記載の方法