JPH05232115A - 魚類の脳細胞壊死ウイルス感染診断法 - Google Patents
魚類の脳細胞壊死ウイルス感染診断法Info
- Publication number
- JPH05232115A JPH05232115A JP4039038A JP3903892A JPH05232115A JP H05232115 A JPH05232115 A JP H05232115A JP 4039038 A JP4039038 A JP 4039038A JP 3903892 A JP3903892 A JP 3903892A JP H05232115 A JPH05232115 A JP H05232115A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- fish
- antibody
- serum
- cell necrosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 魚類血清中の抗脳細胞壊死ウイルス抗体を免
疫学的手段により検出することによる魚類の脳細胞壊死
ウイルス感染診断法。 【効果】 本発明によれば魚類を殺すことなく魚類のＮ
Ｎウイルス感染の有無が簡便に判定でき、感染した親魚
のみを種苗生産材料からはずすことにより、ＮＮウイル
ス感染なしに魚類の種苗育成が可能となった。
疫学的手段により検出することによる魚類の脳細胞壊死
ウイルス感染診断法。 【効果】 本発明によれば魚類を殺すことなく魚類のＮ
Ｎウイルス感染の有無が簡便に判定でき、感染した親魚
のみを種苗生産材料からはずすことにより、ＮＮウイル
ス感染なしに魚類の種苗育成が可能となった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は魚類の脳細胞壊死ウイル
ス感染を診断する方法に関し、更に詳細には魚類血清中
の抗脳細胞壊死ウイルス抗体を検出して魚類の脳細胞壊
死ウイルス感染の有無を診断する方法に関する。
ス感染を診断する方法に関し、更に詳細には魚類血清中
の抗脳細胞壊死ウイルス抗体を検出して魚類の脳細胞壊
死ウイルス感染の有無を診断する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】我国に
おいて、魚類、特に海産魚類は食料として極めて重要な
位置を占めている。ところが、漁獲量は年々低下する一
方であり、食料供給、ひいては種の保存のため、種苗生
産方法及び養殖方法の開発が種々検討されている。
おいて、魚類、特に海産魚類は食料として極めて重要な
位置を占めている。ところが、漁獲量は年々低下する一
方であり、食料供給、ひいては種の保存のため、種苗生
産方法及び養殖方法の開発が種々検討されている。
【０００３】種苗生産は一般に親魚から卵及び精子を採
取し、人工的に受精、孵化させて仔魚にまで育成するこ
とにより行われる。かかる種苗生産の最大の問題は糸状
菌、細菌、ウイルス等による感染である。このうち糸状
菌や細菌による感染は、抗菌剤の開発により予防可能な
場合が多い。これに対し、ウイルス感染は、有効な抗ウ
イルス剤がほとんど存在しないため予防が困難である。
取し、人工的に受精、孵化させて仔魚にまで育成するこ
とにより行われる。かかる種苗生産の最大の問題は糸状
菌、細菌、ウイルス等による感染である。このうち糸状
菌や細菌による感染は、抗菌剤の開発により予防可能な
場合が多い。これに対し、ウイルス感染は、有効な抗ウ
イルス剤がほとんど存在しないため予防が困難である。
【０００４】一方、本発明者らはシマアジの種苗生産に
関する研究過程で、孵化後１０日以内のシマアジ稚魚に
鰾異常を起こし、死に至らしめるウイルス、すなわち、
魚類脳細胞壊死ウイルス（Ｓｔｒｉｐｅｄ Ｊａｃｋ
Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ，以下
「ＮＮウイルス」という）が存在することを見出した。
このＮＮウイルスは、親魚から稚魚に受精卵を経由して
垂直感染していることからＮＮウイルスに感染した親魚
を検出し、当該親魚を種苗生産の材料として用いなけれ
ば魚類のＮＮウイルス感染は予防できると考えられる。
ところが、このＮＮウイルスの確認は卵巣のみからであ
り、他の組織でのＮＮウイルスの確認は困難であった。
卵巣からＮＮウイルスを検出する方法においては、卵巣
を親魚から摘出する必要があり、親魚を殺さなければな
らず、ＮＮウイルスが検出されなかった親魚はもはや種
苗生産には使用できないため、この方法は種苗生産のた
めのＮＮウイルス検出法としては利用できなかった。
関する研究過程で、孵化後１０日以内のシマアジ稚魚に
鰾異常を起こし、死に至らしめるウイルス、すなわち、
魚類脳細胞壊死ウイルス（Ｓｔｒｉｐｅｄ Ｊａｃｋ
Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ，以下
「ＮＮウイルス」という）が存在することを見出した。
このＮＮウイルスは、親魚から稚魚に受精卵を経由して
垂直感染していることからＮＮウイルスに感染した親魚
を検出し、当該親魚を種苗生産の材料として用いなけれ
ば魚類のＮＮウイルス感染は予防できると考えられる。
ところが、このＮＮウイルスの確認は卵巣のみからであ
り、他の組織でのＮＮウイルスの確認は困難であった。
卵巣からＮＮウイルスを検出する方法においては、卵巣
を親魚から摘出する必要があり、親魚を殺さなければな
らず、ＮＮウイルスが検出されなかった親魚はもはや種
苗生産には使用できないため、この方法は種苗生産のた
めのＮＮウイルス検出法としては利用できなかった。
【０００５】従って、親魚を殺すことなく、その親魚の
ＮＮウイルス感染の有無を簡便に判定する方法の開発が
望まれていた。
ＮＮウイルス感染の有無を簡便に判定する方法の開発が
望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは更に研究を進めた結果、ＮＮウイルスに感染
した魚類の血清中には抗ＮＮウイルス抗体が存在するこ
と、更に当該抗ＮＮウイルス抗体は免疫学的手法を用い
れば検出でき、これにより魚類を殺すことなく魚類のＮ
Ｎウイルス感染診断が可能となることを見出し、本発明
を完成するに至った。
発明者らは更に研究を進めた結果、ＮＮウイルスに感染
した魚類の血清中には抗ＮＮウイルス抗体が存在するこ
と、更に当該抗ＮＮウイルス抗体は免疫学的手法を用い
れば検出でき、これにより魚類を殺すことなく魚類のＮ
Ｎウイルス感染診断が可能となることを見出し、本発明
を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は魚類血清中の抗ＮＮウ
イルス抗体を免疫学的手段により検出することを特徴と
する魚類のＮＮウイルス感染診断法を提供するものであ
る。
イルス抗体を免疫学的手段により検出することを特徴と
する魚類のＮＮウイルス感染診断法を提供するものであ
る。
【０００８】本発明においては検体として魚類の血清を
用いる。当該血清は魚類から血液を採取し、常法により
分取することにより容易に入手することができる。魚類
血清はそのまま検体として用いてもよいが、ＩｇＭ画分
を分取して用いれば感度が向上するため好ましい。血清
からＩｇＭ画分を分取する方法としては、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）のＭｏｎｏ Ｑカラムを利
用する方法があるが、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ５０
を用い当該セファデックスに吸着した画分を分取する方
法が簡便であり好ましい。なお、ＩｇＭ画分は、ＩｇＭ
を多量に含有する画分であればよく、高純度である必要
はなく、部分純化されたものでよい。
用いる。当該血清は魚類から血液を採取し、常法により
分取することにより容易に入手することができる。魚類
血清はそのまま検体として用いてもよいが、ＩｇＭ画分
を分取して用いれば感度が向上するため好ましい。血清
からＩｇＭ画分を分取する方法としては、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）のＭｏｎｏ Ｑカラムを利
用する方法があるが、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ５０
を用い当該セファデックスに吸着した画分を分取する方
法が簡便であり好ましい。なお、ＩｇＭ画分は、ＩｇＭ
を多量に含有する画分であればよく、高純度である必要
はなく、部分純化されたものでよい。
【０００９】本発明における免疫学的手段としては、抗
原抗体反応を利用した免疫学的測定法であれば特に制限
されず、通常の競合法、サンドイッチ法によるラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ）
等が挙げられ、これらの方法の操作、手順等は常法に従
って行われる。より具体的には、例えば競合法を採用す
る場合、検体中の抗ＮＮウイルス抗体と一定量の不溶化
された抗ＮＮウイルス抗体とを、標識剤で標識されたＮ
Ｎウイルス抗原の一定量と競合反応させ、次いで不溶化
抗ＮＮウイルス抗体と標識抗原とを分離し、その何れか
の標識活性を測定することにより検体中の抗ＮＮウイル
ス抗体が検出できる。一方、サンドイッチ法を採用する
場合は、検体中の抗ＮＮウイルス抗体と不溶化されたＮ
Ｎウイルス抗原とを反応させて、抗ＮＮウイルス抗体−
不溶化抗原複合体を形成させ、この複合体に、標識抗原
の一定量を反応させ、次いで複合体と標識抗原との結合
体及び非結合標識抗原を分離し、その何れか一方の標識
活性を測定することにより、検体中の抗ＮＮウイルス抗
体を検出することができる。また、本発明においては、
ＥＬＩＳＡ法を用いるのがより好ましい。例えば不溶化
検体にＮＮウイルス抗原を反応させ、この複合体に抗Ｎ
Ｎウイルス抗体を反応させ、更に標識２次抗ウサギ−Ｉ
ｇＧ抗体を反応させ、次いでその標識量を測定すること
により、検体中の抗ＮＮウイルス抗体を検出できる。ま
た、不溶化ＮＮウイルスに検体を反応させ、その複合体
に標識ＮＮウイルス抗原を反応させるか、あるいはその
複合体にＮＮウイルスを反応させ、更にＮＮウイルス抗
体、抗ウサギＩｇＧ抗体、標識２次抗体を順次反応させ
たのち、結合標識量を測定する。
原抗体反応を利用した免疫学的測定法であれば特に制限
されず、通常の競合法、サンドイッチ法によるラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ）
等が挙げられ、これらの方法の操作、手順等は常法に従
って行われる。より具体的には、例えば競合法を採用す
る場合、検体中の抗ＮＮウイルス抗体と一定量の不溶化
された抗ＮＮウイルス抗体とを、標識剤で標識されたＮ
Ｎウイルス抗原の一定量と競合反応させ、次いで不溶化
抗ＮＮウイルス抗体と標識抗原とを分離し、その何れか
の標識活性を測定することにより検体中の抗ＮＮウイル
ス抗体が検出できる。一方、サンドイッチ法を採用する
場合は、検体中の抗ＮＮウイルス抗体と不溶化されたＮ
Ｎウイルス抗原とを反応させて、抗ＮＮウイルス抗体−
不溶化抗原複合体を形成させ、この複合体に、標識抗原
の一定量を反応させ、次いで複合体と標識抗原との結合
体及び非結合標識抗原を分離し、その何れか一方の標識
活性を測定することにより、検体中の抗ＮＮウイルス抗
体を検出することができる。また、本発明においては、
ＥＬＩＳＡ法を用いるのがより好ましい。例えば不溶化
検体にＮＮウイルス抗原を反応させ、この複合体に抗Ｎ
Ｎウイルス抗体を反応させ、更に標識２次抗ウサギ−Ｉ
ｇＧ抗体を反応させ、次いでその標識量を測定すること
により、検体中の抗ＮＮウイルス抗体を検出できる。ま
た、不溶化ＮＮウイルスに検体を反応させ、その複合体
に標識ＮＮウイルス抗原を反応させるか、あるいはその
複合体にＮＮウイルスを反応させ、更にＮＮウイルス抗
体、抗ウサギＩｇＧ抗体、標識２次抗体を順次反応させ
たのち、結合標識量を測定する。
【００１０】本発明に用いられる抗原であるＮＮウイル
スは、ＮＮウイルスに感染したシマアジから純化するこ
とができる。すなわち、ＮＮウイルスに感染したシマア
ジをＥＤＴＡ、２−メルカプトエタノールを含むトリス
緩衝液と等量のクロロホルムとともに磨砕し、８，００
０×ｇで２０分程度遠心分離して上清を得、この上清を
しょ糖、各種塩等の濃度勾配にて遠心分離をくり返すこ
とにより次の性状を有するＮＮウイルスを得ることがで
きる。
スは、ＮＮウイルスに感染したシマアジから純化するこ
とができる。すなわち、ＮＮウイルスに感染したシマア
ジをＥＤＴＡ、２−メルカプトエタノールを含むトリス
緩衝液と等量のクロロホルムとともに磨砕し、８，００
０×ｇで２０分程度遠心分離して上清を得、この上清を
しょ糖、各種塩等の濃度勾配にて遠心分離をくり返すこ
とにより次の性状を有するＮＮウイルスを得ることがで
きる。
【００１１】ＮＮウイルスの性状 直径約２５nmの球形のＲＮＡウイルスである。分子量約
４００００ダルトンからなる外被蛋白質をもっている。
ゲノムＲＮＡは約１．０１×１０5 ダルトン及び０．４
９×１０6 ダルトンの２本のＲＮＡからなっている。Ｒ
ＮＡは１本鎖のポジティブセンスＲＮＡであり、ウサギ
網状赤血球ライセートのインビトロ翻訳系において、そ
れぞれ約１００，０００ダルトン及び４２，０００ダル
トンと４０，０００ダルトンの蛋白質を合成することが
できる。
４００００ダルトンからなる外被蛋白質をもっている。
ゲノムＲＮＡは約１．０１×１０5 ダルトン及び０．４
９×１０6 ダルトンの２本のＲＮＡからなっている。Ｒ
ＮＡは１本鎖のポジティブセンスＲＮＡであり、ウサギ
網状赤血球ライセートのインビトロ翻訳系において、そ
れぞれ約１００，０００ダルトン及び４２，０００ダル
トンと４０，０００ダルトンの蛋白質を合成することが
できる。
【００１２】これらの性状から、ＮＮウイルスは昆虫ウ
イルスのＮｏｄａｖｒｉｄａｅに属するものと考えられ
る。
イルスのＮｏｄａｖｒｉｄａｅに属するものと考えられ
る。
【００１３】なお、本発明における抗原としてはＮＮウ
イルス自体及びＮＮウイルス外被蛋白質のいずれを用い
てもよい。
イルス自体及びＮＮウイルス外被蛋白質のいずれを用い
てもよい。
【００１４】本発明に使用できる標識酵素としては、グ
ルコアミラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられ、標識化は
常法に従えばよい。また不溶化ＮＮウイルス又は不溶化
ＮＮウイルス外被蛋白質は、これらの抗原を不溶性担体
に化学的又は物理的手段により結合させることにより製
造される。不溶性担体としては、セルロース粉末、セフ
ァデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カル
ボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラ
ン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナ
イロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチルビニル
エーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合物、エ
チレン−マレイン酸共重合物等が挙げられる。不溶化
は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法（酸アミ
ド誘導体法、カルボキシクロリド樹脂法、カルボジイミ
ド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘
導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボ
ナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法）、アルキル
化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてグル
タルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等を用
いる）、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学的反応；
あるいはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結
合法；ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用い
る物理的吸着法によって行われる。
ルコアミラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられ、標識化は
常法に従えばよい。また不溶化ＮＮウイルス又は不溶化
ＮＮウイルス外被蛋白質は、これらの抗原を不溶性担体
に化学的又は物理的手段により結合させることにより製
造される。不溶性担体としては、セルロース粉末、セフ
ァデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カル
ボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラ
ン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナ
イロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチルビニル
エーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合物、エ
チレン−マレイン酸共重合物等が挙げられる。不溶化
は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法（酸アミ
ド誘導体法、カルボキシクロリド樹脂法、カルボジイミ
ド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘
導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボ
ナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法）、アルキル
化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてグル
タルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等を用
いる）、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学的反応；
あるいはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結
合法；ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用い
る物理的吸着法によって行われる。
【００１５】ＥＬＩＳＡ法に用いる酵素標識２次抗体と
しては、ＮＮウイルスをウサギ、マウス、ヤギ等に免疫
して得られる抗ＮＮウイルス抗体を前述の方法で酵素標
識したものを用いることができる。
しては、ＮＮウイルスをウサギ、マウス、ヤギ等に免疫
して得られる抗ＮＮウイルス抗体を前述の方法で酵素標
識したものを用いることができる。
【００１６】本発明方法における反応は、通常の抗原抗
体反応の条件、すなわち、０〜４０℃で種々の緩衝液中
で行われる。また標識量の測定は、標識物質により異な
るが、例えば酵素としてアルカリホスファターゼを用い
た場合には基質であるパラニトロフェニルリン酸２ナト
リウムを添加し、４０５nmにおける吸光度を測定するこ
とにより行うことができる。
体反応の条件、すなわち、０〜４０℃で種々の緩衝液中
で行われる。また標識量の測定は、標識物質により異な
るが、例えば酵素としてアルカリホスファターゼを用い
た場合には基質であるパラニトロフェニルリン酸２ナト
リウムを添加し、４０５nmにおける吸光度を測定するこ
とにより行うことができる。
【００１７】魚類血清中の抗ＮＮウイルス抗体の定量
は、予め作成しておいた検量線より算出される。
は、予め作成しておいた検量線より算出される。
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば魚類を殺すことなく魚類
のＮＮウイルス感染の有無が簡便に判定でき、感染した
親魚のみを種苗生産材料からはずすことにより、ＮＮウ
イルス感染なしに魚類の種苗育成が可能となった。
のＮＮウイルス感染の有無が簡便に判定でき、感染した
親魚のみを種苗生産材料からはずすことにより、ＮＮウ
イルス感染なしに魚類の種苗育成が可能となった。
【００１９】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２０】参考例１（ＮＮウイルスの純化） ＮＮウイルスに感染したシマアジの仔魚６０ｇを２００
mlの１mMのエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）及び２mM ２−メルカプトエタノールを含む０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）と１００mlの
クロロホルムとともにミキサーで磨砕する。その磨砕液
を８，０００×ｇで２０分間遠心分離を行い上清を得
る。その上清を１００，０００×ｇ、２．５時間の遠心
分離を行い沈澱としてウイルス画分を得る。得られた沈
澱を０．５mlのＴＥ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ pH７．２，１mM ＥＤＴＡ）に溶解する。その溶液
を１０−４０％のショ糖密度勾配にのせ、８０，０００
×ｇ、２時間の遠心分離を行う。ウイルスは白いバンド
として得られるが、チューブの側面から注射器でそのバ
ンドを抜き取った。得られたウイルス画分を約５倍のＴ
Ｅ緩衝液で希釈したのち、１００，０００×ｇ、２時間
の遠心分離を行い、ウイルスを沈澱として得た。更に、
沈澱を０．５mlのＴＥに溶解したのち３０−４０％のＣ
ｓＣｌの密度勾配の上にのせ２１０，０００×ｇ、１６
時間の遠心分離を行った。ウイルスのバンドを注射器で
抜き取り、ＴＥで約５倍に希釈したのち、１０，０００
×ｇ、２時間の遠心分離を行い、ウイルスを沈澱として
得た。得られたウイルス沈澱をＴＥ緩衝液で適当に希釈
し、−７０℃で保存した。ウイルスの濃度は他の球形の
ＲＮＡウイルスを参考にして、本ウイルスの０．１％溶
液がＯＤ260nm ＝５であるとして計算した。
mlの１mMのエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）及び２mM ２−メルカプトエタノールを含む０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）と１００mlの
クロロホルムとともにミキサーで磨砕する。その磨砕液
を８，０００×ｇで２０分間遠心分離を行い上清を得
る。その上清を１００，０００×ｇ、２．５時間の遠心
分離を行い沈澱としてウイルス画分を得る。得られた沈
澱を０．５mlのＴＥ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ pH７．２，１mM ＥＤＴＡ）に溶解する。その溶液
を１０−４０％のショ糖密度勾配にのせ、８０，０００
×ｇ、２時間の遠心分離を行う。ウイルスは白いバンド
として得られるが、チューブの側面から注射器でそのバ
ンドを抜き取った。得られたウイルス画分を約５倍のＴ
Ｅ緩衝液で希釈したのち、１００，０００×ｇ、２時間
の遠心分離を行い、ウイルスを沈澱として得た。更に、
沈澱を０．５mlのＴＥに溶解したのち３０−４０％のＣ
ｓＣｌの密度勾配の上にのせ２１０，０００×ｇ、１６
時間の遠心分離を行った。ウイルスのバンドを注射器で
抜き取り、ＴＥで約５倍に希釈したのち、１０，０００
×ｇ、２時間の遠心分離を行い、ウイルスを沈澱として
得た。得られたウイルス沈澱をＴＥ緩衝液で適当に希釈
し、−７０℃で保存した。ウイルスの濃度は他の球形の
ＲＮＡウイルスを参考にして、本ウイルスの０．１％溶
液がＯＤ260nm ＝５であるとして計算した。
【００２１】参考例２（シマアジへのＮＮウイルス外被
蛋白質による免疫） 約１５０μg のウイルス外被蛋白質を含む０．５mlのＰ
ＢＳに等量の不完全アジュバントを加えよく混合したの
ち、シマアジの筋肉内に１週間毎に４回注射した。２回
目の注射からは完全アジュバントを用いた。最終の注射
から１０日後に採血した。
蛋白質による免疫） 約１５０μg のウイルス外被蛋白質を含む０．５mlのＰ
ＢＳに等量の不完全アジュバントを加えよく混合したの
ち、シマアジの筋肉内に１週間毎に４回注射した。２回
目の注射からは完全アジュバントを用いた。最終の注射
から１０日後に採血した。
【００２２】実施例１ 天然シマアジ及び人工受精で育成したシマアジの血清２
５検体、ウイルスの外被蛋白質で免疫したシマアジの血
清、及び自然海域から採取した健全魚と思われるシマア
ジの血清をそれぞれ５００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡに供
した。ＥＬＩＳＡは次の手順で実施した。 （１）抗ＮＮウイルスウサギ抗体の調製 約１５０μg のＮＮウイルスを含む０．５mlのＰＢＳに
等量の不完全アジュバントを加えよく混合したのち、ウ
サギの皮下に１週間毎に４回注射した。２回目の注射か
らは完全アジュバントを用いた。最後の注射から１０日
後にウサギの耳から１０ml採血した。血液を３７℃、１
時間培養したのち、氷中に数時間置き、分離した血清を
１．５ml採取した。得られた血清に１．５mlのＰＢＳを
加え、更に３mlのＰＢＳ飽和硫安を加え３０分、氷中に
置いた。遠心分離（８，０００×ｇ、１０分間）を行
い、ＩｇＧ画分を沈澱として得た。この操作を３回繰り
返し、最終的に得られたＩｇＧ画分に２mlのＰＢＳを加
え溶解したのち、３，０００mlのＰＢＳに対して透析し
た。非特異的な抗原抗体反応を避けるためＩｇＧ画分を
アセトンパウダー処理した。健全なシマアジを−２０℃
に冷却したアセトンとともに乳鉢で磨砕し、Ｗｈａｔｍ
ａｎ Ｎｏ．２濾紙で濾過し、残渣をアセトンでよく洗
ったのち、風乾した。アセトンパウダーを水不溶性にす
るため、７０％エタノールに懸濁し、湯煎の中で１０分
間処理した。残渣を濾紙上に集めＰＢＳでよく洗浄し
た。得られたペレット１ｇを２mlのＩｇＧ溶液に入れ、
３７℃、１時間培養したのち、４℃で一晩置いた。濾紙
で濾過し得られた濾液を１次抗体としてＥＬＩＳＡに用
いた。 （２）ＥＬＩＳＡ手順 被検体を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（pH９．６）で希釈し、
マイクロタイタープレートのウエルに２００μl 入れ、
３７℃、１時間反応させウエルにＩｇＭを吸着させた。
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）
でウエルを５回洗浄した。ＰＢＳに１００ng／mlになる
ように純化ＮＮウイルスを懸濁し、その２００μl をウ
エルに入れ、３７℃、１時間培養した。ＰＢＳＴで５回
洗浄したのち、ＰＢＳで２，０００倍に希釈した抗ＮＮ
ウイルスＩｇＧ画分を加え、３７℃、１時間反応させ
た。ＰＢＳＴで５回洗浄したのち、ＰＢＳで３，０００
倍に希釈した市販アルカリフォスファターゼ結合抗ウサ
ギＩｇＧ−ヤギ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）２００μl を
ウエルに入れ、３７℃、１時間反応させた。ＰＢＳＴで
５回洗浄したのち、１０％ジエタノールアミン（pH９．
８）に１mg／mlになるようにパラニトロフェニルリン酸
−２Ｎａを溶解し、その２００μl をウエルに入れ、３
０分室温に置いたのち、マイクロプレートリーダ（東ソ
ー社）で４０５nmにおける吸光度を測定した。
５検体、ウイルスの外被蛋白質で免疫したシマアジの血
清、及び自然海域から採取した健全魚と思われるシマア
ジの血清をそれぞれ５００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡに供
した。ＥＬＩＳＡは次の手順で実施した。 （１）抗ＮＮウイルスウサギ抗体の調製 約１５０μg のＮＮウイルスを含む０．５mlのＰＢＳに
等量の不完全アジュバントを加えよく混合したのち、ウ
サギの皮下に１週間毎に４回注射した。２回目の注射か
らは完全アジュバントを用いた。最後の注射から１０日
後にウサギの耳から１０ml採血した。血液を３７℃、１
時間培養したのち、氷中に数時間置き、分離した血清を
１．５ml採取した。得られた血清に１．５mlのＰＢＳを
加え、更に３mlのＰＢＳ飽和硫安を加え３０分、氷中に
置いた。遠心分離（８，０００×ｇ、１０分間）を行
い、ＩｇＧ画分を沈澱として得た。この操作を３回繰り
返し、最終的に得られたＩｇＧ画分に２mlのＰＢＳを加
え溶解したのち、３，０００mlのＰＢＳに対して透析し
た。非特異的な抗原抗体反応を避けるためＩｇＧ画分を
アセトンパウダー処理した。健全なシマアジを−２０℃
に冷却したアセトンとともに乳鉢で磨砕し、Ｗｈａｔｍ
ａｎ Ｎｏ．２濾紙で濾過し、残渣をアセトンでよく洗
ったのち、風乾した。アセトンパウダーを水不溶性にす
るため、７０％エタノールに懸濁し、湯煎の中で１０分
間処理した。残渣を濾紙上に集めＰＢＳでよく洗浄し
た。得られたペレット１ｇを２mlのＩｇＧ溶液に入れ、
３７℃、１時間培養したのち、４℃で一晩置いた。濾紙
で濾過し得られた濾液を１次抗体としてＥＬＩＳＡに用
いた。 （２）ＥＬＩＳＡ手順 被検体を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（pH９．６）で希釈し、
マイクロタイタープレートのウエルに２００μl 入れ、
３７℃、１時間反応させウエルにＩｇＭを吸着させた。
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）
でウエルを５回洗浄した。ＰＢＳに１００ng／mlになる
ように純化ＮＮウイルスを懸濁し、その２００μl をウ
エルに入れ、３７℃、１時間培養した。ＰＢＳＴで５回
洗浄したのち、ＰＢＳで２，０００倍に希釈した抗ＮＮ
ウイルスＩｇＧ画分を加え、３７℃、１時間反応させ
た。ＰＢＳＴで５回洗浄したのち、ＰＢＳで３，０００
倍に希釈した市販アルカリフォスファターゼ結合抗ウサ
ギＩｇＧ−ヤギ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）２００μl を
ウエルに入れ、３７℃、１時間反応させた。ＰＢＳＴで
５回洗浄したのち、１０％ジエタノールアミン（pH９．
８）に１mg／mlになるようにパラニトロフェニルリン酸
−２Ｎａを溶解し、その２００μl をウエルに入れ、３
０分室温に置いたのち、マイクロプレートリーダ（東ソ
ー社）で４０５nmにおける吸光度を測定した。
【００２３】得られた結果を図１に示す。その結果、Ｎ
ｏ．１〜Ｎｏ．２５の全ての検体で、Ｎｏ．２７よりも
強い反応が認められ、いずれもＮＮウイルス感染が示唆
された。また、ＮＮウイルス外被蛋白質で免疫したシマ
アジ（Ｎｏ．２６）は非常に高い抗体価を示した。
ｏ．１〜Ｎｏ．２５の全ての検体で、Ｎｏ．２７よりも
強い反応が認められ、いずれもＮＮウイルス感染が示唆
された。また、ＮＮウイルス外被蛋白質で免疫したシマ
アジ（Ｎｏ．２６）は非常に高い抗体価を示した。
【００２４】実施例２ （１）ＨＰＬＣ−Ｍｏｎｏ ＱカラムによるＩｇＭの部
分純化 魚血清をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー、ファ
ルマシア社製）のＭｏｎｏ Ｑカラムにかけて分画し
た。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳで平衡化したカ
ラムに血清をのせ、同バッファーで未吸着成分を完全に
溶出したのち、ＮａＣｌ濃度を０．１５〜１Ｍまで直線
的に高め２０の画分に分け溶出した。各画分から１μl
をスライドガラス上に滴下し、純化ウイルス１μl （２
mg／ml）と混合したのち、湿室に入れ、２５℃で３０分
間反応させた。顕微鏡下で凝縮反応を示した画分をＩｇ
Ｍ画分とした。 （２）ＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳＡ 実施例１の検体Ｎｏ．２６及びＮｏ．２７の血清より上
記（１）の方法に従ってＩｇＭを部分純化した検体を用
いて、実施例１（２）に準じてＥＬＩＳＡを行った。そ
の結果、Ｎｏ．２６のＩｇＭ画分の場合、ＩｇＭの濃度
が高いと（原液の８０倍希釈まで）非特異的に反応が起
こるようであった。しかし、更に希釈を行うと濃度依存
的に抗体価が低下した（図２）。一方、自然海域から捕
獲したシマアジ（Ｎｏ．２７）のＩｇＭ画分において
も、その濃度が高いと（原液の１６０倍希釈まで）非特
異的反応が起こるようである（図３）。従って、部分純
化したＩｇＭ画分を用い原液ＩｇＭを３２０倍以上に希
釈することによって、非特異的反応を消去することがで
き、魚血清中のウイルスに対する抗体価を正しく測定で
きるものと判定した。
分純化 魚血清をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー、ファ
ルマシア社製）のＭｏｎｏ Ｑカラムにかけて分画し
た。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳで平衡化したカ
ラムに血清をのせ、同バッファーで未吸着成分を完全に
溶出したのち、ＮａＣｌ濃度を０．１５〜１Ｍまで直線
的に高め２０の画分に分け溶出した。各画分から１μl
をスライドガラス上に滴下し、純化ウイルス１μl （２
mg／ml）と混合したのち、湿室に入れ、２５℃で３０分
間反応させた。顕微鏡下で凝縮反応を示した画分をＩｇ
Ｍ画分とした。 （２）ＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳＡ 実施例１の検体Ｎｏ．２６及びＮｏ．２７の血清より上
記（１）の方法に従ってＩｇＭを部分純化した検体を用
いて、実施例１（２）に準じてＥＬＩＳＡを行った。そ
の結果、Ｎｏ．２６のＩｇＭ画分の場合、ＩｇＭの濃度
が高いと（原液の８０倍希釈まで）非特異的に反応が起
こるようであった。しかし、更に希釈を行うと濃度依存
的に抗体価が低下した（図２）。一方、自然海域から捕
獲したシマアジ（Ｎｏ．２７）のＩｇＭ画分において
も、その濃度が高いと（原液の１６０倍希釈まで）非特
異的反応が起こるようである（図３）。従って、部分純
化したＩｇＭ画分を用い原液ＩｇＭを３２０倍以上に希
釈することによって、非特異的反応を消去することがで
き、魚血清中のウイルスに対する抗体価を正しく測定で
きるものと判定した。
【００２５】実施例３ （１）ＨＰＬＣは高価な機械であること、また、大量の
試料を処理するには長時間が必要なことから、ＩｇＭの
簡易調製法を考案した。その操作は次のようにして行
う。 （ａ）魚血清１００μl をマイクロチューブにとり、９
００μl のＰＢＳを加える。更に、ＰＢＳで平衡化した
ＤＥＡＥ−セファデックス５０を２００μl 加え、数回
チューブを上下逆さまにして、３０分間室温に置く。 （ｂ）５００rpm,３０秒間遠心し、セファデックス粒子
を集め、上清（未吸着成分）をすてる。沈澱に１mlのＰ
ＢＳを加え、よく混合したのち、遠心し、セファデック
ス粒子をＰＢＳでよく洗浄する。この操作を３回繰り返
す。 （ｃ）セファデックス粒子画分に１Ｍ ＮａＣｌを含む
ＰＢＳを１ml加え、よく混合したのち遠心し、上清をＰ
ＢＳで３０及び６０倍に希釈したのちＥＬＩＳＡに供試
する。 （２）簡易調製法によりＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳＡ 代表として実施例１で用いたＮｏ．１、３、１０、２
１、２６及び２７の試料を選び、それぞれからＩｇＭ画
分を上記（１）の簡易純化法で部分純化し、ＥＬＩＳＡ
の試料とした。各試料を３２０倍に希釈したのち、実施
例１（２）に準じてＥＬＩＳＡを行った結果、いずれも
非感染魚ＩｇＭ（Ｎｏ．２７）よりも高い反応が認めら
れた（図４）。その結果、Ｎｏ．１〜２５は全て本ウイ
ルスの感染魚であることが示唆された。
試料を処理するには長時間が必要なことから、ＩｇＭの
簡易調製法を考案した。その操作は次のようにして行
う。 （ａ）魚血清１００μl をマイクロチューブにとり、９
００μl のＰＢＳを加える。更に、ＰＢＳで平衡化した
ＤＥＡＥ−セファデックス５０を２００μl 加え、数回
チューブを上下逆さまにして、３０分間室温に置く。 （ｂ）５００rpm,３０秒間遠心し、セファデックス粒子
を集め、上清（未吸着成分）をすてる。沈澱に１mlのＰ
ＢＳを加え、よく混合したのち、遠心し、セファデック
ス粒子をＰＢＳでよく洗浄する。この操作を３回繰り返
す。 （ｃ）セファデックス粒子画分に１Ｍ ＮａＣｌを含む
ＰＢＳを１ml加え、よく混合したのち遠心し、上清をＰ
ＢＳで３０及び６０倍に希釈したのちＥＬＩＳＡに供試
する。 （２）簡易調製法によりＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳＡ 代表として実施例１で用いたＮｏ．１、３、１０、２
１、２６及び２７の試料を選び、それぞれからＩｇＭ画
分を上記（１）の簡易純化法で部分純化し、ＥＬＩＳＡ
の試料とした。各試料を３２０倍に希釈したのち、実施
例１（２）に準じてＥＬＩＳＡを行った結果、いずれも
非感染魚ＩｇＭ（Ｎｏ．２７）よりも高い反応が認めら
れた（図４）。その結果、Ｎｏ．１〜２５は全て本ウイ
ルスの感染魚であることが示唆された。
【図１】シマアジ血清を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す
図である。
図である。
【図２】検体Ｎｏ．２６をＨＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑカラ
ムで部分純化したＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳＡの結果
を示す図である。
ムで部分純化したＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳＡの結果
を示す図である。
【図３】検体Ｎｏ．２７をＨＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑカラ
ムで部分純化したＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳＡの結果
を示す図である。
ムで部分純化したＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳＡの結果
を示す図である。
【図４】簡易法で調製したＩｇＭ画分を用いたＥＬＩＳ
Ａの結果を示す図である。
Ａの結果を示す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 魚類血清中の抗脳細胞壊死ウイルス抗体
を免疫学的手段により検出することを特徴とする魚類の
脳細胞壊死ウイルス感染診断法。 - 【請求項２】 免疫学的手段が、脳細胞壊死ウイルス又
は当該ウイルスの外被蛋白質及び酵素標識２次抗体を用
いた酵素標識免疫測定法によるものである請求項１記載
の診断法。 - 【請求項３】 魚類血清に脳細胞壊死ウイルス又は当該
ウイルスの外被蛋白質及び標識２次抗体を反応させ、魚
類血清中の抗脳細胞壊死ウイルス抗体に結合した標識量
又は非結合標識量を測定することを特徴とする、魚類血
清中の抗脳細胞壊死ウイルス抗体の検出法。 - 【請求項４】 魚類血清のＩｇＭ画分に脳細胞壊死ウイ
ルス又は当該ウイルスの外被蛋白質及び標識２次抗体を
反応させ、魚類血清中の抗脳細胞壊死ウイルス抗体に結
合した標識量又は非結合標識量を測定することを特徴と
する魚類血清中の抗脳細胞壊死ウイルス抗体の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4039038A JPH07104353B2 (ja) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | 魚類の脳細胞壊死ウイルス感染診断法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4039038A JPH07104353B2 (ja) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | 魚類の脳細胞壊死ウイルス感染診断法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05232115A true JPH05232115A (ja) | 1993-09-07 |
| JPH07104353B2 JPH07104353B2 (ja) | 1995-11-13 |
Family
ID=12541954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4039038A Expired - Lifetime JPH07104353B2 (ja) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | 魚類の脳細胞壊死ウイルス感染診断法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07104353B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007255892A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-10-04 | Mie Univ | 魚類抗体産生の新規検出法 |
-
1992
- 1992-02-26 JP JP4039038A patent/JPH07104353B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007255892A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-10-04 | Mie Univ | 魚類抗体産生の新規検出法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07104353B2 (ja) | 1995-11-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4433059A (en) | Double antibody conjugate | |
| US4536479A (en) | Use of anti-idiotype antibodies in immunoassays | |
| CN111246918A (zh) | 对称二甲基精氨酸的检测 | |
| WO1986000140A1 (en) | Polyclonal antibodies, preparation and use | |
| US6800608B2 (en) | Homogeneous assay of vancomycin using a stable particle-vancomycin conjugate, a novel rate enhancer, and a novel dose response modulator | |
| US4233286A (en) | Low affinity IGM-latex particles and assay therewith for immune complexes | |
| KR100756117B1 (ko) | 모노클로날 항체, 하이브리도마, 면역분석 방법 및 진단킷트 | |
| JP2001505778A (ja) | ＨＩＶ感染の初期の検出のための未変性の（ｎｏｎ―ｄｅｎｔｕｒｅｄ）ＨＩＶ抗原を使用する新規のＥＩＡ試験 | |
| CA2005204C (en) | Solid phase immunoassay with lyophilised conjugate | |
| JPH05232115A (ja) | 魚類の脳細胞壊死ウイルス感染診断法 | |
| JPWO1993003365A1 (ja) | 下痢性貝毒に特異的なモノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び下痢性貝毒の検出方法 | |
| EP0404186A2 (en) | Process of measuring specific antibody | |
| JP2000180446A (ja) | 干渉作用を回避する方法及び試薬 | |
| JP3569074B2 (ja) | イムノアッセイ法 | |
| KR920010224B1 (ko) | 응집반응 측정법 | |
| US4937201A (en) | Latex reagent for detection of the toxin of clostridium difficile | |
| JP3483586B2 (ja) | Ｃ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体 | |
| JP4422291B2 (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 | |
| JPH11344493A (ja) | 免疫的測定法 | |
| JP3493543B2 (ja) | 抗体測定方法 | |
| JP3936678B2 (ja) | 抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及び抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法 | |
| JP4037586B2 (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 | |
| JP2004184125A (ja) | 免疫学的検出試薬、該試薬を用いた検出方法及び該試薬の製造方法 | |
| JP2003302401A (ja) | 高性能モノクローナル抗ハプテン抗体による迅速高感度測定法 | |
| JPH11311625A (ja) | 簡便な抗体価測定方法及び抗パルボウイルス抗体検出用参照抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |