JPH05236986A - 安定同位体標識蛋白質の製造法および試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 無細胞蛋白質合成系に、アミノ酸を含む基質
溶液を連続的に供給しつつ、該反応系から生成した蛋白
質を含む流出液を取り出して連続的に目的蛋白質を製造
する方法であって、¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの安定同位体により
標識された少なくとも１種類の標識アミノ酸を含む基質
を用いる安定同位体標識蛋白質の製造法。 【効果】 蛋白質に存在する２０種類のアミノ酸残基の
うち、任意の特定アミノ酸残基の任意の原子だけにほぼ
１００％の効率で安定同位体で標識された目的の標識蛋
白質を安価に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、分子生物学および蛋白
質工学の分野において使用される安定同位体標識蛋白質
の製造法に係わり、より詳細には、蛋白質を安定同位体
で標識し、核磁気共鳴装置などによりその蛋白質の立体
構造や、その機能を解析する技術において、蛋白質のあ
る特定の種類のアミノ酸残基のみ、もしくは全てのアミ
ノ酸残基を標識する方法、およびその方法を行なうため
の試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、分子生物学および蛋白質工学の分
野においては、炭素１３（以下¹³Ｃと記す）や窒素１５
（以下¹⁵Ｎと記す）などの安定同位体で蛋白質を標識
し、この標識された蛋白質を用いて蛋白質の立体構造や
その機能を解析する技術が知られている。また、このよ
うな安定同位体により標識された蛋白質の製造法につい
ても、いくつかの例が知られている。

【０００３】目的の蛋白質を合成、分泌するバクテリ
ア、動物細胞などの細胞が入手可能な場合には、その細
胞を特定の安定同位体標識アミノ酸を含むアミノ酸混合
培地で培養し、合成された目的の蛋白質を分離生成す
る。

【０００４】目的の蛋白質の遺伝情報をコードする塩
基配列が分かっている場合には、遺伝子組み換えの手法
により、その塩基配列をベクターに組み込み、そのベク
ターを宿主菌に導入し、目的の蛋白質を発現させ、目的
蛋白質を分離、精製する。この時、宿主菌として標識し
ようとするアミノ酸に対する要求性変異株を用い、培地
中にその安定同位体標識アミノ酸を加えることにより、
目的のアミノ酸残基が安定同位体で標識された蛋白質が
得られる。

【０００５】全てのアミノ酸残基を標識する場合に
は、培地中の炭素源、窒素源、酸素源、水素源、硫黄源
などを安定同位体で標識したものに置換し、目的の蛋白
質を合成する細胞、もしくは目的の蛋白質を合成するよ
うに形質転換された細胞を培養し、目的蛋白質を合成さ
せ、次いで目的蛋白質を分離精製する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
安定同位体標識蛋白質の製造法では、細胞内の蛋白質合
成系を用いて蛋白質を合成しているために、次のような
問題があった。

【０００７】ａ．蛋白質を合成する細胞がアミノ酸要求
性変異株でない場合には、細胞自身がアミノ酸生合成系
を持つため、細胞内で新たに合成されたアミノ酸により
安定同位体の標識化率が場合によっては４０％程度まで
低下する。

【０００８】ｂ．また、生体内では、アミノ酸の代謝経
路が存在するため、標識した安定同位体が目的以外のア
ミノ酸に転移してしまう。特にアミノ基に標識した¹⁵Ｎ
がアミノトランスフェラーゼにより転移することは顕著
である。また、セリン←→グリシン←→スレオニン間の
代謝反応も非常に頻繁に起こり、この３種のアミノ酸内
の特定のアミノ酸のみを標識することは困難である。

【０００９】ｃ．また、遺伝子組み換えの手法を用いる
場合には、遺伝子組み換えの一般的な問題点として、蛋
白質の不溶化や、菌体内プロテアーゼによる蛋白質の分
解などにより目的の蛋白質が得られないことがしばしば
起こる。

【００１０】ｄ．また、培地として安定同位体標識アミ
ノ酸を加えているため、目的の蛋白質合成以外に細胞増
殖のためにもアミノ酸が消費される。このため、大量の
安定同位体標識アミノ酸を必要とするため、得られる目
的蛋白質は非常に高価なものとなってしまう。

【００１１】一方、細胞内から蛋白質合成系を取り出し
た無細胞蛋白質合成系を用いて放射性同位体標識蛋白質
を合成する技術は既に知られており、そのための試薬キ
ットも市販されている。しかし、この反応に用いる無細
胞蛋白質合成系は、従来からのバッチ式の反応系を用い
ているため極微量の蛋白質（μｇ以下）が合成可能なだ
けであり、放射性同位体を用いた系でなければ検出する
ことができない。このため従来の技術では無細胞蛋白質
合成系において、放射性同位体の代わりに安全性の高い
安定同位体標識蛋白質を合成することは全く考えられて
いなかった。そして、既に市販されている試薬キットも
バッチ式の無細胞蛋白質合成系において放射性同位体標
識蛋白質を合成することのみを目的としており、連続式
無細胞蛋白質合成系において安定同位体標識蛋白質を合
成する目的には不適である。

【００１２】本発明は、上記事情に鑑みてなされたもの
で、安定同位体標識蛋白質の合成において、蛋白質の不
溶化や細胞内プロテアーゼによる分解を受けることな
く、蛋白質に存在する２０種類のアミノ酸残基のうち任
意の特定のアミノ酸残基の任意の原子だけにほぼ１００
％の標識化率で安定同位体が標識された目的の蛋白質が
安価に、簡単にかつ必要充分量を得ることが可能な安定
同位体標識蛋白質の製造法の提供を目的としている。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、無細胞蛋白質
合成系にアミノ酸を含む基質溶液を連続的に供給しつ
つ、該反応系から生成した蛋白質を含む流出液を取り出
して連続的に目的蛋白質を製造する方法であって、
¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの安定同位体により標識された少なくと
も１種類の標識アミノ酸を含む基質を用いることを特徴
とする安定同位体標識蛋白質の製造法によって上記課題
を解消した。

【００１４】また、前記安定同位体標識蛋白質の製造法
は、¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの安定同位体により標識された少な
くとも１種類の標識アミノ酸を含む基質と、無細胞蛋白
質合成系と、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰなどのリ
ボヌクレオチドとを具備した安定同位体標識蛋白質の試
薬キットに適用させることができる。

【００１５】また、前記無細胞蛋白質合成系は、アミノ
酸生合成系、アミノ酸代謝系などの蛋白質合成系以外の
活性を低下させた無細胞蛋白質合成系を用いることが望
ましい。この蛋白質合成系以外の活性を低下させた無細
胞蛋白質合成系としては、アミノ酸リッチの条件下で培
養した細菌または細胞から抽出した無細胞蛋白質合成
系、アミノ酸生合成系やアミノ酸代謝系に対する阻害剤
を添加した無細胞蛋白質合成系、アミノ酸生合成系やア
ミノ酸代謝系などが欠損した細菌または細胞から抽出し
た無細胞蛋白質合成系、モノクローナル抗体によりアミ
ノ酸生合成系やアミノ酸代謝系などを除いた無細胞蛋白
質合成系の各種の無細胞蛋白質合成系の１種または２種
以上を組み合わせて用いることができる。

【００１６】

【作用】無細胞蛋白質合成系を用い、¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの
安定同位体により標識された少なくとも１種類の標識ア
ミノ酸を含む基質を連続的に供給して安定同位体標識蛋
白質を製造することによって、蛋白質に存在する２０種
類のアミノ酸残基のうち、任意の特定アミノ酸残基の任
意の原子だけにほぼ１００％の標識化率で安定同位体が
標識された目的蛋白質が安価に得られる。

【００１７】

【実施例】本発明において好適に用いられる無細胞蛋白
質合成系としては、ウサギ網状赤血球の溶血系、小麦胚
芽抽出物などの無細胞翻訳系や、大腸菌Ｓ−３０抽出物
のような無細胞転写翻訳共役系などである。これらは主
としてリボゾーム、ｔＲＮＡや蛋白質合成に必要な酵素
等であり、２０種類のアミノ酸を基質として蛋白質を合
成するものである。

【００１８】また、本発明では、上記無細胞蛋白質合成
系に存在しているアミノ酸生合成系、アミノ酸代謝系な
ど蛋白質合成系以外の活性を低下させたものが用いられ
る。蛋白質合成系以外の活性を低下させた無細胞蛋白質
合成系を作製する方法としては、無細胞蛋白質合成系を
取り出すべき細胞あるいは細菌を、アミノ酸リッチの条
件下（通常の培養培地中のアミノ酸濃度の約１０倍の濃
度とした培地を用いる。）で培養し、細胞あるいは細菌
体内のアミノ酸生合成系、アミノ酸代謝系などの蛋白質
合成系以外の活性を低下させた後、Ｚｕｂａｙの方法
（Ｚｕｂａｙ Ｇ．(1973) Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇ
ｅｎｅｔ．７， ２６７−２８７）などの従来より知ら
れている無細胞転写翻訳共役系やｔＲＮＡの調製法など
の技術を用い、細菌あるいは細胞から分離して利用する
方法が好適に用いられる。

【００１９】また、蛋白質合成系以外の活性を低下させ
た無細胞蛋白質合成系を作製する方法としては、上記方
法以外に、 ・無細胞蛋白質合成系にアミノ酸生合成系やアミノ酸代
謝系に対する阻害剤を添加する方法 ・アミノ酸生合成系やアミノ酸代謝系などが欠損した細
菌または細胞から抽出した無細胞蛋白質合成系を用いる
方法 ・アミノ酸生合成系、アミノ酸代謝系に対する抗体（モ
ノクローナル抗体）を作製し、その抗体によりアミノ酸
生合成系やアミノ酸代謝系などを除いた無細胞蛋白質合
成系を用いる方法 があり、これらの方法を単独あるいは２種以上の組み合
わせによって、蛋白質合成系以外の活性を低下させた無
細胞蛋白質合成系を得る。

【００２０】また、本発明において用いられる基質とし
ては、蛋白質を構成する２０種類のアミノ酸（グリシ
ン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリ
ン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アス
パラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、シスチ
ン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプ
トファン、ヒスチジン、プロリン）のうちの少なくとも
１種あるいは全ての種類のアミノ酸が、¹³Ｃ，¹⁵Ｎなど
の安定同位体により標識された標識アミノ酸を含む基質
溶液が用いられる。この基質溶液には、標識アミノ酸、
非標識アミノ酸の他、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ
等のリボヌクレオチドなどが加えられる。

【００２１】図１は、本発明に係わる安定同位体標識蛋
白質の製造方法を実施するのに好適な製造装置の一例を
示す図であって、符号１は反応槽、２は基質溶液タン
ク、３は流出液である。反応槽１内には、前述した蛋白
質合成系以外の酵素活性を低下させた無細胞蛋白質合成
系が収容されている。この反応槽１の下方側からは基質
溶液タンク２から圧送された基質溶液が連続的に供給さ
れ、反応槽１の上部に取り付けられた限外ろ過器４を通
して、反応槽１内で生成した標識蛋白質を含む流出液３
が流出するようになっている。

【００２２】この装置を用いて連続的に標識蛋白質を製
造するには、反応槽１内に、目的蛋白質を合成するため
の無細胞蛋白質合成系を含む溶液を収容し、この反応槽
１内に標識アミノ酸を含む基質溶液を連続的に圧送す
る。基質溶液を反応槽１内に圧送するには、系内に気相
を含むことがなく、脈流が少なく、圧力と流量の制御が
可能なポンプ、例えば高速液体クロマトグラフィー用ポ
ンプ、中圧液体クロマトグラフィー用ポンプ、低圧液体
クロマトグラフィー用ポンプなどを用いて圧送すること
が望ましい。この基質溶液の圧送量は、通常は一定に設
定されるが、反応時間の経過とともに圧送量を増加させ
あるいは減少させても良い。

【００２３】反応槽１内に供給された少なくとも１種類
の標識アミノ酸を含む２０種類のアミノ酸は、無細胞蛋
白質合成系の作用によって標識アミノ酸を含んだ標識蛋
白質に生合成される。この標識蛋白質は、蛋白質を構成
するアミノ酸のうちの少なくとも１種類が¹³Ｃ，¹⁵Ｎな
どの安定同位体により標識されており、この標識アミノ
酸残基はＮＭＲを用いて検出することができる。

【００２４】反応槽１内で生合成された標識蛋白質を含
む流出液３は、限外ろ過器４を通って採取容器５に集め
られる。この限外ろ過器３は、反応槽１内に収容された
リボゾームやＲＮＡ、酵素等の無細胞蛋白質合成系本体
を透過させることなく、合成された標識蛋白質、基質あ
るいはその分解物（ＡＭＰ，ＧＭＰ，ポリリン酸塩、無
機リン酸塩など）を透過させるような孔径を有するろ過
材を備えたものが使用される。

【００２５】上記基質溶液タンク２内の基質溶液は１０
℃以下の温度で保存されるのが望ましく、また、反応槽
１内は２０〜４０℃に保温するのが望ましい。また反応
槽１内はマグネチックスターラーなどを用いて攪拌状態
としても良い。

【００２６】流出液３から標識蛋白質を分離精製する方
法は、従来より知られている蛋白質の分離生成法が使用
され、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動法などが好適に用いられる。分離された標
識蛋白質は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）などにより標識され
たアミノ酸残基を検出し、その立体構造や機能を解析す
る技術において使用される他、代謝試験用試薬などの医
療分野にも利用が可能である。

【００２７】この安定同位体標識蛋白質の製造方法は、
無細胞蛋白質合成系を用い、¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの安定同位
体により標識された少なくとも１種類の標識アミノ酸を
含む基質を連続的に供給して安定同位体標識蛋白質を製
造することによって、蛋白質に存在する２０種類のアミ
ノ酸残基のうち、任意の特定アミノ酸残基の任意の原子
だけにほぼ１００％の標識化率で安定同位体が標識され
た目的の標識蛋白質を製造することができる。

【００２８】次に、本発明に係わる安定同位体標識蛋白
質の試薬キットについて説明する。この試薬キットは、 ¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの安定同位体により標識された少な
くとも１種類の標識アミノ酸を含むアミノ酸混合体（ア
ミノ酸基質） 無細胞蛋白質合成系 ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰなどのリボヌクレ
オチド とを具備して構成される。なお、これら〜の材料の
他、基質溶液のｐＨを調節するための緩衝液などを含め
ることができる。

【００２９】蛋白質の構造解析などにおいては、標識ア
ミノ酸の種類の異なる多種類の標識蛋白質が必要となる
場合が多い。このような場合には、標識アミノ酸の種類
を各種組み合わせた基質用アミノ酸混合体を用意するこ
とが望ましい。即ち、２０種類のアミノ酸のうちの少な
くとも１種類に標識アミノ酸を用いたアミノ酸混合体あ
るいは２０種類のアミノ酸の全てに標識アミノ酸を用い
たアミノ酸混合体である。１種類以上の標識アミノ酸を
含むアミノ酸混合体は、多種類の組み合わせが考えられ
るが、通常は、２０種類のアミノ酸のうちの１種類を標
識アミノ酸とし、残りの１９種類を非標識（天然型）ア
ミノ酸としたアミノ酸混合体（２０種類）、全ての種類
のアミノ酸を標識アミノ酸としたアミノ酸混合体、全て
の種類のアミノ酸を非標識（天然型）アミノ酸としたア
ミノ酸混合体という程度の組み合わせが用いられる。

【００３０】上記無細胞蛋白質合成系は、蛋白質合成系
以外の活性を低下させた無細胞蛋白質合成系を用いるこ
とが望ましい。このような無細胞蛋白質合成系は、アミ
ノ酸リッチの条件下で培養した細菌または細胞から抽出
した無細胞蛋白質合成系、アミノ酸生合成系やアミノ酸
代謝系に対する阻害剤を添加した無細胞蛋白質合成系、
アミノ酸生合成系やアミノ酸代謝系などが欠損した細菌
または細胞から抽出した無細胞蛋白質合成系、モノクロ
ーナル抗体によりアミノ酸生合成系やアミノ酸代謝系な
どを除いた無細胞蛋白質合成系の各種の無細胞蛋白質合
成系の１種または２種以上を組み合わせて用いることが
できる。

【００３１】この試薬キットにあっては、アミノ酸混
合体、無細胞蛋白質合成系、リボヌクレオチドは、
それぞれ別容器に収容されるか、あるいはアミノ酸混
合体とリボヌクレオチドを混合した基質と、無細胞
蛋白質合成系とを別容器に収容する。アミノ酸混合体
およびリボヌクレオチドは、水（緩衝液や酸溶液）に
溶かした状態でも冷凍保存すれば比較的安定である。
無細胞蛋白質合成系は、細菌や細胞から抽出したリボゾ
ームやＲＮＡ、酵素等を含む液体であり、そのままの状
態では短時間で劣化してしまうので、その保存は−８０
℃〜液体窒素中保存とするのが望ましい。

【００３２】（実験例）図１に示す製造装置を構築し、
標識蛋白質の合成を実施した。無細胞蛋白質合成系とし
ては、Ｚｕｂａｙらの開発した大腸菌のＳ３０抽出液を
用いる転写翻訳共役系（Ｚｕｂａｙ Ｇ．（１９７３）
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．７，２６７−２８７）
を用い、グリシン残基を¹⁵Ｎで標識したＣＡＴ（クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を合成さ
せた。

【００３３】大腸菌Ｓ３０抽出液の調製 Ｚｕｂａｙらの方法にしたがって、大腸菌Ａ１９株から
調製した。なお、この抽出液は、−８０℃以下であれば
比較的長期間の保存が可能であった。

【００３４】プラスミドＤＮＡ 転写翻訳共役系において、ＣＡＴを効率良く発現するよ
うに作製したプラスミドＤＮＡ ｐＡＣＬ６を用いた。

【００３５】連続無細胞蛋白質合成反応は、容量１ｍ
ｌの反応槽で行なった。ここに１７０μｌの大腸菌Ｓ３
０抽出液、１００μｇのプラスミドＤＮＡ、１７４μｇ
のｔＲＮＡを入れ、基質溶液を満たした。この反応槽を
３７℃に加温し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）用のポンプ（東ソー社製、ＣＣＰＭ）を用いて基質
溶液を供給した。

【００３６】基質溶液としては、グリシンが¹⁵Ｎにより
標識された標識アミノ酸を含む２０種類のアミノ酸（各
０．３５ミリモル）、５５．０ミリモル・トリス酢酸溶
液（ｐＨ８．２）、１．６５ミリモル・ＤＴＴ、１．２
２ミリモルＡＴＰ、０．８４ミリモル・ＣＴＰ・ＧＴＰ
・ＵＴＰ、２７．０ミリモル・ホスホエノールピルビン
酸エステル、１．９％ポリエチレングリコール-6000、
３４．４μｇ／ｍｌフォリン酸、０．６４ミリモル・
3',5'-サイクリックＡＭＰ、３６．０ミリモル酢酸アン
モニウム、７２．０ミリモル酢酸カリウム、９．７ミリ
モル酢酸カルシウム、１０．０ミリモル酢酸マグネシウ
ムを含む溶液を用いた。この基質溶液は、−２０℃冷凍
保存により長期保存が可能であった。

【００３７】基質溶液を供給すると同時に、分画分子量
１０万ダルトンの限外ろ過膜ＹＭ１００（アミコン社
製）を通して、反応生産物（標識ＣＡＴ）および反応に
用いられたリボヌクレオチド、アミノ酸および分解物
（ＡＭＰ，ＧＭＰ，無機リン酸など）を含む流出液を反
応槽から取り出した。なお、基質溶液の供給量は２ｍｌ
／時間に設定した。また基質溶液は約４℃で保存した。

【００３８】このようなシステムを用い、１７時間にわ
たり無細胞蛋白質合成系により、２０種類のアミノ酸の
うちのグリシン残基が¹⁵Ｎにより標識されたＣＡＴ（安
定同位体標識蛋白質）の合成を行なった。この合成終了
後、アフィニティクロマトグラフィーにより流出液中の
ＣＡＴを精製した。

【００３９】精製後のＣＡＴを６Ｎ−ＨＣｌで２４時
間、酸加水分解し、得られたアミノ酸をＴＢＤＭＳで誘
導体化した後、ＧＣ−ＭＳで各アミノ酸を分析した結
果、グリシン残基のみが¹⁵Ｎで標識されているのを確認
した。

【００４０】

【発明の効果】以上説明したように、本発明は、無細胞
蛋白質合成系を用い、¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの安定同位体によ
り標識された少なくとも１種類の標識アミノ酸を含む基
質を連続的に供給して安定同位体標識蛋白質を製造する
ことによって、蛋白質に存在する２０種類のアミノ酸残
基のうち、任意の特定アミノ酸残基の任意の原子だけに
ほぼ１００％の効率で安定同位体で標識された目的の標
識蛋白質を安価に製造することができる。従って、蛋白
質の立体構造や機能を解析する技術などに用いる標識蛋
白質を安全かつ極めて容易に製造することが可能とな
り、蛋白質の構造解析等の技術において寄与するところ
が大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の安定同位体標識蛋白質の製造方法を説
明するための製造装置の概略構成図である。

【符号の説明】

１ 反応槽 ２ 基質溶液タンク ３ 流出液 ４ 限外ろ過器

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無細胞蛋白質合成系にアミノ酸を含む基
   質溶液を連続的に供給しつつ、該反応系から生成した蛋
   白質を含む流出液を取り出して連続的に目的蛋白質を製
   造する方法であって、前記基質に、¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの安
   定同位体により標識された少なくとも１種類の標識アミ
   ノ酸を含むことを特徴とする安定同位体標識蛋白質の製
   造法。
2. 【請求項２】 前記無細胞蛋白質合成系として、アミノ
   酸生合成系、アミノ酸代謝系などの蛋白質合成系以外の
   酵素活性を低下させた無細胞蛋白質合成系を用いること
   を特徴とする請求項１記載の安定同位体標識蛋白質の製
   造法。
3. 【請求項３】 前記無細胞蛋白質合成系として、アミノ
   酸リッチの条件下で培養した細菌または細胞から抽出し
   た無細胞蛋白質合成系を用いることを特徴とする請求項
   ２記載の安定同位体標識蛋白質の製造法。
4. 【請求項４】 前記無細胞蛋白質合成系として、アミノ
   酸生合成系、アミノ酸代謝系に対する阻害剤を添加した
   無細胞蛋白質合成系を用いることを特徴とする請求項２
   記載の安定同位体標識蛋白質の製造法。
5. 【請求項５】 前記無細胞蛋白質合成系として、アミノ
   酸生合成系、アミノ酸代謝系などが欠損した細菌または
   細胞から抽出した無細胞蛋白質合成系を用いることを特
   徴とする請求項２記載の安定同位体標識蛋白質の製造
   法。
6. 【請求項６】 前記無細胞蛋白質合成系として、モノク
   ローナル抗体によりアミノ酸生合成系、アミノ酸代謝系
   などを除いた無細胞蛋白質合成系を用いることを特徴と
   する請求項２記載の安定同位体標識蛋白質の製造法。
7. 【請求項７】 請求項３〜６記載の無細胞蛋白質合成系
   のうちの少なくとも２種以上を組み合わせて用いること
   を特徴とする請求項２記載の安定同位体標識蛋白質の製
   造法。
8. 【請求項８】 ¹³Ｃ，¹⁵Ｎなどの安定同位体により標識
   された少なくとも１種類の標識アミノ酸を含む基質と、
   無細胞蛋白質合成系と、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴ
   Ｐなどのリボヌクレオチドとを具備した安定同位体標識
   蛋白質の試薬キット。
9. 【請求項９】 前記無細胞蛋白質合成系として、アミノ
   酸生合成系、アミノ酸代謝系などの蛋白質合成系以外の
   活性を低下させた無細胞蛋白質合成系を用いることを特
   徴とする請求項８記載の安定同位体標識蛋白質の試薬キ
   ット。
10. 【請求項１０】 前記無細胞蛋白質合成系として、アミ
    ノ酸リッチの条件下で培養した細菌または細胞から抽出
    した無細胞蛋白質合成系を用いることを特徴とする請求
    項９記載の安定同位体標識蛋白質の試薬キット。
11. 【請求項１１】 前記無細胞蛋白質合成系として、アミ
    ノ酸生合成系、アミノ酸代謝系に対する阻害剤を添加し
    た無細胞蛋白質合成系を用いることを特徴とする請求項
    ９記載の安定同位体標識蛋白質の試薬キット。
12. 【請求項１２】 前記無細胞蛋白質合成系として、アミ
    ノ酸生合成系、アミノ酸代謝系などが欠損した細菌また
    は細胞から抽出した無細胞蛋白質合成系を用いることを
    特徴とする請求項９記載の安定同位体標識蛋白質の試薬
    キット。
13. 【請求項１３】 前記無細胞蛋白質合成系として、モノ
    クローナル抗体によりアミノ酸生合成系、アミノ酸代謝
    系などを除いた無細胞蛋白質合成系を用いることを特徴
    とする請求項９記載の安定同位体標識蛋白質の試薬キッ
    ト。
14. 【請求項１４】 請求項１０〜１３記載の無細胞蛋白質
    合成系のうちの少なくとも２種以上を組み合わせて用い
    ることを特徴とする請求項９記載の安定同位体標識蛋白
    質の試薬キット。