JPH05236997A - ポリヌクレオチド捕捉用チップ - Google Patents

ポリヌクレオチド捕捉用チップ

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JPH05236997A
JPH05236997A JP4042829A JP4282992A JPH05236997A JP H05236997 A JPH05236997 A JP H05236997A JP 4042829 A JP4042829 A JP 4042829A JP 4282992 A JP4282992 A JP 4282992A JP H05236997 A JPH05236997 A JP H05236997A
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target polynucleotide
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Kazunobu Okano
和宣 岡野
Hideki Kanbara
秀記 神原
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Hitachi Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】試料中の複数の標的ポリヌクレオチドを単一の
反応チップで同時に検出する方法、及び複数の標的ポリ
ヌクレオチドを分取する方法を提供する。 【構成】反応チップに異なる標的ポリヌクレオチドを捕
捉する複数の独立したセル１１、〜ｎを設ける。各セル
には異なるプローブが固定されており、標的ポリヌクレ
オチドが捕捉されたセルを検出し、捕捉された標的ポリ
ヌクレオチドの種類を判定する。また、個々のセルは電
極を兼ね、捕捉された標的ポリヌクレオチドをセル毎に
溶離させ複数の標的ポリヌクレオチドを分取する。 【効果】反応操作が少なく、試料溶液が少なくてすむ。
同一の標的ポリヌクレオチドを複数のプローブで検出す
るので、測定結果の信頼度が従来法に比べ高い。また複
数の標的ポリヌクレオチドを分離できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明の目的は、疾病の原因とな
るウィルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクレオ
チド、あるいは、生物中の特定の遺伝情報を担うポリヌ
クレオチドの有無およびその変異を検出する診断的方
法、及び、ポリヌクレオチド構造解析に関するポリヌク
レオチド分取法、並びに、これらに使用するプローブ固
定チップに関する。
【０００２】
【従来の技術】標的となるポリヌクレオチド（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）試料を固相に捕捉する方法、並びに、血液
や排泄物等の試料中の細菌やウィルス等の外来性の標的
ポリヌクレオチドを検出する方法が、特開昭５８−３１
９９８に開示されている。この方法では、試料中のポリ
ヌクレオチドを加熱等により変性させて一本鎖とした
後、これを、ニトロセルロース膜に固定する。次に、検
査したい細菌やウィルスのポリヌクレオチドと相補的な
塩基配列を持つ放射性同位元素標識されたポリヌクレオ
チドプローブを反応させた後、この膜を洗浄する。も
し、試料中に細菌やウィルスのポリヌクレオチドが含ま
れていれば、これに標識ポリヌクレオチドプローブがハ
イブリダイゼーション反応により会合して膜上に残る。
これをオートラジオグラフィーにより検出することで標
的ポリヌクレオチドの有無を判定できる。
【０００３】標的となるポリヌクレオチド（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）試料を固相に捕捉する他の方法は、アナリテ
ィカル バイオケミストリー １９８巻（１９９１
年）、１３８頁から１４２頁（Ｓφｒｅｎ Ｒｉｃｈａ
ｒｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔａｌ，Ａｎａｌｉｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８，１２８〜
１４２（１９９１））にエス．アール．ラスムッセンら
の方法が記載されている。この方法では、ポリヌクレオ
チドの５’末端のリン酸基を１−メチルイミダゾールと
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミドを用いて活性化し、表面に２級アミンを導
入したポリスチレンマイクロプレートに固定する。この
方法では２級アミンと活性化した５’末端のリン酸基が
反応するのでポリヌクレオチドの５’末端側がマイクロ
プレート表面に共有結合で固定される。この例では、固
定化されたポリヌクレオチドを用いて試料中の標的オリ
ゴヌクレオチドを捕捉することをできる。いずれの方法
でも、32Ｐ等で標識したプローブを用いて特定のオリゴ
ヌクレオチドを検出することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記ポリヌクレオチド
固定法では、複数の測定対象物を測定するには測定対象
の数だけ反応担体を準備する必要がある。これは検出に
用いる標識プローブが測定対象により異なるためであ
る。もちろん、個々のプローブを標識する物質を波長の
ことなる蛍光体を用いて数種の測定対象を同時に測定す
ることは可能であるが測定対象の数が増えると同時検出
は困難になる。さらに捕捉した標的ポリヌクレオチドを
分取する目的には、前記した最初の従来技術ではチップ
上に多数の異なるポリヌクレオチドが固定されている
上、各ポリヌクレオチドが強固に固定されているので、
標的ポリヌクレオチドのみを溶出させることが難しい。
また、エス．アール．ラスムッセンらの方法では、プロ
ーブとなるポリヌクレオチドを固定した担体を用い、標
的ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせて捕
捉するので、標的ポリヌクレオチドを溶出させることは
容易と考えられる。しかし、この方法では固定されたプ
ローブにハイブリダイズするのは特定の配列を持つポリ
ヌクレオチドなので、複数種の標的オリゴヌクレオチド
を同時に分取することは難しい。もちろんハイブリダイ
ゼージョンの条件をあいまいにして溶出条件を変化させ
て配列の似た複数種の標的ポリヌクレオチドを得る方法
もあるが、不安定な条件での分離を強いられるため十分
な分離能が得られないことがあり、試料の状態に左右さ
れやすく条件設定が煩雑になる場合が多い。また、全く
配列の異なる標的オリゴヌクレオチドを分取することは
困難である。本発明の目的は、複数種の標的ポリヌクレ
オチドを同時に捕捉できるようなポリヌクレオチド捕捉
用チップを提供し、さらにこれを用い複数種のポリヌク
レオチドを検出できる方法と複数種の標的ポリヌクレオ
チドを分取する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】標的ポリヌクレオチドに
相補的なプローブを固定したポリヌクレオチド捕捉用チ
ップにおいて、複数の標的ポリヌクレオチドに対する各
々異なるプローブが単一チップ上の各々異なる部位に形
成されたセルに固定化される。標的ポリヌクレオチドに
相補的なプローブを固定したポリヌクレオチド捕捉用担
体に、標識物の結合した標的ポリヌクレオチドを捕捉さ
せる工程、あるいは標的ポリヌクレオチドを捕捉させる
工程と標識物を結合させる工程を含むポリヌクレオチド
検出法において、ポリヌクレオチド捕捉用担体として上
記のポリヌクレオチド捕捉用チップを用いて、複数の標
的ポリヌクレオチドを測定する。標的ポリヌクレオチド
に相補的なプローブを固定したポリヌクレオチド捕捉用
担体により標的ポリヌクレオチドを捕捉したのち、これ
を分取する標的ポリヌクレオチド分取法であって、ポリ
ヌクレオチド捕捉用担体として使用される上記のポリヌ
クレオチド捕捉用チップでは、ポリヌクレオチド捕捉用
チップの各セルが標的ポリヌクレオチドを溶離させるた
めの電極を兼ね、複数の各プローブを固定した電極にか
かる電場を切り替えて、複数の標的ポリヌクレオチドを
溶離させ分取する。
【０００６】複数の標的ポリヌクレオチドを同時に分析
したり分取する目的のための本発明の特に注目すべき第
一の点は、同一の反応チップ内に異なる標的ポリヌクレ
オチドを捕捉する複数の独立した部位を設けた点にあ
る。これを図１を用いて説明する。図１は本発明の反応
チップの概念を示したもので、反応部１は複数のセル１
１〜ｎからなり、それぞれのセルにはそれぞれ異なるポ
リヌクレオチドプローブが固定されている。試料溶液を
添加しハイブリダイゼーション条件下で反応させると、
試料中に含まれる標的ポリヌクレオチドが反応チップに
捕捉される。この時、本発明では、それぞれの標的ポリ
ヌクレオチドをそれぞれのポリヌクレオチドプローブが
固定されている異なるセルに捕捉することができる。標
的ポリヌクレオチドを同時に分析するには標識プローブ
を用いて各セルに捕捉された標識物の量を測定すれば良
い。
【０００７】標的ポリヌクレオチドを分取するには各セ
ルに捕捉された標的ポリヌクレオチドを順次溶離させれ
ばよいが、各セルは隣接しているので、各セルに捕捉さ
れた標的ポリヌクレオチド同士の混入が問題になる。本
発明の注目すべき第２の点は、標的ポリヌクレオチドの
溶離方法にある。ハイブリダイゼーション反応によりチ
ップに捕捉した標的ポリヌクレオチドは加熱等により簡
単に溶離することができる。本発明では図２のように、
各セルに捕捉された標的ポリヌクレオチドを順次溶離さ
せるために、各セルに電場をかけられる構造としてい
る。正電場がかかっているセルでは加温した溶離液を添
加しても標的ポリヌクレオチドは負に帯電しているので
溶離しない。セルにかかる電場を負にすると静電的な反
発力により標的ポリヌクレオチドから溶離する。電場の
切り替えを全てのセルに関し順次行うことで、複数のセ
ルに捕捉された異なる標的ポリヌクレオチドを混入させ
ることなく溶離回収できる。もちろん一度溶離した標的
ポリヌクレオチドが他のセルに再捕捉されないようにた
だちに溶離した標的ポリヌクレオチドを回収する工夫も
必要である。これは、分取したいセルに正電極を配した
キャピラリー管を配置し、これに溶離した標的ポリヌク
レオチドを再捕捉させることで解決できる。
【０００８】
【作用】標的ポリヌクレオチド上に相補的に結合しうる
ポリヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドをハ
イブリダイゼーション条件下で反応させると、標的ポリ
ヌクレオチドとプローブの間で２種のポリヌクレオチド
のハイブリッドが形成される。この時、ポリヌクレオチ
ドプローブをチップに固定化しておけば標的ポリヌクレ
オチドがチップ上に捕捉されることになる。本発明で
は、チップ上に複数のセルを形成する必要上、チップは
表面が平坦なガラス、シリコンウエハーあるいは光学的
に平坦なプラスチックが望ましい。特にシリコンウエハ
ーは、実施例で示すように半導体製造プロセスで用いら
れる光反応型のレジストを用いてセルを形成させること
が容易なので有用なチップである。即ち、複数の標的ポ
リヌクレオチド用の異なるプローブを固定するには、各
セルを１個づつ活性化しプローブを固定する必要があ
る。ポジ型ホトレジストを用いて個々のセルを順次露出
しレジストを除き表面を活性化することで異なるプロー
ブを任意のセルに固定することが出来る。各セルに捕捉
された標的ポリヌクレオチドの検出には蛍光体等を標識
した第２のプローブを用いれば良い。標的ポリヌクレオ
チドはセルに固定された捕捉用プローブと標識プローブ
にサンドイッチ状に結合するので、各セルには標的ポリ
ヌクレオチドの量だけ標識プローブが固定される。よっ
て、螢光強度を測定することで捕捉された標的ポリヌク
レオチドの量を知ることが出来る。各セルに捕捉された
標的ポリヌクレオチドの分取には、温度を上げること
で、標的ポリヌクレオチドとプローブを解離させること
が出来る。高濃度のテトラエチルアンモニウムクロライ
ド等の４級アンモニウム塩を加えれば、標的ポリヌクレ
オチドの溶離温度をほぼそろえることができる。よっ
て、一定の温度に加熱すれば捕捉した標的ポリヌクレオ
チドを回収することが可能である。前記したように反応
チップのセルの電場を操作することで複数の標的ポリヌ
クレオチドを混在することなく得ることが出来る。
【０００９】
【実施例】
実施例１ 以下、本発明の実施例を説明する。本実施例で使用する
ポリヌクレオチドを示す。 配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
１のプローブ 配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
２のプローブ 配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
３のプローブ 配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
４のプローブ 配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
５のプローブ 配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
６のプローブ 本実施例では、同一の反応チップ内に異なるポリヌクレ
オチドプローブを固定した複数の独立したセルを有する
反応チップの調製法とこれを用いた標的ポリヌクレオチ
ドの検出法について説明する。
【００１０】配列番号１と２のポリヌクレオチドは、標
的ポリヌクレオチドであるλファージＤＮＡ捕捉用プロ
ーブ、配列番号３と４はＭ１３ファージ捕捉用プローブ
で、シリコンウエハーよりなる図１に示す反応チップに
固定して使用する。この反応チップは各プローブを固定
した反応部１、試料や標識プローブ等の添加部２、反応
残液排出部３からなり、周囲のフッ化エチレン樹脂でで
きた堤４で溶液を保持する構造となっている。反応部１
は異なるプローブを固定できるセル１１、１２、１３、
１４…ｎ−１、ｎよりなり、本実施例ではセル１１、１
２、１３、１４にプローブ１、２、３及び４を固定して
用いる。反応部は１列で不足の場合は２次元的に平面上
に配置することが可能なので、固定できるプローブの種
類は任意に増やすことができる。反応チップの反応部１
への各プローブの固定は以下の手順で行う。まず、シリ
コンウエハー表面を水蒸気酸化した後、フッ化エチレン
樹脂堤４を形成する。ここで、水蒸気酸化は次の工程で
表面をアミノシラン化する上で必須であるが、通常の半
導体製造プロセスでの絶縁膜形成のような厚い酸化層を
形成させる必要はない。次に、３−（２−アミノエチル
アミノプロピル）トリメトキシシランを用いて酸化膜表
面をアミノシラン化しシリコンウエハー表面にアミノ基
を導入する。アミノ基をトリフルオロアセチル化して保
護する。
【００１１】次に、キノンジアジドを付加したフェノー
ルノボラック系のポジ型レジストを塗布し９５℃でベー
クする。このレジストは露光した部分をアルカリ洗浄で
除去できるので、露光、アルカリ洗浄、トリフルオロア
セチル基の除去、ポリヌクレオチドプローブの固定の工
程を繰り返すことで異なるプローブをシリコンウエハー
上の異なる位置に順次固定することができる。まず、シ
リコンウエハー表面の１１の部分を３５０ｎｍ〜４００
ｎｍの光で露光し、セル１１のレジストを除去する。次
に、トリメチルアンモニウム水溶液で洗浄し、分解した
レジストを除去する。アミノ基を保護しているトリフル
オロアセチル基も同時に除去される。次に、アナリティ
カル バイオケミストリー １９８巻（１９９１年）、
１３８頁から１４２頁（Ｓφｒｅｎ Ｒｉｃｈａｒｄ
Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎａｌｉｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８、１２８〜１４
２（１９９１））に記載のエス．アール．ラスムッセン
らの方法に従い５’末端にリン酸基を持つ第１のプロー
ブを固定する。即ち、ｐＨ７の１−メチルイミダゾール
緩衝液と０．２Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミドの存在下、第１のプロ
ーブを５時間５０℃で反応させる。
【００１２】同様にしてセル１２、１３、１４で同様の
工程を繰返し第２第３及び第４のプローブを固定する。
最後に、全てのセルをトリメチルアンモニウム水溶液で
洗浄し、カルボジイミドの副反応物を除去する。以上の
工程で、表面に異なるポリヌクレオチドプローブを固定
した複数の独立したセルを有する反応チップを得る。
【００１３】標的ポリヌクレオチドであるλファージＤ
ＮＡとＭ１３ファージの検出法を示す。第５のプローブ
はλファージＤＮＡ検出用のプローブで、５’末端がス
ルホローダミン１０１で標識されている。第６のプロー
ブはＭ１３ファージの検出用のプローブで、同じく５’
末端がスルホローダミン１０１で標識されている。５’
末端をスルホローダミン１０１で標識する方法を述べ
る。各プローブをホスホアミダイト法で合成し、合成の
最終段にＮ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−６−
オキシ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルア
ミノホスホアミダイトを反応させてアミノ基を５’末端
に導入する。０．１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で
１００倍モルのスルホローダミン１０１酸クロライドを
反応させた後、エタノール沈殿と７Ｍの尿素を含む電気
泳動を行いスルホローダミン１０１標識プローブを精製
する。このようにして調製した標識プローブは電気泳動
的に単一バンドの純品である。
【００１４】表面に異なるポリヌクレオチドプローブを
固定した複数の独立したセルを有する反応チップにλフ
ァージＤＮＡとＭ１３ファージの混合試料と標識プロー
ブの混合液を添加する。反応チップを９５℃で２分間加
熱した後、０℃に急冷する。４８℃でハイブリダイゼー
ション反応を行う。０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを
含むＳＳＰＥで２５℃で３０分間洗浄した後、さらに、
０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、
３Ｍのテトラメチルアンモニウム、トリス塩酸（ｐＨ
８．０）溶液で５８℃で洗浄する。次に、０．０５％の
Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍｇ／ｍｌ（ミリリットル）牛血清
アルブミン、０．１５ｍｏｌ／ｌ（リットル）のＮａＣ
ｌ、０．０５ｍｏｌ／ｌ（リットル）のリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で洗浄する。この操作により反応チップ
上に標的ポリヌクレオチドを捕捉し、標識プローブで標
識できる。
【００１５】反応の終了した反応チップ上の蛍光標識プ
ローブの結合部を検出するには、Ｈｅ／Ｎｅレーザー
（５９４ｎｍ）（あるいはＮａランプなど）と光電子増
倍管（あるいは高感度ラインセンサーやエリアセンサ
ー）を用いて反応チップから発する蛍光を測定する。も
ちろん他の光源と蛍光体の組みあわせを用いてもよい。
本実施例ではチップにシリコンウエハーを用いているた
め、図２に記載のような反射型の蛍光測定装置を用い
る。実際に本実施例で用いる蛍光測定装置を説明する。
レーザー光源２０１の光は、ビームエキスパンダー２０
２でビーム径を拡張し、ダイクロイックミラー２０３で
反射される。ダイクロイックミラー２０３は５９４ｎｍ
の光を反射し、６１０ｎｍ以上の光を８０％以上透過す
るものを使用する。ダイクロイックミラー２０３で反射
された光は、サーボモーター２０５で角度を変えられる
ミラー２０４で反射され、さらに、ミラー２０４と直交
する方向に角度を変えられるミラー２０６で反射された
後、集光レンズ２０８で集光され、反応チップ２０９上
の特定領域を照射する。ここで、ミラー２０４とミラー
２０６はお互いに直交する方向に角度が変えられるの
で、反応チップ上をＸ−Ｙ方向に走査することが出来
る。蛍光体が存在するセルにレーザースポットがあたる
とその部位から蛍光が発生する。蛍光は集光レンズ２０
８、ミラー２０６、ミラー２０４の順に進行し、ダイク
ロイックミラー２０３を通過する。バンドパスフィルタ
ー２１０を通過した後、光電子増倍管２１１で検出され
る。検出された信号は、マイクロプロセッサー２１２に
取り込まれ、サーボモーター２０５、２０７からの角度
情報と同期させて処理することで、反応チップ表面の各
セルにおける蛍光強度を算出する。この方法で、各セル
毎の蛍光強度を測定できる。
【００１６】図３に各セル上に標的ポリヌクレオチドと
してλファージＤＮＡと標識プローブが結合している状
態を模式的に示す。チップ４９の表面のセルナンバー１
１、１３にはλファージＤＮＡ用のプローブ５０、セル
ナンバー１２、１４にはＭ１３ファージ用のプローブ５
１が結合している。標的となる編成したλファージ５２
はセル１１、１３のλファージ用のプローブに結合する
が、セル１２、１４のＭ１３ファージ用のプローブには
結合しない。セルに捕捉されているλファージには蛍光
標識プローブ５３が結合している。実際にλファージの
みを含む試料、Ｍ１３ファージのみを含む試料、両者を
含む試料をそれぞれ測定した結果を図４に示す。λファ
ージのみを含む試料を反応させたチップでは図４の
（１）のようにλファージに対するプローブを固定した
セル１１と１３で蛍光が検出される。Ｍ１３ファージの
みを含む試料を反応させたチップでは図４の（２）のよ
うにＭ１３ファージに対するプローブを固定したセル１
２と１４で蛍光が検出される。λファージとＭ１３ファ
ージの両者を含む試料を反応させたチップでは図４の
（３）のようにλファージとＭ１３ファージに対するプ
ローブを固定した全てのセルで蛍光が検出される。この
ように蛍光が検出される位置で標的ポリヌクレオチドの
有無が判断できる。
【００１７】このように、本発明を用いれば、複数の標
的ポリヌクレオチドを同一の反応チップ上で検出できる
ので、１回の反応操作で複数の検査ができる利点があ
る。特に、ウィルス等のスクリーニングを行う場合、通
常測定対象が未知であるため可能性のある項目を全て検
査することが望ましい。本発明を用いれば少量の試料で
従来に比べ多くの項目が測定できる利点がある。このこ
とは被測定試料である体液や組織使用の採取の面で被検
者の負担を少なくできる利点がある。また、同一の標的
ポリヌクレオチドを複数の捕捉用プローブを用いて検出
できるので、ただ１種のプローブを用いる従来の検出法
に比べ、検出の精度を高めることができる利点がある。
即ち、上記実施例においては、第１と２のセルで蛍光が
検出される場合は試料中にλファージが含まれ、いずれ
かのセルのみに蛍光が認められるときは試料中にλファ
ージが含まれることか疑われ、いずれのセルにも蛍光が
認められないときは、試料中のλファージはきはめて少
ないと判断できる。１種類の捕捉用プローブを用いる従
来法では、試料中に標的ポリヌクレオチドとよく似た夾
雑物を含む場合等はこれを間違って検出するケースが多
いが、本発明では異なる位置に固定した複数の捕捉用プ
ローブを用いて検出するので、これら夾雑物の影響を少
なくできる利点がある。また、従来法ではナイロンやニ
トロセルロース製のメンブレンを担体として使用するた
め、機械強度が弱く取扱が不便であったが、本発明では
シリコン等のチップを用いるため自動化に適している。
【００１８】実施例２ 本発明を用いてＤＮＡ診断等に用いるプローブの検索を
効率的に行う方法について説明する。標的ポリヌクレオ
チドの配列が未知の場合、既知配列に対するプローブを
用いることができない。従来法では標的ポリヌクレオチ
ドの配列の一部あるいは全部を決定する必要があった。
本発明を用いて、直接標的ポリヌクレオチドの配列を決
定しないでプローブを検索する方法について述べる。本
実施例で用いるポリヌクレオチドプローブは３’末端が
ＣＡＴで他がＸＡＡ，ＸＧＡ，ＸＴＡ，ＸＣＡ，ＸＡ
Ｇ，ＸＧＧ，ＸＴＧ，ＸＣＧ，ＸＡＴ，ＸＧＴ，ＸＴ
Ｔ，ＸＣＴ，ＸＡＣ，ＸＧＣ，ＸＴＣ，ＸＣＣの３塩基
ずつのランダムな組合せで構成されている塩基長１２の
オリゴヌクレオチドを含み、５’末端にはスペーサーを
介してアミノ基が結合している。よって本実施例で使用
するポリヌクレオチドプローブは４０９６種類である。
ここで、Ｘはスペーサーで各塩基と特異的に結合しない
物質が用いられる。各プローブを実施例１の手法に従い
反応チップの各セルに固定する。試料としてはモデルと
して配列番号１０ならびに配列番号１１記載のものを以
下の方法で蛍光体標識して用いる。まずアナリティカル
バイオケミストリー記載のラリー イー．モリソン等
の方法（ＬａｒｒｙＥ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １８３、２３１−２４４（１９８９））に従い、Ｔ
４ポリメラーゼ キナーゼを用いて上試料ポリヌクレオ
チドの５’末端にりん酸基を導入する。
【００１９】次に、０．２Ｍ １−エチル−３−（ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドと０．５Ｍ エチ
レンジアミンを含むｐＨ６の溶液中で１８時間反応させ
５’末端にアミノ基を導入する。エタノール沈殿を繰返
し未反応のエチレンヂアミン等を除いた後、２０％のア
セトニトリルを含むｐＨ９の０．１Ｍ 炭酸緩衝液中
で、終濃度２０ｍＭ のスルホローダミン１０１酸クロ
ライド（標的オリゴヌクレオチドの６０ないし１００倍
モル量）を反応させる。エタノール沈殿で未反応のスル
ホローダミン１０１等を除いて５’末端がスルホローダ
ミン１０１標識されたポリヌクレオチド試料を得る。ス
ルホローダミン１０１標識されたポリヌクレオチド試料
を４０９６種類のプローブを各セルに固定した上記チッ
プに実施例１に従いハイブリダイゼーション条件下で反
応させる。非特異吸着した該ポリヌクレオチド試料を５
５℃の洗浄液で除く。反応の終了した反応チップ上の蛍
光体結合部を実施例１に従い、Ｈｅ／Ｎｅレーザー（５
９４ｎｍ）（あるいはＮａランプなど）と光電子増倍管
（あるいは高感度ラインセンサーやエリアセンサー）を
用いて反応チップの各セルから発する蛍光を測定する。
もちろん他の光源と蛍光体の組みあわせを用いてもよ
い。その結果、配列番号１０のポリヌクレオチド試料
は、以下の５種のオリゴヌクレオチドプローブを固定し
たセルに結合することが観察される。
【００２０】 ５’ＸＴＴＸＴＴＸＧＴＣＡＴ３’ ５’ＸＴＡＸＣＡＸＡＧＣＡＴ３’ ５’ＸＡＡＸＡＡＸＡＡＣＡＴ３’ ５’ＸＡＣＸＧＡＸＴＡＣＡＴ３’ ５’ＸＡＧＸＴＴＸＴＧＣＡＴ３’ 配列番号１１のポリヌクレオチド試料では、以下の２種
のオリゴヌクレオチドプローブを固定したセルに結合す
ることが観察される。 ５’ＸＣＡＸＣＡＸＧＧＣＡＴ３’ ５’ＸＴＣＸＧＡＸＡＣＣＡＴ３’ このように本発明では異なるポリヌクレオチド試料はチ
ップ上の異なるセルに結合することになる。本実施例で
用いるプローブを固定したセルは標的ポリヌクレオチド
のＡＴＧで始まる塩基長１１の領域の可能な全ての配列
を網羅しているため、配列が未知のオリゴヌクレオチド
のプローブを検索することができる利点がある。さらに
標的ポリヌクレオチドのＡＴＧで始まる領域はＤＮＡで
はオープンリーディングフレームの可能性がありるの
で、オープンリーディングフレームを含む可能性がある
ポリヌクレオチドフラグメントの検索用にも有用であ
る。
【００２１】実施例３ 以下、本発明の他の実施例を説明する。本実施例で使用
するポリヌクレオチドを示す。 配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
１のプローブ 配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
２のプローブ 配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
３のプローブ 配列番号８の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
４のプローブ 配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチド……第
５のプローブ 本実施例では、標的ポリヌクレオチド試料としてλファ
ージＤＮＡの分解物を分取する方法について説明する。
【００２２】第１から第５のプローブは、標的ポリヌク
レオチドであるλファージＤＮＡのそれぞれ異なる部位
を認識する捕捉用プローブである。これらを反応チップ
の反応部に実施例１の方法に従い固定する。ここで使用
する反応チップは反応部の拡大図を示す図５のようにセ
ルが標的ポリヌクレオチド解離用電極１００を兼ねてい
る。各セル間はカウンター電極１０１が配置されてい
る。図６に標的ポリヌクレオチド回収法の概念図を示
す。標的ポリヌクレオチド捕捉用セル兼解離用電極１１
１、１１３、１１５、１１７、１１９及びカウンター電
極１１２、１１４、１１６、１１８、１２０は基板９０
の上に形成されている。本実施例ではλファージＤＮＡ
のＨｉｎｄ III分解物を各フラグメント毎に分取する。
５種の捕捉用プローブを固定したチップの試料添加部９
３にλファージＤＮＡのＨｉｎｄ III分解物を添加し、
ハイブリダイゼージョン条件下で反応させる。未反応物
を洗浄し洗浄液を反応残液排出部９４より排出させる。
ここまでの操作は実施例１に従う。この操作で、６種の
Ｈｉｎｄ III分解物のうち５種のフラグメントが捕捉さ
れる。各セルを正極、カウンター電極を負極となるよう
に電界をかけた状態で、２．４Ｍのテトラエチルアンモ
ニウムクロライドを含む解離溶液を試料添加部９３より
添加し６５℃ないし７０℃に加熱する。このとき解離溶
液は９２のように反応容器全体を被い、セル兼解離用電
極１１１、１１３、１１５、１１７、１１９は正極、カ
ウンター電極１１２、１１４、１１６、１１８、１２０
は負極になるように電界をかける。標的ポリヌクレオチ
ドは負に帯電しているので、この時点ではセルから溶出
しない。次に、溶離する標的ポリヌクレオチド捕捉用の
電極１３２を備えたキャピラリー１３１をセル１１９に
配置しセル１１９が負極、キャピラリー内の電極１３２
が正極になるように電圧をかける。この操作で１番目の
標的ポリヌクレオチドが回収、分取される。同様の操作
をセル１１７、１１５、１１３、１１１の順に繰返し５
種の標的ポリヌクレオチドを回収する。回収した標的ポ
リヌクレオチドをポリアクリルアミド電気泳動で分析す
ると、セル１１９、１１７、１１５、１１３、１１１か
ら回収した溶液には、約２０００塩基長、約６６００塩
基長、約２３００塩基長、約１３０塩基長、約９４００
塩基長のポリヌクレオチドが含まれることがわかる。こ
のように、本発明を用いれば、複数の標的ポリヌクレオ
チドを容易に分離回収できる。
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば、単一の反応チップで複
数の標的ポリヌクレオチドを同時に検出できるので、標
的ポリヌクレオチド毎に反応チップを用意する必要のあ
る従来法に比べ反応操作が少なくなる利点がある。ま
た、試料溶液の量も１回の反応操作に使用する量ですむ
ため試料溶液が少なくてすむ。さらに、同一の標的ポリ
ヌクレオチドを複数のプローブで検出することにより、
測定結果の信頼度が従来法に比べ高い。また本方法では
複数の標的ポリヌクレオチドを分離できる利点がある。
【００２４】
【配列表】
配列番号 ：１ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＡＧＴＴＧＡＣＴＡ
ＴＡＣＡＧＣＣＡ ３’ 配列番号 ：２ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＡＴＧＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＴＴ
ＣＴＣＡＣＣＴＡ ３’ 配列番号 ：３ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＡＴＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＴＴＴＧ
ＧＡＴＴＡＴＡＣ ３’ 配列番号 ：４ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＡＡＡＣＴＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＴＣＡＴ
ＡＴＧＴＡＣＣＣ ３’ 配列番号 ：５ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＧＡＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＧＣＣＧＣＡ
ＧＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＧＣ ３’ 配列番号 ：６ 配列の長さ：４０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＴＡＡＧＴＡＴＡＧＣＣＣＧＧＡＡＴＡＧ
ＧＴＧＴＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧ ３’ 配列番号 ：７ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＴＡＧＴＡＧＴＴＧ
ＧＴＡＡＣＣＴＧ ３’ 配列番号 ：８ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＡＴＧＡＣＣＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴ
ＣＣＡＡＧＣＣＡ ３’ 配列番号 ：９ 配列の長さ：２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＡＧＣＡＣＡＡＡＧＣＣＴＣＧＣＡＡＴＣ
ＣＡＧＴＧＣＡＡ ３’ 配列番号 ：１０ 配列の長さ：２００ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＡＧＣＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＴＧＣＧ
ＡＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＧ
ＡＣＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣ
ＧＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＴＣＡＣＣＴＴＧＣＧ
ＣＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＡＡ
ＴＡＣＣＡＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＴＣＡＴＡＧ
ＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧ
ＴＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡ
ＡＡＡＴＣＴ ３’ 配列番号 ：１１ 配列の長さ：２０１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ：５’ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴ
ＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡ
ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡ
ＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＧ
ＴＴＧＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＣＡＧＴ
ＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣ
ＡＡＴＴＴＴＧＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧ
ＴＣＡＴＣＡＣＧＡＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧ
ＴＧＴＣＣＧＡ ３’
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による一実施例である反応チップを模式
的に示す平面図。
【図２】本発明での蛍光測定装置の概念図。
【図３】本発明による反応チップでの反応終了状態を示
す模式図。
【図４】本発明による蛍光測定の結果例を示す図。
【図５】本発明による反応部を模式的に示す拡大平面
図。
【図６】本発明による標的ポリヌクレオチドの回収、分
取法の概念を示す断面図。
【符号の説明】
１…反応部、２…試料等添加部、３…反応残液排出部、
４，１１，１２，１３，１４，１５，ｎ−１，ｎ…セ
ル、４９…チップ、５０，５１…プローブ、５２…λフ
ァージ、５３…蛍光標識プローブ、９０…基板、９１…
フッ化エチレン樹脂堤、９２…液、９３…試料等添加
部、９４…反応残液排出部、１００，１１１，１１３，
１１５，１１７，１１９…セル兼解離用電極、１０１，
１１２，１１４，１１６，１１８，１２０…カウンター
電極、１３１…キャピラリー、１３２…標的ポリヌクレ
オチド捕捉用電極、２０１…レーザー、２０２…ビーム
エキスパンダー、２０３…ダイクロイックミラー、２０
４，２０６…ミラー、２０５，２０７…サーボモータ
ー、２０８…集光レンズ、２０９…チップ、２１０…バ
ンドパスフィルター、２１１…光電子増倍管、２１２…
マイクロプロセッサー。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】標的ポリヌクレオチドに相補的なプローブ
    を固定した、標的ポリヌクレオチドを補捉するためのポ
    リヌクレオチド捕捉用チップにおいて、複数の標的ポリ
    ヌクレオチドに対する各々異なるプローブが単一チップ
    上の各々異なる部位に形成されたセルに固定化されてい
    ることを特徴とする標的ポリヌクレオチド捕捉用チッ
    プ。
  2. 【請求項２】標的ポリヌクレオチドに相補的なプローブ
    を固定したポリヌクレオチド捕捉用担体に、標識物の結
    合した標的ポリヌクレオチドを捕捉させる工程、あるい
    は標的ポリヌクレオチドを捕捉させる工程と標識物を結
    合させる工程を含むポリヌクレオチド検出法において、
    ポリヌクレオチド捕捉用担体として請求項１に記載のポ
    リヌクレオチド捕捉用チップを用い、複数の標的ポリヌ
    クレオチドを検出することを特徴とするポリヌクレオチ
    ド検出法。
  3. 【請求項３】標的ポリヌクレオチドに相補的なプローブ
    を固定したポリヌクレオチド捕捉用担体により標的ポリ
    ヌクレオチドを捕捉し、分取する標的ポリヌクレオチド
    分取法であって、ポリヌクレオチド捕捉用担体として使
    用される請求項１に記載のポリヌクレオチド捕捉用チッ
    プの各セルは標的ポリヌクレオチドを溶離させるための
    電極を兼ねており、これら各電極にかかる電場を切り替
    えて複数の標的ポリヌクレオチドを溶離させ分取するこ
    とを特徴とする、複数の標的ポリヌクレオチドを捕捉し
    分取するポリヌクレオチド分取法。
  4. 【請求項４】標的ポリヌクレオチドに相補的なプローブ
    を固定したポリヌクレオチド捕捉用担体により標的ポリ
    ヌクレオチドを捕捉し、分取する標的ポリヌクレオチド
    分取用チップであって、ポリヌクレオチド捕捉用担体と
    して使用される請求項１に記載のポリヌクレオチド捕捉
    用チップの各セルが標的ポリヌクレオチドを溶離させる
    ための電極により形成されたことを特徴とする、複数の
    標的ポリヌクレオチドを捕捉し溶離させ分取するポリヌ
    クレオチド分取チップ。
  5. 【請求項５】チップ表面上に保護膜を設ける工程、所定
    の部位の保護膜を除去しセルを形成する工程、および保
    護膜の除去されたセルの表面にプローブを固定する工程
    とを有し、複数の標的プローブを各々異なるセルの部位
    に固定することを特徴とする標的ポリヌクレオチド捕捉
    用チップの調製方法。
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