JPH0523742B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、遺伝子組換えによつてペプチド等を
生産するために、特に有用なプロテアーゼ生産性
の低い枯草菌に関する。 ［従来の技術と発明が解決しようとする課題］ 枯草菌（Bacillus subtilis）は、エンドトキシ
ンなどを生産せず、しかも病原微生物として人や
動物に寄生したり共生することがないので、大腸
菌に比べて安全性が高い。このような枯草菌を遺
伝子組換え体の宿主菌として利用することによ
り、外来遺伝子産物であるペプチド、タンパク質
等のペプチド結合を有する有用な生産物を菌体外
へ分泌生産させることができるので、枯草菌は、
その安全性と共に、その工業的有用性が注目され
ている。しかしながら、枯草菌は、プロテアーゼ
を菌体外に多量に分泌生産する。従つて、外来遺
伝子に由来する有用な外来分泌産物が多量に生産
されたとしても、ペチプド結合を有する外来分泌
生産物は、枯草菌が培地中に分泌する種々の菌体
外プロテアーゼにより分解されてしまい、高い収
率で有用生産物を回収することができない。 この問題を解決するために、最近、宿主枯草菌
のプロテアーゼ活性を低下させるための研究が行
なわれている。プロテアーゼ生産性の低い枯草菌
として、枯草菌の主たる菌体外プロテアーゼであ
るアルカリプロテアーゼおよび中性プロテアーゼ
の両者を欠失したバチルス・サブチリス
（Bacillus subtilis）104HL株［バイオケミカ
ル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミ
ユニケーシヨンズ（Biochem.Biophys.Res.
Commun.），128；601−606，1985］や、本出願
人が先に提案したように、バチルス・サブチリス
104HL株に、pap遺伝子を導入したバチルス・サ
ブチリスDY−16株（特開昭64−37284号公報）
が公知である。 しかしながら、バチルス・サブチリス104HL
株やDY−16株には、未だプロテアーゼ活性が残
存しているので、残存するプロテアーゼ活性によ
り、有用な分泌産物が培地中で分解されてしま
う。 従つて、本発明の目的は、安全性が高く、しか
もペプチド結合を有する有用な分泌産物を高収率
で回収できるプロテアーゼ生産性の低い枯草菌を
提供することにある。 ［発明の構成］ 本発明者等は、枯草菌におけるプロテアーゼの
生産が、胞子形成期にその大半が起こることに着
目して、プロテアーゼ低生産性枯草菌を得るべく
鋭意検討した結果、枯草菌の主たる２つのプロテ
アーゼであるアルカリプロテアーゼと中性プロテ
アーゼの生産能を欠き、かつプロテアーゼ活性が
野生株の３％以下の枯草菌に、特定の遺伝子を導
入することによつて、親株枯草菌よりプロテアー
ゼ活性が著しく低下した枯草菌が得られることを
見い出し、本発明を完成した。すなわち、本発明
は、枯草菌の主たる２つのプロテアーゼであるア
ルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生産
能を欠き、しかもプロテアーゼ活性が野生株の３
％以下である枯草菌に、spoOAΔ677遺伝子
（Ellis，et al，Recombinant DNA Technical
Bulletin，４，１−３（1981）が導入された、プ
ロテアーゼ生産性の低下した枯草菌を提供する。 本発明において、spoOAΔ677遺伝子が導入さ
れる枯草菌は、枯草菌の主たる２つのプロテアー
ゼであるアルカリプロテアーゼと中性プロテアー
ゼの生産能を失い、かつプロテアーゼ活性が野生
株の３％以下に低下した枯草菌であればよい。野
生株や、プロテアーゼ活性が野生株の３％を越え
る枯草菌に、spoOAΔ677遺伝子を導入しても、
プロテアーゼ活性が残存し、ペプチド結合を有す
る分泌産物の回収率が低下する。なお、枯草菌の
プロテアーゼ活性が低下しているほど、結果とし
て得られるプロテアーゼ活性も低いことは容易に
類推できる。 このような枯草菌としては、前記バチルス・サ
ブチリス104HL株、バチルス・サブチリスDY−
16株などが挙げられる。なお、バチルス・サブチ
リスDY−16株は、バチルス・サブチリス104HL
株にpap遺伝子を導入した菌株であり、微工研菌
寄第9488号として寄託されている。 これらの菌株は、実施例において詳述するよう
に、野生株バチルス・サブチリス207−25株と比
較して、プロテアーゼ活性が著しく小さい。すな
わち、バチルス・サブチリス104HL株は、野生
株207−25株の約2.8％、バチルス・サブチリス
DY−16株は、野生株207−25株の約１％しかプ
ロテアーゼを生産しない。 ところで、枯草菌におけるプロテアーゼの生産
は、胞子形成期にその大半が起こることが知られ
ている。そこで、本発明者らは、プロテアーゼ活
性の低い前記枯草菌宿主に、spoOAΔ677遺伝子
を導入することにより、宿主に残存するプロテア
ーゼ活性が更に低下することを見い出した。 spoOAΔ677変異は、胞子形成の最も初期の段
階において、胞子形成を遮断する欠失変異であ
る。すなわち、胞子は、枯草菌が、熱、紫外線、
化学薬品及び乾燥に晒されたときにおいても、通
常、自然界で生存し得る形態であるが、上記変異
遺伝子は、枯草菌における胞子形成能を破壊す
る。従つて、spoOAΔ677遺伝子が導入された枯
草菌は、胞子形成能を有しない。 本発明において用いられるspoOAΔ677遺伝子
としては特に限定されず、spoOAΔ677遺伝子を
有する菌株、例えば、バチルス・サブチリス
ATCC35148株、ATCC39090株、ATCC39091株、
ATCC39092株、ATCC39094株、ATCC39096株
などのspoOAΔ677遺伝子を用いることができ、
これらの株は、アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（American Type Culture
Correction）から入手できる。またバチルス・サ
ブチリスATCC39090株は、バチルス・サブチリ
スBGSC1S53として、バチルス・サブチリス
ATCC39096株は、バチルス・サブチリス
BCSCW1S58としてバチルス・ジエネテイツク・
ストツク・センター（Bacilus Genetic Stock
Center）からも入手できる。 spoOAΔ677遺伝子を宿主枯草菌に導入する方
法としては、慣用の方法、例えば、 (1) spoOAΔ677遺伝子供与体菌の染色体DNAを
すべて宿主枯草菌に導入するコンピテントセル
トランスフオーメーシヨン法、 (2) spoOAΔ677遺伝子供与体菌の染色体DNA遺
伝子を制限酵素により切断し、spoOAΔ677遺
伝子を含むDNA断片をプラスミドに組み込み、
宿主枯草菌を形質転換する方法、及び (3) 上記プラスミドと同様にして、フアージ粒子
に組込んだspoOAΔ677遺伝子を用いて、宿主
枯草菌を形質転換する方法 などを挙げることができる。なお、上記(1)(2)(3)の
形質転換法については、「微生物遺伝子実験法、
第３巻、p.96〜116、共立出版」を参照できる。 このようにしてspoOAΔ677遺伝子を枯草菌宿
主に導入した形質転換株の中から、胞子形成能を
欠損した枯草菌を選別する。 胞子形成能が欠損した菌株は、 (1) 胞子形成培地に形質転換株を植菌し、そのコ
ロニーがメラニン色素生産能を失つたこと、 (2) 温度80℃、10分間の熱処理に耐性を示さない
こと、及び (3) 顕微鏡検査により胞子形成を認めないことに
よつて確認できる。 また胞子形成能を有しない枯草菌のうち、宿主
である枯草菌よりもプロテアーゼ生産性が低下し
た菌を選別することにより、本発明のプロテアー
ゼ生産性の低下した枯草菌を得ることができる。 プロテアーゼ生産性の低下した菌株は、spo
OAΔ677遺伝子が導入され、かつ胞子形成能欠損
株となつた枯草菌を、カゼインを含むプレートを
用いて培養し、菌体が分泌するプロテアーゼによ
り形成されるクリアゾーン（Halo）が宿主に比
べて小さい菌株を選別することにより得られる。
またプロテアーゼの生産性をさらに詳しく調べる
方法としては、カゼイン、合成基質であるアゾコ
ール、FITC−カゼインを用いる方法がある。こ
の方法では、これらの基質の分解を、分光光度計
もしくは螢光光度計で測定することにより、培養
上清中のプロテアーゼ活性を調べることができる
ので、プロテアーゼ生産性の低い株を確実に選別
できる。 本発明のプロテアーゼ生産性の低下した枯草菌
のうち、特に好ましい菌株は、バチルス・サブチ
リス104HL株に、spoOAΔ677遺伝子を導入して
得られるバチルス・サブチリスSP011株（微工研
菌寄第10987号）と、バチルス・サブチリスDY
−16株に、spoOAΔ677遺伝子を導入して得られ
るバチルス・サブチリスSPL14株（微工研菌寄第
10988号）である。 本発明のプロテアーゼ生産性の低い枯草菌変異
株は、胞子形成能を有していない点を除き、一般
的な枯草菌としての性質を保持する。好ましい菌
株についてより具体的に説明すると、バチルス・
サブチリスSP011株の親株であるバチルス・サブ
チリス104HL株は、遺伝子マーカーとして、his
leunprR2nprE4ΔaprA3を有している。これに対
して、その変異株であるバチルス・サブチリス
SP011株は、遺伝子マーカーhis nprR2nprE4Δapr
A3spoOAΔ677を有し、親株のleuが欠損し、親
株にspoOAΔ677が導入されている。 またバチルス・サブチリスSPL14株の親株であ
るバチルス・サブチリスDY−16株は、遺伝子マ
ーカーとしてhis leu nprR2nprE4ΔaprA3cyc−ｒ
pap−Ｓを有している。これに対して、その変異
株であるバチルス・サブチリスSPL14株は、his
leunprR2nprE4ΔaprA3cyc−ｒpap−Ｓspo
OAΔ677 lin２を有し、親株にspoOAΔ677とlin
２の遺伝形質が導入されている。 上記遺伝子マーカーからも明らかなように、本
発明の枯草菌は、通常、少なくともヒスチジン要
求性を有しているので、遺伝子組換え実験などの
宿主として有用である。 なお、spoOAΔ677遺伝子を含む菌株、例えば、
spoOAΔ677遺伝子の供与体であるバチルス・サ
ブチリスATCC39096株は、遺伝形質としてthy
A1thyB1pyrD1aro10lin２amy３spoOAΔ677を
有している。 本明細書に記載の遺伝子マーカーの記号の意義
は、次の通りである。 leu：ロイシン要求性変異 his：ヒスチジン要求性変異 nprR2：中性プロテアーゼ制御遺伝子変異 nprE4：中性プロテアーゼ遺伝子欠損変異 ΔaprA3：アルカリプロテアーゼ遺伝子欠失変
異 cyc−ｒ：サイクロセリン耐性変異 pap−Ｓ：α−アミラーゼとプロテアーゼの生
産性に影響を与える遺伝変異 spoOAΔ677：胞子形成の最も初期の段階にお
ける遮断を起こさせる欠失変異 lin２：リンコマイシン耐性変異 thyA1，thyB1：チミン及びチミジンに対する
要求性を付与する突然変異で、トリメトプリ
ム耐性を付与する pyrD1：ピリミジンに対する要求性を付与する
突然変異 aro10：芳香族アミノ酸であるフエニルアラニ
ン、チロシン、トリプトフアンに対する要求
性を付与する突然変異 ［発明の効果］ 以上のように、本発明のプロテアーゼ生産性の
低い枯草菌は、プロテアーゼ活性が小さな枯草菌
にspoOAΔ677遺伝子が導入されているので、安
全性が高く、ペチプド結合を有する有用な分泌産
物を高収率で回収できる。 従つて、本発明の枯草菌は、遺伝子組換技術を
利用して、ペプチド等を生産するときの宿主とし
て有用である。 ［実施例］ 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。 実施例 １ spoOAΔ677遺伝子及びリンコマイシン耐性遺
伝子（以下、Linrと表す）を有する枯草菌である
バチルス・サブチリスATCC39096株を、表１に
示すLB培地を用いて、温度37℃で対数増殖期ま
で振盪培養した。 表 １ 1.0重量％ トリプトン 0.5重量％ 酵母エキス 0.5重量％ NaC PH 7.5 培養液50ml中に含まれる菌体を集め、斎藤・三
浦の方法（H.Saito，K.Miura，Biochim.
Biophis.Acta，72，619（1963））により染色体
DNAを抽出精製した。 得られた染色体DNAを用いて、コピテントセ
ルトランスフオーメーシヨン法により、バチル
ス・サブチリス104HL株を形質転換した。 ヒスチジンを50mg／含む最小寒天培地に形質
転換した枯草菌をまき、温度37℃で48時間培養し
た。以下の指標１〜３に合致する菌株を、胞子形
成能欠損株として選別した。 １ 胞子形成培地に形質転換株を植菌しそのコロ
ニーがメラニン色素生産能を失つたこと、 ２ 温度80℃で10分間の熱処理に耐性を示さない
こと、及び ３ 顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと。 得られた胞子形成能欠損株173株のうちプロテ
アーゼ活性が最も低い株を選出すると共に、プロ
テアーゼ活性を、以下の方法で測定した。 すなわち、１重量％のカゼインを含むLB寒天
平板培地に、胞子形成能を欠損した形質転換株
と、親株であるバチルス・サブチリス104HL株
とを別々に植菌し、温度37℃で24時間培養した。
菌体が分泌するプロテアーゼによりカゼインが分
解されるので、カゼインの分解により形成される
菌体の回りのハローの大きさを指標として、親株
であるバチルス・サブチリス104HL株よりもプ
ロテアーゼ生産能が低下した菌株を24株分離し
た。 さらに、これらの菌株を、LB培地で液体培養
し、その培養上清に存在するプロテアーゼの活性
を、アゾコール（シグマ社製）を基質として測定
した。すなわち、バチルス・サブチリス104HL
株と、プロテアーゼ活性が低下した形質転換株24
株とを、それぞれ、LB培地10mlを用いて一晩培
養した後、培養液１mlを遠心分離し、その上清を
プロテアーゼ酵素液とした。 また基質溶液として、0.48gのアゾコールを、
50mMトリス−塩酸（PH7.5）と1mM塩化カルシ
ウムとからなる混合液20mlに懸濁し、その750μ
を酵素液50μと混合し、温度37℃で30分間イ
ンキユベートした。反応溶液に、反応停止液とし
て0.5Mトリクロロ酢酸800μを加えた後、遠心
分離し、その上清の吸光度を波長520nmで測定し
た。 なお、プロテアーゼ活性（PU）は、科研製薬
(株)製、アクチナーゼＥの活性に換算して算出し
た。その際、アクチナーゼＥがカゼインを基質と
して温度37℃、PH7.5において、１分間に1μmol
のチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプ
チドを遊離する活性を１ユニツトとした。すなわ
ち、上清のプロテアーゼ酵素液に代えて、上記ア
クチナーゼＥを用い、上記と同様の反応を行な
い、上清の吸光度を測定して検量線を作成し、こ
の検量線に基づいて、プロテアーゼ活性を算出し
た。 そして、親株バチルス・サブチリス104HL株
よりも、プロテアーゼ活性が極端に低下した４株
を得、これらの菌株を、それぞれ、バチルス・サ
ブチリスspo6株、spo7株、spo9株、spo11株とし
た。 これら４株のプロテアーゼ活性を、さらに詳し
く測定した。すなわち、バチルス・サブチリス
104HL株及びプロテアーゼ活性が低下した形質
転換株４株を、10mlのLB培地で18時間培養した
後、50mlのMedium Ａ培地（Journal of
Bacteriology，165，796−804，1986）に菌体を
移し、24時間及び48時間培養した後、培養上清中
のプロテアーゼ活性を上記と同様にして測定し
た。 その結果を表２に示す。 【表】 表２より、得られた胞子形成能欠損株のうち、
SPO7及びSPO11株は、親株に比べてプロテアー
ゼ活性が極めて低いことが確認された。特に
SPO11株は、プロテアーゼ活性が、親株である
104HL株の約１％に低下していることから、ペ
プチド等の分泌生産のための宿主としてきわめて
有用である。またSPO11株は、前記の遺伝子マ
ーカーを有している。またいずれの株もヒスチジ
ンに対する要求性を有している。従つて、バチル
ス・サブチリスspo6株、spo9株、特にspo7株、
中でもバチルス・サブチリスSPO11株は、ペチ
プドを効率よく生産できる宿主として、安全かつ
有用である。 実施例 ２ バチルス・サブチリスATCC39096株の染色体
DNAを用いて、コンピテントセル形質転換法に
より、バチルス・サブチリスDY−16株を形質転
換した。次に、得られた形質転換株を、5μg／ml
のリンコマイシンを含むLB寒天平板培地を用い
て培養し、Linrの導入された株を選択した。 その結果、約800株のリンコマイシン耐性形質
転換株を得た。また実施例１と同様にして、これ
らのリンコマイシン耐性形質転換株から胞子形成
能欠損株を51株分離した。 得られた胞子形成能欠損株のうちプロテアーゼ
活性が最も小さい株を、実施例１と同様にして、
選出し、プロテアーゼ活性を測定した。 すなわち、１重量％のカゼインを含むLB寒天
平板培地に、胞子形成能欠損形質転換株と、親株
であるバチルス・サブチリスDY−16株とを別々
に植菌し、温度37℃で24時間培養し、実施例１と
同様に、菌体の回りのハローの大きさを指標とし
て、バチルス・サブチリスDY−16株よりもプロ
テアーゼ生産能が低下した菌株を40株分離した。 これらの株をLB培地で液体培養し、その培養
上清に存在するプロテアーゼの活性を、FITC−
カゼイン（シグマ社製）を基質として測定した。
すなわち、バチルス・サブチリスDY−16株及び
プロテアーゼ活性が低下した形質転換株40株を、
それぞれ、LB培地10mlを用いて一晩培養し、そ
の培養液1mlを遠心分離し、その上清をプロテア
ーゼ酵素液とした。 酵素液50μと0.2μgのFITC−カゼインとを、
10mMトリス−塩酸（PH7.5）及び2mM塩化カル
シウムからなる200μの緩衝液中で、温度37℃
で２時間反応した。反応液に、200μの7.5重量
％トリクロロ酢酸を加え遠心分離した後、その上
清100μに、500mMのトリス−塩酸（PH8.5）
900μを加え、螢光光度計でプロテアーゼ活性
を測定した。 なお、プロテアーゼ活性（PUD）は、カゼイ
ンを用い、温度37℃、PH7.5において、１分間に
1μmolのチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶
性ペプチドを遊離する酵素量を1PUDとして、算
出した。 その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・
サブチリスDY−16株に比べて、極端に低下した
４株を得、これらの菌株を、それぞれ、バチル
ス・サブチリスSPL9株、SPL11株、SPL14株、
SPL39株とした。 そして、実施例１と同様にして、バチルス・サ
ブチリスDY−16株及びこれらのプロテアーゼ活
性が低下した形質転換株を10mlのLB培地で18時
間培養した後、50mlのMediumA培地に菌体を移
し、培養24時間及び48時間培養した後、培養上清
中のプロテアーゼの活性を上記と同様にして測定
した。その結果を表３に示す。 【表】 表３より、形質転換株４株は、親株よりもプロ
テアーゼ活性が1/20以下と低いことが確認され
た。特にSPL14株は、プロテアーゼ活性が、親株
であるDY−16株の３％程度に抑制されているこ
とが確認された。このSPL4株は、前記の遺伝子
マーカーを有している。またこれらの菌株は、い
ずれも、ヒスチジンとロイシンに対する要求性を
有しており、遺伝子組換え実験において宿主に要
求される複数の栄養要求性を確認した。従つて、
バチルス・サブチリスSPL9株、SPL11株、
SPL39株、特にSPL14株はペプチドを効率よく生
産できる宿主として、安全かつ有用である。 なお、実施例１及び実施例２において形質転換
に供したバチルス・サブチリス104HL株及びバ
チルス・サブチリスDY−16株のプロテアーゼ活
性を、プロテアーゼの野生株であるバチルス・サ
ブチリス207−25株と比較したところ、表４に示
す結果が得られた。なお、プロテアーゼ活性は、
実施例１と同様にして、菌株を24時間培養し、測
定した。 【表】 表４より、バチルス・サブチリス104HL株は、
野生株207−25株の2.8％、バチルス・サブチリス
DY−16株は野生株207−25株の約１％しかプロ
テアーゼを生産しない。
生産するために、特に有用なプロテアーゼ生産性
の低い枯草菌に関する。 ［従来の技術と発明が解決しようとする課題］ 枯草菌（Bacillus subtilis）は、エンドトキシ
ンなどを生産せず、しかも病原微生物として人や
動物に寄生したり共生することがないので、大腸
菌に比べて安全性が高い。このような枯草菌を遺
伝子組換え体の宿主菌として利用することによ
り、外来遺伝子産物であるペプチド、タンパク質
等のペプチド結合を有する有用な生産物を菌体外
へ分泌生産させることができるので、枯草菌は、
その安全性と共に、その工業的有用性が注目され
ている。しかしながら、枯草菌は、プロテアーゼ
を菌体外に多量に分泌生産する。従つて、外来遺
伝子に由来する有用な外来分泌産物が多量に生産
されたとしても、ペチプド結合を有する外来分泌
生産物は、枯草菌が培地中に分泌する種々の菌体
外プロテアーゼにより分解されてしまい、高い収
率で有用生産物を回収することができない。 この問題を解決するために、最近、宿主枯草菌
のプロテアーゼ活性を低下させるための研究が行
なわれている。プロテアーゼ生産性の低い枯草菌
として、枯草菌の主たる菌体外プロテアーゼであ
るアルカリプロテアーゼおよび中性プロテアーゼ
の両者を欠失したバチルス・サブチリス
（Bacillus subtilis）104HL株［バイオケミカ
ル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミ
ユニケーシヨンズ（Biochem.Biophys.Res.
Commun.），128；601−606，1985］や、本出願
人が先に提案したように、バチルス・サブチリス
104HL株に、pap遺伝子を導入したバチルス・サ
ブチリスDY−16株（特開昭64−37284号公報）
が公知である。 しかしながら、バチルス・サブチリス104HL
株やDY−16株には、未だプロテアーゼ活性が残
存しているので、残存するプロテアーゼ活性によ
り、有用な分泌産物が培地中で分解されてしま
う。 従つて、本発明の目的は、安全性が高く、しか
もペプチド結合を有する有用な分泌産物を高収率
で回収できるプロテアーゼ生産性の低い枯草菌を
提供することにある。 ［発明の構成］ 本発明者等は、枯草菌におけるプロテアーゼの
生産が、胞子形成期にその大半が起こることに着
目して、プロテアーゼ低生産性枯草菌を得るべく
鋭意検討した結果、枯草菌の主たる２つのプロテ
アーゼであるアルカリプロテアーゼと中性プロテ
アーゼの生産能を欠き、かつプロテアーゼ活性が
野生株の３％以下の枯草菌に、特定の遺伝子を導
入することによつて、親株枯草菌よりプロテアー
ゼ活性が著しく低下した枯草菌が得られることを
見い出し、本発明を完成した。すなわち、本発明
は、枯草菌の主たる２つのプロテアーゼであるア
ルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生産
能を欠き、しかもプロテアーゼ活性が野生株の３
％以下である枯草菌に、spoOAΔ677遺伝子
（Ellis，et al，Recombinant DNA Technical
Bulletin，４，１−３（1981）が導入された、プ
ロテアーゼ生産性の低下した枯草菌を提供する。 本発明において、spoOAΔ677遺伝子が導入さ
れる枯草菌は、枯草菌の主たる２つのプロテアー
ゼであるアルカリプロテアーゼと中性プロテアー
ゼの生産能を失い、かつプロテアーゼ活性が野生
株の３％以下に低下した枯草菌であればよい。野
生株や、プロテアーゼ活性が野生株の３％を越え
る枯草菌に、spoOAΔ677遺伝子を導入しても、
プロテアーゼ活性が残存し、ペプチド結合を有す
る分泌産物の回収率が低下する。なお、枯草菌の
プロテアーゼ活性が低下しているほど、結果とし
て得られるプロテアーゼ活性も低いことは容易に
類推できる。 このような枯草菌としては、前記バチルス・サ
ブチリス104HL株、バチルス・サブチリスDY−
16株などが挙げられる。なお、バチルス・サブチ
リスDY−16株は、バチルス・サブチリス104HL
株にpap遺伝子を導入した菌株であり、微工研菌
寄第9488号として寄託されている。 これらの菌株は、実施例において詳述するよう
に、野生株バチルス・サブチリス207−25株と比
較して、プロテアーゼ活性が著しく小さい。すな
わち、バチルス・サブチリス104HL株は、野生
株207−25株の約2.8％、バチルス・サブチリス
DY−16株は、野生株207−25株の約１％しかプ
ロテアーゼを生産しない。 ところで、枯草菌におけるプロテアーゼの生産
は、胞子形成期にその大半が起こることが知られ
ている。そこで、本発明者らは、プロテアーゼ活
性の低い前記枯草菌宿主に、spoOAΔ677遺伝子
を導入することにより、宿主に残存するプロテア
ーゼ活性が更に低下することを見い出した。 spoOAΔ677変異は、胞子形成の最も初期の段
階において、胞子形成を遮断する欠失変異であ
る。すなわち、胞子は、枯草菌が、熱、紫外線、
化学薬品及び乾燥に晒されたときにおいても、通
常、自然界で生存し得る形態であるが、上記変異
遺伝子は、枯草菌における胞子形成能を破壊す
る。従つて、spoOAΔ677遺伝子が導入された枯
草菌は、胞子形成能を有しない。 本発明において用いられるspoOAΔ677遺伝子
としては特に限定されず、spoOAΔ677遺伝子を
有する菌株、例えば、バチルス・サブチリス
ATCC35148株、ATCC39090株、ATCC39091株、
ATCC39092株、ATCC39094株、ATCC39096株
などのspoOAΔ677遺伝子を用いることができ、
これらの株は、アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（American Type Culture
Correction）から入手できる。またバチルス・サ
ブチリスATCC39090株は、バチルス・サブチリ
スBGSC1S53として、バチルス・サブチリス
ATCC39096株は、バチルス・サブチリス
BCSCW1S58としてバチルス・ジエネテイツク・
ストツク・センター（Bacilus Genetic Stock
Center）からも入手できる。 spoOAΔ677遺伝子を宿主枯草菌に導入する方
法としては、慣用の方法、例えば、 (1) spoOAΔ677遺伝子供与体菌の染色体DNAを
すべて宿主枯草菌に導入するコンピテントセル
トランスフオーメーシヨン法、 (2) spoOAΔ677遺伝子供与体菌の染色体DNA遺
伝子を制限酵素により切断し、spoOAΔ677遺
伝子を含むDNA断片をプラスミドに組み込み、
宿主枯草菌を形質転換する方法、及び (3) 上記プラスミドと同様にして、フアージ粒子
に組込んだspoOAΔ677遺伝子を用いて、宿主
枯草菌を形質転換する方法 などを挙げることができる。なお、上記(1)(2)(3)の
形質転換法については、「微生物遺伝子実験法、
第３巻、p.96〜116、共立出版」を参照できる。 このようにしてspoOAΔ677遺伝子を枯草菌宿
主に導入した形質転換株の中から、胞子形成能を
欠損した枯草菌を選別する。 胞子形成能が欠損した菌株は、 (1) 胞子形成培地に形質転換株を植菌し、そのコ
ロニーがメラニン色素生産能を失つたこと、 (2) 温度80℃、10分間の熱処理に耐性を示さない
こと、及び (3) 顕微鏡検査により胞子形成を認めないことに
よつて確認できる。 また胞子形成能を有しない枯草菌のうち、宿主
である枯草菌よりもプロテアーゼ生産性が低下し
た菌を選別することにより、本発明のプロテアー
ゼ生産性の低下した枯草菌を得ることができる。 プロテアーゼ生産性の低下した菌株は、spo
OAΔ677遺伝子が導入され、かつ胞子形成能欠損
株となつた枯草菌を、カゼインを含むプレートを
用いて培養し、菌体が分泌するプロテアーゼによ
り形成されるクリアゾーン（Halo）が宿主に比
べて小さい菌株を選別することにより得られる。
またプロテアーゼの生産性をさらに詳しく調べる
方法としては、カゼイン、合成基質であるアゾコ
ール、FITC−カゼインを用いる方法がある。こ
の方法では、これらの基質の分解を、分光光度計
もしくは螢光光度計で測定することにより、培養
上清中のプロテアーゼ活性を調べることができる
ので、プロテアーゼ生産性の低い株を確実に選別
できる。 本発明のプロテアーゼ生産性の低下した枯草菌
のうち、特に好ましい菌株は、バチルス・サブチ
リス104HL株に、spoOAΔ677遺伝子を導入して
得られるバチルス・サブチリスSP011株（微工研
菌寄第10987号）と、バチルス・サブチリスDY
−16株に、spoOAΔ677遺伝子を導入して得られ
るバチルス・サブチリスSPL14株（微工研菌寄第
10988号）である。 本発明のプロテアーゼ生産性の低い枯草菌変異
株は、胞子形成能を有していない点を除き、一般
的な枯草菌としての性質を保持する。好ましい菌
株についてより具体的に説明すると、バチルス・
サブチリスSP011株の親株であるバチルス・サブ
チリス104HL株は、遺伝子マーカーとして、his
leunprR2nprE4ΔaprA3を有している。これに対
して、その変異株であるバチルス・サブチリス
SP011株は、遺伝子マーカーhis nprR2nprE4Δapr
A3spoOAΔ677を有し、親株のleuが欠損し、親
株にspoOAΔ677が導入されている。 またバチルス・サブチリスSPL14株の親株であ
るバチルス・サブチリスDY−16株は、遺伝子マ
ーカーとしてhis leu nprR2nprE4ΔaprA3cyc−ｒ
pap−Ｓを有している。これに対して、その変異
株であるバチルス・サブチリスSPL14株は、his
leunprR2nprE4ΔaprA3cyc−ｒpap−Ｓspo
OAΔ677 lin２を有し、親株にspoOAΔ677とlin
２の遺伝形質が導入されている。 上記遺伝子マーカーからも明らかなように、本
発明の枯草菌は、通常、少なくともヒスチジン要
求性を有しているので、遺伝子組換え実験などの
宿主として有用である。 なお、spoOAΔ677遺伝子を含む菌株、例えば、
spoOAΔ677遺伝子の供与体であるバチルス・サ
ブチリスATCC39096株は、遺伝形質としてthy
A1thyB1pyrD1aro10lin２amy３spoOAΔ677を
有している。 本明細書に記載の遺伝子マーカーの記号の意義
は、次の通りである。 leu：ロイシン要求性変異 his：ヒスチジン要求性変異 nprR2：中性プロテアーゼ制御遺伝子変異 nprE4：中性プロテアーゼ遺伝子欠損変異 ΔaprA3：アルカリプロテアーゼ遺伝子欠失変
異 cyc−ｒ：サイクロセリン耐性変異 pap−Ｓ：α−アミラーゼとプロテアーゼの生
産性に影響を与える遺伝変異 spoOAΔ677：胞子形成の最も初期の段階にお
ける遮断を起こさせる欠失変異 lin２：リンコマイシン耐性変異 thyA1，thyB1：チミン及びチミジンに対する
要求性を付与する突然変異で、トリメトプリ
ム耐性を付与する pyrD1：ピリミジンに対する要求性を付与する
突然変異 aro10：芳香族アミノ酸であるフエニルアラニ
ン、チロシン、トリプトフアンに対する要求
性を付与する突然変異 ［発明の効果］ 以上のように、本発明のプロテアーゼ生産性の
低い枯草菌は、プロテアーゼ活性が小さな枯草菌
にspoOAΔ677遺伝子が導入されているので、安
全性が高く、ペチプド結合を有する有用な分泌産
物を高収率で回収できる。 従つて、本発明の枯草菌は、遺伝子組換技術を
利用して、ペプチド等を生産するときの宿主とし
て有用である。 ［実施例］ 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。 実施例 １ spoOAΔ677遺伝子及びリンコマイシン耐性遺
伝子（以下、Linrと表す）を有する枯草菌である
バチルス・サブチリスATCC39096株を、表１に
示すLB培地を用いて、温度37℃で対数増殖期ま
で振盪培養した。 表 １ 1.0重量％ トリプトン 0.5重量％ 酵母エキス 0.5重量％ NaC PH 7.5 培養液50ml中に含まれる菌体を集め、斎藤・三
浦の方法（H.Saito，K.Miura，Biochim.
Biophis.Acta，72，619（1963））により染色体
DNAを抽出精製した。 得られた染色体DNAを用いて、コピテントセ
ルトランスフオーメーシヨン法により、バチル
ス・サブチリス104HL株を形質転換した。 ヒスチジンを50mg／含む最小寒天培地に形質
転換した枯草菌をまき、温度37℃で48時間培養し
た。以下の指標１〜３に合致する菌株を、胞子形
成能欠損株として選別した。 １ 胞子形成培地に形質転換株を植菌しそのコロ
ニーがメラニン色素生産能を失つたこと、 ２ 温度80℃で10分間の熱処理に耐性を示さない
こと、及び ３ 顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと。 得られた胞子形成能欠損株173株のうちプロテ
アーゼ活性が最も低い株を選出すると共に、プロ
テアーゼ活性を、以下の方法で測定した。 すなわち、１重量％のカゼインを含むLB寒天
平板培地に、胞子形成能を欠損した形質転換株
と、親株であるバチルス・サブチリス104HL株
とを別々に植菌し、温度37℃で24時間培養した。
菌体が分泌するプロテアーゼによりカゼインが分
解されるので、カゼインの分解により形成される
菌体の回りのハローの大きさを指標として、親株
であるバチルス・サブチリス104HL株よりもプ
ロテアーゼ生産能が低下した菌株を24株分離し
た。 さらに、これらの菌株を、LB培地で液体培養
し、その培養上清に存在するプロテアーゼの活性
を、アゾコール（シグマ社製）を基質として測定
した。すなわち、バチルス・サブチリス104HL
株と、プロテアーゼ活性が低下した形質転換株24
株とを、それぞれ、LB培地10mlを用いて一晩培
養した後、培養液１mlを遠心分離し、その上清を
プロテアーゼ酵素液とした。 また基質溶液として、0.48gのアゾコールを、
50mMトリス−塩酸（PH7.5）と1mM塩化カルシ
ウムとからなる混合液20mlに懸濁し、その750μ
を酵素液50μと混合し、温度37℃で30分間イ
ンキユベートした。反応溶液に、反応停止液とし
て0.5Mトリクロロ酢酸800μを加えた後、遠心
分離し、その上清の吸光度を波長520nmで測定し
た。 なお、プロテアーゼ活性（PU）は、科研製薬
(株)製、アクチナーゼＥの活性に換算して算出し
た。その際、アクチナーゼＥがカゼインを基質と
して温度37℃、PH7.5において、１分間に1μmol
のチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性ペプ
チドを遊離する活性を１ユニツトとした。すなわ
ち、上清のプロテアーゼ酵素液に代えて、上記ア
クチナーゼＥを用い、上記と同様の反応を行な
い、上清の吸光度を測定して検量線を作成し、こ
の検量線に基づいて、プロテアーゼ活性を算出し
た。 そして、親株バチルス・サブチリス104HL株
よりも、プロテアーゼ活性が極端に低下した４株
を得、これらの菌株を、それぞれ、バチルス・サ
ブチリスspo6株、spo7株、spo9株、spo11株とし
た。 これら４株のプロテアーゼ活性を、さらに詳し
く測定した。すなわち、バチルス・サブチリス
104HL株及びプロテアーゼ活性が低下した形質
転換株４株を、10mlのLB培地で18時間培養した
後、50mlのMedium Ａ培地（Journal of
Bacteriology，165，796−804，1986）に菌体を
移し、24時間及び48時間培養した後、培養上清中
のプロテアーゼ活性を上記と同様にして測定し
た。 その結果を表２に示す。 【表】 表２より、得られた胞子形成能欠損株のうち、
SPO7及びSPO11株は、親株に比べてプロテアー
ゼ活性が極めて低いことが確認された。特に
SPO11株は、プロテアーゼ活性が、親株である
104HL株の約１％に低下していることから、ペ
プチド等の分泌生産のための宿主としてきわめて
有用である。またSPO11株は、前記の遺伝子マ
ーカーを有している。またいずれの株もヒスチジ
ンに対する要求性を有している。従つて、バチル
ス・サブチリスspo6株、spo9株、特にspo7株、
中でもバチルス・サブチリスSPO11株は、ペチ
プドを効率よく生産できる宿主として、安全かつ
有用である。 実施例 ２ バチルス・サブチリスATCC39096株の染色体
DNAを用いて、コンピテントセル形質転換法に
より、バチルス・サブチリスDY−16株を形質転
換した。次に、得られた形質転換株を、5μg／ml
のリンコマイシンを含むLB寒天平板培地を用い
て培養し、Linrの導入された株を選択した。 その結果、約800株のリンコマイシン耐性形質
転換株を得た。また実施例１と同様にして、これ
らのリンコマイシン耐性形質転換株から胞子形成
能欠損株を51株分離した。 得られた胞子形成能欠損株のうちプロテアーゼ
活性が最も小さい株を、実施例１と同様にして、
選出し、プロテアーゼ活性を測定した。 すなわち、１重量％のカゼインを含むLB寒天
平板培地に、胞子形成能欠損形質転換株と、親株
であるバチルス・サブチリスDY−16株とを別々
に植菌し、温度37℃で24時間培養し、実施例１と
同様に、菌体の回りのハローの大きさを指標とし
て、バチルス・サブチリスDY−16株よりもプロ
テアーゼ生産能が低下した菌株を40株分離した。 これらの株をLB培地で液体培養し、その培養
上清に存在するプロテアーゼの活性を、FITC−
カゼイン（シグマ社製）を基質として測定した。
すなわち、バチルス・サブチリスDY−16株及び
プロテアーゼ活性が低下した形質転換株40株を、
それぞれ、LB培地10mlを用いて一晩培養し、そ
の培養液1mlを遠心分離し、その上清をプロテア
ーゼ酵素液とした。 酵素液50μと0.2μgのFITC−カゼインとを、
10mMトリス−塩酸（PH7.5）及び2mM塩化カル
シウムからなる200μの緩衝液中で、温度37℃
で２時間反応した。反応液に、200μの7.5重量
％トリクロロ酢酸を加え遠心分離した後、その上
清100μに、500mMのトリス−塩酸（PH8.5）
900μを加え、螢光光度計でプロテアーゼ活性
を測定した。 なお、プロテアーゼ活性（PUD）は、カゼイ
ンを用い、温度37℃、PH7.5において、１分間に
1μmolのチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶
性ペプチドを遊離する酵素量を1PUDとして、算
出した。 その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・
サブチリスDY−16株に比べて、極端に低下した
４株を得、これらの菌株を、それぞれ、バチル
ス・サブチリスSPL9株、SPL11株、SPL14株、
SPL39株とした。 そして、実施例１と同様にして、バチルス・サ
ブチリスDY−16株及びこれらのプロテアーゼ活
性が低下した形質転換株を10mlのLB培地で18時
間培養した後、50mlのMediumA培地に菌体を移
し、培養24時間及び48時間培養した後、培養上清
中のプロテアーゼの活性を上記と同様にして測定
した。その結果を表３に示す。 【表】 表３より、形質転換株４株は、親株よりもプロ
テアーゼ活性が1/20以下と低いことが確認され
た。特にSPL14株は、プロテアーゼ活性が、親株
であるDY−16株の３％程度に抑制されているこ
とが確認された。このSPL4株は、前記の遺伝子
マーカーを有している。またこれらの菌株は、い
ずれも、ヒスチジンとロイシンに対する要求性を
有しており、遺伝子組換え実験において宿主に要
求される複数の栄養要求性を確認した。従つて、
バチルス・サブチリスSPL9株、SPL11株、
SPL39株、特にSPL14株はペプチドを効率よく生
産できる宿主として、安全かつ有用である。 なお、実施例１及び実施例２において形質転換
に供したバチルス・サブチリス104HL株及びバ
チルス・サブチリスDY−16株のプロテアーゼ活
性を、プロテアーゼの野生株であるバチルス・サ
ブチリス207−25株と比較したところ、表４に示
す結果が得られた。なお、プロテアーゼ活性は、
実施例１と同様にして、菌株を24時間培養し、測
定した。 【表】 表４より、バチルス・サブチリス104HL株は、
野生株207−25株の2.8％、バチルス・サブチリス
DY−16株は野生株207−25株の約１％しかプロ
テアーゼを生産しない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼ
の生産能を欠き、かつプロテアーゼ活性が野生株
の３％以下である枯草菌に、spoOAΔ677変異遺
伝子が導入されているプロテアーゼ生産性の低い
枯草菌。 ２ プロテアーゼ生産性の低い枯草菌が、バチル
ス・サブチリス104HL株に、spoOAΔ677変異遺
伝子が導入されているバチルス・サブチリス
SP011株（微工研菌寄第10987号）である請求項
１記載の枯草菌。 ３ プロテアーゼ生産性の低い枯草菌が、バチル
ス・サブチリスDY−16株（微工研菌寄第9488
号）に、spoOAΔ677変異遺伝子が導入されてい
るバチルス・サブチリスSPL14株（微工研菌寄第
10988号）である請求項１記載の枯草菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28144089A JPH03143387A (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | プロテアーゼ生産性の低い枯草菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28144089A JPH03143387A (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | プロテアーゼ生産性の低い枯草菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03143387A JPH03143387A (ja) | 1991-06-18 |
| JPH0523742B2 true JPH0523742B2 (ja) | 1993-04-05 |
Family
ID=17639206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28144089A Granted JPH03143387A (ja) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | プロテアーゼ生産性の低い枯草菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03143387A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4318549B2 (ja) | 2002-02-28 | 2009-08-26 | 協和発酵バイオ株式会社 | Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 |
| JP6019528B2 (ja) * | 2012-06-05 | 2016-11-02 | 池田食研株式会社 | 発酵調味料の製造方法 |
-
1989
- 1989-10-27 JP JP28144089A patent/JPH03143387A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03143387A (ja) | 1991-06-18 |
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