JPH05244995A - 新規プライマー - Google Patents
新規プライマーInfo
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- JPH05244995A JPH05244995A JP3243122A JP24312291A JPH05244995A JP H05244995 A JPH05244995 A JP H05244995A JP 3243122 A JP3243122 A JP 3243122A JP 24312291 A JP24312291 A JP 24312291A JP H05244995 A JPH05244995 A JP H05244995A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer
- dna
- sequence
- rice
- polymorphism
- Prior art date
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ＤＮＡフィンガープリントを迅速かつ簡便に得
る。これまで検出が不可能であった稲およびブラシカの
間の多型を検出する。 【構成】配列番号１ないし８から選ばれる塩基配列を有
する新規プライマーおよび該プライマーの少なくとも１
つを用いることを特徴とするＰＣＲ法による稲およびブ
ラシカの間のＤＮＡ配列の多型を検出する方法。
る。これまで検出が不可能であった稲およびブラシカの
間の多型を検出する。 【構成】配列番号１ないし８から選ばれる塩基配列を有
する新規プライマーおよび該プライマーの少なくとも１
つを用いることを特徴とするＰＣＲ法による稲およびブ
ラシカの間のＤＮＡ配列の多型を検出する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規プライマーに関す
る。本発明のプライマーはＤＮＡフィンガープリントを
迅速、かつ、簡便に得ることができ、これまで検出する
ことが不可能であった同一植物種内におけるＤＮＡの多
型を検出することができる。
る。本発明のプライマーはＤＮＡフィンガープリントを
迅速、かつ、簡便に得ることができ、これまで検出する
ことが不可能であった同一植物種内におけるＤＮＡの多
型を検出することができる。
【０００２】
【従来の技術】近年、バイオテクノロジーの進歩によ
り、植物の育種に対して新たな技術が数多く導入され
た。なかでも、染色体上のＤＮＡ断片の多型を検出し、
有用な形質と対応させ標識とする手法や、個体や品種の
識別に用いる手法は、非常に有用な方法である。制限断
片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphis
m；以下、ＲＦＬＰ法と略記する。）分析はその一つで
ある〔Helentjaris ら、PlantMolec.Biol. 5,109-118
(1985)；Helentjaris ら、Theor.Appl.Genet. 72,761-7
69(1986)；Neinhuisら、Crop Science 27,797-803(198
7) 〕。また、ＤＮＡフィンガープリントを取得する方
法が開発され〔Jeffreysら、Nature 316,76-79(198
5)〕、これを植物の品種識別や育種に応用する方法も研
究されている〔Dallas,Proc.Natl.Acad. Sci. 85,6831-
6835(1988), Rogstad ら、Proc.Natl.Acad.Sci. 85,917
6-9178(1988), Rogstad ら、Theor.Appl.Genet. 79,153
-156(1990)〕。ＤＮＡフィンガープリントを取得する方
法において、高頻度に多型を示すミニサテライトＤＮＡ
〔Jeffreysら、Nature 314,67-73(1985)〕、ＶＮＴＲ
〔Nakamuraら、Science 235,1616-1622(1987) 〕また
は、マイクロサテライトＤＮＡ〔Littら、Am.J.Hum.Gen
et.44,397-401(1989) ；Waber ら、Am.J.Hum.Genet.44,
388-396(1989) 〕と呼ばれる反復配列が利用されてい
る。
り、植物の育種に対して新たな技術が数多く導入され
た。なかでも、染色体上のＤＮＡ断片の多型を検出し、
有用な形質と対応させ標識とする手法や、個体や品種の
識別に用いる手法は、非常に有用な方法である。制限断
片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphis
m；以下、ＲＦＬＰ法と略記する。）分析はその一つで
ある〔Helentjaris ら、PlantMolec.Biol. 5,109-118
(1985)；Helentjaris ら、Theor.Appl.Genet. 72,761-7
69(1986)；Neinhuisら、Crop Science 27,797-803(198
7) 〕。また、ＤＮＡフィンガープリントを取得する方
法が開発され〔Jeffreysら、Nature 316,76-79(198
5)〕、これを植物の品種識別や育種に応用する方法も研
究されている〔Dallas,Proc.Natl.Acad. Sci. 85,6831-
6835(1988), Rogstad ら、Proc.Natl.Acad.Sci. 85,917
6-9178(1988), Rogstad ら、Theor.Appl.Genet. 79,153
-156(1990)〕。ＤＮＡフィンガープリントを取得する方
法において、高頻度に多型を示すミニサテライトＤＮＡ
〔Jeffreysら、Nature 314,67-73(1985)〕、ＶＮＴＲ
〔Nakamuraら、Science 235,1616-1622(1987) 〕また
は、マイクロサテライトＤＮＡ〔Littら、Am.J.Hum.Gen
et.44,397-401(1989) ；Waber ら、Am.J.Hum.Genet.44,
388-396(1989) 〕と呼ばれる反復配列が利用されてい
る。
【０００３】しかしながら、これらの方法においては、
サザンブロット法〔Southern,E.M.,J.Molec.Biol.98,50
3-517(1975) 〕を用いるため、多量の試料ＤＮＡが必
要である時間と労力および熟練を必要とする方法であ
る各サザンブロットについて一つの制限酵素断片長多
型性クローンしか分析することができない特別な施設
を必要とする高価な放射性同位元素を使用する等の問題
を有していた。このような問題を解決すべく導入された
のがＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 法である（米
国特許第4,683,195 号および4,683,202 号）。この方法
によれば、少量のＤＮＡ試料で、多数の試料を放射性同
位元素を使用せずに、自動装置を用いて、短時間に、安
い費用で、同時に多種類の項目について分析することが
できる。
サザンブロット法〔Southern,E.M.,J.Molec.Biol.98,50
3-517(1975) 〕を用いるため、多量の試料ＤＮＡが必
要である時間と労力および熟練を必要とする方法であ
る各サザンブロットについて一つの制限酵素断片長多
型性クローンしか分析することができない特別な施設
を必要とする高価な放射性同位元素を使用する等の問題
を有していた。このような問題を解決すべく導入された
のがＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 法である（米
国特許第4,683,195 号および4,683,202 号）。この方法
によれば、少量のＤＮＡ試料で、多数の試料を放射性同
位元素を使用せずに、自動装置を用いて、短時間に、安
い費用で、同時に多種類の項目について分析することが
できる。
【０００４】ＲＦＬＰ法では、制限酵素により切断され
たＤＮＡ断片の長さの違いを個体間または品種間で比較
するが、ＰＣＲ法では、ＤＮＡ断片の長さの違いは、二
つのプライマーがそれぞれハイブリダイズする部位間の
距離の差として検出することができる。すなわち、複数
の個体または品種を比較する場合、ある特定の高可変領
域の両側の変異のない隣接部位に対してプライマーを作
成すれば、ＰＣＲ法により当該高可変領域の可変性に基
く多型を検出することができる〔Jeffreysら、Nucleic
Acid Research 16,10953-10971(1988)；Nelsonら、Pro
c.Natl.Acad.Sci. 86,6686-6690(1989)；Hornら、Nucle
ic Acid Research 17,2140-2140(1989)；D'Ovidioら、P
lant Molec.Biol. 15,169-171(1990)；Oudet ら、Hum.G
enet.84,283-285(1990)〕。図１に品種ＡとＢの間のプ
ライマーの作成部位を示した。また、任意に合成された
１０塩基長のプライマーの一つまたは二つを用いたＰＣ
Ｒ法により品種間の多型を検出する方法も報告されてい
る。
たＤＮＡ断片の長さの違いを個体間または品種間で比較
するが、ＰＣＲ法では、ＤＮＡ断片の長さの違いは、二
つのプライマーがそれぞれハイブリダイズする部位間の
距離の差として検出することができる。すなわち、複数
の個体または品種を比較する場合、ある特定の高可変領
域の両側の変異のない隣接部位に対してプライマーを作
成すれば、ＰＣＲ法により当該高可変領域の可変性に基
く多型を検出することができる〔Jeffreysら、Nucleic
Acid Research 16,10953-10971(1988)；Nelsonら、Pro
c.Natl.Acad.Sci. 86,6686-6690(1989)；Hornら、Nucle
ic Acid Research 17,2140-2140(1989)；D'Ovidioら、P
lant Molec.Biol. 15,169-171(1990)；Oudet ら、Hum.G
enet.84,283-285(1990)〕。図１に品種ＡとＢの間のプ
ライマーの作成部位を示した。また、任意に合成された
１０塩基長のプライマーの一つまたは二つを用いたＰＣ
Ｒ法により品種間の多型を検出する方法も報告されてい
る。
【０００５】植物の個体・品種間の多型を検出する手法
において、実際に多型が検出できるのは、比較する個体
・品種間の類縁関係がある程度離れている場合に限られ
る。一方、農業上重要な植物の多くは、人為的に育成さ
れた栽培品種や自殖性の植物であり、長年にわたって類
似性の高い品種との交雑を繰り返してきたために、上記
のＰＣＲ法を用いても多型が検出される頻度が低い。例
えば、コシヒカリ、ササニシキ、日本晴等の日本型稲の
品種間では、その表現形質に食味、病気抵抗性等の多様
性が見られるにもかかわらず、ＤＮＡの多型が得られる
頻度は日本型とインド型の水稲間で得られる頻度の十分
の一以下である。したがって、遺伝子地図の作成のよう
な通常の植物でも２〜３年を要する研究が、日本型稲を
材料とした場合、２０年以上要すると考えられる。ま
た、全く、無作為にプライマーを合成したうえで有用な
プライマーを一つ一つ実験的に選択する方法は、多型の
検出しにくい品種間では、効率的な方法ではない。
において、実際に多型が検出できるのは、比較する個体
・品種間の類縁関係がある程度離れている場合に限られ
る。一方、農業上重要な植物の多くは、人為的に育成さ
れた栽培品種や自殖性の植物であり、長年にわたって類
似性の高い品種との交雑を繰り返してきたために、上記
のＰＣＲ法を用いても多型が検出される頻度が低い。例
えば、コシヒカリ、ササニシキ、日本晴等の日本型稲の
品種間では、その表現形質に食味、病気抵抗性等の多様
性が見られるにもかかわらず、ＤＮＡの多型が得られる
頻度は日本型とインド型の水稲間で得られる頻度の十分
の一以下である。したがって、遺伝子地図の作成のよう
な通常の植物でも２〜３年を要する研究が、日本型稲を
材料とした場合、２０年以上要すると考えられる。ま
た、全く、無作為にプライマーを合成したうえで有用な
プライマーを一つ一つ実験的に選択する方法は、多型の
検出しにくい品種間では、効率的な方法ではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、類縁性の高
い稲の間およびブラシカの間の多型を検出するための新
規なプライマーを提供することにある。
い稲の間およびブラシカの間の多型を検出するための新
規なプライマーを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＰＣＲ法
で類縁性の高い稲の間の多型およびブラシカの間の多型
を検出するために、プライマーとしてＤＮＡの隣接する
非可変部位に対するものでなく、反復配列を含む染色体
上に複数個存在する配列（以下、複数存在配列と略記す
る。）のうちある特定の配列を用いることにより増幅さ
れてくるＤＮＡ断片が、電気泳動的に分離不可能な、連
続的な長さを持った一連の集団となることなく、電気泳
動的に分離可能な複数のＤＮＡ断片（ＤＮＡフィンガー
プリント）として取得することができ、かつ、そのＤＮ
Ａフィンガープリントが高い頻度で多型を示すことを見
出した。これにより、類縁性の高い個体・品種を同定で
きるばかりでなく、組織培養で生産される苗の変異率の
検定や育種において極めて重要にもかかわらず手間と時
間のかかるＦ１個体の同定および選抜にも応用でき、ま
た、従来法では時間、費用および労力的に不可能であっ
た遺伝子地図の作成も可能となる。
で類縁性の高い稲の間の多型およびブラシカの間の多型
を検出するために、プライマーとしてＤＮＡの隣接する
非可変部位に対するものでなく、反復配列を含む染色体
上に複数個存在する配列（以下、複数存在配列と略記す
る。）のうちある特定の配列を用いることにより増幅さ
れてくるＤＮＡ断片が、電気泳動的に分離不可能な、連
続的な長さを持った一連の集団となることなく、電気泳
動的に分離可能な複数のＤＮＡ断片（ＤＮＡフィンガー
プリント）として取得することができ、かつ、そのＤＮ
Ａフィンガープリントが高い頻度で多型を示すことを見
出した。これにより、類縁性の高い個体・品種を同定で
きるばかりでなく、組織培養で生産される苗の変異率の
検定や育種において極めて重要にもかかわらず手間と時
間のかかるＦ１個体の同定および選抜にも応用でき、ま
た、従来法では時間、費用および労力的に不可能であっ
た遺伝子地図の作成も可能となる。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、配列番号１ないし８から選ばれる塩基配列の一つを
有する新規プライマーに関する。さらに、本発明は、当
該プライマーを用いたＰＣＲ法による稲の間およびブラ
シカの間の多型の検出法に関する。稲に属する品種とし
ては、日本型稲、インド型稲、ジャワ型稲等があげら
れ、また、ブラシカに属する品種としては、アブラナ、
ハクサイ、キャベツ、ブロッコリ等があげられる。本発
明は、これらの品種間または同じ品種間での多型の検出
に有用である。
は、配列番号１ないし８から選ばれる塩基配列の一つを
有する新規プライマーに関する。さらに、本発明は、当
該プライマーを用いたＰＣＲ法による稲の間およびブラ
シカの間の多型の検出法に関する。稲に属する品種とし
ては、日本型稲、インド型稲、ジャワ型稲等があげら
れ、また、ブラシカに属する品種としては、アブラナ、
ハクサイ、キャベツ、ブロッコリ等があげられる。本発
明は、これらの品種間または同じ品種間での多型の検出
に有用である。
【０００９】本発明のプライマーの配列は、識別したい
植物それぞれの植物体、好ましくは葉（乾重量０.1〜５
ｇ）から定法〔Saghai-Maroof ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i. 81,8014-8018(1984)〕によりＤＮＡを抽出し、当該
ＤＮＡ配列のうち一つ以上の複数存在配列に着目し、少
なくとも一つ以上の領域を特定することにより決定す
る。このプライマーの配列中には、複数存在配列そのも
のを含む。本発明のプライマーの合成は定法に従い、Ｄ
ＮＡ合成器サイクロンにより行う。
植物それぞれの植物体、好ましくは葉（乾重量０.1〜５
ｇ）から定法〔Saghai-Maroof ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i. 81,8014-8018(1984)〕によりＤＮＡを抽出し、当該
ＤＮＡ配列のうち一つ以上の複数存在配列に着目し、少
なくとも一つ以上の領域を特定することにより決定す
る。このプライマーの配列中には、複数存在配列そのも
のを含む。本発明のプライマーの合成は定法に従い、Ｄ
ＮＡ合成器サイクロンにより行う。
【００１０】本発明のプライマーを用いるＰＣＲ法によ
る多型の検出法において、本発明のプライマーは少なく
とも一つが反応液中に存在すればよい。また、他の配列
を有するプライマーと混合して用いてもよい。ＰＣＲ法
の反応条件は定法〔Saiki ら、Science 239,487-491(19
88) 〕に従う。アニーリング温度は、プライマーごとに
決定されるが、通常より低い温度、例えば３２℃に設定
する方が多型を検出しやすい。また、通常は７２℃で１
分間程の延長反応を組み込むことが多いが、本発明のプ
ライマーを用いるＰＣＲ法においては反応生成物である
ＤＮＡ断片の長さを１キロベース以下にするためこの延
長反応を省略する。
る多型の検出法において、本発明のプライマーは少なく
とも一つが反応液中に存在すればよい。また、他の配列
を有するプライマーと混合して用いてもよい。ＰＣＲ法
の反応条件は定法〔Saiki ら、Science 239,487-491(19
88) 〕に従う。アニーリング温度は、プライマーごとに
決定されるが、通常より低い温度、例えば３２℃に設定
する方が多型を検出しやすい。また、通常は７２℃で１
分間程の延長反応を組み込むことが多いが、本発明のプ
ライマーを用いるＰＣＲ法においては反応生成物である
ＤＮＡ断片の長さを１キロベース以下にするためこの延
長反応を省略する。
【００１１】反応液としては、例えば、テンプレートＤ
ＮＡ 10ng、プライマー各20pmol、10X バッファー〔50
0mM 塩化カリウム, 100mM トリス塩酸バッファー(pH8.
4), 25mM 塩化マグネシウム〕10μl 、2.5mM dNTP 8μl
、タック(Taq) ポリメラーゼ（パーキンエルマーシー
タス社製）２ユニットに水を加えて100 μl としたもの
を用いる。この反応液を0.5ml 容量の反応チューブに入
れて、サーモサイクラーを用いて反応を行う。反応は、
例えば、95℃で５分間反応させた後、32℃で30秒間、93
℃で30秒間の反応を40回繰り返すか、または、95℃で5
分間反応させた後、55℃で30秒間、93℃で30秒間の反応
を40回繰り返してＤＮＡを増幅させる。
ＮＡ 10ng、プライマー各20pmol、10X バッファー〔50
0mM 塩化カリウム, 100mM トリス塩酸バッファー(pH8.
4), 25mM 塩化マグネシウム〕10μl 、2.5mM dNTP 8μl
、タック(Taq) ポリメラーゼ（パーキンエルマーシー
タス社製）２ユニットに水を加えて100 μl としたもの
を用いる。この反応液を0.5ml 容量の反応チューブに入
れて、サーモサイクラーを用いて反応を行う。反応は、
例えば、95℃で５分間反応させた後、32℃で30秒間、93
℃で30秒間の反応を40回繰り返すか、または、95℃で5
分間反応させた後、55℃で30秒間、93℃で30秒間の反応
を40回繰り返してＤＮＡを増幅させる。
【００１２】反応生成物は、ゲル電気泳動法、高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）法、キャピラリー電気泳動
法等を用いて分離するが、ゲル電気泳動が好ましい。ゲ
ルはアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等が用い
られるが、より、微小な差を検出するにはポリアクリル
アミドゲルが好ましい。ポリアクリルアミドゲルは通
常、５％程度の濃度のものを用いる。電気泳動は通常、
100 〜120Vで２〜３時間行う。電気泳動終了後、1 〜10
μg ／mlのエチジウムブロマイドで10〜30分間染色し、
紫外線下に分離パターンを検出する。
クロマトグラフィー（HPLC）法、キャピラリー電気泳動
法等を用いて分離するが、ゲル電気泳動が好ましい。ゲ
ルはアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等が用い
られるが、より、微小な差を検出するにはポリアクリル
アミドゲルが好ましい。ポリアクリルアミドゲルは通
常、５％程度の濃度のものを用いる。電気泳動は通常、
100 〜120Vで２〜３時間行う。電気泳動終了後、1 〜10
μg ／mlのエチジウムブロマイドで10〜30分間染色し、
紫外線下に分離パターンを検出する。
【００１３】以下に、本発明の実施例を示す。
【００１４】
【実施例】実施例１ 日本型稲の栽培品種であるコシヒカリ、ササニシキ、日
本晴およびヤカンの葉（乾重量0.5g) のそれぞれから定
法によりＤＮＡを抽出した。次に配列番号１のプライマ
ー（プライマー１）および配列番号２のプライマー（プ
ライマー２）をそれぞれＤＮＡ合成機サイクロン（ミリ
ジェン社製）を用いて合成した。それぞれの稲のＤＮＡ
10ng、プライマー１およびプライマー２をそれぞれ20pm
ol、10Xバッファー10μl 、2.5mM dNTP 8μl およびタ
ック(Taq) ポリメラーゼ（パーキンエルマーシータス社
製）2 ユニットに水を加えて、100 μl とした反応液を
作成し、0.5ml 容量の反応チューブに入れ、サーモサイ
クラー〔エリコン(Ericomp) 社製〕を用いて、95℃で5
分間反応を行った後、32℃で30秒間、93℃で30秒間の反
応を40回繰り返し、ＤＮＡの増幅を行った。反応生成物
は120Vで2.5 時間、５％ポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイドで染色し
た後、紫外線下に分離パターンを検出し、品種間のパタ
ーンの違いを調べた。その結果を図２に示す。図２に示
したように、４品種の間で多型が検出された。
本晴およびヤカンの葉（乾重量0.5g) のそれぞれから定
法によりＤＮＡを抽出した。次に配列番号１のプライマ
ー（プライマー１）および配列番号２のプライマー（プ
ライマー２）をそれぞれＤＮＡ合成機サイクロン（ミリ
ジェン社製）を用いて合成した。それぞれの稲のＤＮＡ
10ng、プライマー１およびプライマー２をそれぞれ20pm
ol、10Xバッファー10μl 、2.5mM dNTP 8μl およびタ
ック(Taq) ポリメラーゼ（パーキンエルマーシータス社
製）2 ユニットに水を加えて、100 μl とした反応液を
作成し、0.5ml 容量の反応チューブに入れ、サーモサイ
クラー〔エリコン(Ericomp) 社製〕を用いて、95℃で5
分間反応を行った後、32℃で30秒間、93℃で30秒間の反
応を40回繰り返し、ＤＮＡの増幅を行った。反応生成物
は120Vで2.5 時間、５％ポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイドで染色し
た後、紫外線下に分離パターンを検出し、品種間のパタ
ーンの違いを調べた。その結果を図２に示す。図２に示
したように、４品種の間で多型が検出された。
【００１５】実施例２ 配列番号３のプライマー（プライマー３）および配列番
号４のプライマー（プライマー４）をそれぞれＤＮＡ合
成機サイクロン（ミリジェン社製）を用いて合成した。
プライマー１および２の代わりにそれぞれプライマー３
および４を用いる以外は実施例１と同様にして反応を行
った。反応生成物を120V,2.5時間、５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイドで
染色した後、紫外線下に分離パターンを検出し、品種間
のパターンの違いを調べた。その結果を図３に示す。図
３に示したように、４品種の間で多型が検出された。
号４のプライマー（プライマー４）をそれぞれＤＮＡ合
成機サイクロン（ミリジェン社製）を用いて合成した。
プライマー１および２の代わりにそれぞれプライマー３
および４を用いる以外は実施例１と同様にして反応を行
った。反応生成物を120V,2.5時間、５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイドで
染色した後、紫外線下に分離パターンを検出し、品種間
のパターンの違いを調べた。その結果を図３に示す。図
３に示したように、４品種の間で多型が検出された。
【００１６】実施例３ 配列番号５のプライマー（プライマー５）および配列番
号６のプライマー（プライマー６）をそれぞれＤＮＡ合
成機サイクロン（ミリジェン社製）を用いて合成した。
プライマー１および２の代わりにそれぞれプライマー５
および６を用いる以外は実施例１と同様にして反応を行
った。反応生成物を120Vで2.5 時間、５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイド
で染色した後、紫外線下に分離パターンを検出し、品種
間のパターンの違いを調べた。その結果を図４に示す。
図４に示したように、４品種の間で多型が検出された。
号６のプライマー（プライマー６）をそれぞれＤＮＡ合
成機サイクロン（ミリジェン社製）を用いて合成した。
プライマー１および２の代わりにそれぞれプライマー５
および６を用いる以外は実施例１と同様にして反応を行
った。反応生成物を120Vで2.5 時間、５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイド
で染色した後、紫外線下に分離パターンを検出し、品種
間のパターンの違いを調べた。その結果を図４に示す。
図４に示したように、４品種の間で多型が検出された。
【００１７】実施例４ 配列番号７のプライマー（プライマー７）および配列番
号８のプライマー（プライマー８）をそれぞれＤＮＡ合
成機サイクロン（ミリジェン社製）を用いて合成した。
プライマー１および２の代わりにそれぞれプライマー７
および８を用い、95℃で5 分間反応させた後、55℃で30
秒間、93℃で30秒間の反応を40回繰り返して反応を行う
以外は実施例１と同様に行った。その結果を図５に示
す。図５に示したように、４品種の間で多型が検出され
た。
号８のプライマー（プライマー８）をそれぞれＤＮＡ合
成機サイクロン（ミリジェン社製）を用いて合成した。
プライマー１および２の代わりにそれぞれプライマー７
および８を用い、95℃で5 分間反応させた後、55℃で30
秒間、93℃で30秒間の反応を40回繰り返して反応を行う
以外は実施例１と同様に行った。その結果を図５に示
す。図５に示したように、４品種の間で多型が検出され
た。
【００１８】実施例５ ブロッコリの４つの栽培品種の葉（乾重量0.5g) から定
法によりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを稲ＤＮＡの代
わりに用いる以外は実施例４と同様に反応を行い反応生
成物を得た。この反応生成物を120Vで2.5 時間、５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、エチジウム
ブロマイドで染色した後、紫外線下に分離パターンを検
出し、品種間のパターンの違いを調べた。その結果を図
６に示す。図６に示したように、４品種の間で多型が検
出された。
法によりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを稲ＤＮＡの代
わりに用いる以外は実施例４と同様に反応を行い反応生
成物を得た。この反応生成物を120Vで2.5 時間、５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、エチジウム
ブロマイドで染色した後、紫外線下に分離パターンを検
出し、品種間のパターンの違いを調べた。その結果を図
６に示す。図６に示したように、４品種の間で多型が検
出された。
【００１９】
【発明の効果】本発明により、類縁性の高い稲の間およ
びブラシカの間の多型を検出するための新規なプライマ
ーが提供される。本発明のプライマーはＤＮＡフィンガ
ープリントを迅速、かつ、簡便に得ることができ、これ
まで検出することが不可能であった同一植物種内におけ
るＤＮＡの多型を検出することができる。
びブラシカの間の多型を検出するための新規なプライマ
ーが提供される。本発明のプライマーはＤＮＡフィンガ
ープリントを迅速、かつ、簡便に得ることができ、これ
まで検出することが不可能であった同一植物種内におけ
るＤＮＡの多型を検出することができる。
【００２０】
配列番号：1 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 起源：Oryza sativa 配列の特徴 S repeat unit の一部 配列 CAATATGGTG CGCGACAAT 19
【００２１】配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 起源：Oryza sativa 配列の特徴 S repeat unit の一部 配列 TGCCATTCCT ATACTAACCA 20
【００２２】配列番号：3 配列の長さ：9 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 S 5'UTR 配列 AGCCATGGC 9
【００２３】配列番号：4 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 起源：Oryza sativa 配列の特徴 S repeat unit の一部 配列 GCCGTGCTGC CCCTGGTA 18
【００２４】配列番号：5 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 S repeat unit 配列 TAGATAGATA GATAGA 16
【００２５】配列番号：6 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 S repeat unit 配列 GACAGACAGA CAGACA 16
【００２６】配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 S repeat unit 配列 TGTGTGTGTG TGTGTGTGCC 20
【００２７】配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 起源：Zea maize 配列の特徴 S repeat unit の一部 配列 CCAGAAATCC AAGAATGTGA 20
【図１】ＰＣＲ法における品種ＡとＢの間のプライマー
の作成部位を示した図である。→はプライマーを表す。
の作成部位を示した図である。→はプライマーを表す。
【図２】プライマー１および２を用いて増幅を行った稲
のＤＮＡの電気泳動の結果を示した図である。左端のレ
ーンから、分子量マーカー、コシヒカリ、ササニシキ、
日本晴、ヤカンの葉をそれぞれ示す。
のＤＮＡの電気泳動の結果を示した図である。左端のレ
ーンから、分子量マーカー、コシヒカリ、ササニシキ、
日本晴、ヤカンの葉をそれぞれ示す。
【図３】プライマー３および４を用いて増幅を行った稲
のＤＮＡの電気泳動の結果を示した図である。左端のレ
ーンから、コシヒカリ、ササニシキ、日本晴、ヤカンの
葉をそれぞれ示す。
のＤＮＡの電気泳動の結果を示した図である。左端のレ
ーンから、コシヒカリ、ササニシキ、日本晴、ヤカンの
葉をそれぞれ示す。
【図４】プライマー５および６を用いて増幅を行った稲
のＤＮＡの電気泳動の結果を示した図である。左端のレ
ーンから、コシヒカリ、ササニシキ、日本晴、ヤカンの
葉をそれぞれ示す。
のＤＮＡの電気泳動の結果を示した図である。左端のレ
ーンから、コシヒカリ、ササニシキ、日本晴、ヤカンの
葉をそれぞれ示す。
【図５】プライマー７および８を用いて増幅を行った稲
のＤＮＡの電気泳動の結果を示した図である。左端のレ
ーンから、分子量マーカー、コシヒカリ、ササニシキ、
日本晴、ヤカンの葉をそれぞれ示す。
のＤＮＡの電気泳動の結果を示した図である。左端のレ
ーンから、分子量マーカー、コシヒカリ、ササニシキ、
日本晴、ヤカンの葉をそれぞれ示す。
【図６】プライマー７および８を用いて増幅を行った４
種のブロッコリのＤＮＡの電気泳動の結果を示した図で
ある。
種のブロッコリのＤＮＡの電気泳動の結果を示した図で
ある。
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号１ないし８から選ばれる塩基配
列の一つを有する新規プライマー。 - 【請求項２】 請求項１記載のプライマーの少なくとも
一つを用いることを特徴とするＰＣＲ法による稲の間の
ＤＮＡ配列の多型を検出する方法。 - 【請求項３】 請求項１記載のプライマーの少なくとも
一つを用いることを特徴とするＰＣＲ法によるブラシカ
の間のＤＮＡ配列の多型を検出する方法。 - 【請求項４】 稲が日本型稲であることを特徴とする請
求項２記載の方法。 - 【請求項５】 ブラシカがブロッコリであることを特徴
とする請求項３記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3243122A JPH05244995A (ja) | 1991-09-24 | 1991-09-24 | 新規プライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3243122A JPH05244995A (ja) | 1991-09-24 | 1991-09-24 | 新規プライマー |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244995A true JPH05244995A (ja) | 1993-09-24 |
Family
ID=17099130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3243122A Withdrawn JPH05244995A (ja) | 1991-09-24 | 1991-09-24 | 新規プライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05244995A (ja) |
-
1991
- 1991-09-24 JP JP3243122A patent/JPH05244995A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19981203 |