JPH05246889A - 制癌方法および制癌剤 - Google Patents

制癌方法および制癌剤

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JPH05246889A
JPH05246889A JP4048840A JP4884092A JPH05246889A JP H05246889 A JPH05246889 A JP H05246889A JP 4048840 A JP4048840 A JP 4048840A JP 4884092 A JP4884092 A JP 4884092A JP H05246889 A JPH05246889 A JP H05246889A
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mice
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滉二 江川
Kazuhide Sato
一英 佐藤
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SEITAI CHIYOUSETSU KENKYUSHO KK
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 癌細胞の表面に産生される癌抗原に特異的な
免疫反応を利用した制癌方法および制癌剤を提供する。 【構成】 ヒトの非古典的な組織適合クラス１抗原、ま
たはそれを認識する抗体もしくは障害性リンパ球を免疫
療法として癌患者に投与することにより、癌に対する抵
抗性を惹起させる制癌方法および制癌剤である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、癌細胞の表面に産生さ
れる癌抗原に特異的な免疫反応を利用した制癌方法およ
び制癌剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】特開平２−４８５３２号公報には、担癌
動物の腹水から制癌作用を有する生物活性物質を製造す
る技術が開示されている。
【０００３】上記の技術は、哺乳動物の腹腔内に癌細胞
を移植した後、この腹腔内に抗癌剤を投与し、さらに正
常な同種の哺乳動物から採取した脾細胞を投与して所定
期間経過後、その腹腔内に貯留した腹水から制癌作用を
有する生物活性物質を得る方法、ならびに免疫監視療法
によって改善の見られた癌患者の腹腔内から採取した腹
水の上清から制癌作用を有する生物活性物質を得る方法
に関する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、担癌動
物が癌細胞を排除する免疫学的な機構については、未だ
十分に解明されていない。
【０００５】本発明の目的は、癌抗原に特異的な免疫反
応を利用した制癌方法を提供することにある。
【０００６】本発明の他の目的は、癌抗原に特異的な免
疫反応を利用した制癌剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、非古典
的な組織適合クラス１抗原、またはそれを認識する抗体
もしくは障害性リンパ球を投与する制癌方法および制癌
剤が提供される。
【０００８】以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明
する。
【０００９】
【実施例１】 〔材料および方法〕 (1).動物 Ｑａ、ＴＬおよびＬｙ表現型がすでに明らかにされてい
る１３系統のマウスを用いた〔Klein J, Figueroa F, D
avid CS(1983) H-2 Haplotypes, gene and antigens: S
econd listing. Immunogenetics 17:553〕, 〔McKenzie
IFC, Potter T(1979) Murine lymphocyte surface ant
igens. Adv Immunol 27:179 〕。使用したマウスの系統
およびそれらの表現型を表１に示す。
【００１０】Ｂ６マウス、Ｂ6.Ｋ１マウスおよびＢ6.Ｋ
２マウスは、Ｑａ−１、Ｑａ−２およびＱａ−３抗原に
関してコンジェニックである〔Stanton TH, Boyse EA(1
976)A new serologically defined locus, Qa-1, in th
e Tla-region of the mouse. Immunogenetics 3:52
5〕。Ｃ３Ｈ／ＨｅマウスおよびＣ３Ｈ−Ｌｙ6.２マウ
スは、Ｌｙ６抗原のアロタイプに関してコンジェニック
である。Ｂ6.Ｋ１マウス、Ｂ6.Ｋ２マウスおよびＣ３Ｈ
−Ｌｙ6.２マウスは、愛知ガンセンター研究所の高橋利
忠博士から供給を受け、本発明者が保存した。
【００１１】
【表１】
【００１２】(2).癌細胞 Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス由来の腹水型癌細胞ＭＭ２、ＭＭ４
６、ＭＭ４８、ＭＭ１０２Ｄ、ＦＭ３Ａ、ＭＨ１３４、
ＭＨ１２５Ｆ、ＭＨ１２５ＰおよびＸ５５６３、ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス由来の腹水型癌細胞Ｍｅｔｈ Ａ、Ｂ６マ
ウス由来の腹水型癌細胞ＥＬ−４ならびにＡＫＲマウス
由来の培養癌細胞ＢＷ５１４７を用いた。
【００１３】(3).モノクローナル抗体および補体 抗Ｑａ−２モノクローナル抗体１４１−１5.８をオース
トラリアン モノクローナル ディベロップメント、エ
ヌエスダブリュー(Australian Monoclonal Developmen
t, NSW)から購入した。マウス・イムノグロブリン・サ
ブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ
３、ＩｇＭおよびＩｇＡ）に特異的なヒツジ（羊）抗血
清をバインディング サイト リミティッド（英国）(B
inding Site Ltd, Birmingham, UK.) から購入した。
【００１４】マウスＩｇＤ特異的なヒツジ抗血清をＩＣ
Ｎ イムノバイオロジカルズ ＩＬ(ICN ImmunoBiologi
cals, IL) から購入した。マウスＩｇＧ２ｂ特異的なラ
ット・モノクローナル抗体、マウスＩｇＤ特異的なラッ
ト・モノクローナル抗体およびそのペルオキシダーゼ誘
導体を明治乳業ヘルスサイエンス研究所から購入した。
【００１５】バクテリア成分(NusA プロテイン）に特異
的なＩｇＧ２ｂクラスのマウス・モノクローナル抗体を
上記研究所の中村義一博士より供給してもらい、癌細胞
表面抗原とは無関係なモノクローナル抗体として使用し
た。
【００１６】マウス・イムノグロブリンおよびそのＦＩ
ＴＣ誘導体に特異的なヤギ（山羊）抗体のＦ（ａｂ')2
をタゴ社(Tago Inc., Burlengane.)より入手した。この
ヤギ抗体のＦａｂ' フラグメントは、Ｆ（ａｂ')2 を２
−メルカプトエチルアミンで還元し、セファクリル(Sep
hacryl) Ｓ−２００カラムクロマトグラフィで分画する
ことにより調製した。
【００１７】補体源として使用する前吸収したウサギ血
清をシダー レイン研究所（ニューヨーク)(Ceder Lane
Laboratories, Westbury, N.Y.)より購入した。
【００１８】(4).癌退行動物の血清(regressor serum,
ＲＳ） ＭＭ２癌細胞を移植したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスは、腹腔内
接種の１２〜１４日後に癌細胞を腹水と共に除去する
と、かなりの頻度で癌退行を示すことが報告されている
〔Kimura Y, Tanino-Komaiji T(1966) Survival of hos
ts mice and induced resistance to transplantable a
scites tumors. Japan J EXP Med 36:371〕。
【００１９】癌細胞を除去してから２週間後、完全な癌
退行を示したマウスを選び、エーテル麻酔下で心臓穿刺
により採血した。血液から血清（ＲＳ）を分離し、使用
時まで−６０℃で貯蔵した。
【００２０】(5).ＲＳの吸収 ＲＳを0.３５飽和度の硫酸アンモニウムで沈殿させ、こ
れを後述するデンプンゲル・ゾーン電気泳動法で処理す
ることによってγ−グロブリンを除去したものを吸収試
験に使用した。得られた物質は、まだいくらかのγ−グ
ロブリンを含んでいるが、これをγ−グロブリン除去Ｒ
Ｓとして使用した。
【００２１】γ−グロブリン除去ＲＳを７％のウシ
（牛）胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０
培養液で元の血清の１００倍相当に希釈した。この溶液
１mlに２×１０7 のリンパ球（脾細胞、または脾細胞と
腸間膜リンパ細胞との混合物）を加えた。このリンパ球
は、あらかじめ塩化アンモニウム法〔Boyle W (1968) A
nextension of cytotoxins. Transplantion 6:761〕で
赤血球を取り除いた後、イーグルＭＥＭ(Eagle's minim
um essential medium)で３回洗浄（または、この方法で
洗浄した４〜６×１０6 の腹水癌細胞で３回洗浄）して
おいた。
【００２２】上記の混合物を２５℃で３０分間孵置し、
さらに０℃で１時間孵置した。細胞を遠心分離（１００
０ｒｐｍ、５分間）で除去した。リンパ球で吸収する場
合は、上記の工程を２回繰り返した。得られた上清を吸
収ＲＳとして使用した。
【００２３】(6).細胞障害の検討 ＭＭ２細胞移植後３日目に得たＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの脾
細胞をＲＳ依存性試験管内細胞障害反応のエフェクター
細胞として用いた〔Tanino T, Egawa K (1986)Regresso
r serum factor-dependent nonspecific killers in tu
mor-bearing mice 〕。７％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を加えた0.５mlのＲＰＭＩ−１６４０培養液中でエフェ
クター細胞（１×１０6)と51Ｃｒで標識した標的細胞
（１×１０4)とを混合した。
【００２４】吸収試験では、吸収前または吸収後にγ−
グロブリン除去ＲＳを元のＲＳの５００倍に希釈した最
終濃度で加えた。ＭＭ２細胞、種々のリンパ芽球および
Ｌ細胞形質転換体を標的細胞として用いた。混合物を３
７℃のＣＯ2 恒温器内で、癌細胞の場合は１８時間、リ
ンパ芽球の場合は５〜７時間、Ｌ細胞形質転換体の場合
は１０時間孵置した。
【００２５】孵置後、上清内の細胞から放出される放射
能および細胞内に残った放射能を測定し、細胞障害を溶
解率（％）で表した。全ての測定は２回繰り返して行っ
た。
【００２６】吸収試験では、繰り返し行った実験や異な
る実験の結果をＲＳ活性の減少（％）で表すことによっ
て標準化した。
【００２７】リンパ芽球は、種々のマウス由来の脾細胞
（細胞濃度＝１×１０6 個／ml) を１０％のＦＣＳを加
えたＲＰＭＩ−１６４０培養液中で２日間、次いで５μ
g/mlのコンカナバリンＡ（シグマ社）(Concanavallin
A, Sigma, St. Louis) を含む培養液中で３日間培養す
ることによって調製した。
【００２８】ＬQ7b/Kb細胞およびＬKb細胞は、それぞれ
Ｑ７b ／Ｋb ハイブリット遺伝子ＤＮＡおよびＨ−２Ｋ
b 遺伝子ＤＮＡのＬtk- 細胞への移入によって作製し
た。ＬQ7b/Kb細胞は、Ｑ７b 遺伝子産物のα１およびα
２ドメイン（Ｈ−２b マウスのリンパ球の免疫学的に定
義されたＱａ−２特異性は、主としてこの領域によって
規定される〔Waneck,G.L., D.H.Sherman, S.Clavin, H.
Allen, and R.A.Flavell. 1987. Tissue-specific expr
ession of cell-surface Qa-2 antigen from a transfe
cted Qb7 gene of C57BL/10 mice. J.Exp.Med. 165:135
8 〕）とＨ−２Ｋb 分子のα３ドメインとを表現する。
ＬKb細胞は、その表面にＨ−２b 分子を表現する。
【００２９】補体依存の細胞障害活性は、腸間膜リンパ
細胞を標的細胞に用いた色素除外法(dye exclusion met
hod)によって検討した。細胞（５×１０10）を５％ＦＣ
Ｓと抗体とを含む１００μl のＭＥＭに懸濁させ、この
懸濁液を室温で９０分間孵置した。細胞をＭＥＭで２回
洗浄した後、補体を含む１００μl のＭＥＭ中、３７℃
で４５分間孵置し、細胞をＭＥＭで２回洗浄し、0.２％
のトリパンブルーを含む生理食塩水を加え、顕微鏡で検
査した。溶解（％）を算出し、抗体を含まない値をバッ
クグラウンドとして差し引いた。
【００３０】(7).血清蛋白分画 0.３５〜0.５０飽和の硫酸アンモニウム（４℃）で沈殿
させた血清蛋白を、0.０７M のベロナル(veronal) 緩衝
液（ｐＨ8.６）で緩衝した１０×４０×1.５cmのデンプ
ンブロックを使ったデンプンゲル・ゾーン電気泳動法に
より分画した。
【００３１】上記ゲル電気泳動法に使用した加水分解デ
ンプンは、コンノート研究所(Connaught Laboratories,
Willowdale.) より購入した。
【００３２】４℃、３５mAで２４時間電気泳動した後、
ゲルを１cm幅のブロックに切断し、各ブロックを１０ml
の水で溶出した。得られたβ−グロブリン画分を0.０１
M のトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.６）に透析し、ＦＰ
ＬＣ装置(Pharmacia) でモノ−Ｑカラム(Mono-Q colum
n) を用いて分画した。食塩濃度０から0.５M まで直線
的濃度勾配によって溶出した〔Tomono T, Ikeda H, Tok
unaga E (1983) High-performance ion-exchange chrom
atography of plasma proteins. J Chromatography 26
6:39 〕。再クロマトグラフィーに付した後、対称的な
溶出プロファイルを持った活性な画分を得た。
【００３３】臭化シアンで活性化したセファロース４Ｂ
(Pharmacia, Uppsala)と各抗体とを用いて、マウスのＩ
ｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび
ＩｇＤにそれぞれ特異的なヒツジ抗血清と結合したセフ
ァロース４Ｂを調製した。ＦＰＬＣで精製した標品を４
℃で0.４mlのカラムに付した。カラムを生理食塩水で洗
浄した後、５mMのＨＣｌを含む生理食塩水で溶出した。
溶出液（0.２ml）を１０％のＦＣＳを加えたＲＰＭＩ−
１６４０培養液0.４ml中に直接滴下し、活性の検討に用
いた。
【００３４】(8).蛋白の放射性ヨウ素化およびポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動 ＦＰＬＣで精製した標品（１０μg)を、担体フリーの
125Ｉ−ヨウ化ナトリウム(NEN) １mCi を用いたクロラ
ミンＴ法〔Greenwood HC, Hunter WM, Glover JS(1963)
The preparation of 131I-labelled human growth hor
mone of high specific radioactivity. Biochem J 89:
114〕によって標識した。セファデックスＧ−５０のカ
ラムを通過させることによって、標識した材料をフリー
のヨウ化物から分離した。
【００３５】第一次元では非平衡ｐＨ勾配電気泳動を使
用し、第二次元では標品を還元した後にＳＤＳ−ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動を使用する二次元ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動〔O'Farrell PZ, Goodman H
M, O'Farrell PH (1977) Highresolution two-dimentio
nal electrophoresis of basic as well as acidic pro
teins. Cell 12:1233 〕を実施した。
【００３６】(9).膜蛍光抗体法によるＱａ−２抗原の検
出 ナイロンウール吸着〔Jurius MH, Simpson E, Herzenbe
rg LA (1973) A rapidmethod for isolation of functi
onal thymus-derived murine lymphocytes. Eur J Immu
nol 3:645〕により、マウスの脾細胞からＴ細胞に富ん
だ画分、マウス腹水癌細胞およびＢＷ５１４７細胞を用
いた。細胞をＭＥＭで２回洗浄した。混入したＢ細胞の
細胞表面イムノグロブリンを、抗マウス・イムノグロブ
リン・ヤギ抗体から調製したＦａb'フラクションで６０
分間、室温で処理することによってブロックした。
【００３７】次に、細胞をＱａ−２特異的なモノクロー
ナル抗体１４１−１5.８（２００倍希釈）と反応させ
た。対照として、正常Ｂ6.Ｋ１マウス血清または抗バク
テリア成分モノクローナル抗体を用いた。細胞をモノク
ローナル抗体と共に９０分間孵置した後、ＦＩＴＣで標
識したマウス・イムノグロブリン特異的なヤギ抗体のＦ
（ａb')2フラクションと共に室温で６０分間孵置した。
【００３８】すべての試薬は、１０％のヤギ抗体と１％
のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とを含むＭＥＭで希釈
した。孵置は５０μl 容積で行い、各孵置の後、リン酸
塩で緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。Ｆ
ＩＴＣで標識した細胞を１％パラホルムアルデヒドで固
定した後、ＦＡＣＳIII 装置(Becton Dickinson, Mount
ain View, CA) を用いて分析した。
【００３９】（10).酵素結合免疫吸着剤(enzyme-linked
immunosorbent assay)(ＥＬＩＺＡ）による血清ＩｇＤ
の検出 Ｑａ−２特異的なＩｇＤを検出するため、実施例３に述
べるＱａ−２−ｌａｃＺ融合蛋白を使用した。融合蛋白
の生産をＩＰＴＧによって誘導した後、大腸菌を５０％
酢酸に溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を１％含むＰＢＳに対して透析した
後、酵素抗体法（ＥＬＩＺＡ）による検出に用いた。
【００４０】９６穴プレート(Immunoplate, Nunc) を上
記大腸菌抽出物または抗マウスＩｇＤヒツジ血清（いず
れも５０mMの炭酸塩緩衝液（ｐＨ9.０）で希釈）で被覆
した後、３％ＢＳＡで処理した。このプレートにＰＢＳ
で連続的に希釈した５０μlのサンプル血清を加え、室
温で２時間放置した後、溶液を捨て、容器をＰＢＳで３
回洗浄した。
【００４１】ペルオキシダーゼで標識したマウスＩｇＤ
特異的なラット・モノクローナル抗体を１％ＢＳＡで希
釈した溶液を加え、室温で１時間放置した後、溶液を捨
て、容器をＰＢＳで４回洗浄した。次に、２，2'−アジ
ノ−ジ−（３−エチル−ベンツチアゾリン スルフォネ
ート）溶液と過酸化水素溶液(Kirkegaard and PerryLab
oratories, MD) との混合物１００μl を容器に加え、
室温で５分間放置した後、１％ＳＤＳ溶液１００μl を
加えることにより反応を完了させ、４１０nmでの吸光度
を測定した。
【００４２】〔結果〕 (1).ＲＳ因子の認識特異性 腹水癌細胞移植後３日目のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスから得ら
れた脾細胞は、ＲＳ依存性細胞障害反応によって種々の
同系癌細胞（ＭＭ２、ＭＭ４６など）や同種異系癌細胞
（Ｍｅｔｈ Ａ、ＥＬ−４など）を障害することが報告
されている。いくつかの同系癌細胞（ＭＭ４８、Ｘ５５
６３など）は、上記の反応ではあまり強く障害されなか
った〔Tanino T, Egawa K (1986) Regressor serum fac
tor-dependent nonspecific killers in tumor-bearing
mice 〕。
【００４３】ＲＳのこのような活性は、反応に感受性の
ある癌細胞によって種々の程度に吸収されたが、反応に
耐性のある癌細胞によっては吸収されなかった。同種異
系癌細胞の感受性は、ＲＳ中の活性成分（ＲＳ因子）が
癌細胞の表面に表現された同種異系抗原を認識する可能
性を示唆している。この仮定を調べるため、種々の系統
のマウスから得られたリンパ球でＲＳを吸収した。結果
を表２に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】ＭＭ２標的細胞を使って調べたＲＳの活性
は、ｋ型（ＣＥ、ＡＫＲおよびＣ５８マウス）のＨ−２
ハプロタイプを持ったリンパ球またはｋ型以外（Ｂ６、
ＢＡＬＢ／ｃ、ＤＢＡ／２、ＤＢＡ／１およびＡ／Ｊマ
ウス）のＨ−２ハプロタイプを持ったリンパ球によって
種々の程度に吸収されたが、Ｃ３Ｈ／ＨｅおよびＣＢＡ
マウス（両者共Ｈ−２K ) 由来のリンパ球によっては吸
収されなかった。
【００４６】細胞障害反応の標的細胞にＭｅｔｈ Ａを
使用したときは、ＭＭ２を使用したときと類似してはい
るが同一ではない吸収パターンが観察された。吸収試験
の結果は、吸収に用いたリンパ球のＬｙ抗原群の１また
は複数の抗原の表現型がＣ３Ｈ／Ｈｅマウスのそれと異
なる場合、またはＱａ／ＴＬ抗原群の１または複数が脾
細胞に表現された場合に活性の吸収が生じることを示唆
している。上記の仮定を支持する結果は、二重吸収実験
によって得られた。結果を表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】ＲＳ活性の一部は、Ｃ５８由来のリンパ球
によって吸収された。Ｑａ／ＴＬ系またはＬｙ系の抗原
がＲＳ因子の標的に結合していると仮定すると、この吸
収後の活性の低下は、ＲＳがＬｙ1.２、Ｌｙ3.１、Ｌｙ
6.２、Ｌｙ7.１、Ｑａ−１またはＴＬ抗原の１または複
数と結合した因子を含んでいるということを示唆してい
る。
【００４９】Ｌｙ2.２、Ｌｙ4.２、Ｌｙ5.２、Ｑａ−２
またはＱａ−３抗原のいずれかと結合した因子がもし血
清に含まれているとすれば、吸収されずに残ったと考え
られる。残った活性は、Ｂ６、Ｂ6.Ｋ２またはＤＢＡ／
１リンパ球によってほぼ完全に吸収された。Ｂ6.Ｋ１リ
ンパ球やＢＡＬＢ／ｃリンパ球は、活性を有意に吸収し
なかった。これらの結果は、Ｑａ−２抗原が活性の一部
を吸収することを示している。
【００５０】同様に、Ｂ６リンパ球であらかじめ吸収し
たＲＳをＡ／Ｊリンパ球で吸収することによって、Ｑａ
−１およびＴＬ抗原の寄与を分析した。結果は、あらか
じめ吸収したＲＳの活性が低かったために幾分あいまい
ではあるが、Ｑａ−１およびＴＬ抗原の１または複数が
活性の一部を吸収することを示唆した。
【００５１】Ａ／Ｊ脾細胞であらかじめ吸収した後、Ｍ
Ｍ２標的細胞を使って調べたＲＳの活性は、ＤＢＡ／２
リンパ球またはＢ６リンパ球によってほぼ完全に吸収さ
れたが、ＤＢＡ／２リンパ球またはＢＡＬＢ／ｃリンパ
球によっては吸収されなかった。これは、Ｌｙ6.２抗原
がＲＳ活性の一部を吸収することを示している。標的細
胞にＭｅｔｈ Ａを用いたときは、Ａ／Ｊ脾細胞は、Ｒ
Ｓ活性を完全に吸収した。
【００５２】これらの結果を総合すると、ＲＳがＱａ−
２抗原、Ｌｙ6.２抗原、Ｑａ−１およびＴＬ抗原群の１
または複数と結合する複数の因子を含んでいることを示
唆している。これらの抗原は、すべてＣ３Ｈ／Ｈｅにと
って同種異系のリンパ球抗原であり、その中のＱａ−１
抗原、Ｑａ−２抗原およびＴＬ抗原は、非古典的組織適
合クラス１抗原群に属している。
【００５３】また、これらの結果は、ＭＭ２細胞がＱａ
−２抗原、Ｌｙ6.２抗原、Ｑａ−１およびＴＬ抗原群の
１または複数を表現することを示している。Ｑａ−１、
Ｑａ−２およびＴＬ抗原のいくつかは、Ｍｅｔｈ Ａ細
胞に表現されているものと考えられる。
【００５４】上記の観察に一致して、これらの抗原の１
または複数を表現する種々の異種同系リンパ芽球（Ｃ
Ｅ、Ｃ５８、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂ6.Ｋ１、Ｂ6.Ｋ２、Ｄ
ＢＡ／１、ＤＢＡ／２、Ａ／ＪおよびＣ３Ｈ−Ｌｙ6.２
抗原）がＲＳ依存性細胞介在反応によって障害された
が、Ｃ３Ｈ／ＨｅおよびＡＫＲリンパ芽球は、障害され
なかった（表４）。Ｃ３Ｈ−Ｌｙ6.２リンパ芽球の障害
は、Ｌｙ6.２抗原の寄与を直接的に示している。
【００５５】Ｑａ−２特異的な因子の存在は、Ｑａ−
２、３コンジェニックマウスのリンパ芽球およびＬ細胞
形質転換体のＲＳ依存性障害を利用することによって確
認された（表５）。
【００５６】Ｂ６およびＢ6.Ｋ２リンパ芽球の障害を支
持するＲＳの活性は、Ｂ6.Ｋ１リンパ球によっては部分
的にしか吸収されなかったが、Ｂ６またはＢ6.Ｋ２リン
パ球によって完全に吸収された（表５−Ａ）。ＬQ7b/Kb
およびＬKb細胞を使った同様の実験は、ＲＳが血清学的
なＱａ−２特異性を担うＱ７b 遺伝子産物のα１／α２
領域に対する認識特異性を持った活性成分を含んでいる
ことを示している（表５−Ｂ）。
【００５７】
【表４】
【００５８】
【表５】
【００５９】(2).膜蛍光抗体法によるＱａ−２抗原の証
明 Ｈ−２K （Ｑａ−２- ) マウスから誘導されたＭＭ２お
よび他のいくつかの癌細胞系の表面におけるＱａ−２抗
原の存在は、Ｑａ−２特異的なモノクローナル抗体１４
１−１5.８を使った膜免疫蛍光分析法によって、より直
接的に証明された。
【００６０】図１に示すように、試験した９例の癌細胞
系〔ＭＨ１３４（Ａ）、ＭＨ１２５Ｆ（Ｂ）、ＭＨ１２
５Ｐ（Ｃ）、ＭＭ２（Ｄ）、ＦＭ３Ａ（Ｅ）、ＭＭ１０
２Ｄ（Ｆ）、ＭＭ４６（Ｇ）、ＭＭ４８（Ｈ）およびＢ
Ｗ５１４７（Ｉ）〕の７例で有意なＱａ−２特異的蛍光
が検出された。この結果は、癌細胞表面におけるＱａ−
２アロ抗原の表現は、ＭＭ２特異的なものではなく、む
しろ種々のリンパ球由来および非リンパ球細胞由来の癌
細胞に共通した現象であることを示している。
【００６１】また、このことは、ＲＳ依存反応の広い標
的細胞選択性の一部を説明していると考えられる。
【００６２】(3).Ｑａ−２特異的ＲＳ因子の特性 上述したように、同種異系抗原を認識するＲＳ中の多く
の仮定的因子のうち、Ｑａ−２に対するある因子の特異
性が最も明確に証明された。そこで、本発明者は、この
因子に着目し、その特性を明らかにしようと試みた。
【００６３】すなわち、硫酸アンモニウムによる沈殿お
よび血清蛋白の電気泳動により、細胞介在反応によって
Ｂ６リンパ球を障害し、Ｂ6.Ｋ１リンパ球を障害しない
活性が主としてβ−グロブリン画分中に見出された。そ
こで、モノ−Ｑカラムを使ったＦＰＬＣによってこの画
分をさらに分画した。
【００６４】ＩｇＧサブクラスのマウス・モノクローナ
ル抗体のほとんどすべてとＩｇＭクラスのマウス・モノ
クローナル抗体とは、それぞれ食塩濃度ほぼ0.２５M お
よび0.３５M で溶出したが、活性は、食塩濃度0.３０M
で溶出した物質と関連していた。
【００６５】また、この半精製標品をＱａ−２+ リンパ
球に対する補体依存細胞障害活性試験に付した（図
２）。ＦＰＬＣで精製した標品によるＢ６腸間膜リンパ
細胞の補体依存障害は、３５μｇの蛋白を使用したとき
でも検出されなかった。これに対し、ＩｇＧ２ｂクラス
の抗Ｑａ−２モノクローナル抗体は、補体の存在下にお
いて、抗体濃度が１μｇ蛋白以下でも同じ標的細胞を障
害した。
【００６６】Ｑａ−２特異的なＲＳ成分の特性をより詳
細に調べるため、ＦＰＬＣで精製した標品を放射性ヨウ
素(125Ｉ）で標識し、Ｃ５８リンパ球であらかじめ吸収
した後、Ｑａ−２+ 細胞の表面に吸着させ、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド・ゲル電気泳動または二次元ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動の後にオートラジオグラフィ
に付すことによって分析した。
【００６７】すなわち、放射性ヨウ素(125Ｉ）で標識し
たＦＰＬＣ精製標品の約１００ngを７％のＦＣＳを含む
ＭＥＭ0.２mlに溶解し、この溶液をＣ５８腸間膜リンパ
球（２×１０7)と混合した後、室温で６０分間、続いて
氷上に３０分間放置した。次に、細胞をＭＥＭで二回洗
浄し、４％のＳＤＳ、１０％のグリセロール（またはさ
らに１０％の２−ＭＥ）を含む５０Mmトリス緩衝液（ｐ
Ｈ6.８）５０μｌに溶解した。混合物を１００℃で５分
間加熱した後、５０００rpm で２分間遠心分離し、上清
をゲル電気泳動に付した（図３）。
【００６８】図中、Ａは、非還元条件（ａ）下および還
元条件（ｂ）下での一次元ポリアクリルアミド・ゲル電
気泳動（７％ポリアクリルアミド・ゲルを使用）であ
り、Ｂは、二次元ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動の
パターンである。
【００６９】その結果、全放射能の約２％が細胞に結合
した。結合した物質の非還元条件下での分子量は、１６
０ｋＤａと推定された。還元条件下では、約５０ｋＤａ
および２５ｋＤａの分子量のバンドを示した。これらの
結果は、標品がＩｇＧと同様の重鎖と軽鎖の構造を有し
ていることを明らかにした。標識した標品の二次元ゲル
電気泳動は、この物質が、等電点（ＰＩ）が約5.５から
6.５の範囲にある４つまたはそれ以上の成分からなり、
これら成分のすべてが重鎖と軽鎖の構造を有しているこ
とを示した。
【００７０】ＩｇＤは、各種の血清蛋白分画操作によっ
てβ−グロブリン画分中に見出され、ＩｇＧが一般に塩
基性蛋白であるのに対して酸性糖蛋白〔Ishihara E, Te
jimaY, Takahasi R, Takayasu T, Shinoda T (1983) St
ructure and location of asparagine-linked olygosac
charides in the Fc region of a human immunoglobuli
n D. Biochem Biophys Res Comm 110:181〕であり、Ｉ
ｇＧのような重鎖と軽鎖の構造を有しているが、補体系
のＣ１ｑとは結合しないことが知られている〔Spiegelb
erg HL (1985) Immunoglobulin D(IgD) ．Methods in E
nzymology 116:95〕, 〔Spiegelberg HL (1977) The st
ructure and biology of human IgD. Immunological Re
v 37:3〕。
【００７１】また、マウス血清ＩｇＤには、２つの形態
のあることが知られている。その一つは、約１７０〜２
００ｋＤａの分子量を有し、もう一つは、重鎖のＣ１ド
メインを欠き、約１５０〜１６０ｋＤａの分子量を有し
ている〔Finkelman FD, Kessler SW, Mushinski JF, Po
tter M (1981) IgD-secreting murine plasmacytomas:
Identification and partial characterization of two
IgD myeloma proteins. J Immunol. 126:680 〕, 〔Mo
untz JD, Mushinski JF, Owens JD, FinkelmanFD (199
0) The in vivo generation of murine IgD-secreting
cells is accompanied by deletion of C μ gene and
occasional deletion of the gene forthe Cδ1 domai
n. J Immunol 145:1583〕。ヒト・モノクローナルＩｇ
Ｄ(NIG-65 myeloma protein)も、糖成分の変化によって
は、5.６と6.８との間のＰＩ不均一性を持つことが知ら
れている。
【００７２】これらの特性は、Ｑａ−２特異性を持った
血清成分の特性と一致しており、この血清成分がＩｇＤ
であることを示唆している。
【００７３】この仮定を確かめるため、ＦＰＬＣで精製
した標品をＬKb細胞で吸収した後、種々のマウス・イム
ノグロブリン・サブクラスに特異的な抗体のそれぞれと
結合したセファロース４Ｂでさらに吸収した（図４）。
【００７４】図４Ａ中、（▲）はＬKb細胞で吸収する
前、（■）は吸収後における標品のＬQ7b/Kb細胞に対す
る細胞介在溶解活性を示し、（●）はセファロース４Ｂ
でさらに吸収した後における標品のＬQ7b/Kb細胞に対す
る細胞介在溶解活性を示している。すなわち、ＬQ7b/Kb
細胞を標的細胞に用いて検出した活性は、抗ＩｇＤと結
合したセファロース４Ｂでかなりの程度吸収された。
【００７５】一方、抗ＩｇＤカラムに保持され、その後
溶出した物質は、ＬQ7b/Kb細胞の障害を支持する有意の
活性を有した（図４Ｂ）。なお、図４Ｂ中の矢印は、溶
出の開始位置を示している。
【００７６】活性は、抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２ｂ、抗Ｉ
ｇＧ３、抗ＩｇＡおよび抗ＩｇＭのいずれかと結合した
セファロース４Ｂでは有意に吸収されなかった。わずか
な活性が抗ＩｇＧ２ａと結合したセファロース４Ｂカラ
ムで吸収され、その後元に回復した。これらの結果は、
再現可能であり、ＲＳ中のＱａ−２特異性を持つ活性成
分がＩｇＤであることを示している。
【００７７】ＲＳ中にＱａ−２抗原特異性を持つＩｇＤ
が存在することは、Ｑａ−２−ｌａｃＺ融合蛋白を用い
たＥＬＩＺＡによってさらに証明された。図５に示すよ
うに、Ｑａ−２特異的なＩｇＤは、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス
正常成体の血清からは検出されなかったが、ＲＳ中から
検出された。Ｑａ−２特異的なＩｇＤの出現と一致し
て、対照正常マウス血清と比較した血清ＩｇＤ全量の増
加が検出された。
【００７８】融合蛋白を被覆したプレートと、ペルオキ
シダーゼで標識したマウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ
にそれぞれ特異的なラット・モノクローナル抗体とを用
いたＥＬＩＺＡにより、ＲＳ中に少量のＱａ−２特異的
なＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂが検出された。ＦＰＬＣ
精製標品中には、Ｑａ−２特異的なＩｇＤが検出された
が、Ｑａ−２特異的なＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂは、
検出されなかった。
【００７９】これらの結果から、本発明者は、ＲＳ中の
Ｑａ−２特異的な活性を持った血清成分は、ＩｇＤであ
るという結論に達した。
【００８０】
【実施例２】 〔材料および方法〕 (1).動物 Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、ＡＫＲマウス、Ｂ６マウスおよび
Ｂ6.Ｋ１マウスを使用した。前二者は、Ｈ−２K 表現型
およびＱａ−２- , ３- 表現型を有している。
【００８１】Ｂ６は、Ｈ−２b ，Ｑａ−１- , ２+ , ３
+ 、Ｂ6.Ｋ１は、Ｈ−２b ，Ｑａ−１+ , ２- , ３- の
表現型を有している。
【００８２】(2).癌細胞 ＢＷ５１４７は、ＡＫＲマウスのＴ細胞リンパ腫から誘
導された試験管内(invitro)細胞系である。ＭＭ２およ
びＦＭ３Ａは、ウィルスによって引き起こされたＣ３Ｈ
／Ｈｅマウスの乳癌の腹水細胞系である。ＭＨ１３４
は、化学的に引き起こされたＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの肝癌
の腹水細胞系である。
【００８３】これらの細胞系は、Ｑａ−２特異的モノク
ローナル抗体１４１−１5.８と反応することが明らかに
されている〔Tanino,T., N.Seo, T.Okazaki, C.Nakanis
hi-Ito, M.Sekimata, and K.Egawa. Humoral responses
to Qa-2 and other tumor antigens in mice. Submitt
ed for publication in Cancer Immunology Immunother
apy.〕。
【００８４】ＬQ7b/Kb細胞およびＬKb細胞は、Ｑ７b ／
Ｋb ハイブリット遺伝子ＤＮＡおよびＨ−２Ｋb ゲノム
ＤＮＡの移入によりそれぞれ確立された。ＬQ7b/Kb細胞
は、Ｑ７b 遺伝子産物のα１およびα２ドメイン、Ｈ−
２Ｋb のα３、膜貫通および細胞質ドメインを表現し、
ＬKb細胞は、Ｈ−２Ｋb 抗原を表現する。これらの細胞
は、非移入Ｌ細胞と同じく、Ｈ−２K 抗原を表現する。
【００８５】(3).モノクローナル抗体 Ｑａ−２特異的モノクローナル抗体１４１−１5.８は、
アメリカン タイプカルチャー コレクション(America
n Type Culture Collection)から入手した。
【００８６】Ｑａ−２特異的モノクローナル抗体３４−
1.２は、オーストラリアン モノクローナル ディベロ
ップメント(Australian Monoclonal Development) から
入手した。
【００８７】Ｑａ−２特異的モノクローナル抗体５９を
産生するハイブリドーマ・クローンは、Ｂ６マウスのリ
ンパ球で免疫にしたＢ6.Ｋ１マウス由来のリンパ球とＮ
Ｓ−１細胞とを融合させることにより、新たに取得し
た。
【００８８】Ｔｈｙ1.１抗原特異的なモノクローナル抗
体は、明治乳業ヘルスサイエンス研究所より購入した。
Ｔｈｙ1.２抗原特異的なモノクローナル抗体は、シダー
レイン研究所(Ceder Lane Laboratories) より購入し
た。
【００８９】バクテリア成分(NusA プロテイン）に特異
的なＩｇＧ２ｂクラスのマウス・モノクローナル抗体
は、明治乳業ヘルスサイエンス研究所の中村義一博士よ
り供給を受け、癌細胞表面抗原とは無関係なモノクロー
ナル抗体として使用した。
【００９０】マウス・イムノグロブリンおよびその誘導
体に特異的なヤギ（山羊）抗体のＦ（ａｂ')2 は、タゴ
社(Tago Inc.,)より入手した。この抗体のＦａｂ' フラ
グメントは、Ｆ（ａｂ')2 を２−メルカプトエチルアミ
ンで還元した後、セファクリル(Sephacryl) Ｓ−２００
カラムクロマトグラフィで分画することにより調製し
た。
【００９１】(4).フォスファチジルイノシトール特異的
なフォスフォリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）を使った癌細
胞の処理 バチルス・トゥリギエンシス(Bacillus thurigiensis)
から誘導されたＰＩ−ＰＬＣ〔Ikezawa,H., and R.Tagu
chi. 1981. Phosphatidylinositol-specific phospholi
pase C from Bacillus cereus and Bacillus thurigien
sis. Methods in Enzymol. 71:731 〕は、サッポロビー
ル社より購入した。
【００９２】癌細胞（２×１０6)は、0.１mUのＰＩ−Ｐ
ＬＣと１mg/ml の卵白アルブミンとを含む３０μl のＤ
−ＭＥＭ（ｐＨ7.５）中で３７℃、６０分間培養した。
培養後、癌細胞をＤ−ＭＥＭで二度洗浄し、細胞表面抗
原の検出に使用した。
【００９３】(5).免疫蛍光分析(Immunofluorescence an
alysis) 細胞表面のＱａ−２抗原およびＴｈｙ１抗原の検出は、
膜蛍光抗体法により行った。すなわち、癌細胞をＱａ−
２特異的モノクローナル抗体と反応させ、次いでＦＩＴ
Ｃで標識したマウス・イムノグロブリン特異的なヤギ抗
体のＦ（ａｂ')2 と反応させた。
【００９４】リンパ球の場合は、ナイロンウールカラム
を用いてＴ細胞画分を得、混入したＢ細胞の細胞表面イ
ムノグロブリンは、抗体のＦａｂ' フラグメントで処理
することによってブロックした。ＦＩＴＣで標識した細
胞は、１％パラホルムアルデヒドで固定し、自動細胞分
析装置(FACS III, Becton Dickinson)を使って分析し
た。
【００９５】(6).ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）の調製 グアニジンイソシアネート法〔Schibler,U., M.Tosi,
A.-C.Pinett, L.Fabiani, and P.K.Wellauer. 1980. Ti
ssue-specific expression of mouse alpha-amirase ge
nes. J.Mol.Biol. 142:93〕を使って癌細胞および胸腺
リンパ球から全細胞ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）−
セルロース(Boehringer Mannheim GmbH.)〔Aviv,H., an
d P.Leder. 1972. Pulification of biologically acti
ve globinmessenger RNA by chromatography on oligot
hymidylic aci cellulose. Proc.Natl. Acad. Sci. US
A, 69:1408〕でポリ（Ａ) + ＲＮＡを単離することによ
り、ｍＲＮＡ画分を調製した。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ
の合成は、ｃＤＮＡ合成キット(cDNA plus, Amersham C
orp., Arlington Heights,) を使用し、オリゴ−ｄＴを
プライマーとして行った。
【００９６】(7).オリゴヌクレオチド・プライマーおよ
びプローブ Ｃ３Ｈ／ＨｅマウスのＱａ−２、３領域に存在する遺伝
子の既報の塩基配列〔Watts,S., A.C.Davis, B.Gant,
C.Wheeler, L.Hill, and R.S.Goodenow. 1989.Organiza
tion and structure of the Qa genes of the major hi
stocompatibility complex of the C3H mouse. Implica
tions for Qa function and class I evolution. EMBO.
J. 8:1749 〕に基づき、ＤＮＡシンセサイザー(Applied
Biosystems model 391)を使って１１種の２０マー（２
０mer)オリゴクレオチドを調製し、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用した。それらの塩
基配列および特異性を表６および図６に示す。
【００９７】オリゴヌクレオチドＮo.１、２、３、４、
５および６は、それぞれＨ−２ＤK、Ｑ１K 、Ｑ２K 、
Ｑ４K 、Ｑ５K およびＱ１０K 遺伝子の各第１エクソン
内に見出される特異的なアンチセンス配列と相補的であ
った。オリゴヌクレオチドＮo.１０および１１は、それ
ぞれエクソン８およびエクソン７内のＱ５K 特異的なセ
ンス配列と相補的であった。オリゴヌクレオチドＮo.
７、８および９は、すべてのクラス１遺伝子に共通な配
列と相補的であった。また、オリゴヌクレオチドＮo.１
〜６に対してそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドＮo.
１２〜１７を合成し、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼイ
ション実験のプローブとして使用した。
【００９８】
【表６】
【００９９】(8).ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ＤＮＡ５０ng、センスおよびアンチセンス配列に相補的
なプライマー各５０pmol、２０mMトリス−クロライド
（ｐＨ8.３）、ＭｇＣｌ2 1.５mM、ＫＣｌ２５mM、ツイ
ーン２０ 0.０５％、ゼラチン0.１mg／ml、ｄＮＴＰ各
５０μM およびＴaq ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin-Elme
r/Cetus, Norwalk, CT) ２単位を含む反応混合物１００
μl 中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。蒸
発を防ぐため、反応混合物は１００μl の鉱油で被覆し
た。熱循環器(Atto, Tokyo, Japan)を４０サイクル（１
サイクルは、９４℃で１分、５５℃で1.８分および７２
℃で２分）運転した。
【０１００】(9).ＰＣＲで増幅させたＤＮＡのクローン
化および配列 ＰＣＲで増幅させたＤＮＡを直接またはｐＵＣ１１９の
ＳｍａＩ部位内にクローン化した後、その塩基配列を決
定した。クローン化のため、大腸菌ＭＶ１１８４細胞を
プラスミドＤＮＡで形質転換し、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ
およびアンピシリンを含むプレート上で成育させた。白
色のコロニーを採取し、２ｘＹＴブイヨン内で成育させ
た後、細胞をＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させ
た。
【０１０１】ＰＣＲで増幅されたＤＮＡと同じく、得ら
れた単鎖ＤＮＡを、ＤＮＡ配列キット(Sequenase versi
on 2.0, United States Biochemical Corp., Cleavelan
d, OH)と、ＰＣＲプライマーまたはＭ１３ユニバーサル
プライマーとして用いられる合成オリゴヌクレオチドと
を使用したジデオキシ法〔Samger,F., S.Nicklen, and
A.R.Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-termi
nating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:
5463〕によって塩基配列を決定した。
【０１０２】(10). ゲノムＤＮＡの調製およびＤＮＡ−
ＤＮＡハイブリダイゼイション Ｂ６マウス、Ｃ３Ｈ／ＨｅマウスおよびＡＫＲマウス由
来の脾細胞とＢＷ５１４７細胞とを0.１mg／mlのプロテ
イナーゼＫを含む0.０３％ＳＤＳ溶液中、６０℃で１夜
培養した後、フェノールで抽出した。得られた水層を１
mMのＥＤＴＡを含む１０mMのトリス−クロライド（ｐＨ
7.５）で１夜透析し、ＤＮＡ溶液として使用した。
【０１０３】各ゲノムＤＮＡ１０μｇをＨｉｎｄIII ま
たはＢａｍＨＩで消化し、0.８％アガロースゲル中で電
気泳動させた後、ナイロンフィルター（Hybridon-N+ ,
Amersham) に移した。フィルターを３７℃で乾燥し、サ
ケ（鮭）の精子のＤＮＡ１mgを含むハイブリダイゼイシ
ョン用緩衝液（６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液(Denha
rdt's solution) 、0.５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミ
ド、２０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ6.５）６ml
中、６０℃で１時間培養した。次に、ランダムプライマ
ー法により、32Ｐで標識したＤＮＡプローブを培養液に
加えた。ハイブリダイゼイションは、４２℃で１夜行っ
た。
【０１０４】ハイブリダイゼイション後のフィルタを、
室温で１５分間、0.１％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中で
２回洗浄し、さらに３７℃で３０分間、0.１％のＳＤＳ
を含む0.２×ＳＳＣ中で２回洗浄した。次に、フィルタ
ーを0.１×ＳＳＣで洗浄し、増感スクリーンを使ってＸ
線フィルムで検出した。
【０１０５】(11). ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼイシ
ョン 前述した方法でＡＫＲマウスの胸腺リンパ球およびＢＷ
５１４７細胞からポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製し、グリオ
キサールで変性した後、２０Mmのリン酸塩緩衝液（ｐＨ
7.４）を含む1.２％アガロースゲル中で電気泳動させ、
次いでナイロンフィルターに移した。このフィルターを
３７℃で乾燥し、サケの精子のＤＮＡ１００μｇを含む
ハイブリダイゼイション用緩衝液２ml中、６０℃で１時
間培養した。
【０１０６】次に、オリゴヌクレオチドプローブの5'−
末端を32Ｐで標識して培養液に加えた。４２℃で１夜培
養した後、フィルターを室温で１５分間、0.１％のＳＤ
Ｓを含む２×ＳＳＣで２回洗浄し、さらに５０℃で３０
分間、0.１％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣで２回洗浄し
た。次に、フィルターを0.２×ＳＳＣで洗浄し、増感ス
クリーンを使ってＸ線フィルムにより放射能を検出し
た。
【０１０７】(12). Ｑ５K 蛋白質の合成および酵素標識
抗体による検出 ＢＷ５１４７細胞のｃＤＮＡから増幅したＱ５K 遺伝子
のエクソン１〜４に対応するＤＮＡを前述した方法でプ
ラスミドｐＵＣ１１９のｌａｃＺプロモーター下流に組
み込んだ。塩基配列の決定により、正しい蛋白の合成が
期待されるコロニーを選択し、これをアンピシリンを含
むブイヨン内で６００nmの吸光度が0.３に達するまで成
育させた。さらに培地にＩＰＴＧを５０μM 加え、吸光
度が0.７５になるまで培養を続けた。
【０１０８】次に、細胞を採取して１０％トリフルオロ
酢酸で沈殿させ、アセトンで洗浄した後、２％のＳＤ
Ｓ、５％のグリセロール、0.０１２５％のＢＰＢおよび
2.５％の２−メルカプトエタノール2.５％を含むトリス
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ6.８）２５mMに３０分、１００℃
で溶解させた。
【０１０９】溶解した物質を0.１％のＳＤＳを含む１２
％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させた後、２５
mMのトリス塩基、１９２mMのグリシン、２０％メタノー
ルおよび0.０２％のＳＤＳからなる溶液中で電気泳動的
にポリ二フッ化ビニル膜(Immobilon, Millipore, Bedfo
rd.)に移した。次に、0.２％のツイーン２０を含む0.１
５M 塩化ナトリウムで膜を洗浄した後、１０mMトリス−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ7.６）（ＴＴＢＳ）に浸し、さらに
１０％のヤギ血清および１０％のウマ血清を含むＴＴＢ
Ｓ中で３７℃、２時間孵置した。
【０１１０】次に、膜を水で洗浄し、ＴＴＢＳで２００
倍に希釈したマウスの腹水（モノクローナル抗体５９を
含む）５ml中で１夜（室温）孵置した。孵置後、膜をＴ
ＴＢＳで３回洗浄し、１０mMのトリス−ホウ酸緩衝液
（ｐＨ7.６）を含む生理食塩水中でペルオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇＧ(Amersham)と３７℃、１時間反応させ
た。膜を再度ＴＴＢＳで３回洗浄した後、４０mgの３，
3'−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(Wako
Chemicals, Osaka, Japan)および１５μl の３０％過酸
化水素を含むＴＴＢＳ５０ml中で呈色させた。
【０１１１】〔結果〕 (1).Ｈ−２K マウスに由来する癌細胞に表現されたＱａ
−２抗原の特性 Ｈ−２K （Ｑａ−２- ) マウスから誘導された癌細胞系
の殆ど（試験した９例の細胞系の７例）は、抗Ｑａ−２
抗血清またはＱａ−２特異的モノクローナル抗体１４１
−１5.８を使った膜免疫蛍光法によって検出されるＱａ
−２抗原を表現することが明らかにされている〔Tanin
o,T., N.Seo, T.Okazaki, C.Nakanishi-Ito, M.Sekimat
a, and K.Egawa. Humoral responses to Qa-2 and othe
r tumor antigens in mice. Submitted for publicatio
n in Immunogenetics. 〕。
【０１１２】しかし、他のＱａ−２特異的モノクローナ
ル抗体３４−1.２を使った場合は、一般にこれらの癌細
胞にＱａ−２抗原は検出されなかった。新たに得たモノ
クローナル抗体５９のＱａ−２特異性を試験し、モノク
ローナル抗体１４１−１5.８およびモノクローナル抗体
３４−1.２のＱａ−２特異性と比較した。結果を表７に
示す。
【０１１３】
【表７】
【０１１４】モノクローナル抗体５９は、Ｑ７b 遺伝子
の産物であるＱａ−２分子のα１またはα２ドメインを
認識し、少なくともＨ−２K およびＨ−２b 抗原と交差
反応しないことは明らかである。モノクローナル抗体３
４−1.２と異なり、モノクローナル抗体５９は、Ｈ−２
b リンパ球のみならず、ＭＭ２やＢＷ５１４７などの種
々のＨ−２K 癌細胞とも反応した。
【０１１５】Ｑａ−２特異的なモノクローナル抗体に対
するこのような反応性は、これらの癌細胞が、Ｈ−２b
マウスの正常なリンパ球から検出されるＱａ−２抗原と
同じではないが密接に関連したＱａ−２抗原を表現する
こと、および分子のα１またはα２ドメインは、上記二
つのＱａ−２抗原の差異の少なくとも一部に関与してい
ることを示している。また、表７は、これらのモノクロ
ーナル抗体のいずれかを使用した場合、Ｑａ−２抗原
は、Ｈ−２K マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅマウスおよびＡＫＲ
マウス）の胸腺リンパ球および脾細胞には検出されない
ことを示している。
【０１１６】Ｈ−２b マウスから得られるリンパ球に表
現されるＱａ−２抗原は、ＰＩ−ＰＬＣ処理に感受性の
あることが報告されている〔Schibler,U., M.Tosi, A.-
C.Pinett, L.Fabiani, and P.K.Wellauer. 1980. Tissu
e-specific expression of mouse alpha-amirase gene
s. J.Mol.Biol. 142:93〕。これは、分子がグリコフォ
スファチジルイノシトール（ＧＰＩ）成分を経由して細
胞膜に付着(anchor)することを示している。
【０１１７】ＧＰＩ構造は、細胞表面蛋白分子のアスパ
ラギン酸と連結していることが知られている〔LOW,M.G.
1987. Biochemistry of the glycosyl-phosphatidyl i
nositol membrane anchors. Biochem. J. 244:1 〕。Ｑ
ａ−２分子の場合、ＧＰＩアンカーは、Ｑ７b 遺伝子の
エクソン５中のＣＡＣによってコードされた２９５位の
アスパラギン酸残基と連結していると推測されている
〔Waneck,G.L., D.H.Sherman, P.W.Kincade, M.G.Low,
and R.A.Flavell. 1988. Molecular mapping ofsignals
in the Qa-2 antigen required for attachment of th
e phosphatidylinositol membrane anchor. Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA. 85:577 〕。ＰＩ−ＰＬＣ処理に耐
性のあるＨ−２抗原分子中では、このアスパラギン酸残
基は、バリンに置き換えられている。
【０１１８】Ｑａ−２、３領域の遺伝子のＤＮＡ配列
は、報告されている限り、Ｑ７遺伝子およびＱ９遺伝子
とは異なるすべての推測されるＱ遺伝子の産物がこの位
置にバリンを有していることを示している〔Devlin,J.
J., E.H.Weiss, M.Panslon, andR.A.Flavell. 1985. Du
plication of gene pairs and alleles of class I gen
es in the Qa-2 region of the murine major histocom
patibility complex: acomparison. EMOB J. 4:320
3〕。
【０１１９】これらの観察から、Ｈ−２K 癌細胞表面に
表現されたＱａ−２抗原は、ＰＩ−ＰＬＣ処理に耐性が
あると推測された。表８−Ａに示すように、Ｈ−２K マ
ウスから誘導された種々の癌細胞の、モノクローナル抗
体１４１−１5.８によって検出されるＱａ−２分子は、
ＰＩ−ＰＬＣ処理に耐性があった。
【０１２０】対照実験として、ＢＷ５１４７細胞のＴｈ
ｙ−１抗原の感受性を試験した。Ｔｈｙ−１抗原は、Ｇ
ＰＩアンカーを持った細胞表面分子の一つであることが
知られている〔Low,M.G., and P.W.Kindade. 1985. Pho
sphatidylinositol is teh membrane-anchoring domain
of the thy-1 glycoprotein. Nature 318:62 〕。
【０１２１】表８−Ｂに示すように、ＢＷ５１４７細胞
に表現されたＴｈｙ−１抗原は、ＰＩ−ＰＬＣ処理に感
受性があった。この結果は、ＢＷ５１４７細胞のＱａ−
２抗原におけるＧＰＩアンカーの欠損は、ＧＰＩアンカ
ーを合成する細胞機構の欠陥によるものではなく、Ｑａ
−２分子それ自体の生化学的な差異によるものであるこ
とを示している。
【０１２２】
【表８】
【０１２３】これらの観察から、Ｈ−２K マウスに由来
する癌細胞に表現されたＱａ−２抗原（Ｑａ−２K 抗
原）は、Ｈ−２b マウスの正常なリンパ球に表現される
それとは免疫学的および生化学的に異なっていることは
明らかである。Ｑａ−２K 抗原は、Ｈ−２K マウスから
誘導された癌細胞に表現されるＰＩ−ＰＬＣ耐性であっ
て、モノクローナル抗体５９およびモノクローナル抗体
１４１−１5.８に対しては反応性を有するが、モノクロ
ーナル抗体３４−1.２に対しては反応性を有しない分子
として定義される。
【０１２４】(2).ＢＷ５１４７細胞のＱａ−２K 表現型
をコードする遺伝子の同定 Ｑａ−２K 遺伝子の表現がかなり強く、しかも宿主由来
の細胞の混入のない細胞が得られるという理由から、Ｑ
ａ−２K 遺伝子に陽性な癌細胞中、試験管内で培養した
ＢＷ５１４７細胞を材料として以下の試験を行った。
【０１２５】図７は、ゲノムＤＮＡのＨｉｎｄIII およ
びＢａｍＨＩフラグメントと、32Ｐで標識した約８００
ｂｐのＤＮＡプローブとを用いたＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リダイゼイション分析の結果を示している。上記のＤＮ
Ａプローブは、すべてのクラス１遺伝子のエクソン２、
３および４を含むＤＮＡ領域を検出することができる。
【０１２６】Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、ＡＫＲマウスおよび
ＢＷ５１４７細胞由来のＤＮＡを使って得られたオート
ラジオグラムのパターンは、本質的に同一であり、それ
らはＢ６マウス由来のＤＮＡを使って得られたものと異
なっている。これらの結果から、クラス１遺伝子群の配
列は、Ｈ−２K マウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅマウスおよびＡＫ
Ｒマウス）のゲノムおよびＡＫＲマウスから誘導された
リンパ腫細胞系の間で保存されると考えられる。
【０１２７】Ｃ３Ｈ／ＨｅマウスのゲノムのＱａ−２、
３領域は、Ｑ１K 、Ｑ２K 、Ｑ４K、Ｑ５K およびＱ１
０K 遺伝子を含むことが報告されている〔Watts,S., A.
C.Davis, B.Gant, C.Wheeler, L.Hill, and R.S.Gooden
ow. 1989. Organization andstructure of the Qa gene
s of the major histocompatibility complex of the C
3H mouse. Implications for Qa function and class I
evolution. EMBO.J.8:1749 〕, 〔Weiss,E.H., D.Beve
c, G.Messer, S.Schwemmle, C.Grosshause,M.Steinmet
z, and W.Schmidt. 1989. Oranization of the AKR Qa
region: Structure of a divergent class I sequence,
Q5 K .J.Immunogenet. 16:283〕。
【０１２８】Ｑ３K 遺伝子は偽遺伝子であり、Ｑ６、Ｑ
７、Ｑ８および大部分のＱ９に対応する遺伝子が欠如し
ていた。Ｑ５K 遺伝子は、Ｑ５遺伝子の大きな5'部分と
Ｑ９遺伝子の短い3'部分とからなるハイブリッド遺伝子
と推定された。
【０１２９】本発明者は、ＡＫＲマウス中では不活性
で、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼイションと、Ｑ
１K 、Ｑ２K 、Ｑ４K 、Ｑ５K およびＱ１０K 遺伝子の
それぞれに特異的なプライマーおよびプローブとを使っ
たＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅によって、ＢＷ５１４７
内に転写された遺伝子の同定を試みた（表６および図
６）。
【０１３０】また、Ｈ−２ＤK 遺伝子に特異的なプライ
マーおよびプローブをポジティブコントロールとして用
いた。
【０１３１】図８は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼイ
ション試験の結果を示している。Ｈ−２ＤK 特異的なプ
ローブ（Ｎo.１２）は、ＡＫＲ胸腺リンパ球およびＢＷ
５１４７ＲＮＡの両者の1.５ｋｂＲＮＡと特異的にハイ
ブリダイズした。これに対し、Ｑ５K 遺伝子特異的なプ
ローブ（Ｎo.１６）は、ＡＫＲマウスのＲＮＡに関して
はハイブリダイゼイションが検出されなかったが、ＢＷ
５１４７細胞の1.２、1.５および4.０ｋｂＲＮＡとハイ
ブリダイズした。
【０１３２】また、プローブＮo.１３、１４、１５およ
び１７を使用した場合は、ＡＫＲマウスのＲＮＡまたは
ＢＷ５１４７細胞のＲＮＡのいずれとのハイブリダイゼ
イションも検出されなかった（データは示さない）。こ
れらの結果は、Ｑ遺伝子群のうち、Ｑ５K 遺伝子（その
転写は、Ｈ−２K マウスの胸腺リンパ球では検出されな
かった）がＢＷ５１４７細胞で特異的に転写されること
を示した。ＢＷ５１４７細胞内のＱ５K 遺伝子の転写
は、ＰＣＲの結果によって確認された。
【０１３３】Ｈ−２ＤK 、Ｑ１K 、Ｑ２K 、Ｑ４K 、Ｑ
５K およびＱ１０K （Ｎo.１〜６）に特異的なプライマ
ーとクラス１のエクソン４の3'−末端近傍の共通的なセ
ンス配列に相補的なプライマー（Ｎo.８）とを使ってＰ
ＣＲを実施した。
【０１３４】図９に示すように、ＢＷ５１４７細胞のｃ
ＤＮＡの増幅は、Ｈ−２ＤK およびＱ５K 遺伝子のそれ
ぞれのエクソン１のアンチセンス配列と相補的なプライ
マーＮo.１または６をプライマーＮo.８と共に使用した
場合にのみ成功した。プライマーＮo.２、３、４または
６をプライマーＮo.８と共に使用した場合は、アニール
温度を４５℃に下げたときでも増幅が検出されなかっ
た。プライマーＮo.５および８を使って増幅したＤＮＡ
は、直接、およびｐＵＣ１１９を用いてクローン化した
後、プライマーＮo.５、７、８とＭ１３ユニバーサルプ
ライマーとを使ってその塩基配列を決定した。
【０１３５】その結果、この塩基配列は、報告されてい
るＣ３Ｈ／ＨｅマウスのＱ５K 遺伝子のエクソン１〜４
における塩基配列と同一であることが確認された。Ｑ５
K 遺伝子と異なるｃＤＮＡの増幅は、検出されなかっ
た。また、プライマーＮo.１および８を使用した場合に
は、ＡＫＲマウスのＨ−２ＤK ｃＤＮＡの増幅が検出さ
れた。
【０１３６】しかし、これらのＱ特異的プライマーを用
いてＡＫＲマウスのｃＤＮＡを増幅させることはできな
かった。また、ＢＷ５１４７細胞のｃＤＮＡの増幅は、
クラス１のエクソン４内における通常のアンチセンス配
列と相補的なプライマーＮo.９およびエクソン８内にお
けるＱ５K 特異的なセンス配列と相補的なプライマーＮ
o.１０を使用したときにも観察された。これらのプライ
マーを使って増幅したｃＤＮＡの塩基配列は、プライマ
ーＮo.９および１０を使って直接決定した。
【０１３７】これらの結果から判明したｃＤＮＡの塩基
配列は、既報のＱ５K 遺伝子の塩基配列から予測される
ｃＤＮＡの塩基配列と完全に一致した。従って、ＢＷ５
１４７細胞においては、正常Ｈ−２K リンパ球では転写
されていないＱ５K 遺伝子が転写されていることが明ら
かとなった。
【０１３８】ＢＷ５１４７細胞のＱ５K 遺伝子が免疫学
的に定義されたＱａ−２抗原の遺伝子であるかどうかを
明らかにするため、プライマーＮo.５および９を使った
ＰＣＲによって増幅したｃＤＮＡの塩基配列によって規
定されたペプチドと、酵素標識した抗体との反応性を検
討した。
【０１３９】増幅したＤＮＡをｐＵＣ１１９のＳｍａＩ
部位に正しく挿入した組換え体を作製し、これを大腸菌
ＭＶ１１８４細胞内に導入した。この大腸菌をＩＰＴＧ
の存在下で培養することにより、ｌａｃＺ蛋白との融合
蛋白を誘導した。
【０１４０】図１０に示すように、得られた大腸菌は、
期待された約３５ｋＤａの分子量を持ったペプチドの誘
導合成を示した。この３５ｋＤａの分子量を持った蛋白
は、ペルオキシダーゼ標識抗Ｑａ−２モノクローナル抗
体５９と反応した。同じ条件でペルオキシダーゼ標識抗
Ｑａ−２モノクローナル抗体３４−1.２を使用した場合
は、蛋白は検出されなかった。
【０１４１】以上の結果から、モノクローナル抗体３４
−1.２によっては検出されないがモノクローナル抗体５
９によって検出され、また、ＰＩ−ＰＬＣ処理に耐性が
あるＢＷ５１４７細胞表面のＱａ−２K 抗原は、Ｑ５K
遺伝子の産物であることが明らかとなった。
【０１４２】
【実施例３】前記実施例の実験により、マウスの実験癌
細胞において、Ｑａ／Ｔｌａ遺伝子領域のＱ５遺伝子の
発現が認められ、またＱ５遺伝子の産物がＱ７遺伝子産
物であるＱａ−２正常リンパ球抗原と共通抗原性（交差
反応性）を持つものであり、さらにＱａ−２- 担癌体が
癌細胞の表現するＱ５遺伝子の産物に対して行う生体反
応は、同種異系マウスの正常リンパ球表面のＱａ−２抗
原（Ｑ７遺伝子産物）をも標的とし得ることが明らかに
なった。
【０１４３】そこで、本発明者は、以下の方法により、
Ｑａ−２抗原を用いた免疫による癌抵抗性の誘導実験を
行った。
【０１４４】〔方法〕Ｑａ−２- マウスをＱａ−２+ 同
種異系マウスの正常リンパ球によって免疫した。マウス
は、（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ×Ｂ6.Ｋ１）Ｆ1 マウスを使用し、
これにＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞を腹腔内投与する
ことによって、Ｑａ−２抗原特異的な免疫を行った。癌
細胞は、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系マウス由来のＱａ−２+ 癌細胞
を用いた。
【０１４５】〔結果〕 (1).上記のＱａ−２抗原特異的な免疫処置により、Ｆ1
マウスにＣ３Ｈ／Ｈｅマウス由来のＭＭ２等の癌細胞に
対する抵抗性が誘導された。すなわち、対照無処置群に
おいては、癌細胞２×１０5 個の腹腔内移植が全てのマ
ウスで成立したが、免疫処置群においては、移植が成立
したものは全く認められなかった。
【０１４６】(2).免疫を受けたＦ1 マウスから得られた
脾細胞を試験管内でＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞によ
り再刺激することによって、Ｑａ−２抗原特異的な細胞
障害性を持つＴ細胞を誘導したところ、これはＱａ−２
+ 同種異系マウスの正常リンパ球のみならず、Ｃ３Ｈ／
Ｈｅマウス由来の癌細胞をも強く刺激した。
【０１４７】(3).Ｆ1 マウス足蹠部にＣ３Ｈ／Ｈｅマウ
ス由来の癌細胞ＮＳＦａを移植し、腫瘤が直径約１cmに
達したときに腫瘤を持つ足を大腿部より切断して腫瘤を
除去し、その１〜４日後にＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細
胞によるＱａ−２抗原特異的な免疫を行った。
【０１４８】対照無処置群の全例において多数の肺転移
が生じ、約４週間後に全例が肺転移によって死亡した
が、免疫群においては、少数例において１〜２個の転移
巣が認められたのみで、大多数のマウスは全く転移が認
められなかった。
【０１４９】このように、Ｑａ−２- マウスをＱａ−２
+ 異系マウスの正常リンパ球で免疫することにより、癌
に対する抵抗性を惹起し得ることが明らかとなった。す
なわち、Ｑａ−２- マウスにおいてＱ７遺伝子産物に対
して惹起された免疫反応は、Ｑ５遺伝子産物に対しても
交差反応性を持ち、この交差反応性が上記の癌抵抗性を
形成していることが明らかになった。
【０１５０】
【実施例４】ヒトの非古典的組織適合クラス１抗原につ
いても、すでにそのいくつかについては遺伝子の全塩基
配列が決定されている。また、それらのいくつかは、正
常成体においては発現されていないことが知られてい
る。
【０１５１】そこで、このような遺伝子に特異的な塩基
配列を持つポリヌクレオチドを調製し、これをプライマ
ーとして、ヒト癌細胞株（ＨＬ６０、Ｕ９３７、Ｈｍｙ
２Ｃ１ＲおよびＳＫＷ−３）より調製したｃＤＮＡのＰ
ＣＲ法による増幅を試みたところ、図１１に示すよう
に、予想される長さのヌクレオチド増幅（図中、矢印で
示す）が認められた。
【０１５２】上記の結果は、ヒト癌細胞においても、正
常成体においては発現されていない非古典的組織適合ク
ラス１抗原の発現が認められることを示している。
【０１５３】
【発明の効果】以上により、Ｑａ−２- マウスをＱａ−
２+ 同種異系マウスの正常リンパ球で免疫することで、
Ｑａ−２- マウスに癌に対する抵抗性が惹起されること
が明らかになった。また、Ｑａ−２+ マウスの由来の癌
細胞にも正常成体では発現されないＱ５遺伝子の発現が
認められるので、Ｑａ−２+ マウスにおいては、Ｑ５遺
伝子産物を用いた免疫操作によってＱ５遺伝子産物特異
的な免疫反応を誘導することにより、自家癌に対する抵
抗性を惹起することができる。
【０１５４】さらに、ヒトにおいても、正常成体には発
現されていない非古典的な組織適合クラス１抗原が癌細
胞に発現されていることが明らかになった。
【０１５５】従って、本発明によれば、免疫反応を利用
した制癌方法および制癌剤を提供することができる。す
なわち、非古典的な組織適合クラス１抗原、またはそれ
を認識する抗体もしくは障害性リンパ球を癌患者などに
投与することにより、癌に対する抵抗性を惹起させるこ
とが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】膜免疫蛍光分析法による、Ｈ−２K マウスから
誘導された癌細胞系の表面におけるＱａ−２抗原の存在
を示すグラフ図である。
【図２】抗Ｑａ−２モノクローナル抗体およびＦＰＬＣ
精製標品の補体依存細胞障害活性試験結果を示すグラフ
図である。
【図３】放射性ヨウ素(125Ｉ）で標識したＦＰＬＣ精製
標品のオートラジオグラフィによる分析結果を示す図で
ある。
【図４】抗ＩｇＤセファロースカラムを用いたＲＳ活性
の吸収を示すグラフ図である。
【図５】酵素抗体法による、ＲＳ中におけるＱａ−２抗
原特異的ＩｇＤの存在を示すグラフ図である。
【図６】ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーに用いたオ
リゴクレオチドの特異性を示す図である。
【図７】ゲノムＤＮＡのＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ
フラグメントと、32Ｐで標識した約８００ｂｐのＤＮＡ
プローブとを用いたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼイシ
ョン分析の結果を示す図である。
【図８】ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼイション試験の
結果を示す図である。
【図９】ポリメラーゼ連鎖反応によるＢＷ５１４７細胞
ｃＤＮＡの増幅を示す図である。
【図１０】大腸菌によって誘導された融合蛋白のＱａ−
２特異的モノクローナル抗体に対する反応性を示す図で
ある。
【図１１】ヒト癌細胞株より調製したｃＤＮＡのＰＣＲ
法によるヌクレオチド増幅を示す図である。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非古典的な組織適合クラス１抗原を投与
    することを特徴とする制癌方法。
  2. 【請求項２】 非古典的な組織適合クラス１抗原を認識
    する抗体を投与することを特徴とする制癌方法。
  3. 【請求項３】 非古典的な組織適合クラス１抗原を認識
    する障害性リンパ球を投与することを特徴とする制癌方
    法。
  4. 【請求項４】 非古典的な組織適合クラス１抗原を有効
    成分とする制癌剤。
  5. 【請求項５】 非古典的な組織適合クラス１抗原を認識
    する抗体を有効成分とする制癌剤。
  6. 【請求項６】 非古典的な組織適合クラス１抗原を認識
    する障害性リンパ球を有効成分とする制癌剤。
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