JPH0525472B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は各種の酵素およびオルガネラ（以下、
酵素という）の固定化に適した諸特性を有する各
種の炭素質材料および黒鉛質材料（以下、単に炭
素材という）からなる担体に関し、詳しくは、酵
素を利用した医薬品や食品を生産するための担体
として最適な酵素固定化用担体に関する。 （従来の技術） 従来より酵素を結合固定化する担体としては、
次のようなものが知られている。 (a) セルロース、デキストラン、アガロース等多
糖類の誘導体などの天然高分子。 (b) ポリスチレン、ポリビニルアルコール、イオ
ン交換樹脂などの合成高分子。 (c) 多孔性ガラス、多孔性金属、セラミツクなど
の無機物質。 （発明が解決しようとする課題） しかしながら、前記従来から酵素の固定化に使
用される各種の担体には次のような問題点があ
る。 すなわち、前記(a)、(b)のような有機質担体は機
械的な強度が比較的小さく、酵素等の固定化用担
体としては保持性が弱い欠点がある。また、その
形状については自由に制御しうるわけではなく、
多孔性の微細構造を賦与することが可能であつて
も、それを用いて板状等の任意の高次構造を賦与
することが困難であつたり、逆に高次構造を賦与
することができても、これに微細構造を賦与する
ことが困難であつたりする。さらに有機質担体の
大きな欠点は、微生物により分解されやすく、高
温処理を施せず再生利用ができないことである。
これらのことから、当然、リアクリターの形式に
制約が生ずる。 一方、前記(c)のような無機質担体は機械的な強
度は有機質担体に比較して大きく、有機溶媒、酸
アルカリなどの化学薬品に対する抵抗力もあり、
再生利用も可能であるなどの利点があるが、反面
酵素を利用した医薬品や食品を生産するための担
体として使用するには、担体の混入があると人体
に有害であり、多孔性ガラスやセラミツクスは比
較的高価であつて、賦形の自由度が小さく、また
多孔性金属はイオン化して混入する恐れがあり、
現在のところ工業的には余り用いられていない。 本発明はこのような事情に鑑みなされたもので
あり、前記従来の担体の有する欠点を除去、改善
することを目的とし、酵素の固定に際しての有効
固定面積が大きく、酵素反応時の物質交換に有利
となる多孔性の微細構造組織が簡単に得られ、加
工性に優れ、耐薬品性、耐久性をもち、有害な不
純物を含まず人体に無害であり、入手が容易で安
価に製造することができる酵素固定化用担体を提
供するものである。 （課題を解決するための手段） 本発明に係る酵素固定化用担体は、熱硬化性樹
脂等の炭素化する有機物により補強され、形態が
保持されたまま炭素化された植物組織よりなる炭
素材からなることを特徴としている。すなわち、
本発明は植物組織の導管孔又は仮導管孔等の組織
形態が酵素の固定に適した微細構造を備えている
ことに着目し、各種針葉樹、広葉樹、竹類などの
植物組織を炭素化する有機物により補強し、炭素
化し、その植物の導管孔等の組織形態をそのまま
保持した多孔質の炭素材からなるものである。 そして、本発明に係る担体は、担体を構成する
炭素材に官能基を導入することによつて、酵素等
を結合固定するものである。すなわち、酵素が有
する官能基（水酸基、カルボキシル基、アミノ
基、イミダゾール基、スルフヒドリル基など）の
うち酵素活性に影響を与えない官能基と、担体で
ある炭素材に導入された官能基とが直接もしくは
架橋剤を介して結合することにより、酵素を固定
化しようとするものである。 炭素材に官能基を導入する方法としては、炭素
材を空気中で100〜500℃に加熱する乾式酸化処理
と、硝酸などの酸化剤で湿式酸化処理をする方法
とがある。これらのうち特に前者が簡単であり、
かつ多数の官能基の導入が可能であるので、コス
トが安く工業化に適している。これらの方法によ
つて得られる官能基としては、例えば、カルボキ
シル基、水酸基、アルデヒド基、又はジカルボン
酸無水物もしくはキノン構造、ラクトン構造、エ
ポキシサイド構造が考えられる。また、これらの
官能基は有機化学的手法により、他の官能基、例
えばアミノ基等に容易に置換し得る。 結合固定には、酵素の有する官能基と炭素材の
官能基とが直接結合することによりなされる場合
と、架橋剤を介して行なわれる場合とがある。 架橋剤としては、ジアルデヒド類、ジイソシア
ナート類、Ｓ−トリアジン類、イミドエステル
類、シアヌルクロリド類などの中から選ばれる一
種又は二種以上の二官能性以上の物質が考えられ
る。 ところで、担体に結合される酵素が担体に対し
てあまり接近して結合されていると、立体障害な
ど酵素の活性に重大な影響を及ぼす場合がある。
この場合は導入する官能基を長鎖分子にすること
によつて、担体である炭素材と酵素等との結合固
定に接近がなく、酵素等の基質のとり込みを行な
いやすくして、いわゆる酵素等の立体障害を防ぎ
効率よく反応させることができる。 酵素は、アミノアシラーゼ、トリプシン、５−
ホスホジエステラーゼ、５−アデニル酸デアミナ
ーゼ、グルコースアミラーゼ、カタラーゼン、パ
パイン、ペプシン、ペニシリンアミラーゼ、α−
キモトリプシン、イソベルターゼ、プロナーゼ、
エラスターゼ、アルカリプロテアーゼなどの加水
分解酵素や、グルコースイソメラーゼ、アミノ酸
ラセマーゼ、ステロイドイソメラーゼなどの異性
化酵素のほか、アルコール脱水素酵素、乳酸脱水
素酵素、パーオキシダーゼなどの酸化還元酵素、
あるいはアスパルターゼ、シクロリガーゼなどの
合成酵素、さらにこれらすべての酵素を含むオル
ガネラも対象にし得る。 補強のための有機物は、熱硬化性樹脂等の炭素
化するものであつて、とくにレジン、又はレジン
との複合材料が好適である。 （作用） 本発明の固定化用担体は、熱硬化性樹脂等の炭
素化する有機物により補強されて炭素化された植
物組織よりなる炭素材によつて形成される。この
ような固定化用担体は、第１図の顕微鏡による組
織拡大写真に示すように、木材等導管孔は又は仮
導管孔が貫通孔ないし連続した細孔状に多数存在
しているので、表面積が大きく、酵素の固定に際
しての有効固定面積が大きく、酵素反応時の物質
交換に有利である。また、生体由来の多孔質体で
あるがゆえに、有害な不純物を含まず、他の炭素
材と同様に官能基を導入することができると共
に、これらの導管孔等の表面が熱硬化性樹脂等の
炭素化する有機物で補強されて炭素化されている
ので靭性や耐薬品性に優れており、炭素粉塵の発
生や脱落がなく、実用的強度が高く安定性の点で
も優れた固定化酵素が得られる。 また、各種固定化装置の形状および構造に適合
する形状に簡易に接着、切削できる優れた加工性
を有しており、使用目的に最適の形態の固定化用
担体をつくることができる。 （実施例） 次に、実施例について説明する。 実施例 １ 桐由来の熱硬化性樹脂炭により補強された多孔
質炭素材（第２図参照）を約10mmφ、２mm厚の大
きさに加工し、乾燥機中に150℃空気雰囲気中で
４時間加熱し、含酸素官能基を導入した。これを
アンモニア飽和、亜硫酸アンモニウム水溶液とと
もにオートクレーブ中150℃、８時間自生圧下で
処理し、表面含酸素官能基をアミノ基に置換し
た。このアミノ基を導入した桐由来の多孔質炭素
材と0.5％のβ−ガラクトシダーゼ水溶液を５℃
で10％グルタルアルデビト水溶液と混合し、一昼
夜攪拌し、桐由来の多孔質炭素材にβ−ガラクト
シダーゼを固定化した。 固定化多孔質炭素材は10mmφ、150mmlのガラ
スカラムに70枚重ねて詰め、30℃恒温槽に固定
し、0.5molKC1及び0.01molリン酸バツフアーで
充分洗浄後、ρ−ニトロフエニル−β−ｄ−ガラ
クトシド0.1％水溶液を、５ml／minの流速で通
液した。反応の確認は分解生成物のρ−ニトロフ
エノールを420nm可視吸収によつて定量すること
で行なつた。 比較例１は上記桐由来の多孔質炭素材を約10mm
φ、２mm厚の大きさに加工し、官能基導入処理を
せずに0.5％のβ−ガラクトシダーゼ水溶液に一
昼夜浸した。これを10mmφ、150mmlのガラスカ
ラムに70枚重ねて詰め、30℃恒温槽に固定し、
0.5molKC1及び0.01molリン酸バツフアーで充分
洗浄後、ρ−ニトロフエニル−β−ｄ−ガラクト
シド0.1％水溶液を、５ml／minの流速で通液し
た。反応の確認は分解生成物のρ−ニトロフエノ
ールを420nm可視吸収によつて定量することで行
なつた。 結果を表１に示した。

【表】 実施例 ２ 市販の５mm厚のレーヨン系カーボンフアイバー
フエルトを15mm×150mmに切断し、乾燥機に入れ
て250℃で４時間、空気雰囲気で加熱し、主にカ
ルボキシル基を導入した。 このフエルトとβ−ガラクトシターゼの0.5％
水溶液をCMC（１−Cyclohexyl−３−（２−
morpholinoethyl）carbodiimide−metho−ｐ−
toluene−Sulfonate）の存在下５℃で混合し、12
時間振とうし、フエルトのカルボキシル基とβ−
ガラクトシターゼのアミノ基を直接、結合固定し
た。 固定化フエルトは、10mmφ、150mmlのガラス
カラムにまるめて詰め、30℃の恒温槽に固定し、
0.5molKC1及び0.01molリン酸バツフアーで充分
洗浄後、ρ−ニトロフエニル−β−ｄ−ガラクト
シド0.1％水溶液を、５ml／minの流速で通液し
た。反応の確認は分解生成物のＰ−ニトロフエノ
ールを420nm可視吸収によつて定量することで行
なつた。 比較例２は市販の５mm厚のレーヨン系カーボン
フアイバーフエルトを15mm×150mmに切断し、
CMCを用いずに、β−ガラクトシターゼの0.5％
水溶液に浸し、12時間振とうし、これを10mmφ、
150mmlのガラスカラムにまるめて詰め、30℃の
恒温槽に固定し、0.5molKC1及び0.01molリン酸
バツフアーで充分洗浄後、ρ−ニトロフエニル−
β−ｄ−ガラクトシド0.1％水溶液を、５ml／
minの流速で通液した。反応の確認は分解生成物
のρ−ニトロフエノールを420nm可視吸収によつ
て定量することで行なつた。 結果を表２に示した。

【表】 実施例 ３ 市販のフアインモザイクコークスを、粉砕、分
級し500〜1000μmの粒度とし、乾燥機に入れて
200℃の空気雰囲気で２時間加熱し、主にヒドロ
キシル基を導入した。 これをγ−アミノプロピルトリエトキシシラン
で処理し、官能基末端にアミノ基を導入した。こ
のアミノ基導入担体と、トリプシン0.5％水溶液
を５℃でPH6.5のリン酸バツフアー（0.01mol）
中、10％のグルタルアルデヒドを架橋剤として、
一昼夜攪拌し、固定化した。 トリプシンを固定化した担体を10mmφ150mml
のガラスカラムに充填し、0.5molKC1水溶液で
充分洗浄した後、0.01molのリン酸バツフアーで
洗浄した。37℃恒温層中にカラムを固定し、カゼ
イン0.5％水溶液を10ml／minの流速で通液した。
反応の判定は、カゼインの分解生成物であるペプ
タイドを280nmのUVにて定量し行なつた。 比較例３は、上記市販のフアインモザイクコー
クスを、粉砕、分級し500〜1000μmの粒度とし、
乾燥機に入れて200℃の空気雰囲気で２時間加熱
し、これをトリプシン0.5％水溶液に浸し、一昼
夜攪拌した。これを10mmφ150mmlのガラスカラ
ムに充填し、0.5molKC1水溶液で充分洗浄した
後、0.01molのリン酸バツフアーで洗浄した。37
℃恒温層中にカラムを固定し、カゼイン0.5％水
溶液を10ml／minの流速で通液した。反応の判定
は、カゼインの分解生成物であるペプタイドを
280nmのUVにて定量し行なつた。 結果を表３に示した。

【表】 （発明の効果） 以上のように、本発明は、熱硬化性樹脂等の炭
素化する有機物により補強され、形態が保持され
たまま炭素化された植物組織よりなる炭素材から
なることにより、酵素の固定に際して有効固定面
積が大きく、酵素反応時の物質交換に有利な微細
構造をもつた酵素固定化用担体を簡単に提供する
ことができる。また、担体を構成する炭素材が生
体由来の多孔質体であるがゆえに、有害な不純物
を含まず、他の炭素材と同様に官能基を導入する
ことができると共に、これらの導管孔等の組織が
熱硬化性樹脂等の炭素化する有機物で補強されて
炭素化されているので靭性や耐薬品性に優れてお
り、炭素粉塵の発生や脱落がなく、実用的強度が
高く、安定性の点でも優れた固定化酵素が得られ
る利点がある。また、各種固定化装置の形状およ
び構造に適合する形状に簡易に接着、切削できる
優れた加工性を有しており、使用目的に最適の形
態の固定化酵素担体をつくることができる。 これによつて得られた酵素の固定化用担体は、
従来の担体よりも安価でしかも従来の無機質担体
の有する利点である高強度、高耐熱性、高耐久性
をもち、またイオン化したり、微生物により分解
されたりしせず再生利用が可能であり、しかも人
体に無害であるため食品や医薬品を製造する酵素
の固定化用担体として最適である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に最適の多孔質炭素材の組織拡
大斜視図としての顕微鏡写真、第２図は桐由来の
多孔質炭素材の組織拡大斜視図としての顕微鏡写
真である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 熱硬化性樹脂等の炭素化する有機物により補
   強され、形態が保持されたまま炭素化された植物
   組織よりなる炭素材からなることを特徴とする酵
   素固定化用担体。