JPH05262792A

JPH05262792A - ペプチドおよびその用途

Info

Publication number: JPH05262792A
Application number: JP3068007A
Authority: JP
Inventors: Terumasa Arima; 暉勝有馬; Kyoko Yamada; 恭子山田; Tadashi Hatanaka; 唯史畑中; Toshihiko Nanba; 敏彦難波; Masao Tsuji; 正男辻
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 1990-03-08
Filing date: 1991-03-07
Publication date: 1993-10-12
Anticipated expiration: 2016-12-25
Also published as: JP3241057B2

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は Lys Arg Ser Thr Asn、Arg Arg Tyr
Lys Glu Lys Glu Lys またはAla Ile Ile Pro Asp Arg
Glu Val Leu Tyr のアミノ酸配列を含有する、非Ａ非Ｂ
型肝炎関連抗原に対して特異性を有する抗体と特異的に
結合する能力を有するペプチドおよび該ペプチドを含有
する測定試薬に関する。【効果】該ペプチドは非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に特異性
を有する抗体と高度に特異的に結合する能力を有するの
で、抗HCV 抗体の測定に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はペプチドおよびその用途
に関する。本発明によって提供されるペプチドは、非Ａ
非Ｂ型肝炎関連抗原（以下、これをHCV 関連抗原と略称
する）に特異性を有する抗体（以下、これを抗HCV 抗体
と略称する）と高度に特異的に結合する能力を有するこ
とから、抗HCV 抗体の測定に利用できる。

【０００２】本発明によって提供される抗HCV 抗体の測
定試薬は、血清または血漿中の抗HCV 抗体を高感度で検
出する能力を有しており、抗HCV 抗体の測定に有用であ
る。

【０００３】

【従来の技術】肝疾患の大部分を占めるウイルス性肝炎
の病因ウイルスとしては現在５種類が知られており、そ
れぞれＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎ウイルスと呼
ばれている。ウイルス性肝炎のなかでもＡ型肝炎および
Ｅ型肝炎は経口感染であり、一過性感染のみで慢性化す
ることはないが、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎は持続感染に
より慢性化し、高い確率で肝硬変または肝癌に移行する
ため、大きな問題となっている。Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎お
よびＤ型肝炎についてはそれらの原因ウイルスが見い出
され、現在では免疫学的な診断が可能となっている。Ｅ
型肝炎ウイルスについても最近遺伝子が単離されたとの
報告がある。

【０００４】輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎（以下、これを PTN
ANBHと略称する) の病因ウイルスについては多くの研究
者による研究にもかかわらず長い間不明であったが、19
88年にアメリカのカイロン社 (Chiron Corporation) の
研究グループによって、PTNANBH に感染させたチンパン
ジーの血漿から PTNANBHウイルスの遺伝子の単離、同定
がなされ［サイエンス (Science)、第 244巻、第 359頁
(1988年) およびサイエンス、第 244巻、第 362頁 (19
88年) 参照］、Ｃ型肝炎ウイルス (以下、これをHCV と
略称する) と命名された。その遺伝子の塩基配列と推定
されるものの一部はすでに明らかにされており［ヨーロ
ッパ特許第0318216 号明細書参照］、抗HCV 抗体の検出
ができるようになり、HCV 感染についての血清学的診断
が可能となっている。

【０００５】また、本発明者らの１人を含む数人によっ
て PTNANBHの原因となるウイルスの遺伝子と推定される
リボ核酸が PTNANBH患者の血清から単離され、同定され
たことが報告されている［ガストロエンテロロジア・ジ
ャポニカ（Gastroenterologia Japonica) 、第24巻、第
５号、第 540頁 (1989年) ；ガストロエンテロロジア・
ジャポニカ、第24巻、第５号、第 545頁 (1989年) およ
び内科、第64巻、第６号、第1022頁 (1989年) 参照］。

【０００６】これまでcDNAライブラリーからの必要なcD
NAのスクリーニングの手段として、λファージを利用し
た抗原抗体反応によって抗HCV 抗体の陽性または陰性の
判定を行うことが一般的に行われてきたが、上記のイム
ノスクリーニング法は定量性がなく、大腸菌の発現産物
中の非特異な抗原成分との反応が起こる場合があり、現
在、HCV の遺伝子をクローニングし、ファージに組み込
んで酵母を宿主として発現させた抗原蛋白を用いて行う
酵素免疫測定法による抗HCV 抗体の検査薬の開発が検討
されている［内科、第64巻、第６号、第1027頁（1989
年) 参照］。さらに、ウイルスまたはその抗原成分によ
って感作されたゼラチン粒子が抗ウイルス抗体存在下で
凝集する性質を利用した粒子凝集法または酵素免疫測定
をウイルスまたはその抗原成分をコーティングしたビー
ズを用いて行うビーズ法の開発が進められている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】HCV 関連抗原を利用し
たこれまでの酵素免疫測定法では、測定対象が臨床的に
PTNANBHと診断された場合においても、抗HCV 抗体陽性
率は約75％であり、抗HCV 抗体に陰性である PTNANBHが
約25％の割合で含まれている。また上記の酵素免疫測定
法では測定対象が健常者である場合には陽性率が約１％
であり、統計学的なHCV 蔓延率が約３％であることから
約２％の抗HCV 抗体陽性検体が見逃されている。このこ
とから、献血者での HCVキャリアスクリーニングにおい
ては、キャリアの見逃しが避けられず、非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス感染血液の輸血を阻止する割合は必ずしも高く
はない。

【０００８】一方、HCV の遺伝子をクローニングし、フ
ァージに組み込んで酵母を宿主として発現させた抗原蛋
白は非特異な種々の抗原成分を含有していることから、
その抗原蛋白を試薬として用いて抗HCV 抗体の測定を行
う場合には、その試薬が試料中の抗HCV 抗体以外の他の
非特異な抗体成分をも認識することになり、測定結果は
必ずしも抗HCV 抗体の存在を正確に表しているとは限ら
ないことになる。このようにHCV 関連抗原を利用したこ
れまでの酵素免疫測定法によれば、抗HCV 抗体の存在を
正確に知ることができないのが現状である。

【０００９】本発明の１つの目的は抗HCV 抗体と特異的
に結合する能力を有するペプチドを提供することにあ
る。本発明の他の１つの目的は抗HCV 抗体の測定試薬を
提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、 PTNANBH
関連遺伝子にコードされるポリペプチドから選択された
ペプチド断片の中から、非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に対す
る特異性を有する抗体と特異的に結合する能力を有する
特定のペプチドを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。

【００１１】本発明によれば、上記の目的は、Lys Arg
Ser Thr Asn （配列番号：２）、Arg Arg Tyr Lys Glu
Lys Glu Lys （配列番号：４）、またはAla Ile Ile Pr
o Asp Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：６）のアミノ
酸配列を含有する、HCV 関連抗原に対して特異性を有す
る抗体と特異的に結合する能力を有するペプチドを提供
することによって達成される。

【００１２】具体的には、(I) 式（１）：Lys Asp Arg
Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys ArgSer Thr Asn Arg Arg
Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys （配列番号：
１）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそ
の断片からなるペプチドであって、該ペプチドがLys Ar
g Ser Thr Asn （配列番号：２）のアミノ酸配列を有
し、HCV 関連抗原に対して特異性を有する抗体と特異的
に結合する能力を有するペプチド、(II) 式（２）：Gl
u Lys Lys Gly Glu Ala Ser Asn Gly Glu Ala Glu Asn
Asp Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Gl
u Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys
Pro Arg （配列番号：３）で示されるアミノ酸配列を有
するペプチドまたはその断片からなるペプチドであっ
て、該ペプチドがArgArg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys
（配列番号：４）のアミノ酸配列を有し、HCV 関連抗原
に対する特異性を有する抗体と特異的に結合する能力を
有するペプチド、(III) 式（３）：Arg Val Val Leu Se
r Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu
Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln Hi
s Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met （配列番号：
５）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそ
の断片からなるペプチドであって、該ペプチドがAla Il
eIle Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：６）
のアミノ酸配列を有し、HCV 関連抗原に対する特異性を
有する抗体と特異的に結合する能力を有するペプチドで
ある。

【００１３】また、上記のペプチドからなる抗HCV 抗体
の測定試薬を提供することによって達成される。

【００１４】本明細書においては各種アミノ酸残基を次
の略号で記述する。 Ala ：Ｌ−アラニン残基 Arg ：Ｌ−アルギ
ニン残基 Asn ：Ｌ−アスパラギン残基 Asp ：Ｌ−アスパ
ラギン酸残基 Cys ：Ｌ−システイン残基 Gln ：Ｌ−グルタ
ミン残基 Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基 Gly ：グリシン残
基 His ：Ｌ−ヒスチジン残基 Ile ：Ｌ−イソロ
イシン残基 Leu ：Ｌ−ロイシン残基 Lys ：Ｌ−リシン
残基 Met ：Ｌ−メチオニン残基 Phe ：Ｌ−フェニ
ルアラニン残基 Pro ：Ｌ−プロリン残基 Ser ：Ｌ−セリン
残基 Thr ：Ｌ−トレオニン残基 Trp ：Ｌ−トリプ
トファン残基 Tyr ：Ｌ−チロシン残基 Val ：Ｌ−バリン
残基また本明細書においては、常法に従ってアミノ酸配列を
Ｎ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ
酸残基が右側に位置するように記述する。

【００１５】本発明のペプチドは、HCV 関連抗原に対し
て特異性を有する抗体と特異的に結合する能力を有する
ペプチドであり、ペプチド中に少なくともLys Arg Ser
ThrAsn （配列番号：２）、Arg Arg Tyr Lys Glu Lys G
lu Lys （配列番号：４）、またはAla Ile Ile Pro Asp
Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：６）のアミノ酸配
列を有しているものである。

【００１６】これらの部分的アミノ酸配列のうち、特に
Lys Arg Ser Thr Asn の配列（配列番号：２）をもつペ
プチドは抗原性が高く、HCV 関連抗原に特異性を有する
抗体の測定において好ましく用いられる。

【００１７】本発明のペプチドは前記の部分的アミノ酸
配列を有するものであれば、特に制限されるものではな
いが、通常10〜40個のアミノ酸からなるペプチドであ
る。

【００１８】具体的には次のようなペプチドまたはその
断片からなるペプチドが挙げられる。即ち、本発明のペ
プチドとしては、前記の式（１）で示されるアミノ酸配
列を有するペプチドまたはその断片からなるペプチドで
あって、該ペプチドがLys Arg Ser Thr Asn （配列番
号：２）のアミノ酸配列を有し、HCV 関連抗原に対して
特異性を有する抗体と特異的に結合する能力を有するペ
プチドが挙げられる。ここで断片からなるペプチドとし
ては、例えば、式（１−ａ）が例示されるが、これに限
定されるものではない。式（１−ａ）： Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser （配列番号：７）

【００１９】また、本発明のペプチドとしては、前記の
式（２）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドまた
はその断片からなるペプチドであって、該ペプチドがAr
g Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys （配列番号：４）のア
ミノ酸配列を有し、HCV 関連抗原に対して特異性を有す
る抗体と特異的に結合する能力を有するペプチドが挙げ
られる。ここで断片からなるペプチドとしては、例え
ば、式（２−ａ）、式（２−ｂ）および式（２−ｃ）が
例示されるが、これらに限定されるものではない。式（２−ａ）： Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg （配列番号：８）式（２−ｂ）： Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys （配列番号：９）式（２−ｃ）： Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala （配列番号：10）

【００２０】また、本発明のペプチドとしては、前記の
式（３）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドまた
はその断片からなるペプチドであって、該ペプチドがAl
a Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：
６）のアミノ酸配列を有し、HCV 関連抗原に対して特異
性を有する抗体と特異的に結合する能力を有するペプチ
ドが挙げられる。ここで断片からなるペプチドとして
は、例えば、式（３−ａ）、式（３−ｂ）および式（３
−ｃ）が例示されるが、これらに限定されるものではな
い。式（３−ａ）： Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met （配列番号：11）式（３−ｂ）： Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：12）式（３−ｃ）： Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：13）

【００２１】本発明のペプチドは前記のように、種々の
ものを例示することができるが、好ましくは反応の特異
性の点から式（１−ａ）のペプチドが挙げられる。本発
明のペプチドは、このようなHCV 関連抗原に対して特異
性を有する抗体と特異的に結合する能力を有するもので
ある。

【００２２】本発明のペプチドの合成は、ペプチドの合
成において通常用いられる方法、例えば、固相合成法ま
たは段階的伸長法、フラグメント縮合法のような液相合
成法により行われるが、固相合成法により行うのが操作
上簡便である［例えば、ジャーナル・オブ・ジ・アメリ
カン・ケミカル・ソサエテイ（Journal of the America
n Chemical Society) 、第85巻、第2149〜2154頁 (1963
年) ；日本生化学会編「生化学実験講座１タンパク質
の化学IV 化学修飾とペプチド合成」（昭和52年11月15
日株式会社東京化学同人発行) 、第 207〜495 頁；日
本生化学会編「続生化学実験講座２タンパク質の化学
（下）」（昭和62年５月20日株式会社東京化学同人発
行) 、第 641〜694 頁など参照］。

【００２３】本発明のペプチドの固相合成法による製造
は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体など
の反応溶媒に不溶性である重合体に、目的とするペプチ
ドのＣ末端に対応するアミノ酸またはそのアミドをそれ
らが有するα−COOH基またはα−CONH₂基からそれぞれ
水素原子を除いて得られるα−COO −基またはα−CONH
−基を介して結合させ、次いで該アミノ酸またはそのア
ミドに目的とするペプチドのＮ末端の方向に向って、対
応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸または
ペプチド断片が有するα−COOH基以外のα−アミノ基な
どの官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作
と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα
−アミノ基などのペプチド結合を形成するアミノ基が有
する保護基を除去する操作を順次繰返すことによって、
ペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応する
ペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を重合体から
脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去
することにより目的とするペプチドを得、次いでこれを
精製することによって実施される。ここで、ペプチド鎖
の重合体からの脱離および保護基の除去は、フッ化水素
を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ま
しい。また、得られたペプチドの精製は逆相液体クロマ
トグラフィーで行うのが効果的である。

【００２４】本発明のペプチドは特異的に抗HCV 抗体を
結合する能力を有するので、HCV 感染により出現する抗
HCV 抗体の検出のための測定試薬として有効である。即
ち、本発明の測定試薬は、本発明のペプチドを含んでな
るものであり、前記のような本発明のペプチドを単独で
あるいは２種以上を混合して用いられる。

【００２５】本発明のペプチドを利用した抗HCV 抗体の
測定は、蛍光免疫測定法、受身血球凝集法、放射免疫測
定法、酵素免疫測定法のいずれかを利用することによっ
て行われる。これらの方法はいずれも公知であるが、例
えば酵素免疫測定法を利用する場合について以下に説明
する。

【００２６】測定系全体の構成要素は担体、測定試薬と
しての本発明のペプチド、ブロッキング剤、被検試料、
標識用抗体、酵素および発色剤からなる。担体に本発明
のペプチドをコーティングし、次いでペプチドコーティ
ング担体にブロッキング剤を作用させて担体上の非特異
的な蛋白結合部位をブロックし、ペプチドコーティング
担体に被検試料を加えてインキュベートし、続いて酵素
標識抗体を接触させてインキュベートし、次にこのよう
に処理した担体に発色剤を加えてインキュベートし、酵
素と発色剤との反応の反応産物の生成量を吸光度計を用
いて測定する。なお、コーティングに用いられる本発明
のペプチドは１種類でも２種類以上でもよい。担体とし
てはエンザイムイムノアッセイ用カップ、またはガラス
もしくは樹脂製のビーズを用いるのが好ましい。

【００２７】測定に先立ち、本発明のペプチドを0.01M
炭酸緩衝液に溶解し、その溶液を例えばポリスチレン製
エンザイムイムノアッセイ用カップに加えたのち、４℃
で一夜または室温で３時間静置することにより、担体表
面は本発明のペプチドによってコートされる。担体上の
非特異的な蛋白結合部位をブロックするためのブロッキ
ング剤としては例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、
脱脂粉乳、抗ヒトIgG抗体または抗ヒトIgM 抗体を得る
ための免疫原動物の血清、ゼラチンなどが用いられる。
標識用抗体としては例えば、抗ヒトIgG 抗体、抗ヒトIg
M 抗体などが用いられる。また酵素としては例えば、ア
ルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなどが挙げら
れる。測定に先立ち、グルタールアルデヒドなどの２個
以上の官能基を有する化合物を用いて、標識用抗体に酵
素を結合せしめてコンジュゲートとし、測定系全体の構
成要素の一部として予め準備しておくことが好ましい。
発色剤は選択した酵素に応じて適宜使用すればよい。例
えば、酵素としてペルオキシダーゼを選択した場合には
ｏ−フェニレンジアミンなどを使用することが好まし
い。

【００２８】このように本発明によれば、抗HCV 抗体と
特異的に結合する能力を有するペプチドが提供される。
このペプチドにより、既存の抗HCV 抗体測定試薬を上回
る感度および特異性を有する抗HCV 抗体測定試薬を提供
することが可能となった。

【００２９】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例により限定されるもので
はない。

【００３０】実施例１式（１）：Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys
Arg Ser Thr Asn ArgArg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys
Lys Lys （配列番号：１）で示されるペプチドをペプ
チド自動合成装置［米国アプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems) 社製、モデル 431A (Model 431
A)］を用いて固相合成法により合成した。

【００３１】すなわち、４−［Ｎα−(t−ブトキシカル
ボニル) −Ｎε− (２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル) −Ｌ−リジルオキシメチル］フェニルアセチルアミ
ドメチル基

【化１】を0.65ミリモル／ｇ (樹脂) の割合で有するスチレン−
ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベンゼ
ンの構成モル比：99対１］からなる粒状樹脂［米国アプ
ライド・バイオシステムズ社製、PAM リジン (Lysine)
、t-Boc-L-Lys (Cl-Z)］を760 mg用い、これに表１に
示す一連の操作に従って目的とするペプチドのＮ末端の
方向に向って対応するＬ−アルギニン、Ｌ−アスパラギ
ン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニンを順
次結合させた。縮合反応において、上記のアミノ酸はそ
れぞれＮα−（ｔ−ブトキシカルボニル) −Ｎγ− (メ
シチレン−２−スルフォニル）−Ｌ−アルギニン、Ｎ−
（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−
（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸−β
−ベンジルエステル、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）
−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−
Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル、Ｎα−（ｔ
−ブトキシカルボニル）−Ｎε−（２−クロロベンジル
オキシカルボニル）−Ｌ−リジン、Ｎ−（ｔ−ブトキシ
カルボニル）−ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｎ−（ｔ−
ブトキシカルボニル）−ｏ−ベンジル−Ｌ−トレオニン
として用い、それらの使用量は基質に対して約４倍モル
量とした。

【表１】

【００３２】縮合反応は室温下で行った。アミノ酸１残
基を結合させるために要した全工程を含む反応時間は 1
00〜110 分間の範囲内であった。全てのアミノ酸につい
ての反応操作が終了したのち、得られた樹脂をグラスフ
ィルター上でジクロロメタンおよびメタノールを用いて
順次洗浄し、次いで真空乾燥することによって2.58ｇの
乾燥樹脂を得た。次に、ポリトリフルオロモノクロロエ
チレン製の反応容器 (株式会社ペプチド研究所製、HF−
反応装置Ｉ型）中で、得られた乾燥樹脂 0.7ｇをアニソ
ール1.05mlおよびエチルメチルスルフィド0.175 mlと混
合し、この混合物に−20℃の温度でフッ化水素 7.0mlを
加え、同温度で30分間、次いで０℃の温度で30分間撹拌
した。得られた反応混合物からフッ化水素、アニソール
およびエチルメチルスルフィドを減圧下に除去し、残留
物をグラスフィルター上でジエチルエーテルおよびジク
ロロメタンを用いて充分洗浄した。得られたその残留物
を２規定の酢酸水溶液で抽出し、抽出液を凍結乾燥する
ことによりペプチドの粗製物を 200mg得た。

【００３３】得られた粗製物を分取用逆相高速液体クロ
マトグラフィー［カラム：オクタデシル化シリカゲル
(粒径：15μm ) 充填カラム (内径：50mm、長さ： 300m
m) 、日本ウオーターズ社製、μBONDASPHERE 15μC18
−100 ；移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有す
るアセトニトリルと水との混合溶媒 (アセトニトリルの
濃度は30分間で10容量％から20容量％になるように漸次
変化させた) ；流速： 5ml／分；検出法：波長 210nmに
おける吸光度］で精製することによって、目的とするペ
プチドの精製物を80mg得た。得られた精製物を分析用逆
相高速液体クロマトグラフィー［カラム：オクタデシル
化シリカゲル (粒径： 5μm)充填カラム (内径： 4mm、
長さ： 150mm) 、東ソ−株式会社製、TSK-gel ODS-80T
M；移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するア
セトニトリルと水との混合溶媒 (アセトニトリルの濃度
は30分間で５容量％から50容量％になるように漸次変化
させた) ；流速：1 ml／分；検出法：波長 210nmにおけ
る吸光度］に付したところ、15.0分に単一の鋭いピーク
が示された。高速原子衝撃法 (以下、これを FAB法と略
称する) マススペクトルにより求められた精製物の分子
量は3188であった (理論値：3187.53)。

【００３４】実施例２実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（１−ａ）：Thr Lys Ar
g Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser （配列番号：７）で示
されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆相
高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付したと
ころ、14.2分に単一の鋭いピークが示された。FAB 法マ
ススペクトルにより求められたペプチドの分子量は1243
であった(理論値：1243.33)。

【００３５】実施例３実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（２−ａ）：Arg Arg Ty
r Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn AsnPro Gly L
ys Asn Lys Lys Pro Arg （配列番号：８）で示される
ペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液
体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付したところ、
22.0分に単一の鋭いピークが示された。FAB 法マススペ
クトルにより求められたペプチドの分子量は2542であっ
た (理論値：2541.85)。

【００３６】実施例４実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（２−ｂ）：Thr His Ly
s Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys（配列番
号：９）で示されるペプチドを得た。得られたペプチド
を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同
じ）に付したところ、14.3分に単一の鋭いピークが示さ
れた。FAB 法マススペクトルにより求められたペプチド
の分子量は1758であった (理論値：1758.01)。

【００３７】実施例５実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（２−ｃ）：Arg Arg Ty
r Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala （配列番号：１０）で
示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆
相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付した
ところ、14.5分に単一の鋭いピークが示された。FAB 法
マススペクトルにより求められたペプチドの分子量は13
06であった (理論値：1306.49)。

【００３８】実施例６実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（３−ａ）：Ala Ile Il
e Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu PheAsp Glu M
et Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln
Gly Met Met（配列番号：１１）で示されるペプチドを
得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体クロマト
グラフィー（前記と同じ）に付したところ、29.8分に単
一の鋭いピークが示された。FAB 法マススペクトルによ
り求められたペプチドの分子量は3785であった (理論
値：3785.19)。

【００３９】実施例７実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（３−ｂ）：Arg Val Va
l Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro AspArg Glu V
al Leu Tyr （配列番号：１２）で示されるペプチドを
得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体クロマト
グラフィー（前記と同じ）に付したところ、28.7分に単
一の鋭いピークが示された。FAB 法マススペクトルによ
り求められたペプチドの分子量は1953であった (理論
値：1953.15)。

【００４０】実施例８実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（３−ｃ）：Ala Ile Il
e Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：１３）で
示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆
相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付した
ところ、26.9分に単一の鋭いピークが示された。FAB 法
マススペクトルにより求められたペプチドの分子量は12
03であった (理論値：1203.34)。

【００４１】参考例１実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（１）で示されるアミノ
酸配列を有するペプチドのうち、Lys Arg SerThr Asn
（配列番号：２）で示されるアミノ酸配列を有しない
式：Lys Asp ArgThr Gln Gln Arg Lys Thr Lys （配列
番号：１４）で示されるペプチドを得た。得られたペプ
チドを分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と
同じ）に付したところ、11.9分に単一の鋭いピークが示
された。FAB 法マススペクトルにより求められたペプチ
ドの分子量は1290であった (理論値：1290.39)。

【００４２】参考例２実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（１）で示されるアミノ
酸配列を有するペプチドのうち、Lys Arg SerThr Asn
（配列番号：２）で示されるアミノ酸配列を有しない
式：Arg Ser ThrAsn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys
Lys Lys Lys （配列番号：１５）で示されるペプチド
を得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体クロマ
トグラフィー（前記と同じ）に付したところ、13.6分に
単一の鋭いピークが示された。FAB法マススペクトルに
より求められたペプチドの分子量は1915であった (理論
値：1915.16)。

【００４３】参考例３実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式：Glu Gln Asp Gln Ile
Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Ar
g Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys
Lys Lys （配列番号：１６）で示されるペプチドを得
た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグ
ラフィー（前記と同じ）に付したところ、24.6分に単一
の鋭いピークが示された。FAB 法マススペクトルにより
求められたペプチドの分子量は4031であった (理論値：
4031.38)。

【００４４】参考例４実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（２）で示されるアミノ
酸配列を有するペプチドのうち、Arg Arg TyrLys Glu L
ys Glu Lys （配列番号：４）で示されるアミノ酸配列
を有しない式：Glu Lys Lys Gly Glu Ala Ser Asn Gly
Glu Ala Glu Asn Asp （配列番号：１７）で示されるペ
プチドを得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体
クロマトグラフィー（前記と同じ）に付したところ、1
4.9分に単一の鋭いピークが示された。FAB 法マススペ
クトルにより求められたペプチドの分子量は1473であっ
た (理論値：1473.47)。

【００４５】参考例５実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（２）で示されるアミノ
酸配列を有するペプチドのうち、Arg Arg TyrLys Glu L
ys Glu Lys （配列番号：４）で示されるアミノ酸配列
を有しない式：Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys
Pro Arg （配列番号：１８）で示されるペプチドを得
た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグ
ラフィー（前記と同じ）に付したところ、12.6分に単一
の鋭いピークが示された。FAB 法マススペクトルにより
求められたペプチドの分子量は1253であった (理論値：
1253.38)。

【００４６】参考例６実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（２）で示されるアミノ
酸配列を有するペプチドのうち、Arg Arg TyrLys Glu L
ys Glu Lys （配列番号：４）で示されるアミノ酸配列
を有しない式：Val Gly Arg Ile Lys Asn Trp Asn Arg
Glu Gly Arg Lys Asp Ala Tyr Gln IleArg Lys Arg
（配列番号：１９）で示されるペプチドを得た。得られ
たペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグラフィー
（前記と同じ）に付したところ、19.4分に単一の鋭いピ
ークが示された。FAB 法マススペクトルにより求められ
たペプチドの分子量は2644であった (理論値：2643.9
2)。

【００４７】参考例７実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式（３）で示されるアミノ
酸配列を有するペプチドのうち、Ala Ile IlePro Asp A
rg Glu Val Leu Tyr （配列番号：６）で示されるアミ
ノ酸配列を有しない式：Arg Val Val Leu Ser Gly Lys
Pro Ala Ile Ile （配列番号：２０）で示されるペプチ
ドを得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体クロ
マトグラフィー（前記と同じ）に付したところ、26.7分
に単一の鋭いピークが示された。FAB 法マススペクトル
により求められたペプチドの分子量は1081であった (理
論値：1081.20)。

【００４８】参考例８被検試料 GPT ＞ 200IU； HBsHg(-) 血清： 65検体正常ヒト血清： 10検体酵素免疫測定法による検定各血清検体について、下記の酵素免疫測定法により抗HC
V 抗体の有無を検定した。

【００４９】すなわち、本発明者らの１人を含む数人に
よって単離されたリボ核酸からクローン化された＃８ク
ローン、＃14クローンおよび＃18クローンを持つファー
ジλgt11を含む溶液 100μl に大腸菌 Y1090株 (Escher
ichia coli Y1090) を支持菌として混合したのち、37℃
で15分間インキュベーションし、ファージを大腸菌に感
染させた。続いて、50μg ／mlのアンピシリンを含む寒
天培地に上記の混合液を植菌し、43℃で３時間培養し
た。次に、10mMのIPTG水溶液に２時間浸漬したのち風乾
して得られたニトロセルロース膜を、上記の寒天培地上
に載せ、37℃で３時間インキュベーションした。こうし
て得られたニトロセルロース膜を150mMNaCl を含む10mM
トリス塩酸 (pH7.5) (以下、これをTS Buffer と略称す
る) で３回洗浄し、次いで 500mM NaCl および３％ゼラ
チンを含む20mMトリス塩酸 (pH7.5)中で室温で一晩振盪
して膜上の非特異的な蛋白結合部位をブロックした。続
いて、TS Buffer 中で２分間振盪して膜を洗浄した。血
清検体を１％ゼラチンを含むTS Buffer で希釈して得ら
れた溶液中に、上記で得られたニトロセルロース膜を浸
漬し、室温で３時間振盪した。こうして得られたニトロ
セルロース膜を0.05％Tween20 を含むTS Buffer (以
下、これを TS-T Bufferと略称する) 中で室温で５分間
振盪し、この操作を５回繰り返した。続いて、ヤギ抗ヒ
トIgG 抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１％ゼ
ラチンを含むTS Buffer で至適濃度に希釈したもの）中
にニトロセルロース膜を浸漬し、室温で 1.5時間振盪し
た。こうして得られたニトロセルロース膜を TS-T Buff
er中で室温で５分間振盪し、この操作を５回繰り返し
た。

【００５０】次に、0.05％ HRP-color (バイオラッド社
製) 、0.05％Ｈ₂Ｏ₂、17％メタノールを含むTS Buffe
r でニトロセルロース膜を振盪し、発色反応を行ったの
ち、蒸留水中で室温で５分間振盪し、この操作を５回繰
り返した。風乾後、発色の有無により、用いた血清中の
抗HCV 抗体の有無を検定した。

【００５１】なお、＃８クローンの塩基配列（配列番
号：21）は、次のとおりである。 GAATTCCAAA AAGAGCAAAA CAAACCGCCG AAGAAAAAAC TAATAAGAGA AGAAAAGGCG 60 AAGAGACACA GGAAAAAAAA AACAGAGACG AAGGTCAGAT AGAAAAAAAG CAAGGAATTC 120 ＃14クローンの塩基配列（配列番号：22）は、次のとお
りである。 GAATTCCGAG AACAAGACCA GATAAAAACC AAAGACAGAA CACAACAGAG AAAGACGAAA 60 AGAAGCACCA ATCGCAGGCG AAGCAAAAAC GAAAAAAAAA AAAAAAAGGA ATTC 114 ＃18クローンの塩基配列（配列番号：23）は、次のとお
りである。 GAATTCCAAG AAAAAAAGGG AGAAGCCAGC AATGGAGAAG CCGAAAACGA CACACACAAG 60 AAACAAAGGA GGTACAAAGA AAAAGAAAAA ACGGCAACAA ATAACCCAGG AAAGAACAAA 120 AAGCCAAGAG TGGGCAGAAT AAAAAACTGG AACCGGGAGG GAAGGAAGGA CGCATATCAG 180 ATTAGAAAAA GGAGGGAATT C 201

【００５２】結果検定結果を表２に示す。その結果より被検試料である G
PT＞200IU ；HBsHg(-)血清65検体は３群に分類できるこ
とが判った。すなわち、＃14クローンおよび＃18クロー
ンの２つにおいて陽性と判定された群Ａ、＃８クロー
ン、＃14クローンおよび＃18クローンの３つにおいて陽
性と判定された群Ｂならびに＃８クローン、＃14クロー
ンおよび＃18クローンのいずれにおいても陰性と判定さ
れた群Ｃの３群である。

【表２】

【００５３】実施例９被検試料参考例８の結果分類された各血清を用いた。 GPT ＞ 200IU； HBsAg(-) 血清Ａ： 30検体 GPT ＞ 200IU； HBsAg(-) 血清Ｂ： 15検体 GPT ＞ 200IU； HBsAg(-) 血清Ｃ： 20検体正常ヒト血清Ｄ： 10検体

【００５４】酵素免疫測定法による検定各血清検体について、下記の酵素免疫測定法により吸光
度を測定し、抗HCV 抗体の有無を検定した。

【００５５】すなわち、抗原物質として実施例１、実施
例２、参考例１、参考例２および参考例３で得られたペ
プチドをそれぞれ0.01M 炭酸緩衝液 (pH9.5)に溶解し、
得られたペプチド溶液をポリスチレン製エンザイムイム
ノアッセイ用カップ (ダイナテック社製) に各 100μl
づつ加えたのち、４℃で12時間静置することにより、ペ
プチドによるコーティングを行った。次いで、得られた
アッセイ用カップに含まれるペプチド溶液を除去したの
ち、それらのカップに20容量％の正常ヤギ血清を含む0.
01M リン酸緩衝生理食塩水 (以下、これを PBSと略称す
る) 150 μl を加えて室温で３時間静置し、非特異的な
蛋白結合部位をブロックした。次いで、ブロッキングに
用いた20容量％の正常ヤギ血清を含む PBSを除いたの
ち、各アッセイ用カップを乾燥させた。

【００５６】血清希釈用溶液として10容量％の正常ヤギ
血清を含む PBSを上記の各アッセイ用カップに 100μl
づつ加えたのち、各被検血清(GPT＞ 200IU； HBsAg(-)
血清Ａ30検体、GPT ＞ 200IU； HBsAg(-) 血清Ｂ15検
体、GPT ＞ 200IU； HBsAg(-)血清Ｃ20検体および正常
ヒト血清Ｄ10検体) を血清希釈用溶液と被検血清の割合
が20対１（容量比）となるように加えた。37℃で１時間
インキュベーション後、それらのカップを0.05容量％の
Tween20 を含む PBSで３回洗浄した。

【００５７】得られた各アッセイ用カップに、ヤギ抗ヒ
トIgG 抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート（10容量
％の正常ヤギ血清を含む PBSで至適濃度に希釈したも
の)100μl を加えた。37℃で30分間インキュベーション
後、それらのカップを0.05容量％のTween20 を含む PBS
で３回洗浄した。続いて、得られた各アッセイ用カップ
に発色剤（ｏ−フェニレンジアミンを 0.3重量％となる
ように0.02容量％の過酸化水素を含む0.1Mクエン酸−リ
ン酸緩衝液 pH5.6に溶解したもの)100μl を加えた。室
温で15分間静置したのち、2N硫酸 100μl を加えて反応
を停止し、反応液の 492nmの吸光度OD₄₉₂値を測定し
た。

【００５８】結果測定結果を表３、表４、表５および表６に示す。表３、
表４、表５および表６は実施例１〜２および参考例１〜
３で得られたペプチドを用いた酵素免疫測定法でそれぞ
れ血清Ａ、血清Ｂ、血清Ｃおよび血清Ｄを測定した場合
のそれぞれの測定結果を示す。さらに正常ヒト血清Ｄ10
検体のOD₄₉₂値よりカットオフ値を設定し、抗HCV 抗体
陽性・陰性の判定を行った。カットオフ値は、((正常ヒ
ト血清のOD₄₉₂値の平均値) ＋ 2SD) の計算式により求
めた。

【００５９】表３、表４、表５、表６に基づいて計算し
たカットオフ値により、実施例１〜２および参考例１〜
３のペプチドのそれぞれのOD₄₉₂値の分布を図１〜図５
に示す。表３、表４、表５および表６と上記のカットオ
フ値により算出した陽性率を表７に示す。表７より、実
施例１で得られたペプチドによる酵素免疫測定法を実施
した場合、血清Ａ、血清Ｂ、血清Ｃおよび正常ヒト血清
Ｄではそれぞれ93.3％、93.3％、10.0％、０％の陽性率
を示した。実施例２で得られたペプチドによる酵素免疫
測定法を実施した場合、血清Ａ、血清Ｂ、血清Ｃおよび
正常ヒト血清Ｄではそれぞれ96.7％、93.3％、０％、０
％の陽性率を示し、これらのペプチドを用いた酵素免疫
測定法は、参考例８に示したイムノスクリーニング法と
高い相関があることが判った。

【００６０】参考例１および参考例２で得られたペプチ
ドによる酵素免疫測定法を実施した場合、血清Ａ、血清
Ｂ、血清Ｃさらに正常ヒト血清Ｄのいずれにおいても約
10.0％の陽性率を示し、これらのペプチドを用いた酵素
免疫測定法は感度および特異性が不良であることが判っ
た。また、本発明者らの１人を含む数人によって単離、
クローニングされたクローン中から選ばれた１つのクロ
ーンをアミノ酸に翻訳したペプチドの全アミノ酸配列か
らなるペプチドである、参考例３で得られたペプチドに
よる酵素免疫測定法を実施した場合、血清Ａ、血清Ｂお
よび血清Ｃではそれぞれ93.3％、93.3％、０％の陽性率
を示したが、正常ヒト血清Ｄでは10.0％の陽性率を示
し、偽陽性が生じることが判った。実施例１または実施
例２で得られたペプチドを用いた酵素免疫測定法と比較
すると特異性および感度がより不良であることが判っ
た。以上の結果より、実施例１および実施例２で得られ
たペプチドを用いることによって、有効な抗HCV 抗体の
有無の判定がなされることが示された。

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【００６１】実施例１０実施例９におけると同様な方法で、抗原物質として実施
例３、実施例４、実施例５、参考例４、参考例５および
参考例６で得られたペプチドを用いて酵素免疫測定法に
よる検定を行った。

【００６２】測定結果を表８、表９、表１０および表１
１に示す。また、陽性率を表１２に示す。また、それぞ
れのOD₄₉₂値を図６〜図１１に示す。表１２より、実施
例３または実施例５で得られたペプチドによる酵素免疫
測定法を実施した場合、血清Ａおよび血清Ｂでは陽性率
はそれぞれ96.7％または100 ％を示し、血清Ｃおよび正
常ヒト血清Ｄでは０％または非常に低い陽性率を示し、
これらのペプチドを用いた酵素免疫測定法は高い感度と
特異性を有することが判った。また、実施例４で得られ
たペプチドによる酵素免疫測定法を実施した場合、血清
Ａ、血清Ｂ、血清Ｃおよび血清Ｄではそれぞれ36.7％、
53.3％、5.0 ％、0.0 ％の陽性率を示し、用いたペプチ
ドは実施例３および実施例５で得られたペプチドの有す
る抗原性とは異なる抗原性を有することが明らかにされ
た。

【００６３】さらに、参考例４〜６で得られたペプチド
による酵素免疫測定法を実施した場合、血清Ａ、血清
Ｂ、血清Ｃおよび血清Ｄでは０％または非常に低い陽性
率を示し、これらのペプチドを用いた酵素免疫測定法は
感度および特異性が不良であることが判った。以上の結
果より、実施例３、実施例４および実施例５で得られた
ペプチドを用いることによって、有効な抗HCV 抗体の有
無の判定がなされることが示された。

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【００６４】実施例１１実施例９におけると同様な方法で、抗原物質として実施
例６、実施例７、実施例８および参考例７で得られたペ
プチドを用いて酵素免疫測定法による検定を行った。

【００６５】測定結果を表１３、表１４、表１５および
表１６に示す。また、陽性率を表１７に示す。また、そ
れぞれのOD₄₉₂値を図１２〜図１５に示す。表１７よ
り、実施例６で得られたペプチドによる酵素免疫測定法
を実施した場合、血清Ａ、血清Ｂ、血清Ｃおよび正常ヒ
ト血清Ｄではそれぞれ33.3％、40.0％、0 ％、0 ％の陽
性率を示した。実施例７で得られたペプチドによる酵素
免疫測定法を実施した場合、血清Ａ、血清Ｂ、血清Ｃお
よび正常ヒト血清Ｄではそれぞれ50.0％、66.7％、5.0
％、0 ％の陽性率を示した。さらに、実施例８で得られ
たペプチドによる酵素免疫測定法を実施した場合、血清
Ａ、血清Ｂ、血清Ｃおよび正常ヒト血清Ｄではそれぞれ
23.3％、93.3％、5.0 ％、10.0％、の陽性率を示した。
これらのペプチドを用いた酵素免疫測定法は、本発明者
らの１人を含む数人によって単離されたリボ核酸からク
ローン化された＃８クローン、＃１４クローンおよび＃
１８クローンを用いた参考例８に示したイムノスクリー
ニング法と高い相関があることが判った。

【００６６】また、参考例７で得られたペプチドによる
酵素免疫測定法を実施した場合、血清Ａ、血清Ｂ、血清
Ｃおよび血清Ｄではそれぞれ13.3％、13.3％、5.0 ％、
0.0％の陽性率を示し、用いたペプチドは実施例６、実
施例７および実施例８で得られたペプチドの有する抗原
性とは異なる抗原性を有することが明らかにされた。以
上の結果より、実施例６、実施例７および実施例８で得
られたペプチドを用いることによって、有効な抗HCV 抗
体の有無の判定がなされることが示された。

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【００６７】実施例１２被検試料表１８に用いた血清検体の由来する疾患名と検体数を示
した。

【表１８】

【００６８】酵素免疫測定法による検定表１８に示した各血清検体について、下記の酵素免疫測
定法により吸光度を測定し、抗HCV 抗体の有無を検定し
た。

【００６９】すなわち、実施例９におけると同様な方法
で抗原物質として実施例１、実施例２、参考例１、参考
例２および参考例３で得られたペプチドをアッセイ用マ
イクロカップにコーティングし、表１８に示した各血清
検体との反応を行い、発色剤から生成した色素を含む反
応液の 492nmの吸光度OD₄₉₂値を測定した。

【００７０】結果測定結果を表１９および表２０に示す。表１９は実施例
１〜２、表２０は参考例１〜３で得られたペプチドを用
いた酵素免疫測定法により表１８に示した各血清検体を
検定した場合のそれぞれの測定結果を示す。さらに正常
者血清10検体のOD₄₉₂値よりカットオフ値を設定し、抗
HCV 抗体陽性・陰性の判定を行った。カットオフ値は、
((正常者血清のOD₄₉₂値の平均値) ＋ 2SD) の計算式に
より求めた。

【００７１】表１９および表２０の正常者血清検体の測
定値に基づいて計算したカットオフ値により、陽性また
は陰性の区別を判定した結果を表１９および表２０中に
示した。表１９より、実施例１で得られたペプチドによ
る酵素免疫測定法を実施した場合、散発性非Ａ非Ｂ型の
急性肝炎・回復期および慢性肝炎、ならびに輸血後非Ａ
非Ｂ型の急性肝炎・極期および慢性肝炎の患者血清は抗
HCV 抗体が陽性と判定され、アルコール性肝炎患者血
清、Ｂ型肝炎患者血清および正常者血清では抗HCV 抗体
は陰性と判定された。実施例２で得られたペプチドによ
る酵素免疫測定法を実施した場合、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎
患者血清では抗HCV 抗体が陽性と判定され、アルコール
性肝炎患者血清、Ｂ型肝炎患者血清および正常者血清で
は抗HCV 抗体は陰性と判定された。以上のことから実施
例１および実施例２で得られたペプチドを用いた酵素免
疫測定法は非Ａ非Ｂ型肝炎の早期診断に有用であること
が判った。

【００７２】また、表２０より参考例１、参考例２およ
び参考例３で得られたペプチドによる酵素免疫測定法を
実施した場合、非Ａ非Ｂ型肝炎の患者血清で抗HCV 抗体
が陰性と判定される場合があり、また、Ｂ型肝炎患者血
清および正常者血清で抗HCV抗体が陽性と判定される場
合があり、特異性および感度が不良であった。すなわ
ち、参考例１、参考例２および参考例３で得られたペプ
チドを用いた酵素免疫測定法による判定結果は偽陰性お
よび偽陽性を含み、このペプチドを用いた非Ａ非Ｂ型肝
炎の診断効率は不良であることが判った。以上の結果よ
り、実施例１および実施例２で得られたペプチドを用い
ることによって、有効な抗HCV 抗体の有無の判定がなさ
れることが示された。

【表１９】

【表２０】

【００７３】実施例１３実施例１２におけると同様な方法で、表１８に示した各
血清検体について、抗原物質として実施例３、実施例
４、実施例５、参考例４、参考例５および参考例６で得
られたペプチドを用いて酵素免疫測定法により吸光度を
測定し、抗HCV 抗体の有無を検定した。

【００７４】測定結果を表２１および表２２に示す。表
２１は実施例３〜５、表２２は参考例４〜６で得られた
ペプチドを用いた酵素免疫測定法により表１８に示した
各血清検体を検定した場合のそれぞれの測定結果を示
す。さらに正常者血清10検体のOD₄₉₂値よりカットオフ
値を設定し、抗HCV 抗体陽性・陰性の判定を行った。カ
ットオフ値は、((正常者血清のOD₄₉₂値の平均値) ＋ 2
SD) の計算式により求めた。

【００７５】表２１および表２２の正常者血清検体の測
定値に基づいて計算したカットオフ値により、陽性また
は陰性の区別を判定した結果を表２１および表２２中に
示した。表２１より、実施例３および実施例５で得られ
たペプチドによる酵素免疫測定法を実施した場合、非Ａ
非Ｂ型肝炎の急性・回復期患者の血清および非Ａ非Ｂ型
慢性肝炎の患者の血清では抗HCV 抗体は陽性と判定され
た。さらに、アルコール性肝炎患者血清、Ｂ型肝炎患者
血清および正常者血清では抗HCV 抗体は陰性と判定さ
れ、これらのペプチドを用いた酵素免疫測定法は上記の
患者の診断に有用であることが判った。また実施例４で
得られたペプチドによる酵素免疫測定法を実施した場
合、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎の患者の血清でのみ特異的に抗
HCV 抗体が陽性と判定され、上記の患者の診断に有用で
あることが判った。

【００７６】さらに、表２２より参考例４〜６で得られ
たペプチドによる酵素免疫測定法を実施した場合、表１
８の疾患を有する患者血清においても抗HCV 抗体が陰性
と判定される場合があり、さらに、正常者血清において
も抗HCV 抗体が陽性と判定される場合があるため、これ
らのペプチドを用いた酵素免疫測定法による判定結果は
偽陽性および偽陰性を含み、これらのペプチドを用いた
非Ａ非Ｂ型肝炎の診断効率は不良であることが判った。
以上の結果より、実施例３、実施例４および実施例５で
得られたペプチドを用いることによって、有効な抗HCV
抗体の有無の判定がなされることが示された。

【表２１】

【表２２】

【００７７】実施例１４実施例１２におけると同様な方法で、表１８に示した各
血清検体について、抗原物質として実施例６、実施例
７、実施例８および参考例７で得られたペプチドを用い
て酵素免疫測定法により吸光度を測定し、抗HCV 抗体の
有無を検定した。

【００７８】測定結果を表２３に示す。表２３は実施例
６〜８および参考例７で得られたペプチドを用いた酵素
免疫測定法により表１８に示した各血清検体を検定した
場合のそれぞれの測定結果を示す。さらに正常者血清10
検体のOD₄₉₂値よりカットオフ値を設定し、抗HCV 抗体
陽性・陰性の判定を行った。カットオフ値は、((正常者
血清のOD₄₉₂値の平均値) ＋ 2SD) の計算式により求め
た。

【００７９】表２３の正常者血清検体の測定値に基づい
て計算したカットオフ値により、陽性または陰性の区別
を判定した結果を表２３中に示した。表２３より、実施
例６で得られたペプチドによる酵素免疫測定法を実施し
た場合、散発性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎の患者の血清で抗HC
V 抗体が陽性と判定され、PTNANBH 急性期・回復期およ
び慢性肝炎はすべてが陽性と判定された。さらに、アル
コール性肝炎患者血清、Ｂ型肝炎患者血清および正常者
血清では抗HCV 抗体は陰性と判定された。以上のことか
ら、実施例６で得られたペプチドを用いた酵素免疫測定
法は非Ａ非Ｂ型肝炎の早期診断に有用であることが判っ
た。また、実施例７および実施例８で得られたペプチド
による酵素免疫測定法を実施した場合、非Ａ非Ｂ型慢性
肝炎回復期の患者および慢性肝炎患者の血清で特異的に
抗HCV 抗体が陽性と判定され、上記の患者の診断に有用
であることが判った。

【００８０】参考例７で得られたペプチドを用いた酵素
免疫測定法を実施した場合、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清は
いずれも陰性と判定され、また、アルコール性肝炎およ
びＢ型肝炎患者血清で陽性と判定された場合があった。
すなわち、参考例７で得られたペプチドを用いた酵素免
疫測定法による判定結果は偽陰性および偽陽性を含み、
このペプチドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎の診断効率は不良
であることが判った。以上の結果より、実施例６、実施
例７および実施例８で得られたペプチドを用いることに
よって、有効な抗HCV 抗体の有無の判定がなされること
が示された。

【表２３】

【００８１】実施例１５被検試料献血者血清： 2476検体酵素免疫測定法による検定

【００８２】各血清検体について、下記の酵素免疫測定
法により吸光度を測定し、抗HCV 抗体の有無を検体し
た。

【００８３】すなわち、抗原物質として実施例１で得ら
れたペプチドをそれぞれ0.01M 炭酸緩衝液 (pH9.5)に溶
解し、得られたペプチド溶液をポリスチレン製エンザイ
ムイムノアッセイ用カップ (ダイナテック社製) に各 1
00μl づつ加えたのち、４℃で12時間静置することによ
り、ペプチドによるコーティングを行った。次いで、そ
れらのカップを0.05容量％のTween20 を含む PBSで３回
洗浄した。続いて、それらのカップに20容量％の正常ヤ
ギ血清を含む PBS 150μl を加えて室温で３時間静置
し、非特異的な蛋白結合部位をブロックした。次いで、
ブロッキングに用いた20容量％の正常ヤギ血清を含む P
BSを除いたのち、各アッセイ用カップを乾燥させた。

【００８４】血清希釈用溶液として10容量％の正常ヤギ
血清を含む PBSを上記の各アッセイ用カップに 100μl
づつ加えたのち、各被検血清を血清希釈用溶液と被検血
清の割合が20対１（容量比) となるように加えた。37℃
で１時間インキュベーション後、それらのカップを0.05
容量％のTween20 を含む PBSで３回洗浄した。

【００８５】得られた各アッセイ用カップに、ヤギ抗ヒ
トIgG 抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート（10容量
％の正常ヤギ血清を含む PBSで至適濃度に希釈したも
の)100μl を加えた。37℃で30分間インキュベーション
後、それらのカップを0.05容量％のTween20 を含む PBS
で３回洗浄した。続いて、得られた各アッセイ用カップ
に発色剤（ｏ−フェニレンジアミンを 0.3重量％となる
ように0.02容量％の過酸化水素を含む0.1Mクエン酸−リ
ン酸緩衝液 pH5.6に溶解したもの)100μl を加えた。室
温で15分間静置したのち、2N硫酸 100μl を加えて反応
を停止し、反応液の 492nmの吸光度OD₄₉₂値を測定し
た。

【００８６】結果実施例１で得られたペプチドによる抗HCV 抗体の阻害試
験の結果、カットオフ値を設定した。上記の測定結果に
基づいて、OD₄₉₂値が 0.5以上であるものを抗HCV 抗体
陽性とし、0.5 未満であるものを陰性と判定した結果を
表２４に示す。なお、表２４に上記の献血者血清2476検
体について市販の抗HCV 抗体測定試薬 (オーソ社製) を
用いて EIA法およびRIBA法による判定を行った結果を併
せて示す。

【表２４】

【００８７】表２４から明らかなように、市販の抗HCV
抗体測定試薬によって陰性と判定された2462検体のうち
35検体は、実施例１で得られたペプチドで測定した抗HC
V 抗体の判定では陽性と判定された。また、市販の抗HC
V 抗体測定試薬によって陽性と判定された14検体は、実
施例１で得られたペプチドで測定した抗HCV 抗体の判定
ではいずれも陽性と判定された。

【００８８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg 1 5 10 15 Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys 20 25

【００８９】配列番号：２配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００９０】配列番号：３配列の長さ：４０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Glu Lys Lys Gly Glu Ala Ser Asn Gly Glu Ala Glu Asn Asp Thr His 1 5 10 15 Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn 20 25 30 Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg 35 40

【００９１】配列番号：４配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００９２】配列番号：５配列の長さ：３９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val 1 5 10 15 Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro 20 25 30 Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met 35

【００９３】配列番号：６配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００９４】配列番号：７配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００９５】配列番号：８配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys 1 5 10 15 Asn Lys Lys Pro Arg 20

【００９６】配列番号：９配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys 1 5 10

【００９７】配列番号：１０配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００９８】配列番号：１１配列の長さ：３１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met 1 5 10 15 Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met 20 25 30

【００９９】配列番号：１２配列の長さ：１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val 1 5 10 15 Leu Tyr

【０１００】配列番号：１３配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１０１】配列番号：１４配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１０２】配列番号：１５配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15

【０１０３】配列番号：１６配列の長さ：３２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Glu Gln Asp Gln Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr 1 5 10 15 Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys 20 25 30

【０１０４】配列番号：１７配列の長さ：１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Glu Lys Lys Gly Glu Ala Ser Asn Gly Glu Ala Glu Asn Asp 1 5 10

【０１０５】配列番号：１８配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１０６】配列番号：１９配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Val Gly Arg Ile Lys Asn Trp Asn Arg Glu Gly Arg Lys Asp Ala Tyr 1 5 10 15 Gln Ile Arg Lys Arg 20

【０１０７】配列番号：２０配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１０８】配列番号：２１配列の長さ：１２０配列の型：核酸鎖の数：不明トポロジー：不明配列の種類：cDNA to genomic RNA フラグメント型：中間部フラグメント起源固体・単離クローン名：＃８クローン組織の種類：ヒト血清配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１２０特徴を決定した方法：Ｅ配列 GAATTCCAAA AAGAGCAAAA CAAACCGCCG AAGAAAAAAC TAATAAGAGA AGAAAAGGCG 60 AAGAGACACA GGAAAAAAAA AACAGAGACG AAGGTCAGAT AGAAAAAAAG CAAGGAATTC 120

【０１０９】配列番号：２２配列の長さ：１１４配列の型：核酸鎖の数：不明トポロジー：不明配列の種類：cDNA to genomic RNA フラグメント型：中間部フラグメント起源固体・単離クローン名：＃１４クローン組織の種類：ヒト血清配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１１４特徴を決定した方法：Ｅ配列 GAATTCCGAG AACAAGACCA GATAAAAACC AAAGACAGAA CACAACAGAG AAAGACGAAA 60 AGAAGCACCA ATCGCAGGCG AAGCAAAAAC GAAAAAAAAA AAAAAAAGGA ATTC 114

【０１１０】配列番号：２３配列の長さ：２０１配列の型：核酸鎖の数：不明トポロジー：不明配列の種類：cDNA to genomic RNA フラグメント型：中間部フラグメント起源固体・単離クローン名：＃１８クローン組織の種類：ヒト血清配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．２０１特徴を決定した方法：Ｅ配列 GAATTCCAAG AAAAAAAGGG AGAAGCCAGC AATGGAGAAG CCGAAAACGA CACACACAAG 60 AAACAAAGGA GGTACAAAGA AAAAGAAAAA ACGGCAACAA ATAACCCAGG AAAGAACAAA 120 AAGCCAAGAG TGGGCAGAAT AAAAAACTGG AACCGGGAGG GAAGGAAGGA CGCATATCAG 180 ATTAGAAAAA GGAGGGAATT C 201

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図２】図２は実施例２で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図３】図３は参考例１で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図４】図４は参考例２で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図５】図５は参考例３で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図６】図６は実施例３で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図７】図７は実施例４で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図８】図８は実施例５で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図９】図９は参考例４で得られたペプチドを用いて実
施例９に記載された方法により測定した各血清検体が与
えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図１０】図１０は参考例５で得られたペプチドを用い
て実施例９に記載された方法により測定した各血清検体
が与えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図１１】図１１は参考例６で得られたペプチドを用い
て実施例９に記載された方法により測定した各血清検体
が与えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図１２】図１２は実施例６で得られたペプチドを用い
て実施例９に記載された方法により測定した各血清検体
が与えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図１３】図１３は実施例７で得られたペプチドを用い
て実施例９に記載された方法により測定した各血清検体
が与えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図１４】図１４は実施例８で得られたペプチドを用い
て実施例９に記載された方法により測定した各血清検体
が与えたOD₄₉₂値の分布図である。

【図１５】図１５は参考例７で得られたペプチドを用い
て実施例９に記載された方法により測定した各血清検体
が与えたOD₄₉₂値の分布図である。尚、これらの図にお
いて、各記号は次のことを示す。

【符号の説明】

●： GPT＞200IU; HBsAg(-)血清Ａが与えたOD₄₉₂値 ○： GPT＞200IU; HBsAg(-)血清Ｂが与えたOD₄₉₂値 ×： GPT＞200IU; HBsAg(-)血清Ｃが与えたOD₄₉₂値

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/29 8413−4ＣＧ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2ＪＣ０７Ｋ 99:00 (31)優先権主張番号特願平2−296899 (32)優先日平２(1990)10月31日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (72)発明者難波敏彦岡山県倉敷市酒津1660 (72)発明者辻正男岡山県倉敷市水江１−１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 Lys Arg Ser Thr Asn （配列番号：
２）、Arg Arg Tyr LysGlu Lys Glu Lys （配列番号：
４）、またはAla Ile Ile Pro Asp Arg Glu ValLeu Tyr
（配列番号：６）のアミノ酸配列を含有する、非Ａ非
Ｂ型肝炎関連抗原に対して特異性を有する抗体と特異的
に結合する能力を有するペプチド。
【請求項２】式（１）：Lys Asp Arg Thr Gln Gln Ar
g Lys Thr Lys ArgSer Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys A
sn Glu Lys Lys Lys Lys （配列番号：１）で示される
アミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチドまたはそ
の断片からなるペプチドであって、該ペプチドが Lys A
rg Ser Thr Asn（配列番号：２）のアミノ酸配列を有
し、非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に対して特異性を有する抗
体と特異的に結合する能力を有する請求項１記載のペプ
チド。
【請求項３】式（２）：Glu Lys Lys Gly Glu Ala Se
r Asn Gly Glu AlaGlu Asn Asp Thr His Lys Lys Gln A
rg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr AlaThr Asn Asn
Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg （配列番号：３）で
示されるアミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチド
またはその断片からなるペプチドであって、該ペプチド
がArg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys （配列番号：４）
のアミノ酸配列を有し、非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に対す
る特異性を有する抗体と特異的に結合する能力を有する
請求項１記載のペプチド。
【請求項４】式（３）：Arg Val Val Leu Ser Gly Ly
s Pro Ala Ile IlePro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg G
lu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser GlnHis Leu Pro
Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met （配列番号：５）で示さ
れるアミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチドまた
はその断片からなるペプチドであって、該ペプチドがAl
a Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：
６）のアミノ酸配列を有し、非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に
対する特異性を有する抗体と特異的に結合する能力を有
する請求項１記載のペプチド。
【請求項５】式（１）：Lys Asp Arg Thr Gln Gln Ar
g Lys Thr Lys ArgSer Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys A
sn Glu Lys Lys Lys Lys （配列番号：１）で示される
請求項２記載のペプチド。
【請求項６】式（１−ａ）：Thr Lys Arg Ser Thr As
n Arg Arg Arg Ser（配列番号：７）で示される請求項
２記載のペプチド。
【請求項７】式（２−ａ）：Arg Arg Tyr Lys Glu Ly
s Glu Lys Thr AlaThr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys L
ys Pro Arg （配列番号：８）で示される請求項３記載
のペプチド。
【請求項８】式（２−ｂ）：Thr His Lys Lys Gln Ar
g Arg Tyr Lys GluLys Glu Lys （配列番号：９）で示
される請求項３記載のペプチド。
【請求項９】式（２−ｃ）：Arg Arg Tyr Lys Glu Ly
s Glu Lys Thr Ala（配列番号：１０）で示される請求
項３記載のペプチド。
【請求項１０】式（３−ａ）：Ala Ile Ile Pro Asp
Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Gl
u Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met
Met （配列番号：１１）で示される請求項４記載のペプ
チド。
【請求項１１】式（３−ｂ）：Arg Val Val Leu Ser
Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Ty
r （配列番号：１２）で示される請求項４記載のペプチ
ド。
【請求項１２】式（３−ｃ）：Ala Ile Ile Pro Asp
Arg Glu Val Leu Tyr （配列番号：１３）で示される請
求項４記載のペプチド。
【請求項１３】請求項１〜１２のいずれかに記載のペ
プチドを含有してなる非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に特異性
を有する抗体の測定試薬。