JPH05268973A

JPH05268973A - 新規ベクター

Info

Publication number: JPH05268973A
Application number: JP4198282A
Authority: JP
Inventors: Pamela Hope Gamel; パメラ・ホープ・ゲイメル; Jean-Christophe Piot; ジャン−クリストフ・ピオット
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1993-10-19
Also published as: CA2074538A1; MX9204348A; AU2050192A; AU658203B2; BR9202803A; EP0537105A1; TW242163B; RU2114909C1

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は、バシルス・スリンジエンシス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）プラス
ミドから単離される複製起点、これらの複製起点を含む
プラスミドベクター、クローニングにおけるこれらの用
途及びそれによって得られる形質転換菌株に関するもの
である。【効果】元のプラスミドを置換することなく安定にバ
シルス・スリンジエンシス菌株を形質転換する際の使用
のためのベクターの調製に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バシルス・スリンジエ
ンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ）プラスミドから単離される複製起点、これらの複製
起点を含むプラスミドベクター、クローニングにおける
これらの用途及びそれによって得られる形質転換菌株に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】一般に
生物学的殺虫剤、特にバシルス・スリンジエンシス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂ．
ｔ．）を基礎とする産物は、近年、これらが天然に存在
する事、そしてこれらの宿主特異性が高い事のために、
広範囲スペクトルの化学的農薬に対する特殊な代替品と
しての用途が増加しつつある事が見いだされている。係
る物質の受け入れが増加することにより、同時に標的の
有害生物に対する活性のスペクトル、及び非標的昆虫を
容赦する能力の点での、より洗練された要求が起こって
きた。この成果を達成する様々な方法、例えば、突然変
異が自然発生的または誘発された、毒素をコードしてい
る突然変異を受けた遺伝子を含む菌株の分離（英国特許
出願２２１６１２７Ａ号参照）、または、天然に存在す
る菌株もしくは突然変異菌株を接合して、異なったまた
は相補的な宿主特異性を有する両親の菌株由来のプラス
ミドを含むハイブリッド菌株を生み出す（米国特許４７
９７２７９号参照）、といったような方法が知られてい
る。これら各々の方法は、突然変異が予測不可能である
こと、そして全菌株が供与体として挙動し得ないこと、
及び全プラスミドが或る菌株から別の菌株へとうまく移
動し得ないこと、といったような、欠点及び制限を有す
る。

【０００３】この事により、結晶蛋白毒素または他の所
望蛋白を発現する遺伝子を、柔軟な且つ制御された様式
で宿主細胞中に導入する組み替えＤＮＡ技術の使用が増
加してきた。例えば、電気穿孔または電気的形質転換と
いったような技術を用いるＢ．ｔ．菌株の形質転換の使
用が拡大している（ボア及びエラン、ＦＥＭＳ、マイク
ロバイオロジー・レターズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ）５８（１９８９）１７１−１７８；
英国特許出願２２１９８０６Ａ号及びＥＰ特許出願４３
３９４５Ａ号；バウム等、アプライド・アンド・エンバ
イアランメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）５６巻（１
１）３４２０−２８、１９９０年１１月参照）。上記参
考文献に詳細に述べられているように、結晶蛋白毒素の
産生、調節、活性、（程度／スペクトル）等に有利に影
響し、または、他の望ましい蛋白遺伝子を導入するため
の、Ｂ．ｔ．菌株の操作を成功させるための重要な要素
は、所望の遺伝学的物質を宿主菌株中に移入させるため
の適当なクローニングベクターの取得可能性である。
Ｂ．ｔ．の形質転換に現在までに使用されているベクタ
ーの性質及び目的についての一般的議論は、上記引用文
献及びミテーバ等（１９８８、アーカイブズ・オブ・マ
イクロバイオロジー、第１５０巻４９６−４９８）に記
載されている。

【０００４】しかしながら、今まで、異種の遺伝学的材
料を導入するための成功したＢ．ｔ．菌株の形質転換
は、Ｂ．ｔ．由来のＤＮＡに加えて、大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）（ＥＰ４３３９４５Ａ号参照）、バシルス・セレ
ウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）（ＧＢ２２１
９８０６Ａ号参照）等のような異種生物由来のＤＮＡを
かなりの量含むプラスミドベクターを使用してきた。異
種生物由来のＤＮＡの存在は、宿主菌株内での安定性の
問題を招き得、そしてさらに、その種に固有のＤＮＡを
主としてまたは単独で含む形質転換生物を得ることがよ
り望ましいことは明らかである。バウム等（アプライド
・アンド・エンバイアランメンタル・マイクロバイオロ
ジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．）５６巻（ＩＩ）３４２０−２８、１９８０年１１
月）は、バシルス・スリンジエンシス・クルスタキ（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｋｕｒ
ｓｔａｋｉ）（Ｂ．ｔ．ｋ．）ＨＤ２６３及びＨＤ７３
の内在プラスミド由来の７個の複製起点の、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるクローニングを記載してい
る。これらの起点のうち、Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ２６３の４
３、４４及び６０ＭＤａプラスミドに由来する３個の起
点が、一組の往復ベクターの組み立てに使用された。し
かしながら、これらクローニングされた複製起点のいず
れもが、それが誘導されたＢ．ｔ．内在プラスミドとの
非両立性を示す（バウム及びギルバート（１９９１）、
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．）第１７３巻（１７）５２８０−５２８
９）。バウム等（同書）は、さらに、ＨＤ２６３の４４
ＭＤａ内在プラスミド及び非特定供給源の４．９ＭＤａ
プラスミドを含んでいるトランス接合体菌株であるＢ．
ｔ．ｋ．ＨＤ７３−２６−１０由来の複製起点を含むプ
ラスミドＤＮＡフラグメントのクローニングを記載して
いる。サザンブロットにおいて、ＨＤ７３−２６菌株の
４．９ＭＤａプラスミドから成るハイブリダイゼーショ
ンプローブと強くハイブリダイズする新規なプラスミド
ｐＥＧ５８８−２、ｐＥＧ５８８−１８及びｐＥＧ５８
８−２１が得られた。しかしながら、これらのプラスミ
ドのＨＤ７３−２６形質転換体は、ＨＤ７３−２６の
４．９ＭＤａ内在プラスミドの減少または不在を示し、
これは、これらの新規プラスミドが４．９ＭＤａプラス
ミドとの或る程度の非両立性を示すことを示唆するもの
である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、ここに、
Ｂ．ｔ．宿主細胞中で安定であり、且つ主にＢ．ｔ．Ｄ
ＮＡを含むＤＮＡベクターの組み立てが可能であること
を発見した。さらに、複製起点の供給プラスミドの適当
な選択及びそのＤＮＡの操作によって、本発明者等は、
その複製起点の導入される天然の内在プラスミドと両立
できるプラスミドの供給が可能であることを見いだし
た。

【０００６】したがって、第一の態様において本発明
は、通常付随し、複製に必要の無いＤＮＡを実質上含ま
ない、バシルス・スリンジエンシス・クルスタキ（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｋｕｒｓ
ｔａｋｉ）ＨＤ７３由来の複製起点を含むバシルス・ス
リンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓ）細胞の形質転換における使用のためのＤＮ
Ａベクターを提供するものである。この複製起点はいか
なるＢ．ｔ．ｋ．ＨＤ７３プラスミド由来のものであっ
てもよい。好ましくは、複製起点は、ＨＤ７３の、５．
２ＭＤａ、５．６ＭＤａまたは最も好ましくは５０ＭＤ
ａプラスミド由来のものである。５０ＭＤａプラスミド
の最小複製起点のＤＮＡ配列を、後記の配列表中、配列
番号６に記す。天然のＨＤ７３プラスミドの複製起点、
例えば５０ＭＤａプラスミドの複製起点に加えて、相同
体ＤＮＡ配列を使用することができ、これは、天然起源
のＤＮＡ配列に関して欠失、置換または小さな付加、例
えば挿入を有するが、これらは、その配列が複製起点と
して機能する能力に影響を及ぼさない。

【０００７】好ましくは、さらに、本発明のＤＮＡベク
ターは主としてＢ．ｔ．ＤＮＡを含む。主としてＢ．
ｔ．ＤＮＡ、という語は、多重クローニングサイト、マ
ーカーとして必要な遺伝子または宿主細胞への取り込み
のために望ましい蛋白をコードする遺伝子を例外とし
て、他の細胞からのＤＮＡを殆どまたは全く含まないベ
クターを意味する。

【０００８】ＨＤ７３プラスミドの一つからの複製起点
を使用する顕著な利点は、複製以外の機能を担うＤＮＡ
を除去することにより、形質転換された菌株から内在プ
ラスミドを置換することなく、類似の複製起点を有する
内在プラスミドを含む菌株中に、安定に導入することの
できるプラスミドベクターを組み立てることができるよ
うになるという点である。このようにして、例えば、異
種の結晶蛋白毒素または他の所望蛋白をコードしている
遺伝子を、ＨＤ７３の５０ＭＤａプラスミドから誘導さ
れた複製起点を含む下記のようなベクターを用いて、重
要なｃｒｙＩＡ（ｃ）結晶蛋白毒素遺伝子を担ってい
る、これに本来含まれる５０ＭＤａプラスミドの全体を
置換することなく、ＨＤ７３に導入することが可能であ
る。この、ＨＤ７３由来の５０ＭＤａプラスミドは、例
えばクロンスタード及びホワイトレイ（ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第
１６０巻９５−１０２）によって知られている。しかし
ながら、このプラスミドの複製起点は、これまでの詳細
な研究または議論の中心ではなかった。

【０００９】ベクターの組み立て及び／またはＢ．ｔ．
菌株の形質転換は常法、例えば上に引用した文献または
レレクラス等（ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レター
ズ（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ）第６
０巻（１９８９）２１１−２１８）；マクダウエル等
（プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）第２５巻１１３−１２
０、１９９１）またはハーディー（プラスミズ：ア・プ
ラクティカル・アプローチ（Ｐｌａｓｍｉｄｓ：ＡＰ
ｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ）、ワシントン・
Ｄ．Ｃ．、ＩＲＬプレス、１９８７）により記載される
ように実施することができる。

【００１０】本発明における使用に好適なベクターは、
ＨＤ７３プラスミドから誘導された複製起点に加えて、
１またはそれ以上の、該プラスミドにより形質転換され
た宿主を選択するための手段、例えば抗生物質耐性を付
与する遺伝子のような、選択マーカーをコードしている
遺伝子；クローニングサイト、好ましくは多重クローニ
ングサイト；選択された宿主において遺伝子の発現を可
能にするＤＮＡ領域；及び、発現時に１またはそれ以上
の所望Ｂ．ｔ．結晶蛋白毒素または他の興味深い蛋白を
コードする１またはそれ以上のＤＮＡ配列、を含み得、
最後の二者は通常クローニングサイトに統合されてい
る。

【００１１】したがって、第二の態様によると本発明
は、バシルス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株中で所望の外因性蛋
白を産生させる方法を提供するものであり、この方法
は、所望の外因性蛋白の発現をコードしている遺伝子を
含む本発明に係るＤＮＡベクターによって該バシルス・
スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ）菌株の細胞を形質転換し、そして、この
形質転換された細胞を適当な手法で増殖させて、所望の
外因性蛋白をコードしている遺伝子を発現させることか
らなる。［結晶蛋白毒素及びそれらをコードしている遺
伝子の一般的議論は、ホフテ及びホワイトレイ、マイク
ロバイオロジカル・レビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｒｅｖｉｅｗｓ）第５３巻２、２４２−２５５頁（１９
８９年６月）に見いだすことができる。］

【００１２】さらに別の態様において、本発明は、本発
明のベクターによって形質転換されたバシルス・スリン
ジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ）菌株、及び、このような形質転換されたバシル
ス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を含む殺虫組成物をも包含し、
ここで、好ましくは該ベクターはバシルス・スリンジエ
ンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ）結晶蛋白毒素をコードしている遺伝子を含む。

【００１３】さらに本発明は、バシルス・スリンジエン
シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ）ＨＤ７３から分離された複製起点、特に５０ＭＤａ
プラスミドからの複製起点（そのＤＮＡ配列は、配列表
に配列番号６として後記してある）、またはそれらの相
同体を包含する。所望の複製起点は、以下の一般的手法
に記載されるように同定し、単離し、そしてＢ．ｔ．菌
株の形質転換に使用することができる。プラスミドＤＮ
Ａは適当なＢ．ｔ．ＨＤ７３の菌株から分離し精製す
る。所望プラスミド、例えば５０ＭＤａプラスミドの分
離には、等比重遠心分離及び分画遠心を用いることがで
きる。次いでこのプラスミドを適当な制限酵素で消化
し、分離したフラグメントを適当に消化した大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドベクターにライゲーション
し、このライゲーション混合物を使用して大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）菌株を形質転換することができる。制限消化
パターンを使用して所望フラグメントを含むサブクロー
ンを同定し、Ｂ．ｔ．形質転換における使用のために、
適当なマーカー遺伝子、エリスロマイシン耐性をこれら
のプラスミド中に挿入することができる。

【００１４】以下の非限定的実験要旨及び実施例におい
て本発明をさらに説明するが、これらは添付の図面に関
連している。図面の説明図１は、エリスロマイシン耐性遺伝子ｅｒｍＣを含むプ
ラスミドｐＳＢ９０１を示す。図２は、ＨＤ７３の５０ＭＤａプラスミドの９．６ｋｂ
ＢｇｌＩＩフラグメント及びｅｒｍＣ遺伝子を含む、
プラスミドｐＳＢ９０４．１を示す。図３は、９．６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントの非必須
部分を除いたｐＳＢ９０４．１の誘導体である、プラス
ミドｐＳＢ９０４．２を示す。図４は、ｐＳＢ９０４．２に含まれる２．４ｋｂＢ．
ｔ．レプリコンのヌクレオチド１２３−１８４３を含む
プラスミドｐＳＢ９０４．３を示す。図５は、ｅｒｍＣマーカー遺伝子及び５０ＭＤａプラス
ミドの短縮化フラグメントを含むプラスミドｐＳＢ９０
９を示す。図６は、ｅｒｍＣ遺伝子を伴う９．６ｋｂ５０ＭＤａ
ＢｇｌＩＩフラグメントの２．４ｋｂ部分を含むプラ
スミドｐＳＢ９０９．３を示す。図７は、ｐＳＢ９０４．１及びｐＳＢ９０９．３上に見
いだされる２．４ｋｂ部分に位置する、ＨＤ７３の５０
ＭＤａプラスミドからの最小レプリコンを決定するのに
使用される除去フラグメントを示す。図８は、ＨＤ７３の５０ＭＤａプラスミドからの最小レ
プリコンをｅｒｍＣ遺伝子と共に含む、プラスミドｐＳ
Ｂ９０９．４を示す。図９は、この最小レプリコン及び多重クローニングサイ
トを含む、プラスミドｐＳＢ９０９．５を示す。図１０は、この最小レプリコン及びＢ．ｔ．テネブリオ
ニス（Ｂ．ｔ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）由来のｃｒｙ
ＩＩＩＡ遺伝子を含む、プラスミドｐＳＢ９２２を示
す。

【００１５】実験要旨Ｂ．ｔ．クルスタキ（Ｂ．ｔ．ｋｕｒｓｔａｋｉ）ＨＤ
７３の５０ＭＤａプラスミド由来のフラグメントを選択
マーカー遺伝子と共に含むプラスミドを使用して、Ｂ．
ｔ．菌株を形質転換する。マーカーの発現を示す形質転
換体は複製起点を含み、これを後の研究のために選択す
る。選択されたプラスミドを適当な酵素で消化して不要
のＤＮＡ配列を除き、ライゲーションして、所望フラグ
メントをマーカー遺伝子と共に含む別のプラスミドを得
るが、これは再度Ｂ．ｔ．の形質転換に使用できる。複
製起点を有すると同定されたフラグメントを含んでいる
様々なプラスミドの部分を、適当な酵素を用いて選択的
に除去し、フラグメントをライゲーションすることによ
り、再環化させてベクターを作成する。これらの新しい
組み立て物を使用して再びＢ．ｔ．を形質転換し、これ
により、所望の複製起点を含む組み立て物のみが同定可
能な形質転換体を産生するようにする。所望の部分をプ
ラスミドから再び除去し、常法により配列決定する。最
小レプリコンを決定するために、所望部分の一端から、
必要とあらば適当な酵素を用いて、常法により再度適当
な制限サイトを導入することにより、除去を行なう。こ
の配列において、複製起点としての挙動能力に影響を及
ぼすことなく、除去、置換及び付加（例えば挿入）を行
なうことができ、また、本発明が、この能力を保持しつ
つ係る欠失、置換及び付加を含む配列を包含するという
意図にあることが理解できるであろう。

【００１６】次に、最小レプリコン、マーカー遺伝子、
及び、選択された遺伝子をＢ．ｔ．菌株中に導入するた
めのベクターとして機能するために必要な多重クローニ
ングサイトを含むプラスミドを組み立てる。次いで、こ
のようにして組み立てられたプラスミドベクターを、サ
ブクローニングされる所望遺伝子の運搬体として使用
し、Ｂ．ｔ．菌株の形質転換に使用する。個々の結晶蛋
白遺伝子または他の所望遺伝子に特異的なプライマーを
用いるＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、
生物検定する。本発明に係るベクターによる形質転換
は、その元々の結晶蛋白遺伝子含有プラスミドを全て保
持する安定な形質転換体を産生する。本発明に係るこの
ようなベクターの主たる用途は、結晶蛋白遺伝子を、通
常これらを発現しないＢ．ｔ．菌株中に、スペクトルの
拡大等のために導入することであるが、これらは興味の
持たれる蛋白をコードしている他の遺伝子の導入にも同
じく良好に使用できるため、これらの用途を上記のごと
く限定する意図は無い。形質転換されたＢ．ｔ．菌株
は、これらの殺虫有効量を昆虫またはそれらの生息地に
適用することにより、昆虫を撲滅するために使用するこ
とができる。好適な製剤及びそれらの製造及びＢ．ｔ．
菌株の調製は、例えば米国特許４７９７２７９号（この
点に関するその内容は引用して本明細書の一部としてあ
る）に記載のようにして実施する。

【００１７】

【実施例】以下の実施例により本発明を例示する。常套
の、または常法の、と述べられている下記の実験方法は
全てサムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア
・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ）第２版、１９８９、ニューヨーク：コールド・スプ
リング・ハーバー・ラブ・プレスに略記されるように実
施する。制限酵素は全てファルマシアＬＫＢバイオテク
ノロジー、アラメダ、ＣＡ及びニュー・イングランド・
バイオラブズ、Ｉｎｃ．、ビバリー、ＭＡにより供給さ
れ、消化は、製造者のプロトコルに従って実施する。Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ（アンプリタク）はパーキン
−エルマー・シータス、ノルウォーク、ＣＴから入手
し、ＰＣＲ反応は彼らの指示に従って実施する。使用さ
れるその他の全ての酵素の供給先はファルマシア・ＬＫ
Ｂである。化学薬品はシグマ・ケミカル・Ｃｏ．、セン
トルイス、ＭＯにより供給される。

【００１８】実施例１ＨＤ７３５０ＭＤａプラスミ
ドからの最小レプリコンの同定ａ）プラスミドＤＮＡの単離ＨＤ７３菌株（レレクラス等、モレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．）１９１：３０７−３１３参照、インスティテュ
ート・パストゥア、パリ、フランスまたはＮＲＲＬ、ピ
オーリア、ＩＬ５１６０４、ＮＲＲＬＢ−４４８８よ
り入手可能）を適当な培地で増殖させ、プラスミドＤＮ
ＡをＣｓＣｌ密度勾配超遠心により精製する。プラスミ
ドＤＮＡのアガロースゲル電気泳動は、特に５０、７．
８、５．６及び５．２ＭＤａプラスミドの存在を示す。
５０ＭＤａプラスミドを、シュクロース勾配超遠心によ
って他のプラスミドから分離する。分離後これをＢｇｌ
ＩＩで消化し、制限フラグメントを調製用アガロースゲ
ル電気泳動によって分離し、電気的溶出によりゲルから
分離する。

【００１９】ｂ）エリスロマイシン耐性遺伝子の調製エリスロマイシン耐性遺伝子ｅｒｍＣ（モノド等、１９
８６、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．）１６７：１３８−１４７）の供給源
としてバシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）プラスミドｐＩＭ１３（マーラー等、
１９８．ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイ
オロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）１２０：
２５９−２６３）を使用する。ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａ
Ｉ二重消化によりｐＩＭ１３からｅｒｍＣ遺伝子フラグ
メントを切り取り、アガロースゲル電気泳動によってプ
ラスミドの残りの部分から分離する。分離後、このＨｉ
ｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩｅｒｍＣフラグメントをＨｉｎ
ｄＩＩＩ／ＡｃｃＩ消化ｐＵＣ１８（ファルマシア・Ｌ
ＫＢ・バイオテクノロジー、アラメダ、ＣＡ）中にサブ
クローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−α
（ジブコＢＲＬ、グランド・アイランド、ＮＹ）におい
て選択する。この組み立て物をｐＳＢ９０１と名付ける
（図１参照）。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩまたはＨｉ
ｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ二重消化によってｐＳＢ９０１
からｅｒｍＣ遺伝子を切り離すが、これ自体にはｐＵＣ
１８のＭＣＳからの部位が付随する。ｐＳＢ９０１を含
む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−α細胞はエリスロマ
イシン耐性を発現するが、これは、エリスロマイシン５
０ｕｇ／ｍｌのＬＢ平板で出現する非形質転換体のバッ
クグラウンド増殖を防止するために、エリスロマイシン
１００ｕｇ／ｍｌを含有するＬＢ平板に蒔かねばならな
い。

【００２０】ｃ）５０ＭＤａプラスミドサブクローンの
調製Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５−αは５０ＭＤａプラスミドＢｇ
ｌＩＩフラグメントをサブクローニングするための宿主
の役割を持ち、その結果、５０ＭＤａプラスミド複製起
点を含むＢｇｌＩＩフラグメントを単離するための最終
的なＢ．ｔ．形質転換のための大量のプラスミドＤＮＡ
が容易に産生できる。上記ＢｇｌＩＩ消化物は、予期さ
れる通り、およそ３５、１３．８、１０．２、９．６、
４．２及び３．３ｋｂの制限フラグメントを産生する。
１３．８ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントはｃｒｙＩＡ
（ｃ）遺伝子を含むことが知られている。ゲル切片から
の電気的溶出により、１３．８ｋｂ及びこれ以下のサイ
ズのフラグメントが全て、良好に回収される。回収され
た全てのＢｇｌＩＩフラグメントを別々にＢａｍＨＩ消
化ｐＵＣ１８にライゲーションし、このライゲーション
混合物を用いて常法によりＥ．ｃｏｌｉＤＨ５−αを
形質転換する。プラスミドＤＮＡの制限消化パターン
を、クロンスタード及びホワイトレイの研究（ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．）第１６０巻９５−１０２）に基づいて予想される
パターンと比較する。３．３、４．２、９．６及び１
３．８ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントを含むサブクロー
ンを、これらの制限パターンに基づいて同定する。１
３．８ｋｂサブクローンを、ｃｒｙＩＡ（ｃ）特異的プ
ライマーを用いるＰＣＲ分析によって証明する。プラスミド説明ｐＳＢ９０２ｐＵＣ１８中の３．３ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントｐＳＢ９０３ｐＵＣ１８中の４．２ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントｐＳＢ９０４ｐＵＣ１８中の９．６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントｐＳＢ９０５ｐＵＣ１８中の１３．８ｋｂＢｇｌＩＩフラグメント

【００２１】Ｂ．ｔ．の形質転換のための選択マーカー
を供給するため、これら種々のプラスミド中にｅｒｍＣ
遺伝子を挿入する。ｅｒｍＣ遺伝子を、ｐＳＢ９０２か
らｐＳＢ９０５までの中に、ｐＳＢ９０１からサブクロ
ーニングする。例えば、ｐＳＢ９０１由来のＢａｍＨＩ
／ＨｉｎｄＩＩＩｅｒｍＣ遺伝子フラグメントを充填
し、次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化した
ｐＳＢ９０４のｐＵＣ１８ＭＣＳＰｓｔＩサイトに
ライゲーションし、ＣＩＡＰで処理する。これらのライ
ゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５−αを
常法により形質転換する。制限分析によりｅｒｍＣ遺伝
子の存在を確認する。以下のようなプラスミドの命名を
行なう：プラスミド説明ｐＳＢ９０２．１３．３ｋｂＢｇｌＩＩフラグメント＋ｐＵＣ１８中のｅｒｍＣｐＳＢ９０３．１４．２ｋｂＢｇｌＩＩフラグメント＋ｐＵＣ１８中のｅｒｍＣｐＳＢ９０４．１９．６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメント＋ｐＵＣ１８中のｅｒｍＣｐＳＢ９０５．１１３．８ｋｂＢｇｌＩＩフラグメント＋ｐＵＣ１８中のｅｒｍＣ１０．２ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントをＢａｍＨＩで消
化したｐＳＢ９０１中に直接サブクローニングする。
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５−αを常法によりライゲーション
混合物を用いて形質転換する。形質転換体プラスミドＤ
ＮＡを制限消化により分析する。制限パターンにより、
このプラスミド中に１０．２ｋｂＢｇｌＩＩフラグメン
トの存在を確認する。プラスミド説明ｐＳＢ９０６ｐＳＢ９０１中の１０．２ｋｂＢｇｌＩＩフラグメント

【００２２】ｄ）５０ＭＤａプラスミド複製起点を含む
ＢｇｌＩＩフラグメントの同定Ｂ．ｔ．ＨＤ１ｃｒｙＢ（スターリー等、バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓ
Ｃｏｍｍ）１９８４．３、５８１−５８８、以後ｃｒｙ
Ｂと呼称）を、ｐＳＢ９０２．１、９０３．１、９０
４．１、９０５．１及び９０６を用いて電気穿孔により
別個に形質転換する。プラスミドｐＳＢ９０４．１（図
２参照）のみがエリスロマイシン耐性形質転換体を生成
し、これは、９．６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントが、ｃ
ｒｙＢ中での増殖を可能にする５０ＭＤａプラスミドの
複製起点を含むことを示している。制限分析により、正
しい大きさの組み立て物が５０ＭＤａプラスミドの９．
６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントを含むことが確認され
る。

【００２３】ｅ）ｐＳＢ９０４．１の制限酵素分析種々の酵素を用いた制限分析を実施し、以下の結果が得
られる：＊＝一つのサイトはｐＵＣ１８由来のＭＣＳの中にあ
る。

【００２４】ｆ）ｐＳＢ９０４．１からのｐＵＣ１８配
列の除去ｐＵＣ１８配列を除去するためにｐＳＢ９０４．１ＤＮ
ＡをＳｐｈＩ及びＳｍａＩで消化するが、これらはｐＵ
Ｃ１８ベクターをどちらかの端で切断し、ＭＣＳ配列の
みを後に残す。調製用アガロースゲル電気泳動、次いで
電気的溶出により、９．６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメント
及びｅｒｍＣ遺伝子のみを含む制限フラグメントをｐＵ
Ｃ１８ベクターから精製する。このフラグメントのＳｐ
ｈＩ末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端
を作り出す。２つの平滑末端をＴ４ＤＮＡリガーゼでラ
イゲーションし、ｃｒｙＢを電気穿孔により、このライ
ゲーション混合物で形質転換する。形質転換体を、アガ
ロースゲル電気泳動により、そのプラスミド含量につい
てスクリーニングする。ｅｒｍＣ遺伝子に加えて５０Ｍ
Ｄａプラスミドの９．６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントを
含むこの組み立て物をｐＳＢ９０９と名付ける（図３参
照）。プラスミド説明ｐＳＢ９０９ｐＳＢ９０４．１からｐＵＣ１８配列を除いた物（９．６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメント及びｅｒｍＣ遺伝子は残っている）

【００２５】ｇ）ｐＳＢ９０９上の複製起点の位置の決
定複製起点を含んでいるプラスミドｐＳＢ９０９の領域の
位置を特定するために、プラスミドの様々な部分を除去
した幾つかの組み立て物を作成する。１．ｐＳＢ９０４．１上でＨｉｎｄＩＩＩ消化を実施し
て２個のフラグメントを得る。Ｂ．ｔ．の約６ｋｂの部
分及びｅｒｍＣ遺伝子を含むフラグメントを、調製用ア
ガロースゲル電気泳動により、ｐＵＣ１８及びＢ．ｔ．
の３．４ｋｂを含むフラグメントから分離する。ｅｒｍ
Ｃを含むフラグメントを電気的溶出によりゲル切片から
除去し、自己ライゲーションさせて再環化する。２．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ二重消化をｐＳＢ９０
９上で行ない、２個のフラグメントを得る。ｅｒｍＣ遺
伝子を含む大きなフラグメントを、調製用アガロースゲ
ル電気泳動によって小さな３．５ｋｂＢ．ｔ．ＤＮＡ
フラグメントから分離する。電気的溶出後、大きなフラ
グメントをクレノウを用いて充填し、平滑末端を作り出
す。これらの平滑末端を自己ライゲーションして、ベク
ターを再閉鎖する。３．ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ二重消化をｐＳＢ９０９上で
行ない、２個のフラグメントを得る。ｅｒｍＣ遺伝子を
含む大きなフラグメントを、調製用アガロースゲル電気
泳動によって小さな２．４ｋｂＢ．ｔ．ＤＮＡフラグ
メントから分離する。電気的溶出後、大きなフラグメン
トをクレノウを用いて充填し、平滑末端を作り出し、こ
れを自己ライゲーションして、再び環化する。このよう
にして、ｐＳＢ９０９の各部分を別個に除去する。

【００２６】どの組み立て物が複製起点を保持している
かを決定するために、種々のライゲーション混合物を使
用してｃｒｙＢを形質転換する。ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ
の２．４ｋｂフラグメントを除去した際には形質転換体
が得られず、これにより、起点がこのＤＮＡ断片に存在
していることがわかる。この事は、他の２つの除去組み
立て物を用いて形質転換体を得ることにより確認され
る。プラスミド説明ｐＳＢ９０９．１ｐＳＢ９０９からＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ３．５ｋｂ断片を除くｐＳＢ９０９．２ｐＳＢ９０９において３．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ部分を欠く

【００２７】ｈ）９０９．３の組み立て除去の考察により示唆されるようにｐＳＢ９０９の２．
４ｋｂ部分が複製起点を含んでいることを立証するため
に、ｐＳＢ９０９の２．４ｋｂ部分及びｅｒｍＣ遺伝子
のみを含む新しいプラスミドを組み立てる。ｐＳＢ９０
４．１からのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩの両者で消化して、およそ３．６、３．５、
３．４及び２．７ｋｂの制限フラグメント（ｐＵＣ１８
部分）を生成させる。この制限フラグメントの混合物を
クレノウを用いて充填して平滑末端を生成させ、次いで
ライゲーションして再度環化する。このライゲーション
混合物を使用して、電気穿孔によりｃｒｙＢを形質転換
する。得られた形質転換体を、アガロースゲル電気泳動
により、そのプラスミド含量についてスクリーニングす
る。２．４ｋｂＢ．ｔ．部分及びｅｒｍＣ遺伝子から
成る３．６ｋｂフラグメントは、これが５０ＭＤａプラ
スミドの複製起点を含むことを確認する複製が可能であ
る。この組み立て物をｐＳＢ９０９．３と名付ける（図
４参照）。プラスミド説明ｐＳＢ９０９．３９．６ｋｂ５０ＭＤａＢｇｌＩＩフラグメントからの２．４ｋｂ部分及びｅｒｍＣ遺伝子を含んでいる

【００２８】ｉ）９０９．３の配列決定５０ＭＤａプラスミド由来の複製起点を含む２．４ｋｂ
部分の配列決定をするため、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを
用いる消化によって、この部分をｐＳＢ９０４．１から
除去する。このＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントを
Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドベクターｐＳｐｏｒｔ（ジブコ
ＢＲＬ、グランド・アイランド、ＮＹ）中にサブクロー
ニングする。製造者の指示（Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
シークエンシングキット、ファルマシア・ＬＫＢ・バイ
オテクノロジー、アラミダ、ＣＡ）によりジデオキシ法
に従って配列決定を行なう。配列決定の結果、この複製
フラグメントが２３９２ｂｐの大きさであることが示さ
れる。

【００２９】ｊ）最小レプリコンの決定ｐＳｐｏｒｔ中にサブクローニングされたＢ．ｔ．レプ
リコンフラグメントのＥｃｏＲＩ末端（ヌクレオチド番
号２３９２と呼称）から種々の部分を除去するために、
製造者の指示（「イレイス−Ａ−ベース」キット、プロ
ミガ・マジソン、ＷＩ）に従ってＥｘｏＩＩＩを使用す
る。配列決定分析により、各除去部分の終末ヌクレオチ
ドを決定する。得られた結果を下の第１表に記し、図５
に示す。各々のＥｘｏＩＩＩ除去サブクローンのプラス
ミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩの両者で消化
する。ｅｒｍＣ遺伝子を有するＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａ
Ｉフラグメントを各ＥｘｏＩＩＩサブクローンにライゲ
ーションする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＤＨ５−α
を、常法に従って、別々のライゲーション混合物を用い
て形質転換する。形質転換体からのプラスミドＤＮＡを
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩによる制限消化によって分
析し、或るＥｘｏＩＩＩ除去サブクローン内にｅｒｍＣ
遺伝子が存在することを確認する。各ＥｘｏＩＩＩサブ
クローンからのプラスミドＤＮＡを用いた電気穿孔によ
るｃｒｙＢの形質転換を行なって、どれが尚且つ複製可
能であるかを決定する。

【００３０】

【表１】

【００３１】ｃｒｙＢにおいて複製可能なプラスミドを
アガロースゲル電気泳動によって分析する。このように
して、複製能を破壊することなく、レプリコンフラグメ
ントのＥｃｏＲＩ末端から４７９塩基を除去することが
できる。したがって、複製に必要な最小ＤＮＡの一端は
１６２６及び１９１２塩基対の間に存在する。どれだけ
のＤＮＡを、複製機能を失うことなくレプリコンフラグ
メントのＢｇｌＩＩ末端（ヌクレオチド番号１と呼称）
から除去することができるかを決定するために、このフ
ラグメントを部分的に置換することによって除去を導入
する。プラスミドｐＳＢ９０４．１をＥｃｏＲＩで消化
して２個のフラグメントを生成させるが、１個はｐＵＣ
１８＋ｅｒｍＣ＋２．４ｋｂレプリコンフラグメントを
含んでいる。混合物をライゲーションしてフラグメント
を環化し、標準的プロトコルに従って大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＤＨ５−αをライゲーション反応物で形質転換す
る。形質転換体プラスミド含量を、ＥｃｏＲＩによる消
化の後アガロースゲル電気泳動によって分析する。ｅｒ
ｍＣ遺伝子及びｐＵＣ１８における２．４ｋｂ複製起点
フラグメントを含んでいるこの組み立て物を、ｐＳＢ９
０４．２と名付ける（図２Ａ参照）。レプリコンフラグ
メントの最初の２００塩基の中には都合の良い制限サイ
トが存在しないため、ＢＴ１１３と称するＰＣＲプライ
マー（添付の配列表中、配列番号１）を、下記において
下線を付した単一塩基変換によってヌクレオチド位置１
２３のＡｖｒＩＩサイトに導入すべく設計する。ＢＴ８
９８．ｒｅｖと称する第二のプライマー（添付の配列表
中、配列番号２）は、ヌクレオチド番号１１３から８９
８までの２．４ｋｂレプリコンフラグメントの部分を増
幅させるために設計する。プライマーの配列は下に示
す。プライマー配列位置 BT113 5'GAA TCA AGC CTA GGC ACT AGG TTG 3' 113-137 BT898.rev 5' CTC AAT TGC TAG ATG CCA TTT GTG 3' 898-875

【００３２】このプライマーの対を、７８６ｂｐフラグ
メントを生成する鋳型として働くｐＳＢ９０４．２プラ
スミドＤＮＡと共に、ＰＣＲで使用する。ＰＣＲフラグ
メントをＡｖｒＩＩ及びＡｃｃＩで消化して、ヌクレオ
チド番号１２３から８２３に対応するフラグメントを作
り出し、これをゲル精製する。プラスミドｐＳＢ９０
４．２をＸｂａＩ及びＡｃｃＩで消化し、その後のゲル
精製物をＡｖｒＩＩ／ＡｃｃＩＰＣＲフラグメントに
ライゲーションする。ＡｖｒＩＩ及びＸｂａＩは、ｐＳ
Ｂ９０４．２ＸｂａＩ／ＡｃｃＩベクターへのＰＣＲフ
ラグメントの挿入を可能にする適合性コヒーシブ末端を
有する。この挿入は、元のフラグメントのうち１２２塩
基を欠くレプリコンフラグメントの新しい５'末端を作
り出す。別法として、ＰＣＲフラグメントをＤｒａＩ及
びＡｃｃＩで消化して、ヌクレオチド番号２９１から８
２３に対応するフラグメントを作り出す。フェノール／
クロロホルム抽出及びエタノール沈澱の後、このＤｒａ
Ｉ／ＡｃｃＩＰＣＲフラグメントを、ＸｂａＩで消化
したｐＳＢ９０４．２に直接ライゲーションし、クレノ
ウで処理して末端を平滑化し、次いでＡｃｃＩで消化
し、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱
する。ＤｒａＩ平滑末端は、平滑化されたＸｂａＩ末端
にライゲーションして、ｐＳＢ９０４．２ベクターへの
ＤｒａＩ／ＡｃｃＩＰＣＲフラグメントの挿入を可能
とし、その結果、元の「ＢｇｌＩＩ」末端から２９０ｂ
ｐが除去される。

【００３３】常法に従い、両ライゲーション混合物を別
個に使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−αを形質
転換する。除去した箇所を取り巻くプライマーを用いる
ＰＣＲ分析によって形質転換体をスクリーニングし、制
限消化分析によって確認する。各除去組み立て物からの
プラスミドＤＮＡを使用して電気穿孔によるｃｒｙＢの
形質転換を行ない、この除去組み立て物が尚複製可能で
あるか否かを調べる。除去された部分ｃｒｙＢ複製１−１２２行なわれる１−２９１行なわれないｃｒｙＢにおいて尚複製可能である除去組み立て物を、
アガロースゲル電気泳動により分析し、ＰＣＲ分析によ
って確認する。このプラスミドをｐＳＢ９０４．２δＡ
３と名付ける。このように、この最小レプリコンの末端
は、塩基対１２２−２９１の間に存在する。

【００３４】レプリコンのＥｃｏＲＩ末端からさらなる
ヌクレオチドを除去することができるか否かを調べるた
めに、ｐＳＢ９０４．２δＡ３をＨｉｎｄＩＩＩ及びＡ
ｆｌＩＩＩで消化してｐＵＣ１８部分を除き、そして
Ｂ．ｔ．レプリコンの塩基対１２３−１８４３及びｅｒ
ｍＣ遺伝子を保持する。このＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｆｌＩ
ＩＩフラグメントをＤＨ５−αにおいてｐＵＣ１８中に
サブクローニングし、以下の確認法を用いて、この除去
物が複製可能であるかを決定するためにｃｒｙＢを形質
転換する。得られた形質転換体をアガロースゲル電気泳
動によりそのプラスミド含量について分析する。このプ
ラスミドをｐＳＢ９０４．３と名付ける（図２Ｂ参
照）。除去組み立て物ｃｒｙＢ複製１２３−１８４３行なわれるｐＵＣ１８配列が、除去組み立て物の複製機能にとって
必要ないことを確認するため、ｐＳＢ９０４．２δＡ３
由来の上記ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｆｌＩＩＩフラグメント
の末端をクレノウで充填し、ライゲーションにより環化
することによって、ｐＵＣ１８部分を欠く組み立て物を
得る。このライゲーション混合物を使用して、電気穿孔
によりｃｒｙＢを形質転換する。形質転換体をアガロー
スゲル電気泳動によりそのプラスミド含量について分析
し、ＰＣＲ及び制限消化分析によって確認する。Ｂ．
ｔ．レプリコンのヌクレオチド１２３−１８４３及びｅ
ｒｍＣ遺伝子からなるこのプラスミドをｐＳＢ９０９．
４（図６参照）と名付けるが、これが最小レプリコンを
表わしている。最小Ｂ．ｔ．レプリコンの配列は、添付
の配列表において配列番号６として掲げる。

【００３５】実施例２最小レプリコンを含むプラスミ
ドベクターによるＢ．ｔ．の形質転換ａ）多重クローニングサイトの挿入この最小レプリコンをクローニングベクターとして有用
とするために、多重クローニングサイトをここに導入す
る。ＭＣＳは２個のオリゴヌクレオチドから組み立てら
れ、その配列は以下に示すが、ハイブリダイズされた場
合にＡｆｌＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端を形成す
る。オリゴ配列ＭＣＳ１５'ＣＡＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡ３' ＭＣＳ２５'ＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡ３' オリゴヌクレオチドＭＣＳ１及びＭＣＳ２は、添付の配
列表に、各々配列番号３及び配列番号４として示す。こ
れらのオリゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼで個別に燐酸化し、混合し、加熱沸騰させ、徐々
に室温まで冷却し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
ｐＳＢ９０４．２δＡ３由来のＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｆｌ
ＩＩＩフラグメントと、１０００倍過剰モルにおいてラ
イゲーションする。このライゲーション混合物を使用し
て、電気穿孔によりｃｒｙＢを形質転換する。形質転換
体を制限消化によりスクリーニングして、このプラスミ
ド内にＭＣＳが存在することを証明する。この組み立て
物をｐＳＢ９０９．５と名付ける（図７参照）。

【００３６】ｂ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子の単離ｃｒｙＩＩＩＡδ−エンドトキシン遺伝子をバシルス・
スリンジエンシス・テネブリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉ
ｓ）から単離しクローニングする。この遺伝子は９０Ｍ
Ｄａプラスミド上に位置する。バシルス・スリンジエン
シス・テネブリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）由来の全
ＤＮＡをＳＤＳ中での細胞溶解及びＮａＣｌによる混入
物質の沈澱化によって単離し、次いで透析し、エタノー
ル中でＤＮＡを沈澱させる。全ＤＮＡ調製物は、ｃｒｙ
ＩＩＩＡ遺伝子を担う９０ＭＤａプラスミドを含んでい
る。ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子のサザン・ブロット検出での
使用のために、４２塩基のプローブ、Ｔｅｎｅｂｒ１
（添付の配列表中配列番号５）を合成した。このプロー
ブはＡＴＧ出発コドン付近の配列と相同的である。この
プローブの配列は、発表されているｃｒｙＩＩＩＡ配列
（シーカー等、１９８７、プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）８４：７０３
６−７０４０）から誘導する。オリゴ配列Ｔｅｎｅｂｒ１５'ＡＣＴＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＧＴＧＣＣＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴ３'

【００３７】全ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１ｘ
ＴＢＥ緩衝液中０．６％アガロース中でのゲル電気泳動
により分離する。プローブＴｅｎｅｂｒ１と共にナイロ
ン膜に移された消化ＤＮＡのサザン・ブロッティング
は、オートラジオグラフィーを行なうと、ハイブリダイ
ズしている３．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを
示す。全ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化する。得
られたフラグメントをゲル電気泳動により分離する。
２．５−３．５ｋｂの大きさに相当するＤＮＡ部分をＤ
ＥＡＥ膜上に単離し、溶出し、ＴＥ１００ｕｌ中に再懸
濁する。次いで、単離されたＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トをＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア・
ＬＫＢ・バイオテクノロジー）にライゲーションするこ
とにより、部分的ライブラリーを作成し、細菌性アルカ
リフォスファターゼで処理する。ライブラリー等級ＢＲ
ＬコンピテントＤＨ５−α細胞を、コンピテント細胞２
５μｌに対しライゲーション反応液１μｌを用いて形質
転換し、アンピシリン７５μｇ／ｍｌ、Ｘ−ｇａｌ１０
０μｇ／ｍｌ、及びＩＰＴＧ１ｍＭを含有するＬＢ平板
上で組み替え体を選択する。得られたコロニーを、プロ
ーブＴｅｎｅｂｒ１に対するコロニーＤＮＡハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングする。陽性のコロ
ニーを増殖させ、プラスミドを単離し、制限分析により
調べる。正しい制限フラグメントを産生し、かつ適当な
大きさの挿入物を含むプラスミドを、ｐＳＢ１００と名
付ける。ｐＳＢ１００がｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子を含んで
いることのさらなる証拠は、Ｔｅｎｅｂｒ１プローブを
用いたサザン・ブロッティング分析から得られる。

【００３８】ｃ）ｐＳＢ９０９．５へのｃｒｙＩＩＩＡ
遺伝子のサブクローニング細胞を、２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、２５％シュク
ロース、２５ｍＭＥＤＴＡの溶液中、３７℃で３０−６
０分間インキュベーションすることにより進行するアル
カリ性溶菌によって、ｐＳＢ９０９．５を含むｃｒｙＢ
菌株からプラスミドＤＮＡを大スケールで単離し、次い
で染色体ＤＮＡを酢酸カリウムで沈澱化する。上清をキ
アゲン・チップ−１００カラム（キアゲン・Ｉｎｃ．、
チャッツワース、ＣＡ）に直接ロードして、プラスミド
ＤＮＡを精製する。次にこのプラスミドベクターＤＮＡ
をＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、次いでＣＩＡＰで処
理する。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＣＩＡＰをストラタクリー
ン樹脂（ストラタジーン、ラジョーラ、ＣＡ）で抽出す
ることにより除去する。ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子を、この
遺伝子を無傷でｐＴＺ１８Ｒベクターから放出するＨｉ
ｎｄＩＩＩを用いる消化によりｐＳＢ１００から単離す
る。ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントを、調製用アガロースゲル電気泳動、続いてキエ
ックス（キアゲン・Ｉｎｄ．、チャッツワース、ＣＡ）
によるアガロースからの抽出によって単離する。単離さ
れたｃｒｙＩＩＩＡＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し、１：５のベクター対挿入
物の比でＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＳＢ９０９．５にライゲ
ーションする。このライゲーション混合物を使用して、
電気穿孔によりｃｒｙＢを形質転換する。５０μｇ／ｍ
ｌを含有するＬＢ平板上で、３０℃で形質転換体を選択
する。コロニーをそのプラスミド含量についてスクリー
ニングする。正しい大きさのプラスミドを、ｃｒｙＩＩ
ＩＡ遺伝子に特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより
分析する。ｐＳＢ９０９．５のＨｉｎｄＩＩＩサイトに
サブクローニングされたｃｒｙＩＩＩＡＨｉｎｄＩＩ
Ｉ遺伝子フラグメントから成る組み立て物をｐＳＢ９２
２と名付ける（図９参照）。

【００３９】ｄ）バシルス・スリンジエンシス・クルス
タキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
ｋｕｒｓｔａｋｉ）の形質転換ｐＳＢ９２２を有するｃｒｙＢ菌株から、上記のように
してプラスミドＤＮＡを大スケールで単離する。精製し
たプラスミドＤＮＡを使用して、電気穿孔により、Ｃｒ
ｙＩＡ（ａ）、ＣｒｙＩＡ（ｂ）、ＣｒｙＩＡ（ｃ）、
及びＣｒｙＩＩＡ遺伝子を含むバシルス・スリンジエン
シス・クルスタキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓｋｕｒｓｔａｋｉ）菌株を形質転換する。
形質転換体を上記のように選択する。単離したコロニー
をそのプラスミド含量について分析する。各結晶遺伝子
に特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより、形質転換
体をこれらのｃｒｙ遺伝子含量についてスクリーニング
する。このバシルス・スリンジエンシス・クルスタキ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｋｕ
ｒｓｔａｋｉ）菌株中へのｃｒｙＩＩＩＡ含有ｐＳＢ９
０９．５の導入は、いかなる元の結晶蛋白遺伝子含有プ
ラスミドの置換をも誘導しない。適当な培地において胞
子形成させた形質転換培養で生物検定を実施する。鱗翅
目及び鞘翅目の両者の種に対する活性が予想される。生
物検定に使用される昆虫には、レプチノタルサ・テキサ
ナタ(Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａｔｅｘａｎａ)、トリ
コプシア・ニ(Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ)、ヘリ
オテイス・ゼア(Heliothis zea)及びスポドプテラ・エ
キシグア(Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ)が含ま
れる。抗生物質による選択をせずに１０世代の栄養生長
をさせた後、結晶遺伝子を有するプラスミドベクター
は、形質転換された細胞中に安定に維持される。したが
って、このＢ．ｔ．プラスミドベクターは、種々の遺伝
子のサブクローニング及び種々のＢ．ｔ．菌株中にそれ
らを安定に導入するために役立つ。属、亜属及び種の請
求項、並びに本明細書に記載する種々の好ましい態様の
組合せが特に好ましい。

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【００４０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ仮説：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列ＧＡＡＴＣＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣＡＣＴＡＧＧＴＴＧ
２４

【００４１】配列番号：２配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ仮説：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 CTCAATTGCT AGATGCCATT TGTG ２４

【００４２】配列番号：３配列の長さ：４８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ仮説：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 CATGTGAATT CCGCGGTACC CGGGGATCCT CTAGAGTCGA CCTGCAGA ４８

【００４３】配列番号：４配列の長さ：４８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｍｏｎｉｃＤＮＡ仮説：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 AGCTTCTGCA GGTCGACTCT AGAGGATCCC CGGGTACCGC GGAATTCA ４８

【００４４】配列番号：５配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｍｏｎｉｃＤＮＡ仮説：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 ACTACTGAAA ATGAGGTGCC AACTAACCAT GTTCAATAT ３９

【００４５】配列番号：６配列の長さ：１７２１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｍｏｎｉｃＤＮＡ仮説：無しアンチセンス：無し配列ＣＴＡＧＴＣＡＣＴＡＧＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＧＡＴＡＧＡＡＴＡＴＡＴＡＡＣＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡ６０ＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＡＧＴＴＡＴＴＴＣＡ
ＴＡＴＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＴＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＡ１２０ＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＣ
ＣＧＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＣＧＡＡＧＴＴＴＧＧＴＧ１８０ＡＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＴＡＧＣＡＧＡＧＴ
ＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＡ２４０ＡＡＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＡＣＴＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＡ
ＡＡＡＡＡＣＴＣＧＣＴＡＡＴＴＴＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＧ３００ＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＡＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＧＴＴＡＴ
ＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡ３６０ＡＡＣＧＡＧＡＡＣＴＡＡＧＴＣＣＴＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＧＴＡＴＡＴ
ＣＴＡＣＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＧ４２０ＣＣＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＡＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＡ
ＴＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＴＴＡＣＴＡ４８０ＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＧＴＡＡＧＴ
ＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣＴＴ５４０ＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＴＧＡＡＡＣ
ＡＧＧＡＴＧＴＧＡＴＡＧＣＣＣＡＡＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡ６００ＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＣＴＴ
ＧＧＣＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＣＡＣＣ６６０ＡＡＡＴＴＡＧＡＡＡＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＧＴＣ
ＣＴＴＣＴＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＡＣＡＡＴＡＣＡＴＡ７２０ＡＴＡＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＡＣ
ＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＧＣＡＡＴＴＧＡＧＡＴＡＡ７８０ＣＡＧＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＴＧＧＡ
ＣＴＣＴＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧ８４０ＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣ
ＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧ９００ＡＡＣＣＴＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＴＴＧＣＴＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴ
ＴＣＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＴＡＡＡＧＡＴＣＡＡＣ９６０ＡＡＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＡＣＴＡＴＡＴＴＡＴＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴ
ＴＴＡＣＴＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴ１０２０ＡＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＴＣＧ
ＡＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＴＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＡＣ１０８０ＡＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＡＧＴＡＡＡＧＣＴＧ
ＡＴＡＡＧＡＧＴＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＧ１１４０ＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＡＴＣＴＴＡＴＴＴＡＡ
ＡＡＣＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴ１２００ＡＴＧＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴ
ＴＡＡＴＡＡＴＴＴＡＣＧＡＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＧＧＧＧ１２６０ＡＡＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＴＡＡＡＡＴＣＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣ
ＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧ１３２０ＧＣＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＴＣＣＴＡＡＡ
ＴＡＣＣＴＣＴＣＡＴＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡ１３８０ＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＡＴＡＡＴ
ＧＧＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＴＡＣＴＡ１４４０ＡＡＡＴＴＧＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡ
ＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣＴ１５００ＡＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＡＧＡＧＴ
ＡＡＧＧＧＴＴＡＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＴ１５６０ＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＡＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＧ
ＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴ１６２０ＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡ
ＴＴＣＴＣＣＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＧ１６８０ＣＴＡＡＡＡＴＡＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡ
ＴＡＡＡＣＡＴＧ１７２１

【図面の簡単な説明】

【図１】エリスロマイシン耐性遺伝子ｅｒｍＣを含むプ
ラスミドｐＳＢ９０１を示す図である。

【図２】ＨＤ７３の５０ＭＤａプラスミドの９．６ｋｂ
ＢｇｌＩＩフラグメント及びｅｒｍＣ遺伝子を含む、
プラスミドｐＳＢ９０４．１を示す図である。

【図３】９．６ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントの非必須
部分を除いたｐＳＢ９０４．１の誘導体である、プラス
ミドｐＳＢ９０４．２を示す図である。

【図４】ｐＳＢ９０４．２に含まれる２．４ｋｂＢ．
ｔ．レプリコンのヌクレオチド１２３−１８４３を含む
プラスミドｐＳＢ９０４．３を示す図である。

【図５】ｅｒｍＣマーカー遺伝子及び５０ＭＤａプラス
ミドの短縮化フラグメントを含むプラスミドｐＳＢ９０
９を示す図である。

【図６】ｅｒｍＣ遺伝子を伴う９．６ｋｂ５０ＭＤａ
ＢｇｌＩＩフラグメントの２．４ｋｂ部分を含むプラ
スミドｐＳＢ９０９．３を示す図である。

【図７】複製機能の位置決めのため、ｐＳＢ９０４．１
及びｐＳＢ９０９．３上に見いだされる２．４ｋｂ部分
に位置する、ＨＤ７３の５０ＭＤａプラスミドからの最
小レプリコンを決定するのに使用される除去フラグメン
トを示す図である。

【図８】ＨＤ７３の５０ＭＤａプラスミドからの最小レ
プリコンをｅｒｍＣ遺伝子と共に含む、プラスミドｐＳ
Ｂ９０９．４を示す図である。

【図９】最小レプリコン及び多重クローニングサイトを
含む、プラスミドｐＳＢ９０９．５を示す図である。

【図１０】最小レプリコン及びＢ．ｔ．テネブリオニス
（Ｂ．ｔ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）由来のｃｒｙＩＩ
ＩＡ遺伝子を含む、プラスミドｐＳＢ９２２を示す図で
ある。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/32 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者ジャン−クリストフ・ピオットアメリカ合衆国94025カリフォルニア州メンロ・パーク、オレンジ・アベニュー1328 番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】通常これに付随し且つ複製に不必要なＤ
ＮＡを実質上含まない、バシルス・スリンジエンシス・
クルスタキＨＤ７３由来の複製起点を含む、バシルス・
スリンジエンシス細胞の形質転換における使用のための
ＤＮＡベクター。
【請求項２】含まれるＤＮＡが主としてバシルス・ス
リンジエンシスのＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮ
Ａベクター。
【請求項３】複製起点が配列番号６のヌクレオチド配
列を有する請求項１または２に記載のＤＮＡベクター、
及び、複製起点として機能する能力に影響しない欠失、
付加または置換を含む、その相同体。
【請求項４】該ベクターにより形質転換された宿主を
選択する手段及びクローニングサイトをさらに含む、請
求項１、２または３に記載のＤＮＡベクター。
【請求項５】発現時に１またはそれ以上の所望のバシ
ルス・スリンジエンシス結晶蛋白または他の所望蛋白を
コードする１またはそれ以上のＤＮＡ配列を有するバシ
ルス・スリンジエンシス中で遺伝子を発現させることの
できる、クローニングサイトに統合されたＤＮＡの領域
をさらに含む、請求項４に記載のＤＮＡベクター。
【請求項６】バシルス・スリンジエンシス菌株中で所
望の外因性蛋白を産生させる方法であって、該バシルス
・スリンジエンシス菌株の細胞を、所望の外因性蛋白の
発現をコードしている遺伝子を含む請求項１または２に
記載のベクターで形質転換し、この形質転換した細胞
を、所望蛋白をコードしている遺伝子を発現させる適当
な手法によって増殖させることからなる方法。
【請求項７】ＤＮＡ配列がバシルス・スリンジエンシ
ス結晶蛋白をコードしている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】請求項１、２または５に記載のＤＮＡベ
クターを用いて形質転換されたバシルス・スリンジエン
シス菌株。
【請求項９】請求項８に記載のバシルス・スリンジエ
ンシス菌株を含む殺虫組成物。
【請求項１０】請求項９に記載のバシルス・スリンジ
エンシス菌株を含む殺虫組成物。
【請求項１１】バシルス・スリンジエンシス・クルス
タキＨＤ７３から単離される複製起点。
【請求項１２】配列番号６に示されるヌクレオチド配
列を有する請求項１１に記載の複製起点、及び複製起点
として機能する能力に影響しない欠失、付加または置換
を含む、その相同体。