JPH05271294A - ヒトプロヒビチンおよびそれをコードするｄｎａ - Google Patents
ヒトプロヒビチンおよびそれをコードするｄｎａInfo
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- JPH05271294A JPH05271294A JP4308654A JP30865492A JPH05271294A JP H05271294 A JPH05271294 A JP H05271294A JP 4308654 A JP4308654 A JP 4308654A JP 30865492 A JP30865492 A JP 30865492A JP H05271294 A JPH05271294 A JP H05271294A
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なヒトプロヒビチン、それをコードする
塩基配列およびそれらを用いる遺伝子解析試薬を提供す
ることにある。 【構成】 ヒト肝臓組織よりプロヒビチン遺伝子をクロ
ーニングし構造を解析。ｃＤＮＡは 816個の塩基より成
り 272個アミノ酸を有するヒトプロヒビチンを確認し
た。該遺伝子の部分オリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、ＰＣＲ法によりヒト組織のプロヒビチン遺伝
子の変異の有無を解析する方法。 【効果】 抗ヒトプロヒビチン抗体を用いる免疫学的手
法により生体試料のプロヒビチンの定量、オリゴヌクレ
オチドを用いる遺伝子解析は癌診断に有用である。
塩基配列およびそれらを用いる遺伝子解析試薬を提供す
ることにある。 【構成】 ヒト肝臓組織よりプロヒビチン遺伝子をクロ
ーニングし構造を解析。ｃＤＮＡは 816個の塩基より成
り 272個アミノ酸を有するヒトプロヒビチンを確認し
た。該遺伝子の部分オリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、ＰＣＲ法によりヒト組織のプロヒビチン遺伝
子の変異の有無を解析する方法。 【効果】 抗ヒトプロヒビチン抗体を用いる免疫学的手
法により生体試料のプロヒビチンの定量、オリゴヌクレ
オチドを用いる遺伝子解析は癌診断に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトプロヒビチン、それ
をコードする遺伝子、ヒトプロヒビチンに対する抗体お
よび該遺伝子の一部をプライマーとして用いるヒトプロ
ヒビチン遺伝子構造解析法に関する。
をコードする遺伝子、ヒトプロヒビチンに対する抗体お
よび該遺伝子の一部をプライマーとして用いるヒトプロ
ヒビチン遺伝子構造解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌は細胞の遺伝子の変異が重要な役割を
演ずるという考え方は古くから知られている。近年の遺
伝子工学の発達は特定ＤＮＡの増幅や癌細胞における遺
伝子変異の解析を可能にし癌研究の分野においても飛躍
的な発展をもたらした。
演ずるという考え方は古くから知られている。近年の遺
伝子工学の発達は特定ＤＮＡの増幅や癌細胞における遺
伝子変異の解析を可能にし癌研究の分野においても飛躍
的な発展をもたらした。
【０００３】これまで細胞の癌化、癌細胞の異常増殖に
関与すると考えられている癌遺伝子の解析、同定が進
み、その数は数十に及んでいる。一方これと反対に作用
する癌抑制遺伝子がここ数年来脚光を浴びているが、そ
の発端は癌細胞を正常細胞と融合させると腫瘍性が失わ
れ正常細胞のごとく振る舞うことが報告され、正常細胞
の側に癌を抑制する遺伝子の存在が暗示されたことによ
る。
関与すると考えられている癌遺伝子の解析、同定が進
み、その数は数十に及んでいる。一方これと反対に作用
する癌抑制遺伝子がここ数年来脚光を浴びているが、そ
の発端は癌細胞を正常細胞と融合させると腫瘍性が失わ
れ正常細胞のごとく振る舞うことが報告され、正常細胞
の側に癌を抑制する遺伝子の存在が暗示されたことによ
る。
【０００４】これまで癌抑制遺伝子として、網膜芽細胞
腫のＲｂ遺伝子（Friend, S. H. etal., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 84, 9095, 1987 ）、大腸癌のp53 遺伝
子（Lane, D. P. et al., Nature, 278, 261, 1979)、W
ilms腫瘍のＷＴ遺伝子(Call,K. M. et al., Cell, 60,
509, 1990 ）など約10種類が候補に上がっているに過ぎ
ない。1991年、Nuell, M. J.らは細胞増殖抑制作用を有
する蛋白質プロヒビチンのｃＤＮＡをラット肝細胞から
クローニングした。さらにラットプロヒビチンの合成ｍ
ＲＮＡを線繊芽細胞およびヘーラ細胞に注入すると、細
胞の増殖サイクルＳ期への進行を阻止すること、また合
成アンチセンスオリゴヌクレオチドの注入によりＳ期に
進行することを発表した (Nuell, M. J. et al., Mol.
Cell. Biol., 11, 1372, 1991)。すなわち、細胞増殖抑
制因子である可能性を示唆した。しかし、ヒトプロヒビ
チンの遺伝子に関しては全く不明であり、細胞の癌化、
増殖に関する分子レベルでの機構解明に、さらに、ガン
の診断、治療の面からもその遺伝子の解明が望まれてい
た。
腫のＲｂ遺伝子（Friend, S. H. etal., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 84, 9095, 1987 ）、大腸癌のp53 遺伝
子（Lane, D. P. et al., Nature, 278, 261, 1979)、W
ilms腫瘍のＷＴ遺伝子(Call,K. M. et al., Cell, 60,
509, 1990 ）など約10種類が候補に上がっているに過ぎ
ない。1991年、Nuell, M. J.らは細胞増殖抑制作用を有
する蛋白質プロヒビチンのｃＤＮＡをラット肝細胞から
クローニングした。さらにラットプロヒビチンの合成ｍ
ＲＮＡを線繊芽細胞およびヘーラ細胞に注入すると、細
胞の増殖サイクルＳ期への進行を阻止すること、また合
成アンチセンスオリゴヌクレオチドの注入によりＳ期に
進行することを発表した (Nuell, M. J. et al., Mol.
Cell. Biol., 11, 1372, 1991)。すなわち、細胞増殖抑
制因子である可能性を示唆した。しかし、ヒトプロヒビ
チンの遺伝子に関しては全く不明であり、細胞の癌化、
増殖に関する分子レベルでの機構解明に、さらに、ガン
の診断、治療の面からもその遺伝子の解明が望まれてい
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は新規なヒトプ
ロヒビチン、それをコードする塩基配列およびそれらを
用いる遺伝子解析試薬の提供を目的とする。
ロヒビチン、それをコードする塩基配列およびそれらを
用いる遺伝子解析試薬の提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記現状に鑑み、本発明
者らはラットプロヒビチンｃＤＮＡ配列の一部を含む合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ヒト肝
細胞のｍＲＮＡを鋳型として逆転写ポリメレースチエン
反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により444bp のＰＣＲ産物を得
た。これをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングした結果、ヒトプロヒビチン遺伝子の単離に
成功した。構造解析したところ 816個の塩基より成り
（配列番号１）272 個のアミノ酸（配列番号１）をコー
ドする新規なヒトプロヒビチン遺伝子であった。さらに
ヒト乳癌細胞のプロヒビチン遺伝子を解析したところ驚
くべきことに第４エクソン部分に数種の変異がみられた
ことから本発明の遺伝子は新しい癌抑制遺伝子であるこ
とが示唆され本発明を完成するに到った。
者らはラットプロヒビチンｃＤＮＡ配列の一部を含む合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ヒト肝
細胞のｍＲＮＡを鋳型として逆転写ポリメレースチエン
反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により444bp のＰＣＲ産物を得
た。これをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングした結果、ヒトプロヒビチン遺伝子の単離に
成功した。構造解析したところ 816個の塩基より成り
（配列番号１）272 個のアミノ酸（配列番号１）をコー
ドする新規なヒトプロヒビチン遺伝子であった。さらに
ヒト乳癌細胞のプロヒビチン遺伝子を解析したところ驚
くべきことに第４エクソン部分に数種の変異がみられた
ことから本発明の遺伝子は新しい癌抑制遺伝子であるこ
とが示唆され本発明を完成するに到った。
【０００７】すなわち、本発明は配列番号１で表わされ
るアミノ酸配列を有するヒトプロヒビチン、配列番号１
で示されるヒトプロヒビチンをコードするｃＤＮＡおよ
び配列番号２で表わされるヒトプロヒビチン遺伝子のイ
ントロンＤＮＡを提供するものである。また本発明のｃ
ＤＮＡを組み込んだベクターにより形質転換された宿主
細胞、ヒトプロヒビチンまたはその部分構造フラグメン
トを抗原とする抗プロヒビチン抗体、および本発明のＤ
ＮＡの一部分をプライマーとするヒトプロヒビチン遺伝
子解析方法および試薬をも提供する。
るアミノ酸配列を有するヒトプロヒビチン、配列番号１
で示されるヒトプロヒビチンをコードするｃＤＮＡおよ
び配列番号２で表わされるヒトプロヒビチン遺伝子のイ
ントロンＤＮＡを提供するものである。また本発明のｃ
ＤＮＡを組み込んだベクターにより形質転換された宿主
細胞、ヒトプロヒビチンまたはその部分構造フラグメン
トを抗原とする抗プロヒビチン抗体、および本発明のＤ
ＮＡの一部分をプライマーとするヒトプロヒビチン遺伝
子解析方法および試薬をも提供する。
【０００８】さらにヒト乳癌組織で確認された変異プロ
ヒビチンＤＮＡ配列を提供し、これら変異体も癌診断へ
の応用が期待される。
ヒビチンＤＮＡ配列を提供し、これら変異体も癌診断へ
の応用が期待される。
【０００９】本発明の構成は次の通りである。 （１）ヒトプロヒビチンのＲＮＡに係る二本鎖ＤＮＡの
調製 ヒトプロヒビチンをコードする遺伝子はヒト臓器からメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡ
を逆転写することによって相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、
次いで二重鎖ＤＮＡを合成する。ヒトプロヒビチンｍＲ
ＮＡは肝臓、心臓、肺臓など医学的事情により摘出され
たヒト組織から得ることができる。調製方法としてはた
とえばグアニジンチオシアネート法（Chirgwin, J.M. e
t al., Biochemistry, 18, 5294, 1979 ）などに基づい
てＲＮＡを抽出する。得られたＲＮＡをさらにオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムを用いる液体クロマトグラフ
ィによってｍＲＮＡを調製することができる。得られた
ｍＲＮＡを鋳型とし、ラットプロヒビチンｃＤＮＡ塩基
配列の２個所のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て、たとえば Gubler, U. らの方法（Gene, 25, 263,19
83）あるいはFrohman, A. らの方法（Proc. Natl. Aca
d. Sci.USA., 85, 8998, 1988）に従って逆転写酵素や
ポリメラーゼチエン反応法（ＰＣＲ）を用いて単鎖ｃＤ
ＮＡ、ついで二本鎖ｃＤＮＡを合成する。
調製 ヒトプロヒビチンをコードする遺伝子はヒト臓器からメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡ
を逆転写することによって相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、
次いで二重鎖ＤＮＡを合成する。ヒトプロヒビチンｍＲ
ＮＡは肝臓、心臓、肺臓など医学的事情により摘出され
たヒト組織から得ることができる。調製方法としてはた
とえばグアニジンチオシアネート法（Chirgwin, J.M. e
t al., Biochemistry, 18, 5294, 1979 ）などに基づい
てＲＮＡを抽出する。得られたＲＮＡをさらにオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムを用いる液体クロマトグラフ
ィによってｍＲＮＡを調製することができる。得られた
ｍＲＮＡを鋳型とし、ラットプロヒビチンｃＤＮＡ塩基
配列の２個所のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て、たとえば Gubler, U. らの方法（Gene, 25, 263,19
83）あるいはFrohman, A. らの方法（Proc. Natl. Aca
d. Sci.USA., 85, 8998, 1988）に従って逆転写酵素や
ポリメラーゼチエン反応法（ＰＣＲ）を用いて単鎖ｃＤ
ＮＡ、ついで二本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００１０】このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを
公知の方法によりプラスミドまたはファージに組み込
む。ｃＤＮＡを組み込むベクターとしてはpBluescript
II SK、ｐＢＲ322 、λgt11などが挙げられるが、これ
らベクターは宿主細胞内に保持されて複製、増幅される
ものであれば、いずれも用いることができる。プラスミ
ドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、たとえば Mania
tis, J. らの MolecularCloning, A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory, p239 (1982)に記
載の方法などが挙げられる。
公知の方法によりプラスミドまたはファージに組み込
む。ｃＤＮＡを組み込むベクターとしてはpBluescript
II SK、ｐＢＲ322 、λgt11などが挙げられるが、これ
らベクターは宿主細胞内に保持されて複製、増幅される
ものであれば、いずれも用いることができる。プラスミ
ドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、たとえば Mania
tis, J. らの MolecularCloning, A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory, p239 (1982)に記
載の方法などが挙げられる。
【００１１】このようにして得られたプラスミドやファ
ージベクターは適切な宿主たとえば大腸菌などに導入す
る。宿主となりうる大腸菌としては、例えば Escherich
iacoli HB101、 JM109 などが挙げられる。ｃＤＮＡのベ
クターがプラスミドの場合、塩化カルシウム法、あるい
は塩化カルシウム・塩化ルビジウム法、またｃＤＮＡの
ベクターがファージの場合、インビトロパッケージング
法などを用いて宿主細胞に保持させることができる（Mo
lecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 19
82, p249）。次いで該形質転換体を培養増殖させた後、
常法（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labora
tory, New York, 1982）に従ってプラスミドやファージ
などの組換えＤＮＡを単離し、制限酵素で消化してから
ｃＤＮＡ塩基配列の解析を行う。塩基配列の構造はマキ
サム・ギルバート法(Maxam, A.M. and Gilbert, W., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560, 1977）あるい
はジデオキシ法（Messing, J. et al., Nucl. Acids Re
s., 9, 309, 1981）によって決められる。
ージベクターは適切な宿主たとえば大腸菌などに導入す
る。宿主となりうる大腸菌としては、例えば Escherich
iacoli HB101、 JM109 などが挙げられる。ｃＤＮＡのベ
クターがプラスミドの場合、塩化カルシウム法、あるい
は塩化カルシウム・塩化ルビジウム法、またｃＤＮＡの
ベクターがファージの場合、インビトロパッケージング
法などを用いて宿主細胞に保持させることができる（Mo
lecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 19
82, p249）。次いで該形質転換体を培養増殖させた後、
常法（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labora
tory, New York, 1982）に従ってプラスミドやファージ
などの組換えＤＮＡを単離し、制限酵素で消化してから
ｃＤＮＡ塩基配列の解析を行う。塩基配列の構造はマキ
サム・ギルバート法(Maxam, A.M. and Gilbert, W., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560, 1977）あるい
はジデオキシ法（Messing, J. et al., Nucl. Acids Re
s., 9, 309, 1981）によって決められる。
【００１２】（２）ヒトプロヒビチン遺伝子の全構造の
確認 上記の方法により得られたｃＤＮＡはヒトプロヒビチン
蛋白質の全長をコードしていないためヒトプロヒビチン
遺伝子全構造はヒトＤＮＡライブラリーを用いて解析す
る。ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーとヒト染色体ライ
ブラリーを用い、上記の方法で得られたＲＴ−ＰＣＲ産
物をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション法
（Gene, 10, 63, 1980）、プラークハイブリダイゼーシ
ョン法（Science, 196, 180, 1977)などによってｃＤＮ
Ａクローンを釣り上げることができる。このようにして
クローン化された形質転換体はヒトプロヒビチンの全ア
ミノ酸配列あるいはその部分アミノ酸配列にコードする
ｃＤＮＡを含有している。これらｃＤＮＡの塩基配列を
前記と同様の方法により解析し、さらに必要があれば塩
基配列の決定されたｃＤＮＡの一部を合成し、それをプ
ライマーとして用い、プライマーエクステンション法
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 731 1979）によっ
て新しくｃＤＮＡを合成、前記と同様の方法により組換
えｃＤＮＡのクローニング、塩基配列の解析が可能であ
る。更にヒトプロヒビチンの染色体ＤＮＡの構造を知る
ために上記ｃＤＮＡをプローブとしてヒト染色体コスミ
ドライブラリーをスクリーニングしジェノミッククロー
ンを単離する。これらｃＤＮＡとジェノミッククローン
の構造決定された塩基配列を比較することによって、イ
ントロン−エクソン結合部が解析される。
確認 上記の方法により得られたｃＤＮＡはヒトプロヒビチン
蛋白質の全長をコードしていないためヒトプロヒビチン
遺伝子全構造はヒトＤＮＡライブラリーを用いて解析す
る。ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーとヒト染色体ライ
ブラリーを用い、上記の方法で得られたＲＴ−ＰＣＲ産
物をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション法
（Gene, 10, 63, 1980）、プラークハイブリダイゼーシ
ョン法（Science, 196, 180, 1977)などによってｃＤＮ
Ａクローンを釣り上げることができる。このようにして
クローン化された形質転換体はヒトプロヒビチンの全ア
ミノ酸配列あるいはその部分アミノ酸配列にコードする
ｃＤＮＡを含有している。これらｃＤＮＡの塩基配列を
前記と同様の方法により解析し、さらに必要があれば塩
基配列の決定されたｃＤＮＡの一部を合成し、それをプ
ライマーとして用い、プライマーエクステンション法
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 731 1979）によっ
て新しくｃＤＮＡを合成、前記と同様の方法により組換
えｃＤＮＡのクローニング、塩基配列の解析が可能であ
る。更にヒトプロヒビチンの染色体ＤＮＡの構造を知る
ために上記ｃＤＮＡをプローブとしてヒト染色体コスミ
ドライブラリーをスクリーニングしジェノミッククロー
ンを単離する。これらｃＤＮＡとジェノミッククローン
の構造決定された塩基配列を比較することによって、イ
ントロン−エクソン結合部が解析される。
【００１３】最終的にヒトプロヒビチンｃＤＮＡは配列
番号１の如く決められ、そのアミノ酸配列は配列番号１
に記載される如く演繹される。エクソン４および５付近
のイントロンＤＮＡは配列番号２に示される。ヒトプロ
ヒビチンは 272個のアミノ酸から成りラットプロヒビチ
ンの構造と比較すると96位アミノ酸チロシン（ラット）
がフェニルアラニン（ヒト）となる一つの差を有してい
る。
番号１の如く決められ、そのアミノ酸配列は配列番号１
に記載される如く演繹される。エクソン４および５付近
のイントロンＤＮＡは配列番号２に示される。ヒトプロ
ヒビチンは 272個のアミノ酸から成りラットプロヒビチ
ンの構造と比較すると96位アミノ酸チロシン（ラット）
がフェニルアラニン（ヒト）となる一つの差を有してい
る。
【００１４】（３）ヒトプロヒビチン組換え発現ベクタ
ーとその形質転換体 上記記載の方法により得られたヒトプロヒビチンｃＤＮ
Ａを適切なベクターに組み込み、該ベクターを適切な宿
主細胞に移入することにより形質転換体を得ることがで
きる。これを常法により培養し培養物よりヒトプロヒビ
チンを大量に生産することができる。ヒトプロヒビチン
をコードするｃＤＮＡをヒトプロヒビチンの発現に適し
たベクターのプロモーター下流に制限酵素とＤＮＡリガ
ーゼを用いる公知の方法により再結合して組換発現ベク
ターを作成することができる。使用できるベクターとし
ては、大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ322 、ｐＵＣ18、
枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ110 、酵母由来のプラス
ミドｐＳＨ15、バクテリオファージλgt10、λgt11ある
いはＳＶ40などが挙げられるが、宿主内で複製、増幅可
能なベクターであれば特に限定されない。プロモーター
およびターミネーターに関してもヒトプロヒビチンをコ
ードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したも
のであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な組み合
わせも可能である。ヒトプロヒビチンをコードするｃＤ
ＮＡはヒトプロヒビチン蛋白をコードするＤＮＡであれ
ば何れでもよく、また化学合成によって合成されたもの
でもよい。さらに発現される蛋白質がプロヒビチンの生
理活性を有するものならば、配列番号１記載の塩基配列
に限定されるものではなく、塩基配列の一部が置換、欠
損、挿入、あるいはこれらが組み合わされた塩基配列を
有するＤＮＡであってもよい。
ーとその形質転換体 上記記載の方法により得られたヒトプロヒビチンｃＤＮ
Ａを適切なベクターに組み込み、該ベクターを適切な宿
主細胞に移入することにより形質転換体を得ることがで
きる。これを常法により培養し培養物よりヒトプロヒビ
チンを大量に生産することができる。ヒトプロヒビチン
をコードするｃＤＮＡをヒトプロヒビチンの発現に適し
たベクターのプロモーター下流に制限酵素とＤＮＡリガ
ーゼを用いる公知の方法により再結合して組換発現ベク
ターを作成することができる。使用できるベクターとし
ては、大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ322 、ｐＵＣ18、
枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ110 、酵母由来のプラス
ミドｐＳＨ15、バクテリオファージλgt10、λgt11ある
いはＳＶ40などが挙げられるが、宿主内で複製、増幅可
能なベクターであれば特に限定されない。プロモーター
およびターミネーターに関してもヒトプロヒビチンをコ
ードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したも
のであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な組み合
わせも可能である。ヒトプロヒビチンをコードするｃＤ
ＮＡはヒトプロヒビチン蛋白をコードするＤＮＡであれ
ば何れでもよく、また化学合成によって合成されたもの
でもよい。さらに発現される蛋白質がプロヒビチンの生
理活性を有するものならば、配列番号１記載の塩基配列
に限定されるものではなく、塩基配列の一部が置換、欠
損、挿入、あるいはこれらが組み合わされた塩基配列を
有するＤＮＡであってもよい。
【００１５】このようにして得られた組換え発現ベクタ
ーはコンビテント細胞法（J. Mol.Biol., 53, 154, 197
0）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 22
1, 551, 1983)、インビトロパッケージング法（Proc. N
atl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975)、ウイルスベク
ター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入
し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯
草菌、酵母および動物細胞などが用いられ、得られた形
質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養され
る。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行われ、
必要に応じて通気、撹拌が行われる。培養物からのヒト
プロヒビチンの分離・精製は公知の分離・精製法を適宜
組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法とし
ては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過法、電気泳動法、
イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグ
ラフィ、逆相高速液体クロマトグラフィなどが挙げられ
る。このようにして得られたヒトプロヒビチンは細胞内
にマイクロインジェクション法により注入することによ
り該細胞の増殖を抑制する活性を示した。
ーはコンビテント細胞法（J. Mol.Biol., 53, 154, 197
0）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 22
1, 551, 1983)、インビトロパッケージング法（Proc. N
atl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975)、ウイルスベク
ター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入
し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯
草菌、酵母および動物細胞などが用いられ、得られた形
質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養され
る。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行われ、
必要に応じて通気、撹拌が行われる。培養物からのヒト
プロヒビチンの分離・精製は公知の分離・精製法を適宜
組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法とし
ては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過法、電気泳動法、
イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグ
ラフィ、逆相高速液体クロマトグラフィなどが挙げられ
る。このようにして得られたヒトプロヒビチンは細胞内
にマイクロインジェクション法により注入することによ
り該細胞の増殖を抑制する活性を示した。
【００１６】（４）抗体の作成 抗原とするプロヒビチンは全構造を保有していてもよ
く、また部分構造を有するフラグメントあるいはペプチ
ドであってもよく、ヒトプロヒビチンの全アミノ酸配列
からフラグメントあるいはペプチド部分を適宜選択する
ことができる。フラグメントあるいはペプチドの調製は
化学合成法、上記遺伝子組換法あるいは天然物の分解の
方法などが用いられる。
く、また部分構造を有するフラグメントあるいはペプチ
ドであってもよく、ヒトプロヒビチンの全アミノ酸配列
からフラグメントあるいはペプチド部分を適宜選択する
ことができる。フラグメントあるいはペプチドの調製は
化学合成法、上記遺伝子組換法あるいは天然物の分解の
方法などが用いられる。
【００１７】抗原とキャリア蛋白の複合体の調製は種々
の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用
できる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、サイログロ
ブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、
通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用い
られる。
の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用
できる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、サイログロ
ブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、
通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用い
られる。
【００１８】免疫される動物としては、マウス、ラッ
ト、ウサギ、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮
下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては
完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュ
バンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週
毎に１回ずつ行われる。
ト、ウサギ、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮
下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては
完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュ
バンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週
毎に１回ずつ行われる。
【００１９】ポリクロナール抗体は免疫された動物から
採血、血清分離し、抗ヒトプロヒビチン抗体を作製す
る。抗体の精製は既知の方法を用いればよく、例えば硫
安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン
交換体の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィな
どの手段により容易に達成することができる。
採血、血清分離し、抗ヒトプロヒビチン抗体を作製す
る。抗体の精製は既知の方法を用いればよく、例えば硫
安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン
交換体の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィな
どの手段により容易に達成することができる。
【００２０】モノクローナル抗体は公知の方法により作
製し得る。例えば、免疫された動物の脾臓あるいはリン
パ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合
させられハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞
としては、マウス、ラット、ヒト等由来のものが使用さ
れ、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好まし
いが、異種間においても可能な場合もある。
製し得る。例えば、免疫された動物の脾臓あるいはリン
パ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合
させられハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞
としては、マウス、ラット、ヒト等由来のものが使用さ
れ、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好まし
いが、異種間においても可能な場合もある。
【００２１】細胞融合の操作は既知の方法、例えばケー
ラーとミルスタインの方法(Nature,256, 495, 1975)に
従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレング
リコールやセンダイウイルスなどがあげられるが、通常
20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分
子量1000〜4000) を用いて20〜40℃、好ましくは30〜37
℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常
１：１〜10：１程度、約１〜10分間程度反応させること
により、細胞融合を実施することができる。
ラーとミルスタインの方法(Nature,256, 495, 1975)に
従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレング
リコールやセンダイウイルスなどがあげられるが、通常
20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分
子量1000〜4000) を用いて20〜40℃、好ましくは30〜37
℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常
１：１〜10：１程度、約１〜10分間程度反応させること
により、細胞融合を実施することができる。
【００２２】抗ヒトプロヒビチン抗体産生ハイブリドー
マのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用で
きる。例えば、ヒトプロヒビチンをコートしたマイクロ
プレートを用いるＥＬＩＳＡ(Enzyme-linked immunosor
bent assay) 法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマ
イクロプレートを用いるＥＩＡ(Enzyme immunoassay)法
などがあげられる。これら免疫化学的手法により、目的
とする抗体を産生しているウエルを得る。このようなウ
エルから、更に例えば限界希釈法によってクローニング
を行いクローンを得る。ハイブリドーマの選別、育種は
通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を含む動物細胞用
培地（例、ＲＰＭＩ1640) で行われる。
マのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用で
きる。例えば、ヒトプロヒビチンをコートしたマイクロ
プレートを用いるＥＬＩＳＡ(Enzyme-linked immunosor
bent assay) 法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマ
イクロプレートを用いるＥＩＡ(Enzyme immunoassay)法
などがあげられる。これら免疫化学的手法により、目的
とする抗体を産生しているウエルを得る。このようなウ
エルから、更に例えば限界希釈法によってクローニング
を行いクローンを得る。ハイブリドーマの選別、育種は
通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を含む動物細胞用
培地（例、ＲＰＭＩ1640) で行われる。
【００２３】このようにして得られたクローンはあらか
じめブリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内
へ移植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に
含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができ
る。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製
の原料とすることもできる。モノクローナル抗体の回収
は免疫グロブリンの精製法として前記の方法を用いれば
よい。これら抗体を用いる免疫学的測定法によりヒト生
体試料中のヒトプロヒビチンの同定や定量を可能とし、
癌診断試薬への応用が期待される。
じめブリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内
へ移植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に
含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができ
る。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製
の原料とすることもできる。モノクローナル抗体の回収
は免疫グロブリンの精製法として前記の方法を用いれば
よい。これら抗体を用いる免疫学的測定法によりヒト生
体試料中のヒトプロヒビチンの同定や定量を可能とし、
癌診断試薬への応用が期待される。
【００２４】ヒトプロヒビチンの免疫学的測定法は、公
知の方法に準ずればよく、例えば蛍光抗体法、受身凝集
反応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施で
きる。本発明のモノクローナル抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、
ＩｇＭいかなるクラスのものでもよく、また該抗体のＦ
ｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦａｂ’あるいはＦａ
ｂ画分、あるいはその重合体を用いてもよい。また、そ
のキメラ抗体であってもよい。
知の方法に準ずればよく、例えば蛍光抗体法、受身凝集
反応法、酵素抗体法などいずれの方法においても実施で
きる。本発明のモノクローナル抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、
ＩｇＭいかなるクラスのものでもよく、また該抗体のＦ
ｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦａｂ’あるいはＦａ
ｂ画分、あるいはその重合体を用いてもよい。また、そ
のキメラ抗体であってもよい。
【００２５】（５）ヒト癌組織の遺伝子解析 本発明により提供されるヒトプロヒビチン遺伝子の中か
ら適切な位置の塩基配列を適宜選択し、その合成オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いることにより該遺
伝子変異の有無の解析を行うことができる。ヒトプロヒ
ビチン遺伝子はＣｃ遺伝子（Eveleth, D. D. et al., N
ucleic Acids Res., 14, 6169, 1986)およびＮＦ１遺伝
子(Hall. A., Cell, 61, 921, 1990) と構造類似性を有
する。プライマーの選択部位は該遺伝子のｃＤＮＡ部
分、イントロン部分および両部の結合部分などいずれの
部位をも選択し得るが、Ｃｃ遺伝子との構造類似性から
よく保存されている塩基配列部位、すなわち第４エクソ
ン部分からプライマーを選択することが適切であり、特
に第４エクソン部分の前後に配位するイントロン部分か
らの選択が好ましい。プライマーとして使用するオリゴ
ヌクレオチドの塩基数としては塩基数から数十塩基まで
使用し得るが好ましくは10塩基から30塩基、さらに好ま
しくは15塩基から25塩基である。
ら適切な位置の塩基配列を適宜選択し、その合成オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いることにより該遺
伝子変異の有無の解析を行うことができる。ヒトプロヒ
ビチン遺伝子はＣｃ遺伝子（Eveleth, D. D. et al., N
ucleic Acids Res., 14, 6169, 1986)およびＮＦ１遺伝
子(Hall. A., Cell, 61, 921, 1990) と構造類似性を有
する。プライマーの選択部位は該遺伝子のｃＤＮＡ部
分、イントロン部分および両部の結合部分などいずれの
部位をも選択し得るが、Ｃｃ遺伝子との構造類似性から
よく保存されている塩基配列部位、すなわち第４エクソ
ン部分からプライマーを選択することが適切であり、特
に第４エクソン部分の前後に配位するイントロン部分か
らの選択が好ましい。プライマーとして使用するオリゴ
ヌクレオチドの塩基数としては塩基数から数十塩基まで
使用し得るが好ましくは10塩基から30塩基、さらに好ま
しくは15塩基から25塩基である。
【００２６】遺伝子解析される生体試料はヒト正常組織
を始め各種ヒト癌組織を用いることができる。組織のＤ
ＮＡは、例えば（Sato T. et al., Cancer Res., 50, 7
184,1990）の方法により抽出・調製することができる。
本発明者らはまずヒト乳癌細胞の遺伝子解析を行なっ
た。本発明のヒトプロヒビチン遺伝子第４エクソンに配
位するイントロン部分、配列番号２記載の塩基配列 134
−152 位のオリゴヌクレオチド5'−GTACTCCAGCCTAGGCAA
C−3'と 491−510位塩基配列のアンチセンスコード部分
のオリゴヌクレオクチド5'−CAGGAAACTAGCAGCCACAT−3'
をプライマーとして使用した。医学的事情により摘出さ
れたヒト乳癌組織（26検体）について上記二種のプライ
マーを用いＰＣＲ法により目的とするヒトプロヒビチン
遺伝子を増幅させ前記と同様に該ヒトプロヒビチン遺伝
子を組み込んだプラスミドにより形質転換させた宿主細
胞を培養しクローンを得る。塩基配列解析の結果表１に
示されるような変異が見られた。コドン105 の位置ＣＧ
ＣがＣＡＣに変異、すなわちアルギニンのヒスチジンへ
の変異（検体番号342)、コドン90−92における２塩基の
欠損（検体番号120)、コドン88における変異（検体番号
136)など第４エクソン部の変異がみられた。これらの事
実は本発明のヒトプロヒビチン遺伝子は癌抑制遺伝子と
しての性格を有し、癌化、増殖と密接に関係することが
示唆され、ヒト乳癌の一つの診断法を提示したものであ
る。
を始め各種ヒト癌組織を用いることができる。組織のＤ
ＮＡは、例えば（Sato T. et al., Cancer Res., 50, 7
184,1990）の方法により抽出・調製することができる。
本発明者らはまずヒト乳癌細胞の遺伝子解析を行なっ
た。本発明のヒトプロヒビチン遺伝子第４エクソンに配
位するイントロン部分、配列番号２記載の塩基配列 134
−152 位のオリゴヌクレオチド5'−GTACTCCAGCCTAGGCAA
C−3'と 491−510位塩基配列のアンチセンスコード部分
のオリゴヌクレオクチド5'−CAGGAAACTAGCAGCCACAT−3'
をプライマーとして使用した。医学的事情により摘出さ
れたヒト乳癌組織（26検体）について上記二種のプライ
マーを用いＰＣＲ法により目的とするヒトプロヒビチン
遺伝子を増幅させ前記と同様に該ヒトプロヒビチン遺伝
子を組み込んだプラスミドにより形質転換させた宿主細
胞を培養しクローンを得る。塩基配列解析の結果表１に
示されるような変異が見られた。コドン105 の位置ＣＧ
ＣがＣＡＣに変異、すなわちアルギニンのヒスチジンへ
の変異（検体番号342)、コドン90−92における２塩基の
欠損（検体番号120)、コドン88における変異（検体番号
136)など第４エクソン部の変異がみられた。これらの事
実は本発明のヒトプロヒビチン遺伝子は癌抑制遺伝子と
しての性格を有し、癌化、増殖と密接に関係することが
示唆され、ヒト乳癌の一つの診断法を提示したものであ
る。
【００２７】
【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【００２８】実施例１ （１）ｍＲＮＡの調製 医学的事情により摘出されたヒト肝 1 gを4Mグアニジウ
ムチオシアネート、0.5 ％Ｎ−ラウロイルザルコシンナ
トリウム、25mMクエン酸ナトリウムpH 7.0、0.1Mメルカ
プトエタノール、0.1 ％アンチホルム（シグマ）溶液 1
0 mlに懸濁させ、ポリトロンによりホモジナイズした。
このホモジネートを 0.1M EDTAを含む 5.7Ｍセシウムク
ロライド水溶液上に重層し、超遠心分離機（ＳＲＰ28
ＳＡローター、日立）を用い、26000rpmで25℃下36時間
遠心分離し、ＲＮＡをペレットとして回収した。得られ
たＲＮＡを10ｍM Tris−HCL 緩衝液（pH 7.4）に溶解
し、エタノールを加えて−70℃下１時間放置した。次に
遠心により沈殿させたＲＮＡを10mM Tris−HCl（pH 7.
4）に溶解し、0.5M KClをさらに加えた。これを同じ緩
衝液を用いて平衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラ
ム（20mmφ×150mm ）に付し、0.5M KCl、10ｍM Tris−
HCl で十分に洗浄後、10ｍM Tris−HCl 水溶液でｍＲＮ
Ａを溶出させた。ヒト肝由来ｍＲＮＡ 500μg を50ｍM
Tris−HCl （pH 7.4）、0.2M NaCl、1mMEDTAを含む10％
から28％ショ糖濃度勾配を形成させた溶液15mlに重層
し、超遠心分離機（ＳＲＰ 28 ローター、日立）を用い
て26000rpmで20℃下16時間遠心分離した。次に 500μl
ずつ分画し、各分画にエタノールを加えｍＲＮＡを沈殿
させた。
ムチオシアネート、0.5 ％Ｎ−ラウロイルザルコシンナ
トリウム、25mMクエン酸ナトリウムpH 7.0、0.1Mメルカ
プトエタノール、0.1 ％アンチホルム（シグマ）溶液 1
0 mlに懸濁させ、ポリトロンによりホモジナイズした。
このホモジネートを 0.1M EDTAを含む 5.7Ｍセシウムク
ロライド水溶液上に重層し、超遠心分離機（ＳＲＰ28
ＳＡローター、日立）を用い、26000rpmで25℃下36時間
遠心分離し、ＲＮＡをペレットとして回収した。得られ
たＲＮＡを10ｍM Tris−HCL 緩衝液（pH 7.4）に溶解
し、エタノールを加えて−70℃下１時間放置した。次に
遠心により沈殿させたＲＮＡを10mM Tris−HCl（pH 7.
4）に溶解し、0.5M KClをさらに加えた。これを同じ緩
衝液を用いて平衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラ
ム（20mmφ×150mm ）に付し、0.5M KCl、10ｍM Tris−
HCl で十分に洗浄後、10ｍM Tris−HCl 水溶液でｍＲＮ
Ａを溶出させた。ヒト肝由来ｍＲＮＡ 500μg を50ｍM
Tris−HCl （pH 7.4）、0.2M NaCl、1mMEDTAを含む10％
から28％ショ糖濃度勾配を形成させた溶液15mlに重層
し、超遠心分離機（ＳＲＰ 28 ローター、日立）を用い
て26000rpmで20℃下16時間遠心分離した。次に 500μl
ずつ分画し、各分画にエタノールを加えｍＲＮＡを沈殿
させた。
【００２９】（２）部分ヒトプロヒビチンｃＤＮＡの合
成 部分ヒトプロヒビチンｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法にて合
成した。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーはNuell M.J.らによ
り報告されたラットプロヒビチンｃＤＮＡのシークエン
スをもとに、DrosophilaのＣｃ遺伝子との間で保存され
ている領域で作製した。 右プライマー (3'）5'−TCACCCTCAGCAGAGATGAT−3' 左プライマー （5'）5'−CGCTCTCGACCACGTAATGT−3' 方法は 0.1μg のヒト肝ｍＲＮＡとＰＣＲバッファー、
ｄＮＴＰｓ、ＤＴＴそして25 pmol の3'オリゴヌクレオ
チドプライマーを合わせ、65℃、５分インキュベーショ
ンし、その後ＲＮＡsin 40 unit 、M−MLV−RT（molone
y murine leukemia virus-reverse transcriptase ：BR
L) 200 unit を加え全量25μl とし42℃で90分インキュ
ベーションする。次いでこの反応物にＰＣＲバッファ
ー、ｄＮＴＰｓ、75 pmol の3'オリゴヌクレオチドプラ
イマー、100 pmolの5'オリゴヌクレオチドプライマーを
さらに加えて全量 100μl としＰＣＲを行う。ＰＣＲの
条件はaneal 温度55℃で２分、extention 温度72℃で２
分、denature温度94℃で１分を35サイクル行い、ＤＮＡ
を増幅し 444bpのプロダクトを得た。
成 部分ヒトプロヒビチンｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法にて合
成した。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーはNuell M.J.らによ
り報告されたラットプロヒビチンｃＤＮＡのシークエン
スをもとに、DrosophilaのＣｃ遺伝子との間で保存され
ている領域で作製した。 右プライマー (3'）5'−TCACCCTCAGCAGAGATGAT−3' 左プライマー （5'）5'−CGCTCTCGACCACGTAATGT−3' 方法は 0.1μg のヒト肝ｍＲＮＡとＰＣＲバッファー、
ｄＮＴＰｓ、ＤＴＴそして25 pmol の3'オリゴヌクレオ
チドプライマーを合わせ、65℃、５分インキュベーショ
ンし、その後ＲＮＡsin 40 unit 、M−MLV−RT（molone
y murine leukemia virus-reverse transcriptase ：BR
L) 200 unit を加え全量25μl とし42℃で90分インキュ
ベーションする。次いでこの反応物にＰＣＲバッファ
ー、ｄＮＴＰｓ、75 pmol の3'オリゴヌクレオチドプラ
イマー、100 pmolの5'オリゴヌクレオチドプライマーを
さらに加えて全量 100μl としＰＣＲを行う。ＰＣＲの
条件はaneal 温度55℃で２分、extention 温度72℃で２
分、denature温度94℃で１分を35サイクル行い、ＤＮＡ
を増幅し 444bpのプロダクトを得た。
【００３０】（３）ｐＢＳＫIIへの組み込みと形質転換 上記のＲＴ−ＰＣＲプロダクトを1.2％アガロースゲル
にて電気泳動を行い444bpのＤＮＡ断片を切り出した。
このＤＮＡ断片を Klenow enzymeで末端修復した後、Ｔ
４リボヌクレオチドキナーゼにより末端をリン酸化し
た。このように処理したＤＮＡ断片と、ＥｃｏＲＶで開
裂し、アルカリフォスファターゼ処理したpBluescript
II SK(−）とをＴ４リガーゼで結合し、大腸菌 E．coli
HB 101 に形質転換して、クローンＨ１、Ｈ２、Ｈ３を
得た。これらクローンをジデオキシ法（ファルマシア、
Ｔ７ sequencing kit ）にて塩基配列を決定したとこ
ろ、Ｈ３にラットプロヒビチンと高いホモロジーがある
ことがわかった。
にて電気泳動を行い444bpのＤＮＡ断片を切り出した。
このＤＮＡ断片を Klenow enzymeで末端修復した後、Ｔ
４リボヌクレオチドキナーゼにより末端をリン酸化し
た。このように処理したＤＮＡ断片と、ＥｃｏＲＶで開
裂し、アルカリフォスファターゼ処理したpBluescript
II SK(−）とをＴ４リガーゼで結合し、大腸菌 E．coli
HB 101 に形質転換して、クローンＨ１、Ｈ２、Ｈ３を
得た。これらクローンをジデオキシ法（ファルマシア、
Ｔ７ sequencing kit ）にて塩基配列を決定したとこ
ろ、Ｈ３にラットプロヒビチンと高いホモロジーがある
ことがわかった。
【００３１】（４）ヒトプロヒビチンｃＤＮＡクローン
の同定 プローブの作製 上記のＨ３クローンを Bam H1 、Hind IIIで開裂し、
1.2％アガロースゲルより444bpのＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡ断片を常法に従い、Klenow enzymeを用
いてγ−32Ｐ−ＣＴＰを導入しプローブとして使用し
た。
の同定 プローブの作製 上記のＨ３クローンを Bam H1 、Hind IIIで開裂し、
1.2％アガロースゲルより444bpのＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡ断片を常法に従い、Klenow enzymeを用
いてγ−32Ｐ−ＣＴＰを導入しプローブとして使用し
た。
【００３２】ｃＤＮＡクローンの同定 ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（CLONTECH）よりファ
ージＤＮＡをトランスファーしたフィルターを作製し
（約 3.5×105 クローン）、上記プローブを用いてＤＮ
Ａハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした
ところ、２つの陽性クローンを得た。この２つのｃＤＮ
Ａの塩基配列を決定したところ、１つにＨ３と同じ塩基
配列を見出すことができ、全ｃＤＮＡ配列は配列番号１
に示す如くヒトプロヒビチンをコードするｃＤＮＡであ
ることを確認した。このｃＤＮＡを組み込んだpBluescr
ipt II SK （−）により形質転換されたE.coli HB101 p
BPH は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
12714 号（FERM P-12714）として平成４年１月21日に寄
託され、その後、微工研条寄第3808号（FERM BP-3808）
として平成４年３月26日に国際寄託された。
ージＤＮＡをトランスファーしたフィルターを作製し
（約 3.5×105 クローン）、上記プローブを用いてＤＮ
Ａハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした
ところ、２つの陽性クローンを得た。この２つのｃＤＮ
Ａの塩基配列を決定したところ、１つにＨ３と同じ塩基
配列を見出すことができ、全ｃＤＮＡ配列は配列番号１
に示す如くヒトプロヒビチンをコードするｃＤＮＡであ
ることを確認した。このｃＤＮＡを組み込んだpBluescr
ipt II SK （−）により形質転換されたE.coli HB101 p
BPH は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
12714 号（FERM P-12714）として平成４年１月21日に寄
託され、その後、微工研条寄第3808号（FERM BP-3808）
として平成４年３月26日に国際寄託された。
【００３３】Genomic クローンの同定 常法に従い作製したヒト genomicコスミドライブラリー
よりコロニーＤＮＡをトランスファーしたフィルターを
作製し、上記のプローブを用いてＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法によりスクリーニングしたところ４つの陽性
クローンを得た。Ｈ３のシークエンスをもとに作製した
プライマーを用いてこの４つのコスミドＤＮＡの塩基配
列を決定したところ、１つのクローンにＨ３と同じ塩基
配列をもつ部分があることが確認された。この塩基配列
とｃＤＮＡの塩基配列と比較することによりイントロン
−エクソン結合部を解析した結果、各エクソンの位置は
配列番号１のＤＮＡ塩基配列において、エクソン１は１
−23位、エクソン２は24−138 位、エクソン３は139 −
300 位、エクソン４は301 −443 位、エクソン５は444
−560 位、エクソン６は561 −656 位、エクソン７は65
7 −1020位であることを確認した。ヒトプロヒビチン遺
伝子のエクソン４と５に配位するイントロン部分の塩基
配列は配列番号２に示した。なお配列番号２におけるエ
クソン４および５部分のアミノ酸番号は配列番号１をも
とにして記載した。
よりコロニーＤＮＡをトランスファーしたフィルターを
作製し、上記のプローブを用いてＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法によりスクリーニングしたところ４つの陽性
クローンを得た。Ｈ３のシークエンスをもとに作製した
プライマーを用いてこの４つのコスミドＤＮＡの塩基配
列を決定したところ、１つのクローンにＨ３と同じ塩基
配列をもつ部分があることが確認された。この塩基配列
とｃＤＮＡの塩基配列と比較することによりイントロン
−エクソン結合部を解析した結果、各エクソンの位置は
配列番号１のＤＮＡ塩基配列において、エクソン１は１
−23位、エクソン２は24−138 位、エクソン３は139 −
300 位、エクソン４は301 −443 位、エクソン５は444
−560 位、エクソン６は561 −656 位、エクソン７は65
7 −1020位であることを確認した。ヒトプロヒビチン遺
伝子のエクソン４と５に配位するイントロン部分の塩基
配列は配列番号２に示した。なお配列番号２におけるエ
クソン４および５部分のアミノ酸番号は配列番号１をも
とにして記載した。
【００３４】実施例２ ｃＤＮＡのＣＯＳ７細胞による発現 ｐｃＤベクター（Okayama, H. and P. Berg., Mol. Cel
l. Biol., 3, 280, 1983）はＳＶ40ウイルスのＤＮＡ複
製開始点と初期プロモーターを持ち、このプロモーター
下流にｃＤＮＡを組み込み、ＳＶ40の T antigenを産生
する細胞株ＣＯＳ７（Y. Glutzman, Cell., 23, 175, 1
981 ）に導入すると、この組換えプラスミドの増幅が起
こり、一過性にｃＤＮＡの強い発現が起こる。
l. Biol., 3, 280, 1983）はＳＶ40ウイルスのＤＮＡ複
製開始点と初期プロモーターを持ち、このプロモーター
下流にｃＤＮＡを組み込み、ＳＶ40の T antigenを産生
する細胞株ＣＯＳ７（Y. Glutzman, Cell., 23, 175, 1
981 ）に導入すると、この組換えプラスミドの増幅が起
こり、一過性にｃＤＮＡの強い発現が起こる。
【００３５】Full-Length ｃＤＮＡクローンであるｐＢ
ＳＰＨよりコーディング領域すべてを含むBam HI−Xho
I 断片を切り出し、Xho I ＋Hind IIIで開裂したｐｃＤ
Ｖ1ベクター（F. Sanger et al., Proc. Nath. Acad. S
ci., 74, 5463, 1977）とＤＮＡリガーゼと結合してｐ
ｃＤＰＨを作製した（図１参照）。この操作によりｃＤ
ＮＡがプロモーター下流に正しい向きに組み込まれた。
ＳＰＨよりコーディング領域すべてを含むBam HI−Xho
I 断片を切り出し、Xho I ＋Hind IIIで開裂したｐｃＤ
Ｖ1ベクター（F. Sanger et al., Proc. Nath. Acad. S
ci., 74, 5463, 1977）とＤＮＡリガーゼと結合してｐ
ｃＤＰＨを作製した（図１参照）。この操作によりｃＤ
ＮＡがプロモーター下流に正しい向きに組み込まれた。
【００３６】ｐｃＤＰＨのプラスミドＤＮＡを調製し、
ＤＥＡＥ−dextran 法（T. Yokotaet al., Proc. Natl.
Acad. Sci., 82, 68, 1985）により、ＣＯＳ７細胞に
トランスフェクトした形質転換細胞は約１日後よりその
培養細胞中にヒトプロヒビチンを産生した。
ＤＥＡＥ−dextran 法（T. Yokotaet al., Proc. Natl.
Acad. Sci., 82, 68, 1985）により、ＣＯＳ７細胞に
トランスフェクトした形質転換細胞は約１日後よりその
培養細胞中にヒトプロヒビチンを産生した。
【００３７】実施例３ ヒトプロヒビチンの哺乳類動物細胞株における発現 実施例２で得たｐｃＤＰＨとｐＳＶ2-dhfr（S. Subrama
ni, R. Mulligan, P.Berg, Mol. Cell. Biol., 1, 854,
1981）をElectro poration法（Bio-Rad 社、Gene Puls
er 0.4kV ／0.4cm. 500μF 、10-15msec 、２回）もし
くはリン酸カルシウム法（Pharmacia 社、キット Cell
Phect ）を用いてＢＨＫ細胞（ATCC、CRL 1632 tk- ts1
3 、大日本製薬）に co-transfectionし、メトトレキサ
ート（ＭＴＸ）250nM で選択してＭＴＸ耐性クローンを
得た。これらのクローンはヒトプロヒビチンを細胞内に
産生した。また、ｐｃＤＰＨをｐＳＶ2 -dhfr 及びｐＳ
Ｖ2-neo （P. J. Southern & P.Berg, J. Mol. Appl. G
ent., 1, 327, 1982 ）とともに、リン酸カルシウム法
（Kao, F. T. and T. T. Puck, Proc. Nath. Acad. Sc
i., 60, 1275, 1981 ）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（ATC
C CCL 61 ）にco-transfection し、1mg ／mlのＧ-418
で選択して neo耐性クローンを得た。次に、このクロー
ンを更に５μM のＭＴＸ含有培地で培養して細胞内にヒ
トプロヒビチンを産生するクローンを得た。
ni, R. Mulligan, P.Berg, Mol. Cell. Biol., 1, 854,
1981）をElectro poration法（Bio-Rad 社、Gene Puls
er 0.4kV ／0.4cm. 500μF 、10-15msec 、２回）もし
くはリン酸カルシウム法（Pharmacia 社、キット Cell
Phect ）を用いてＢＨＫ細胞（ATCC、CRL 1632 tk- ts1
3 、大日本製薬）に co-transfectionし、メトトレキサ
ート（ＭＴＸ）250nM で選択してＭＴＸ耐性クローンを
得た。これらのクローンはヒトプロヒビチンを細胞内に
産生した。また、ｐｃＤＰＨをｐＳＶ2 -dhfr 及びｐＳ
Ｖ2-neo （P. J. Southern & P.Berg, J. Mol. Appl. G
ent., 1, 327, 1982 ）とともに、リン酸カルシウム法
（Kao, F. T. and T. T. Puck, Proc. Nath. Acad. Sc
i., 60, 1275, 1981 ）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（ATC
C CCL 61 ）にco-transfection し、1mg ／mlのＧ-418
で選択して neo耐性クローンを得た。次に、このクロー
ンを更に５μM のＭＴＸ含有培地で培養して細胞内にヒ
トプロヒビチンを産生するクローンを得た。
【００３８】実施例４ 大腸菌によるヒトプロヒビチンの発現 （１）発現プラスミドの作製 ｐＢＰＨからヒトプロヒビチン蛋白質をコードするＤＮ
Ａを作製し、これをλファージのＰＬプロモーターと大
腸菌のrrnBターミネーターの間に挿入し、発現プラスミ
ドｐＢＥＰＨを構築した（図２参照）。λファージのＰ
Ｌプロモーターを含むｐＰＬ−λ（ファルマシア）をＥ
ｃｏＲI とＨｐａＩで切断し、ＰＬプロモーターを含む
470bp 断片を分取した。これをＨａｅ IIIで切断して
プロモーターを含む約 265bpの断片を分取し、下記の合
成ＳＤ配列ＤＮＡ断片 5'-TTAACAACTAAGGGTATCGACAATG-3' 3'-AATTGTTGATTCCCATAGCTGTTAC-5' とともに、さらにｐＢＰＨをＮｌａ IIIで切断後Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ処理したヒトプロヒビチンｃＤＮＡ
断片をＥｃｏＲＩとＢａｌ Ｉで開裂したｐＢＲ322 と
結合してｐＢＥＰＨを得た。
Ａを作製し、これをλファージのＰＬプロモーターと大
腸菌のrrnBターミネーターの間に挿入し、発現プラスミ
ドｐＢＥＰＨを構築した（図２参照）。λファージのＰ
Ｌプロモーターを含むｐＰＬ−λ（ファルマシア）をＥ
ｃｏＲI とＨｐａＩで切断し、ＰＬプロモーターを含む
470bp 断片を分取した。これをＨａｅ IIIで切断して
プロモーターを含む約 265bpの断片を分取し、下記の合
成ＳＤ配列ＤＮＡ断片 5'-TTAACAACTAAGGGTATCGACAATG-3' 3'-AATTGTTGATTCCCATAGCTGTTAC-5' とともに、さらにｐＢＰＨをＮｌａ IIIで切断後Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ処理したヒトプロヒビチンｃＤＮＡ
断片をＥｃｏＲＩとＢａｌ Ｉで開裂したｐＢＲ322 と
結合してｐＢＥＰＨを得た。
【００３９】実施例５ 酵母での発現 ヒトプロヒビチンの酵母での発現ベクターを構築するた
めに、まず酵母における異種遺伝子発現用ベクターｐＹ
ＴＳのクローニングサイトである制限酵素ＢａｍＨＩで
消化後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断部位を平滑にし
た。前記のｐＢＰＨよりヒトプロヒビチン遺伝子を制限
酵母ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで消化後、低融点アガロース
から分離精製しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで制限酵素切断
部位を平滑にした後、前述のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで
処理したｐＹＴＳ ＤＮＡベクターをＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結させｐＹＴＳ−ＰＨを構築した（図３参照）。
めに、まず酵母における異種遺伝子発現用ベクターｐＹ
ＴＳのクローニングサイトである制限酵素ＢａｍＨＩで
消化後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断部位を平滑にし
た。前記のｐＢＰＨよりヒトプロヒビチン遺伝子を制限
酵母ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで消化後、低融点アガロース
から分離精製しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで制限酵素切断
部位を平滑にした後、前述のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで
処理したｐＹＴＳ ＤＮＡベクターをＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結させｐＹＴＳ−ＰＨを構築した（図３参照）。
【００４０】ｐＹＴＳ−ＰＨプラスミドを酵母菌 Sacha
romyces cerevisiae AH22 に酢酸リチウム法（Ito et a
l.，Ｊ．Bacteriol.,153,163,1983 ）で形質転換させ、
ｐＹＴＳ−ＰＨを保持するクローンを得た。プラスミド
ｐＹＴＳは誘導発現可能な酸性フォスファターゼである
ＰＨ０５プロモーターをもちクローニングサイト下流に
転写終結因子であるＧＡＰ（glyceraldehyde-3-phospha
te dehydrogenase）のターミネイターをもつサンドイッ
チ型の異種遺伝子発現ベクターである。ｐＹＴＳ−ＰＨ
を保持する酵母菌 S. cerevisiae AH22 のヒトプロヒビ
チンの発現は以下のようにして行った。すなわち20μg
／mlのヒスチジンと0.15％ KH2PO4を含む Burkholderら
の最小培地10ml中でクローンを30℃でStationary phase
にまで増殖させ、0.15％KH2PO4の代りに0.15％KCl を含
む Burkholder 培地 100mlに移し、リン酸制御下でＰＨ
０５プロモーターを30℃18時間誘導発現させた。リン酸
制御下で30℃48時間誘導発現させた後、酵母を遠心回収
し10mlの 1.2Mソルビトール50mM KH2PO4-50mM Na2PO4
pH 7.2 のバッファーに懸濁し 100μlの 500μg ／ml Z
ymolyae 100T（Seikagaku ）を加え37℃で１時間溶菌し
た。溶菌後セルペレットを1mM PMSF-50mM Tris−HCl (p
H 7.5 ）−10mM EDTA-1 ％ＳＤＳに溶解し 15000回転30
分遠心後上清より細胞抽出液を回収した。この細胞抽出
液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、クマシーブルー
染色後、予想される分子量である30KDa に酵母で過剰発
現されたヒトプロヒビチンを検出することができた。さ
らにヒトプロヒビチン抗体を用いたウエスタンブロッテ
イングによりこの蛋白質がヒトプロヒビチンであること
を確認した。
romyces cerevisiae AH22 に酢酸リチウム法（Ito et a
l.，Ｊ．Bacteriol.,153,163,1983 ）で形質転換させ、
ｐＹＴＳ−ＰＨを保持するクローンを得た。プラスミド
ｐＹＴＳは誘導発現可能な酸性フォスファターゼである
ＰＨ０５プロモーターをもちクローニングサイト下流に
転写終結因子であるＧＡＰ（glyceraldehyde-3-phospha
te dehydrogenase）のターミネイターをもつサンドイッ
チ型の異種遺伝子発現ベクターである。ｐＹＴＳ−ＰＨ
を保持する酵母菌 S. cerevisiae AH22 のヒトプロヒビ
チンの発現は以下のようにして行った。すなわち20μg
／mlのヒスチジンと0.15％ KH2PO4を含む Burkholderら
の最小培地10ml中でクローンを30℃でStationary phase
にまで増殖させ、0.15％KH2PO4の代りに0.15％KCl を含
む Burkholder 培地 100mlに移し、リン酸制御下でＰＨ
０５プロモーターを30℃18時間誘導発現させた。リン酸
制御下で30℃48時間誘導発現させた後、酵母を遠心回収
し10mlの 1.2Mソルビトール50mM KH2PO4-50mM Na2PO4
pH 7.2 のバッファーに懸濁し 100μlの 500μg ／ml Z
ymolyae 100T（Seikagaku ）を加え37℃で１時間溶菌し
た。溶菌後セルペレットを1mM PMSF-50mM Tris−HCl (p
H 7.5 ）−10mM EDTA-1 ％ＳＤＳに溶解し 15000回転30
分遠心後上清より細胞抽出液を回収した。この細胞抽出
液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、クマシーブルー
染色後、予想される分子量である30KDa に酵母で過剰発
現されたヒトプロヒビチンを検出することができた。さ
らにヒトプロヒビチン抗体を用いたウエスタンブロッテ
イングによりこの蛋白質がヒトプロヒビチンであること
を確認した。
【００４１】実施例６ 乳癌組織の遺伝子解析実験 （１）乳癌組織からのＤＮＡ抽出法 乳癌におけるヒトプロヒビチン遺伝子の変異を検出する
ためにまず乳癌患者における腫瘍および正常組織からＤ
ＮＡの抽出を行った。医学的事情により摘出された乳癌
および正常組織を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用い
て組織を液体窒素を少量ずつ加えながら細かく砕き微粉
末にした。あらかじめ４mlの溶解液(10mM Tris−HCl 、
50mM NaCl 、50mM EDTA 、pH 8.5）を入れたチューブに
この粉末を液体窒素で冷やしながら移す。よく撹拌した
後、プロテアーゼＫ（10mg／ml）を 0.35ml 、10％ＳＤ
Ｓを0.4ml 加え時々撹拌しながら37℃で４時間以上静置
する。次にフェノール・クロロホルム・イソアミルアル
コール（25：24：１）４mlを加え37℃で１晩ゆっくりシ
ェーカーで撹拌する。3000回転、20分間遠心後、パスツ
ールピペットで上清を注意深く新しいチューブに移し、
フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（2
5：24：１）４mlを加え37℃で２時間シェーカーでゆっ
くり撹拌する。3000回転20分間遠心後、上清を新しいチ
ューブに移し４mlのクロロホルム・イソアミルアルコー
ル（24：１）を加えシェーカーでゆっくり撹拌する。80
00回転10分間遠心後上清を新しいチューブに移す。中間
層に白い変性蛋白質の層がみえなくなるまで上記のステ
ップを繰返す。上清に等量のイソプロピルアルコールを
加えＤＮＡを沈澱させる。白濁浮遊物（ＤＮＡ）が析出
してくればシリコナイズしたパスツールピペットでエッ
ペンドルフチューブに移す。量の少ない場合は8000回転
10分間の遠心にてＤＮＡを沈殿させて回収後70％エタノ
ールでリンスしたのち、エタノールを捨て室温で数時間
放置しアルコールを蒸発させる。このようにしてＤＮＡ
を抽出しプロヒビチン遺伝子の解析に使用した。
ためにまず乳癌患者における腫瘍および正常組織からＤ
ＮＡの抽出を行った。医学的事情により摘出された乳癌
および正常組織を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用い
て組織を液体窒素を少量ずつ加えながら細かく砕き微粉
末にした。あらかじめ４mlの溶解液(10mM Tris−HCl 、
50mM NaCl 、50mM EDTA 、pH 8.5）を入れたチューブに
この粉末を液体窒素で冷やしながら移す。よく撹拌した
後、プロテアーゼＫ（10mg／ml）を 0.35ml 、10％ＳＤ
Ｓを0.4ml 加え時々撹拌しながら37℃で４時間以上静置
する。次にフェノール・クロロホルム・イソアミルアル
コール（25：24：１）４mlを加え37℃で１晩ゆっくりシ
ェーカーで撹拌する。3000回転、20分間遠心後、パスツ
ールピペットで上清を注意深く新しいチューブに移し、
フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（2
5：24：１）４mlを加え37℃で２時間シェーカーでゆっ
くり撹拌する。3000回転20分間遠心後、上清を新しいチ
ューブに移し４mlのクロロホルム・イソアミルアルコー
ル（24：１）を加えシェーカーでゆっくり撹拌する。80
00回転10分間遠心後上清を新しいチューブに移す。中間
層に白い変性蛋白質の層がみえなくなるまで上記のステ
ップを繰返す。上清に等量のイソプロピルアルコールを
加えＤＮＡを沈澱させる。白濁浮遊物（ＤＮＡ）が析出
してくればシリコナイズしたパスツールピペットでエッ
ペンドルフチューブに移す。量の少ない場合は8000回転
10分間の遠心にてＤＮＡを沈殿させて回収後70％エタノ
ールでリンスしたのち、エタノールを捨て室温で数時間
放置しアルコールを蒸発させる。このようにしてＤＮＡ
を抽出しプロヒビチン遺伝子の解析に使用した。
【００４２】（２）乳癌組織におけるプロヒビチン遺伝
子変異解析 乳癌組織におけるプロヒビチン遺伝子の変異を検出する
ためにまずDrosophilaのＣｃ遺伝子と相同性の高いエク
ソン４について塩基配列の決定を行った。まずＰＣＲ法
によってエクソン４を増幅する必要がある。本発明のヒ
トプロヒビチンのｃＤＮＡと染色体ヒトプロヒビチンの
コスミドクローンの構造解析から、配列番号２に示すよ
うにイントロン−エクソン結合部を確認している。この
配列を基にエクソン４を含む２つのイントロン内にＰＣ
Ｒ用のプライマーとして下記の２種を設けた。 5'-GTACTCCAGCCTAGGCAAC-3' （配列番号２における 134
−152 位塩基のセンスコード）と 5'-CAGGAAACTAGCAGCCACAT-3'（配列番号２における 491
−510 位塩基のアンチセンスコード）。 これらのプライマーを用い、まずＰＣＲ法によりエクソ
ン４を含む領域を増幅し、あらかじめｃＩｐ処理した p
Bluescript II SK（−）のＥｃｏＲＶサイトにポリヌク
レオチドキナーゼ処理およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処
理したＰＣＲプロダクトをサブクローニングした。次い
でこれらの反応混合物を E. coliに導入した後、プラス
ミドＤＮＡを調製しＰＣＲの際に用いたプライマーより
も更に内側のプライマー（配列番号２において 197−21
4 位塩基のセンスコード部と 421−437 位塩基のアンチ
センスコード部）を用いて両方向からＤＮＡ塩基配列を
決定した。正常組織と腫瘍組織におけるプロヒビチン染
色体のエクソン４の塩基配列を比較検討した結果、表１
に示す如く腫瘍組織検体番号 136、 432、 120、 218に
変異を確認した。
子変異解析 乳癌組織におけるプロヒビチン遺伝子の変異を検出する
ためにまずDrosophilaのＣｃ遺伝子と相同性の高いエク
ソン４について塩基配列の決定を行った。まずＰＣＲ法
によってエクソン４を増幅する必要がある。本発明のヒ
トプロヒビチンのｃＤＮＡと染色体ヒトプロヒビチンの
コスミドクローンの構造解析から、配列番号２に示すよ
うにイントロン−エクソン結合部を確認している。この
配列を基にエクソン４を含む２つのイントロン内にＰＣ
Ｒ用のプライマーとして下記の２種を設けた。 5'-GTACTCCAGCCTAGGCAAC-3' （配列番号２における 134
−152 位塩基のセンスコード）と 5'-CAGGAAACTAGCAGCCACAT-3'（配列番号２における 491
−510 位塩基のアンチセンスコード）。 これらのプライマーを用い、まずＰＣＲ法によりエクソ
ン４を含む領域を増幅し、あらかじめｃＩｐ処理した p
Bluescript II SK（−）のＥｃｏＲＶサイトにポリヌク
レオチドキナーゼ処理およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処
理したＰＣＲプロダクトをサブクローニングした。次い
でこれらの反応混合物を E. coliに導入した後、プラス
ミドＤＮＡを調製しＰＣＲの際に用いたプライマーより
も更に内側のプライマー（配列番号２において 197−21
4 位塩基のセンスコード部と 421−437 位塩基のアンチ
センスコード部）を用いて両方向からＤＮＡ塩基配列を
決定した。正常組織と腫瘍組織におけるプロヒビチン染
色体のエクソン４の塩基配列を比較検討した結果、表１
に示す如く腫瘍組織検体番号 136、 432、 120、 218に
変異を確認した。
【００４３】
【表１】
【００４４】他のエクソンについても配列番号２に示さ
れる塩基配列から適切なプライマーを設計すれば、同様
の方法で変異の検定が可能である。また公知の RNase P
rotection 法、ＳＳＣＰ法などを用いても塩基配列の異
常を検出しうる。
れる塩基配列から適切なプライマーを設計すれば、同様
の方法で変異の検定が可能である。また公知の RNase P
rotection 法、ＳＳＣＰ法などを用いても塩基配列の異
常を検出しうる。
【００４５】実施例７ ポリクロナール抗体の作製 配列番号１記載のヒトプロヒビチンアミノ酸配列をもと
に、69−87位、 110−118 位、 140−158 位、 175−19
7 位および 200−221 位のアミノ酸配列を有する５種の
ペプチドを抗原として選択し、それぞれのペプチドを自
動ペプチド固相合成機を用いて合成した。各合成ペプチ
ドは縮合剤マレイミド活性エステルを用いる方法でキャ
リア蛋白質キイホールリンペットとの複合体を調製し、
免疫抗原とした。これら複合体を完全フロイントアジュ
バンドと混和し、ウサギの皮下に２週間ごと合計５回免
疫し、抗体を作製した。抗体産生の確認はそれぞれの抗
原ペプチドをマイクロプレートに固相化し、採血した血
清を添加、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した
抗ウサギ免疫グロブリン抗体を用いるＥＬＩＳＡ法によ
り行った。
に、69−87位、 110−118 位、 140−158 位、 175−19
7 位および 200−221 位のアミノ酸配列を有する５種の
ペプチドを抗原として選択し、それぞれのペプチドを自
動ペプチド固相合成機を用いて合成した。各合成ペプチ
ドは縮合剤マレイミド活性エステルを用いる方法でキャ
リア蛋白質キイホールリンペットとの複合体を調製し、
免疫抗原とした。これら複合体を完全フロイントアジュ
バンドと混和し、ウサギの皮下に２週間ごと合計５回免
疫し、抗体を作製した。抗体産生の確認はそれぞれの抗
原ペプチドをマイクロプレートに固相化し、採血した血
清を添加、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した
抗ウサギ免疫グロブリン抗体を用いるＥＬＩＳＡ法によ
り行った。
【００４６】このようにして得られた抗体について、各
種試料に対する反応性を検討した。まず各抗体は上記Ｅ
ＬＩＳＡ法において、それぞれの抗原合成ペプチドに反
応性を示し、さらにヒトプロヒビチンｃＤＮＡを含むプ
ラスミドで形質転換した大腸菌を培養しヒトプロヒビチ
ンを発現させ、ウエスタンブロット分析において陽性反
応を示した。ヒト正常組織、ヒト癌組織およびヒト癌細
胞株それぞれについて、１％ＣＨＡＰＳリン酸溶液でホ
モジナイズし抽出した溶液をウエスタンブロット法にて
分析した。その結果、配列番号１記載の 200−221 位ア
ミノ酸配列を有するペプチドを抗原とする抗体は、肝臓
および粘膜下織神経のヒト正常組織に陽性、粘膜下織神
経癌組織に対し陰性、培養癌細胞株（ヒト乳癌ＭＸ−
１）に対し陽性反応を示した。これらの結果から、本発
明の抗体は生体試料中のプロヒビチンの確認、定量に利
用することができる。
種試料に対する反応性を検討した。まず各抗体は上記Ｅ
ＬＩＳＡ法において、それぞれの抗原合成ペプチドに反
応性を示し、さらにヒトプロヒビチンｃＤＮＡを含むプ
ラスミドで形質転換した大腸菌を培養しヒトプロヒビチ
ンを発現させ、ウエスタンブロット分析において陽性反
応を示した。ヒト正常組織、ヒト癌組織およびヒト癌細
胞株それぞれについて、１％ＣＨＡＰＳリン酸溶液でホ
モジナイズし抽出した溶液をウエスタンブロット法にて
分析した。その結果、配列番号１記載の 200−221 位ア
ミノ酸配列を有するペプチドを抗原とする抗体は、肝臓
および粘膜下織神経のヒト正常組織に陽性、粘膜下織神
経癌組織に対し陰性、培養癌細胞株（ヒト乳癌ＭＸ−
１）に対し陽性反応を示した。これらの結果から、本発
明の抗体は生体試料中のプロヒビチンの確認、定量に利
用することができる。
【００４７】
【発明の効果】本発明によれば、新規なヒトプロヒビチ
ンおよびそれをコードするｃＤＮＡが提供される。抗ヒ
トプロヒビチン抗体を用いる免疫学的手法により生体試
料のヒトプロヒビチンの定性、定量、またヒトプロヒビ
チン遺伝子の一部オリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用いるＰＣＲ法により生体試料の遺伝子解析を可能に
し臨床診断薬として有用である。またヒトプロヒビチン
の医薬への利用に関しても可能性を有し、研究試薬とし
ても有用である。さらにヒト乳癌組織における変異ヒト
プロヒビチン遺伝子およびそれがコードする蛋白質を提
供することで生体試料中の該遺伝子または該蛋白質の定
量が可能となり、新しいヒト乳癌診断法となりうる。さ
らに予想されるプロヒビチンの機能からこれらは乳癌に
限定されるものではない。
ンおよびそれをコードするｃＤＮＡが提供される。抗ヒ
トプロヒビチン抗体を用いる免疫学的手法により生体試
料のヒトプロヒビチンの定性、定量、またヒトプロヒビ
チン遺伝子の一部オリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用いるＰＣＲ法により生体試料の遺伝子解析を可能に
し臨床診断薬として有用である。またヒトプロヒビチン
の医薬への利用に関しても可能性を有し、研究試薬とし
ても有用である。さらにヒト乳癌組織における変異ヒト
プロヒビチン遺伝子およびそれがコードする蛋白質を提
供することで生体試料中の該遺伝子または該蛋白質の定
量が可能となり、新しいヒト乳癌診断法となりうる。さ
らに予想されるプロヒビチンの機能からこれらは乳癌に
限定されるものではない。
【００４８】
配列番号：１ 配列の長さ：1020 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト ライブラリ−名：ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリ− 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を表わす記号：Peptide 存在位置：２３．．８３９ 特徴を決定した記号：Ｓ 配列 ＴＧＴＧＧＡＧＧＴＣ ＡＧＡＧＴＧＧＡＡＧ ＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧ ＡＧ
ＧＧＴＣＣＡＧＣ ＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣ ＡＴＧ ＧＣＴ 56 Met Ala 1 GCC AAA GTG TTT GAG TCC ATT GGC AAG TTT GGC CTG GCC TTA GCT GTT 104 Ala Lys Val Phe Glu Ser Ile Gly Lys Phe Gly Leu Ala Leu Ala Val 5 10 15 GCA GGA GGC GTG GTG AAC TCT GCC TTA TAT AAT GTG GAT GCT GGG CAC 152 Ala Gly Gly Val Val Asn Ser Ala Leu Tyr Asn Val Asp Ala Gly His 20 25 30 AGA GCT GTC ATC TTT GAC CGA TTC CGT GGA GTG CAG GAC ATT GTG GTA 200 Arg Ala Val Ile Phe Asp Arg Phe Arg Gly Val Gln Asp Ile Val Val 35 40 45 50 GGG GAA GGG ACT CAT TTT CTC ATC CCG TGG GTA CAG AAA CCA ATT ATC 248 Gly Glu Gly Thr His Phe Leu Ile Phe Trp Val Gln Lys Pro Ile Ile 55 60 65 TTT GAC TGC CGT TCT CGA CCA CGT AAT GTG CCA GTC ATC ACT GGT AGC 296 Phe Asp Cys Arg Ser Arg Pro Arg Asn Val Pro Val Ile Thr Gly Ser 70 75 80 AAA GAT TTA CAG AAT GTC AAC ATC ACA CTG CGC ATC CTC TTC CGG CCT 344 Lys Asp Leu Gln Asn Val Asn Ile Thr Leu Arg Ile Leu Phe Arg Pro 85 90 95 GTC GCC AGC CAG CTT CCT CGC ATC TTC ACC AGC ATC GGA GAG GAC TAT 392 Val Ala Ser Gln Leu Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ile Gly Glu Asp Tyr 100 105 110 GAT GAG CGT GTG CTG CCG TCC ATC ACA ACT GAG ATC CTC AAG TCA GTG 440 Asp Glu Arg Val Leu Pro Ser Ile Thr Thr Glu Ile Leu Lys Ser Val 115 120 125 130 GTG GCT CGC TTT GAT GCT GGA GAA CTA ATC ACC CAG AGA GAG CTG GTC 488 Val Ala Arg Phe Asp Ala Gly Glu Leu Ile Thr Gln Arg Glu Leu Val 135 140 145 TCC AGG CAG GTG AGC GAC GAC CTT ACA GAG CGA GCC GCC ACC TTT GGG 536 Ser Arg Gln Val Ser Asp Asp Leu Thr Gln Arg Ala Ala Thr Phe Gly 150 155 160 CTC ATC CTG GAT GAC GTG TCC TTG ACA CAT CTG ACC TTC GGG AAG GAG 584 Leu Ile Leu Asp Asp Val Ser Leu Thr His Leu Thr Phe Gly Lys Glu 165 170 175 TTC ACA GAA GCG GTG GAA GCC AAA CAG GTG GCT CAG CAG GAA GCA GAG 632 Phe Thr Glu Ala Val Glu Ala Lys Gln Val Ala Gln Gln Glu Ala Glu 180 185 190 AGG GCC AGA TTT GTG GTG GAA AAG GCT GAG CAA CAG AAA AAG GCG GCC 680 Arg Ala Arg Phe Val Val Glu Lys Ala Glu Gln Gln Lys Lys Ala Ala 195 200 205 210 ATC ATC TCT GCT GAG GGC GAC TCC AAG GCA GCT GAG CTG ATT GCC AAC 728 Ile Ile Ser Ala Glu Gly Asp Ser Lys Ala Ala Glu Leu Ile Ala Asn 215 220 225 TCA CTG GCC ACT GCA GGG GAT GGC CTG ATC GAG CTG CGC AAG CTG GAA 776 Ser Leu Ala Thr Ala Gly Asp Gly Leu Ile Glu Leu Arg Lys Leu Glu 230 235 240 GCT GCA GAG GAC ATC GCG TAC CAG CTC TCA CGC TCT CGG AAC ATC ACC 824 Ala Ala Glu Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Ser Arg Ser Arg Asn Ile Thr 245 250 255 TAC CTG CCA GCG GGG CAG TCC GTG CTC CTC CAG CTG CCC CAG 866 Tyr Leu Pro Ala Gly Gln Ser Val Leu Leu Gln Leu Pro Gln 260 265 270 TGAGGGCCCA CCCTGCCTGC ACCTCCGCGGG CTGACTGGG CCACAGCCCC GATGATTCTT 926 AACACAGCCT TCCTTCTGCT CCCACCCCAG AAATCACTGT GAAATTTCAT GATTGGCTTA 986 AAGTGAAGGA AATAAAGGTA AAATCACTTC AGAT 1020
ＧＧＴＣＣＡＧＣ ＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣ ＡＴＧ ＧＣＴ 56 Met Ala 1 GCC AAA GTG TTT GAG TCC ATT GGC AAG TTT GGC CTG GCC TTA GCT GTT 104 Ala Lys Val Phe Glu Ser Ile Gly Lys Phe Gly Leu Ala Leu Ala Val 5 10 15 GCA GGA GGC GTG GTG AAC TCT GCC TTA TAT AAT GTG GAT GCT GGG CAC 152 Ala Gly Gly Val Val Asn Ser Ala Leu Tyr Asn Val Asp Ala Gly His 20 25 30 AGA GCT GTC ATC TTT GAC CGA TTC CGT GGA GTG CAG GAC ATT GTG GTA 200 Arg Ala Val Ile Phe Asp Arg Phe Arg Gly Val Gln Asp Ile Val Val 35 40 45 50 GGG GAA GGG ACT CAT TTT CTC ATC CCG TGG GTA CAG AAA CCA ATT ATC 248 Gly Glu Gly Thr His Phe Leu Ile Phe Trp Val Gln Lys Pro Ile Ile 55 60 65 TTT GAC TGC CGT TCT CGA CCA CGT AAT GTG CCA GTC ATC ACT GGT AGC 296 Phe Asp Cys Arg Ser Arg Pro Arg Asn Val Pro Val Ile Thr Gly Ser 70 75 80 AAA GAT TTA CAG AAT GTC AAC ATC ACA CTG CGC ATC CTC TTC CGG CCT 344 Lys Asp Leu Gln Asn Val Asn Ile Thr Leu Arg Ile Leu Phe Arg Pro 85 90 95 GTC GCC AGC CAG CTT CCT CGC ATC TTC ACC AGC ATC GGA GAG GAC TAT 392 Val Ala Ser Gln Leu Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ile Gly Glu Asp Tyr 100 105 110 GAT GAG CGT GTG CTG CCG TCC ATC ACA ACT GAG ATC CTC AAG TCA GTG 440 Asp Glu Arg Val Leu Pro Ser Ile Thr Thr Glu Ile Leu Lys Ser Val 115 120 125 130 GTG GCT CGC TTT GAT GCT GGA GAA CTA ATC ACC CAG AGA GAG CTG GTC 488 Val Ala Arg Phe Asp Ala Gly Glu Leu Ile Thr Gln Arg Glu Leu Val 135 140 145 TCC AGG CAG GTG AGC GAC GAC CTT ACA GAG CGA GCC GCC ACC TTT GGG 536 Ser Arg Gln Val Ser Asp Asp Leu Thr Gln Arg Ala Ala Thr Phe Gly 150 155 160 CTC ATC CTG GAT GAC GTG TCC TTG ACA CAT CTG ACC TTC GGG AAG GAG 584 Leu Ile Leu Asp Asp Val Ser Leu Thr His Leu Thr Phe Gly Lys Glu 165 170 175 TTC ACA GAA GCG GTG GAA GCC AAA CAG GTG GCT CAG CAG GAA GCA GAG 632 Phe Thr Glu Ala Val Glu Ala Lys Gln Val Ala Gln Gln Glu Ala Glu 180 185 190 AGG GCC AGA TTT GTG GTG GAA AAG GCT GAG CAA CAG AAA AAG GCG GCC 680 Arg Ala Arg Phe Val Val Glu Lys Ala Glu Gln Gln Lys Lys Ala Ala 195 200 205 210 ATC ATC TCT GCT GAG GGC GAC TCC AAG GCA GCT GAG CTG ATT GCC AAC 728 Ile Ile Ser Ala Glu Gly Asp Ser Lys Ala Ala Glu Leu Ile Ala Asn 215 220 225 TCA CTG GCC ACT GCA GGG GAT GGC CTG ATC GAG CTG CGC AAG CTG GAA 776 Ser Leu Ala Thr Ala Gly Asp Gly Leu Ile Glu Leu Arg Lys Leu Glu 230 235 240 GCT GCA GAG GAC ATC GCG TAC CAG CTC TCA CGC TCT CGG AAC ATC ACC 824 Ala Ala Glu Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Ser Arg Ser Arg Asn Ile Thr 245 250 255 TAC CTG CCA GCG GGG CAG TCC GTG CTC CTC CAG CTG CCC CAG 866 Tyr Leu Pro Ala Gly Gln Ser Val Leu Leu Gln Leu Pro Gln 260 265 270 TGAGGGCCCA CCCTGCCTGC ACCTCCGCGGG CTGACTGGG CCACAGCCCC GATGATTCTT 926 AACACAGCCT TCCTTCTGCT CCCACCCCAG AAATCACTGT GAAATTTCAT GATTGGCTTA 986 AAGTGAAGGA AATAAAGGTA AAATCACTTC AGAT 1020
【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：850 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト ライブラリ−名：ヒト染色体ライブラリ− 配列の特徴 特徴を表す記号：イントロン、エクソン 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCCTGTCTCT ACAAAACCAT CAAACAGCTG GGTGTGGCGG CGCGTGCTTG TAATCCCAGC 60 TACTCAGGAG GCTGAGGCAG GAGAATTGCT TGAATCTGGG AGGCAGAGGT TGTAGTGAGC 120 CCAGATTGTC CATGTACTCC AGCCTAGGCA ACAAGAGCAA AAACCTGTCT CAAAAAAAAA 180 AAAAAACAAA AAAAAAACAC TTGTTTTCCT ACAGTGGTTT TTATTTTTAA CTCCAGTGTT 240 TGTCCCCTAC CCTAAGAT TTA CAG AAT GTC AAC ATC ACA CTG CGC ATC CTC 291 Leu Gln Asn Val Asn Ile Thr Leu Arg Ile Leu 85 90 95 TTC CGG CCT GTC GCC AGC CAG CTT CCT CGC ATC TTC ACC AGC ATC GGA 339 Phe Arg Pro Val Ala Ser Gln Leu Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ile Gly 100 105 110 GAG GAC TAT GAT GAG CGT GTG CTG CCG TCC ATC ACA ACT GAG ATC CTC 387 Glu Asp Tyr Asp Glu Arg Val Leu Pro Ser Ile Thr Thr Glu Ile Leu 115 120 125 AAG TCA GTG GTG GTGAGTGAAC AGGGGCCTTT AGCTCGAGCC CAGAGCACCA 439 Lys Ser Val Val 130 CCCTGGGAGG GGCGCAGGTG GCAGGAAGCG CTTGGCAGTG GGTTGGTTGG GATGTGGCTG 499 CTAGTTTCCT GGTTCCTTTT CTGCTTCCTC ATTAACCTGA CCTGCCCTTC TGCTCCTCCC 559 TTTGAAACCA G GCT CGC TTT GAT GCT GGA GAA CTA ATC ACC CAG AGA GAG 609 Ala Arg Phe Asp Ala Gly Glu Leu Ile Thr Gln Arg Glu 135 140 CTG GTC TCC AGG CAG GTG AGC GAC GAC CTT ACA GAG CGA GCC GCC ACC 657 Leu Val Ser Arg Gln Val Ser Asp Asp Leu Thr Glu Arg Ala Ala Thr 145 150 155 160 TTT GGG CTC ATC CTG GAT GAC GTG TCC TGG GTAAGATCCT TCGGGAGACC 707 Phe Gly Leu Ile Leu Asp Asp Val Ser Leu 165 170 GAGGAGGGGG AAGGGGCTGC AGTTCTCGTT TAGGTGCCTG GCTCCATTCT GGGTAGACGC 767 TATTAGGTCC TCCTTCTGCT TGCTAGATGT GAGACTTGAA ACACGAACAT GCTGAGGTGA 827 GGCAGTTCCG TGGTTCAGTG AGG 850
【図１】ｐｃＤベクタ−を用いたｐｃＤＨの構築工程図
【図２】ｐＢＥＰＨの構築工程図
【図３】ｐＹＴＳＰＨの構築工程図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/12 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 8114−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｔ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 8413−4Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (13)
- 【請求項１】 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を
有するヒトプロヒビチン。 - 【請求項２】 配列番号１で表わされるヒトプロヒビチ
ンをコードするＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号２で表わされるヒトプロヒビチ
ン遺伝子のイントロンＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項２記載のｃＤＮＡを発現可能なプ
ラスミドに組み込み、それで形質転換された宿主細胞。 - 【請求項５】 請求項１記載のヒトプロヒビチンまたは
その部分構造ペプチドを抗原とする抗体。 - 【請求項６】 ヒトプロヒビチン遺伝子の変異の有無を
検定するに際し、配列番号１記載のＤＮＡ配列の一部ま
たは配列番号２記載のイントロンＤＮＡ配列の一部をプ
ライマーとして使用することを特徴とするヒトプロヒビ
チン遺伝子解析方法。 - 【請求項７】 ヒトプロヒビチン遺伝子の変異の有無を
検定する際にプライマーとして用いられる試薬であっ
て、配列番号１記載のＤＮＡ配列の一部または配列番号
２記載のイントロンＤＮＡ配列の一部からなることを特
徴とするヒトプロヒビチン遺伝子解析試薬。 - 【請求項８】 プライマーとして配列番号２記載の 134
−152 位塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび 4
91−510 位塩基配列のアンチセンスコードを有するオリ
ゴヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項６記載
のヒトプロヒビチン遺伝子解析方法。 - 【請求項９】 プライマーとして用いられる試薬が、配
列番号２記載の 134−152 位塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドおよび 491−510 位塩基配列のアンチセンス
コードを有するオリゴヌクレオチドであることを特徴と
する請求項７記載のヒトプロヒビチン遺伝子解析試薬。 - 【請求項１０】 配列番号１で表わされるヒトプロヒビ
チンをコードするＤＮＡにおいて、アミノ酸番号88位コ
ドンＧＴＣ（バリンのコドン）がＧＣＣ（アラニンのコ
ドン）に変異したＤＮＡまたはそれがコードする蛋白
質。 - 【請求項１１】 配列番号１で表わされるヒトプロヒビ
チンをコードするＤＮＡにおいて、アミノ酸番号 105位
コドンＣＧＣ（アルギニンのコドン）がＣＡＣ（ヒスチ
ジンのコドン）に変異したＤＮＡまたはそれがコードす
る蛋白質。 - 【請求項１２】 配列番号１で表わされるヒトプロヒビ
チンをコードするＤＮＡにおいて、塩基番号 320−324
位のＣＡＣＡＣのＣＡが欠損しているＤＮＡ。 - 【請求項１３】 配列番号２で表わされるＤＮＡにおい
て、塩基番号 409位の塩基ＣがＴに変異したＤＮＡ。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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-
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-
1995
- 1995-01-10 US US08/370,789 patent/US5599707A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013172421A1 (ja) | 2012-05-17 | 2013-11-21 | 杏林製薬株式会社 | Ａｍｐｋタンパク質活性化剤のスクリーニング方法及びａｍｐｋタンパク質活性化剤 |
| US9863955B2 (en) | 2012-05-17 | 2018-01-09 | Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. | AMPK activator screening method, and AMPK activator |
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