JPH05292976A

JPH05292976A - マレック病ウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH05292976A
Application number: JP3353559A
Authority: JP
Inventors: Johannes Antonius Joseph Claessens; ヨハンネス・アントニウス・ヨセフ・クラエツセンス; Martha J Willemse; マルタ・ヤコバ・ウイレムス; Paulus J A Sondermeijer; パウルス・ヤコブス・アントニウス・ソンデルメイエル
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1990-11-16
Filing date: 1991-11-15
Publication date: 1993-11-09
Also published as: EP0486106A2; US5283191A; EP0486106A3

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】家禽をＭＤに対して免疫するのに使用できる
マレック病ウイルスのＭＤ１８及びＭＤ２０ポリペプチ
ドの提供。【構成】マレック病ウイルスポリペプチドをコードす
る核酸配列、この種の核酸配列を含む組換え核酸分子、
前記核酸配列を含むベクターウイルス、この種の核酸配
列で形質転換した宿主細胞、マレック病ウイルスポリペ
プチド及び該ポリペプチドと反応する抗体、並びにマレ
ック病に対するワクチン。ＭＤ１８ポリペプチド（アミ
ノ酸約６６３個分の長さ）をコードする遺伝子はＭＤＶ
ゲノムの非反復長（ｕｎｉｑｕｅｌｏｎｇ、即ち
Ｕ_Ｌ）領域にマップされ、ＭＤ２０ポリペプチド（アミ
ノ酸約１０７４個分の長さ）をコードする遺伝子もＭＤ
ＶゲノムのＵ_Ｌ領域にマップされる。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、マレック病ウイルスポリペプチドをコードす
る核酸配列、この種の核酸配列を含む組換え核酸分子、
前記核酸配列を含むベクターウイルス、この種の核酸配
列で形質転換した宿主細胞、マレック病ウイルスポリペ
プチド及び該ポリペプチドと反応する抗体、並びにマレ
ック病に対するワクチンに係わる。マレック病（ＭＤ）
は、ヘルペスウイルスの一種であるマレック病ウイルス
（ＭＤＶ）によって引き起こされる家禽の悪性リンパ球
増殖障害である。ＭＤは遍在性であり、世界中の家禽生
産国で発生する。集約的生産システムで飼育しているニ
ワトリは、ＭＤによる損失から免れ得ない。ＭＤは日齢
約６週間以上のニワトリに起こり、日齢１２〜２４週間
の間で最も頻繁に発生する。臨床的には３種類の形態の
ＭＤが認識されている。即ち、古典的ＭＤ、急性ＭＤ及
び過渡的麻痺である。古典的ＭＤは、リンパ浸潤及び脱
髄によって生じる末梢神経の拡大を特徴とし、麻痺は主
要な臨床的症候である。死亡率は一定していないが、通
常は１０〜１５％以下である。急性形態では、内臓器官
に多発性及び広範性のリンパ腫が見られる。この形態の
ＭＤによる死亡率は通常、古典的形態の場合より高い。
非予防接種集団では罹患率が通常１０〜３０％であり、
集団の７０％までを巻き添えにして大規模に発生するこ
ともある。古典的ＭＤ及び急性ＭＤの両方における病理
学的障害は本質的に類似しており、正常組織中への悪性
形質転換Ｔリンパ球芽の増殖及び浸潤が生じる。これ
は、古典的形態の場合は末梢神経、急性形態の場合は内
臓器官に見られる。また、ＭＤＶは突発性麻痺を特徴と
する若いニワトリの脳炎の原因となることが判明した。
ＭＤ関連ウイルスの血清学的分類によれば、血清型は下
記の３つである：Ｉ型：ニワトリに対して病原性且つ腫瘍形成性であるマ
レック病ウイルスの天然の毒性株、及びこの株から誘導
された弱毒非病原性株。ＩＩ型：マレック病ウイルスの天然の非病原性株。ＩＩＩ型：ニワトリに対して非病原性である七面鳥ヘル
ペスウイルス（ＨＶＴ）。ＭＤＶ血清型Ｉの病原性株の連続継代は、病原性及び腫
瘍原性は喪失させるが免疫原性は喪失させないことが判
明した。ＨＰＲＳ−１６株及びＣＶＩ−９８８株に由来
する弱毒株はワクチンとして使用されてきた。ＳＢ−Ｉ
株及びＨＮ−ＩＭＤＶ株（血清型２）も予防接種に有用
であることが判明した。最初に七面鳥から単離されたＨ
ＶＴは七面鳥及び家禽に対して非病原性であり、血清型
１及び２ＭＤウイルスに抗原的に関係し、ＭＤに対する
ワクチンとして広く使用されている。ＭＤは治療法がな
く、飼育しているニワトリを感染源から隔離する管理方
法と、遺伝的に耐性のある種類の使用と、ワクチン投与
とに基づいた抑制方法がとられている。しかしながら、
管理操作は通常コストパフォーマンスが低く、また遺伝
子操作により耐性を増強した家禽種を選択しても期待ほ
どの進歩はみられなかった。現在のところ、ＭＤの抑制
はほぼ１００％ワクチン投与に基づいている。現在のワ
クチンは、化学的に不活性化したウイルスのワクチン、
又は修飾した生ウイルスのワクチンからなる。しかしな
がら、不活性化ワクチンは付加的免疫を必要とし、不都
合なことにアジュバントを含み、製造コストが高く、且
つ投与が面倒である。また、感染性ウイルス粒子の一部
が不活性化プロセスの後も生存し得、動物への投与後に
病気を引き起こし得る。通常は弱毒生ウイルスワクチン
が好ましい。なぜなら、この種のワクチンはしばしば体
液反応及び細胞反応の両方に基づく免疫反応を誘起する
からである。ＭＤＶ血清型Ｉ株をベースとするこの種の
ワクチンは従来、組織培養の毒性株の連続継代によって
しか製造できなかった。しかしながら、このような処理
を行うと、ウイルスゲノム中に非制御突然変異が導入さ
れ、その結果毒性及び免疫特性に関して異質のウイルス
粒子集団が形成される。この種のワクチンはまた、細胞
培養の継代中の過剰な弱毒化という問題も伴い得る。従
って、ワクチンの毒性を消すと共にその予防効果を保持
するような微妙なバランスの達成が要求される。また、
このような従来の弱毒ウイルスワクチンは毒性を取り戻
すことがあり、その場合はワクチン投与した動物が発病
し、病原が他の動物に広がる可能性があることも良く知
られている。生ＨＶＴワクチンでは余り効果的に予防で
きなかったＭＤウイルスの極めて有毒な株が単離された
が、この株は世界の様々な場所で過剰な損失をもたらし
ている。血清型２株及び血清型３株を含む二価ワクチン
は、場合によっては、極めて有毒な単離体に対して妥当
な効果を示す。血清型１抗原を含む多価ワクチンは、こ
れらの極めて有毒な株に対する免疫を誘起する上で更に
効果的な筈である。本発明者は、組換えＤＮＡ技術に基
づく改良ワクチンの製造に注目した。この種のワクチン
は、ＭＤＶ病原体に対する防護的免疫反応を誘起するこ
とができる必要且つ有意味なＭＤＶ免疫原物質、又はこ
の物質をコードする遺伝情報のみを含むことになり、生
ワクチン又は不活性化ワクチンに伴う前述の欠点はもた
ないであろうと考えられた。本発明では、ＭＤＶポリペ
プチドをコードする核酸配列であって、家禽をＭＤに対
して免疫するためのワクチンの製造に使用できる核酸配
列を提供する。本明細書で使用する「核酸配列」という
用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指
すものであり、リボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列
の両方を意味する。原則として、この用語は分子の一次
構造に係わる。従って、この用語には二重鎖ＤＮＡ、一
重鎖ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、一重鎖ＲＮＡ及びこれらの
修飾体が含まれる。「ポリペプチド」という用語は通
常、生物学的活性を有するアミノ酸分子鎖に係わり、産
生物の特定長さを示すものではない。このポリペプチド
は、必要であれば、例えばグリコシル化、アミド化、カ
ルボキシル化又はホスホリル化によりｉｎｖｉｖｏ又
はｉｎｖｉｔｒｏで修飾し得る。従って、この用語に
は特にペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質が含ま
れる。本発明では、それぞれＭＤＶポリペプチドＭＤ１
８又はＭＤ２０をコードする遺伝子を含む核酸配列を単
離し、特性を調べた。その結果、これらの核酸配列は宿
主の免疫系によって認識されることが判明した。前記ポ
リペプチドをコードする遺伝子は、毒性ＭＤウイルス株
に感染したニワトリに由来する多価血清を用いて、ラム
ダｇｔ１１ベクターで作成したバクテリオファージ発現
ライブラリーをスクリーニングすることにより同定し
た。ＭＤ１８ポリペプチドをコードする遺伝子はＭＤＶ
ゲノムの非反復長（ｕｎｉｑｕｅｌｏｎｇ、即ち
Ｕ_Ｌ）領域にマップされ、アミノ酸約６６３個分の長さ
のポリペプチドをコードする。ＭＤ１８遺伝子によって
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱＩ
ＤＮＯ：２に示されている。ＭＤ２０ポリペプチドを
コードする遺伝子もＭＤＶゲノムのＵ_Ｌ領域にマップさ
れ、アミノ酸約１０７４個分の長さのポリペプチドをコ
ードする。ＭＤ２０遺伝子によってコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４に示さ
れている。本発明はより特定的には、それぞれＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２又はＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されてい
るアミノ酸配列を有するＭＤ１８ポリペプチド又はＭＤ
２０ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。対
応する免疫学的特性をもつ前記ＭＤ１８又はＭＤ２０ポ
リペプチドの機能的等価物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅ
ｑｕｉｖａｌｅｎｔ）をコードする核酸配列も本発明の
範囲内に含まれる。血清型１のＧＡ株に由来する本発明
の特定のＭＤ１８又はＭＤ２０ポリペプチドに関して
は、１型ＭＤＶの個々のウイルス又は株の間に自然変種
が存在し得る。これらの変種は、配列全体における１つ
又は複数のアミノ酸の相違、又は前記配列における１つ
又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは
付加によって表し得る。生物学的活性及び免疫学的活性
を本質的に変えないものであることを予想させるアミノ
酸置換は既に記述されている。関連アミノ酸間のアミノ
酸置換又は進化の過程でしばしば発生した置換は、特に
Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａ
ｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，
Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑ
ｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂ
ｉｏｍｅｄＲｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎＤ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．
３参照）。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅ
ａｒｓｏｎは、タンパク質を迅速且つ敏感に比較し（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２２７，１４３５−１４４１，１９８
５）、同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチドの間
の類似性を決定する方法を開発した。このような機能的
等価物をコードする核酸配列は本発明の範囲内に含まれ
る。また、これら種々の機能的等価物をコードする核酸
配列の製造に組換えＤＮＡ技術を使用する可能性も存在
する。本発明の核酸配列は、好ましくは、血清型１のＭ
ＤＶ株、例えばＧＡ、ＪＭ、ＨＰＲＳ−１６、Ｃｏｎｎ
Ａ、ＲＢ−ＩＢＣＶＩ−９８８又はＭｄ１１のよう
な株の入手可能な単離体に由来し得る。最も好ましい株
はＧＡ株である。また、ＭＤ１８ポリペプチド、ＭＤ２
０ポリペプチド又は上記したこれらポリペプチドの変種
をコードする核酸配列は、血清型２又は血清型３に属す
るＭＤＶ株、例えばＨＮ、ＨＰＲＳ−２４、ＳＢ−１又
はＦＣ１２６にも由来し得る。ＳＥＱＩＤＮＯ：１
〜４に示した情報を利用すれば、当業者は本明細書に開
示されているＭＤ１８又はＭＤ２０ポリペプチドに対応
する免疫学的特性をもつ前述の種々の機能的等価ポリペ
プチドをコードする核酸配列を単離し且つ同定すること
ができる。そのためには、一般的に使用されているブロ
ッティング及びハイブリダイゼーション技術を使用し得
る（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒ．Ｊ．Ｓｌａｔｅｒ，Ｃ
ｌｉｆｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６；Ｓｉｎｇｅｒ
−Ｓａｍ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８０，８０２−８０６，１９８３；Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，
ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９）。例えば、特定の
ＭＤＶ株に由来する制限酵素消化ＤＮＡフラグメントを
電気泳動にかけ、その後で一片のニトロセルロースフィ
ルターに移す、すなわち「ブロット」する。こうする
と、ＳＥＱＩＤＮＯ：２又はＳＥＱＩＤＮＯ：４
に示されているアミノ酸配列から逆翻訳した所定の標識
ＤＮＡ即ち「プローブ」を用いて、フィルター上に存在
する任意の同種ＤＮＡ配列へのプローブのハイブリダイ
ゼーションを可能にする特定の塩濃度条件及び温度条件
の下でハイブリダイゼーションさせることにより、フィ
ルター上の機能的等価ポリペプチドをコードする核酸配
列を同定することができる。ハイブリダイズした物質
は、フィルターの洗浄後にオートラジオグラフィーによ
って検出し得る。このようにして、ブロットしなかった
出発ＤＮＡを含むアガロースゲルから、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２又は４に示されているポリペプチドと機能的に
等価のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることがで
きる。別の方法として、特定のＭＤＶ株から得たＤＮＡ
をλｇｔ１１ファージにクローン化し、細菌宿主中で発
現させることもできる。次いで、精製ＭＤ１８又はＭＤ
２０ポリペプチドに対する多価血清を用いて組換えファ
ージをスクリーニングにかけ、その変種ポリペプチドの
対応する免疫学的特性を調べればよい。前述の方法の概
要は実施例１で詳述する。ＭＤ１８又はＭＤ２０に対し
て誘起される多価血清の産生は後で説明する。当業者に
は良く知られているように、遺伝暗号の縮重はコドンに
おける塩基の置換を可能にし、その結果別のコドン、但
し依然として同じアミノ酸をコードするコドンが得られ
る。例えば、アミノ酸グルタミン酸に対するコドンはＧ
ＡＴ及びＧＡＡの両方である。従つて、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２又はＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されているア
ミノ酸配列を有するポリペプチドの発現に関しては、前
記ＳＥＱＩＤに示されている核酸配列とは異なる前述
のような別のコドン組成を有する誘導核酸配列を使用す
ることができる。本発明の好ましい核酸配列の１つは、
該配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１又はＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：３に示されているデオキシリボ核酸配列を含むこと
を特徴とする。また、ＭＤ１８もしくはＭＤ２０ポリペ
プチド、又はこれらポリペプチドの前述のような機能的
等価物をコードする核酸配列のフラグメントも本発明の
範囲に含まれる。本明細書で使用する「フラグメント」
という用語は、本発明のいずれか１つの核酸配列又はポ
リペプチドの亜配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む
ＤＮＡ又はアミノ酸配列を意味する。このフラグメント
は、ＭＤＶポリペプチドの１つ以上の免疫反応性及び／
又は抗原性決定基を有するポリペプチドであるか又はこ
のポリペプチドをコードする。即ち、ニワトリにおいて
免疫反応を誘起できるエピトープを１つ以上有し、及び
／又は相補的抗体に特異的に結合することができる。使
用可能なポリペプチドフラグメントを決定する方法は後
で説明する。フラグメントは特に、ＤＮＡの場合には制
限エンドヌクレアーゼを使用し且つポリペプチドの場合
はプロテアーゼを使用して、前駆体分子の酵素開裂によ
り形成することができる。その他に、フラグメントを化
学的に合成する方法、又は適当な宿主細胞環境内に導入
したＤＮＡフラグメントによりポリペプチドフラグメン
トを発現させる方法もある。ＭＤ１８又はＭＤ２０ポリ
ペプチドの前述のような機能的等価物を産生せしめる修
飾は、ＭＤ１８又はＭＤ２０ポリペプチドの免疫学的特
性を本質的に変化させるものでない限り、総て本発明の
範囲内に含まれる。本発明の核酸配列は、自然の状態で
はこれと結合しない種々の複製実行ＤＮＡ配列であっ
て、β−ガラクトシダーゼのような融合タンパク質配列
をコードするＤＮＡ部分を任意に含むＤＮＡ配列に連結
することができ、その結果、適当な宿主の形質転換に使
用できるいわゆる組換え核酸分子が得られる。このよう
なハイブリッドＤＮＡ分子は、例えばプラスミドに由来
するか、又はバクテリオファージ、コスミドもしくはウ
イルス中に存在する核酸配列に由来するのが好ましい。
本発明の核酸配列のクローニングに使用し得る特定ベク
ターは当業者に公知であり、特にプラスミドベクター例
えばｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びブルー
スクリプトプラスミド、バクテリオファージ例えばλｇ
ｔ−Ｗｅｓ−λＢ、Ｃｈａｒｏｎ２８及びＭ１３誘導フ
ァージ、又はウイルスベクター例えばＳＶ４０、アデノ
ウイルスもしくはポリオーマウイルスが挙げられる（Ｒ
ｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒ
ｔ編、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｓｕｒｖｅｙｏｆｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓａ
ｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．ら、Ａｒｃ
ｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１０，１−２４，１９９０参
照）。本発明の組換え核酸分子の形成に使用される方法
は当業者に公知であり、特にＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら
（前出の文献，１９８９）によって記述されている。例
えば、本発明の核酸配列をクローニングベクター中に挿
入する操作は、遺伝子及び所望のクローニングベクター
の両方を同じ制限酵素で切断した場合には、それによっ
て相補的ＤＮＡ末端が形成されるため、Ｔ_４ＤＮＡリガ
ーゼのような酵素での連結によって容易に実施できる。
あるいは、ブラントエンドに形成した制限部位を、一重
鎖ＤＮＡを消化するか、又は凹んだ（ｒｅｃｅｓｓｉｖ
ｅ）末端を適当なＤＮＡポリメラーゼを用いて充填する
ことによって修飾しなければならないこともある。その
場合は、その後で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのような酵素を
用いてブラントエンドの連結を実施し得る。所望であれ
ば、ＤＮＡ末端にリンカーを連結して任意の制限部位を
形成し得る。これらのリンカーは制限部位配列をコード
する特異的オリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限酵
素で開裂したベクター及び核酸配列は、ホモポリマーテ
イリング（ｔａｉｌｉｎｇ）によって修飾してもよい。
本明細書で使用する「形質転換」という用語は、使用す
る方法に関係なく、例えば直接的取り込みであれ、又は
形質導入であれ、異種核酸配列を宿主細胞中に導入する
ことを意味する。前記異種核酸配列は自律的複製を通し
て維持し得、又は宿主ゲノム中に組込み得る。所望であ
れば、挿入した核酸配列の発現を調節できる所定の宿主
に適合する適当な制御配列を組換えＤＮＡ分子に具備し
得る。本発明の組換え核酸分子は、所望の形質転換細胞
を選択するのに使用し得る１つ以上のマーカー活性、例
えばｐＢＲ３２２の場合のアンピシリン及びテトラサイ
クリン耐性、ｐＵＣ８の場合のアンピシリン耐性及びβ
−ガラクトシダーゼ活性を有するのが好ましい。適当な
宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列または
このような核酸配列を含むベクターウイルスまたは組換
え核酸分子によって形質転換することができ、所望であ
れば前記核酸配列によってコードされる前記ポリペプチ
ドを発現するのに使用することができる細胞である。宿
主細胞は、細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏ
ｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ種）のような原核細胞由来のもの、ま
たは酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）もしくはより高級な真核細胞（例えば
昆虫、植物、または、ＨｅＬａ細胞及びチャイニーズハ
ムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖ
ａｒｙ，ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物）のような真核細
胞由来のものとすることができる。昆虫細胞としては、
ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９
またはＳｆ２１細胞系を挙げることができる（Ｌｕｃｋ
ｏｗら，Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６，４７−５
５，１９８９）。真核細胞クローニング系における本発
明の核酸配列のクローニング及び発現に関する情報はＥ
ｓｓｅｒ，Ｋ．ら（ＰｌａｓｍｉｄｓｏｆＥｕｋａ
ｒｙｏｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９
８６）に見ることができる。一般に、ＤＮＡ配列をクロ
ーニング及び操作し、本発明に有効なベクターを構築す
るためには原核細胞が好ましい。例えばＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２は特に有効である。使用し得る他の微生物株とし
ては、ＤＨ５α、ＪＭ１０１またはＨＢ１０１のような
Ｅ．ｃｏｌｉ株を挙げることができる。発現のために
は、本発明の核酸配列を発現制御配列に機能可能な（有
効に発現する）ように結合させる。このような制御配列
は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、イン
デューサー、リボソーム結合部位などを含むことができ
る。宿主細胞が細菌である場合には、有効な発現制御配
列の例としては、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター
（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオ
ペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ２７５，６
１５，１９７８）；外層膜タンパク質（ＯＭＰ）プロモ
ーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．及びＩｎｏｕｇｅ，
Ｍ．，ＥＭＢＯＪ．１，７７１−７７５，１９８２）；
バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター
（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミ
ラーゼ（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーター及びオペ
レーター、終結配列、及び、選択された宿主細胞と適合
性の他の発現増強及び制御配列を挙げることができる。
宿主細胞が酵母である場合には、有効な発現制御配列の
例としては、例えばα−交配因子（ｍａｔｉｎｇｆａｃ
ｔｏｒ）を挙げることができる。昆虫細胞については、
バキュロウイルスのポリヘドリン（Ｐｏｌｙｈｅｄｒｉ
ｎ）またはｐ１０プロモーターを使用することができる
（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳
動物由来のものである場合には、有効な発現制御配列の
例としては、例えばＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍ
ａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２，５２４−
５２７，１９８３）または例えばメタロチオネインプロ
モーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
２９６，３９−４２，１９８２）または熱ショックプ
ロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，４９４９−５３，１
９８５）を挙げることができる。或いは、ＭＤＶ中に存
在する発現制御配列、特にＭＤ１８またはＭＤ２０の発
現を調節するものを適用することもできる。遺伝子発現
を最高にするためには、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒ
（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６
８，４７３，１９７９）も参照されたい。更に本発明
は、通常は伴なう全ウイルスまたは他のタンパク質を実
質的に含まず、配列識別番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）２
または配列識別番号４にそれぞれ示したＭＤ１８または
ＭＤ２０アミノ酸配列の少なくとも一部分またはその誘
導体を含む、ＭＤＶ免疫学的特性を示すポリペプチドか
らなる。実質的に同じ免疫学的特性を示す前記アミノ酸
配列の誘導体、即ち免疫学的等価物も本発明の範囲内に
あると理解されたい。本明細書に開示したＭＤ１８また
はＭＤ２０ポリペプチドの免疫学的等価物は、ＭＤ血清
型１の他の株のウイルスまたは血清型２もしくは３に属
す株のウイルスに存在する対応するポリペプチドであ
る。前記等価物は、前記等価物をコードする遺伝子の発
現によって生産することができる。この遺伝子は、上述
のごとく本明細書中で提供される情報を使用して同定及
び単離される。更に、家禽のＭＤに対する免疫感作に使
用することができるＭＤ１８もしくはＭＤ２０ポリペプ
チドのフラグメントまたはその機能的等価物を含むポリ
ペプチドも本発明に含まれる。既知のアミノ酸配列内で
このような使用可能なポリペプチドフラグメントを検出
するためには種々の方法が公知である。（１つ以上の）
エピトープを含む本発明のポリペプチドの適当な免疫化
学的に活性なポリペプチドフラグメントは、特許出願第
ＷＯ８６／０６４８７号、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３９
９８−４００２，１９８４）、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．
ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−
２７４，１９８７）に記載の、所謂ｐｅｐ−ｓｃａｎ法
に基づく方法によって見付けることができる。この方法
においては、問題の完全なポリペプチドの一部配列に対
応する一部重なり合った一連のポリペプチドを合成し、
それらの抗体との反応性を調査する。更に、理論的考
察、及び今や既知となっているエピトープとの構造的一
致性に基づいて、前記アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドのいくつかの領域をエピトープと指定することができ
る。このような領域の決定は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ
に従う親水性基準（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．７８，３８２４−３８２８，１９８１）とＣｈｏ
ｕ及びＦａｓｍａｎに従う二次構造態様（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４７，４５−１４
８，１９８７）との組合せに基づいていた。必要となり
得るＴ細胞エピトープは同様に、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの
両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５．１０５９−６
２，１９８７）によって理論的に導くことができる。こ
のようなエピトープは、カテプシンＤのタンパク質分解
活性にポリペプチドを限定的に暴露することにより実験
的に生成することもできる。この酵素によるタンパク質
抗原の切断は、抗原供与細胞の表面にある主要組織適合
性複合体によって認識されるペプチドのＮＨ_２−末端残
基内にも認められるアミノ酸配列パターンを特異的に認
識するものである（ｖ．Ｎｏｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．及びｖ．
ｄ．Ｄｒｉｆｔ，Ａ．Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６４．１４１５９，１９８９）。本発明の別の実
施態様においては、上述の核酸配列によってコードされ
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用する。例え
ば、ＭＤＶ感染に対する家禽の免疫感作を、免疫学的関
連を有する本発明のポリペプチドを所謂サブユニットワ
クチンとして動物に投与することにより行なうことがで
きる。本発明に従うサブユニットワクチンは、必要によ
っては医薬的に許容可能な担体の存在下に、純粋形態の
ポリペプチドを含有することができる。ポリペプチドは
必要によっては、例えば融合生成物の精製に有利となり
得る非関連タンパク質に共有結合させることができる。
これらは例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテイン
Ａ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａなどである。場合
によっては、上記ポリペプチド自体に対する中和抗体を
誘起する能力が低いことがある。免疫原性を増大するた
めに、小フラグメントを担体分子に結合することが好ま
しい。この目的に適した担体は、例えば天然ポリマー
（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔのヘモシアニン、アル
ブミン、毒素）、ポリアミノ酸のような合成ポリマー
（ポリリシン、ポリアラニン）、またはサポニンのよう
な両親媒性化合物のミセルといった高分子である。或い
はかかるフラグメントは、そのポリマー、好ましくは直
鎖状ポリマーとして提供することができる。かかるサブ
ユニットワクチンに使用されるポリペプチドは、例えば
前記ポリペプチドをＭＤＶから単離するか、組換えＤＮ
Ａ技術によるかまたは化学合成によるなど当分野におい
ては公知の方法で製造することができる。必要であれ
ば、ワクチンに使用される本発明のポリペプチドは、例
えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリ
ン酸化によってｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ
で変性することができる。サブユニットワクチンに替わ
るものは生体ベクターワクチン（生ワクチン）である。
本発明の核酸配列は組換えＤＮＡ技術によって微生物
（例えば細菌またはウイルス）中に、組換え微生物が尚
も複製でき、従って挿入された核酸配列によってコード
されるポリペプチドを発現するように導入される。例え
ばｉｎｖｉｖｏ相同組換え技術を使用し、異種（ｈｅ
ｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）核酸配列、例えば本発明の核酸
配列をベクター微生物のゲノム中に導入することができ
る。第１に、ベクターゲノムの挿入領域、即ち感染また
は複製に必要なもののようなベクターの必須機能を阻害
することなく異種配列を組込むために使用され得る領域
に対応するＤＮＡフラグメントを、標準的な組換えＤＮ
Ａ技術に従ってクローニングベクター中に挿入する。挿
入領域は多数の微生物において報告されている（例えば
欧州特許第８０，８０６号、欧州特許第１１０，３８５
号、欧州特許第８３，２８６号、欧州特許第３１４，５
６９号、特許第ＷＯ８８／０２０２２号及び特許第Ｗ
Ｏ８８／０７０８８号）。第２に、所望であれば、第
１のステップで得られた組換えＤＮＡ分子中に存在する
挿入領域に欠失を導入することができる。これは、例え
ば、第１のステップで得られた組換えＤＮＡ分子を適当
なエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化または制限酵素処理す
ることにより行なうことができる。第３に、第１のステ
ップの組換えＤＮＡ分子中に存在する挿入領域中または
前記組換え分子から欠失させたＤＮＡの箇所に異種核酸
配列を挿入する。挿入領域のＤＮＡ配列は、ベクターゲ
ノムとの相同組換えが起こるような適当な長さのもので
あるべきである。次いで、適当なベクターＤＮＡ配列を
両端に有する（これによって、組換えＤＮＡ分子中の対
応する領域とベクターゲノムとの間で組換えが生じる）
挿入物を含む組換えＤＮＡ分子の存在下にベクターゲノ
ムＤＮＡを用いて適当な細胞を形質転換することができ
る。そうして組換えベクターの子孫を細胞培養液中で生
産し、例えばハイブリダイゼーション、異種核酸配列と
同時組込みされた遺伝子によってコードされる酵素活性
を検出すること、または組換えベクターによって発現さ
れる抗原性異種ポリペプチドを免疫学的に検出すること
により、遺伝子型でまたは発現型で選択することができ
る。次にこの組換え微生物を、免疫感作のために宿主動
物に投与し、その後それを維持したり、必要によっては
接種動物の体内で複製させ、ベクター生物内に挿入され
た本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチド
をｉｎｖｉｖｏで発現させ、接種動物の免疫系を刺激
することができる。本発明の核酸配列の組込みに適した
ベクターは、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスの
ような（トリ）ポックスウイルス（欧州特許第３１４，
５６９号及び特許第ＷＯ８８／０２０２２号）、ＨＶ
Ｔのようなヘルペスウイルス（特許第ＷＯ８８／０７
０８８）、アデノウイルスまたはインフルエンザウイル
スのようなウイルスや、Ｅ．ｃｏｌｉまたは特定のサル
モネラ種のような細菌から誘導することができる。この
タイプの組換え微生物を用い、宿主細胞中で合成された
ポリペプチドを表面抗原として露出させることができ
る。この点で、前記ポリペプチドと、ＯＭＰタンパク質
即ち例えばＥ．ｃｏｌｉの毛タンパク質（ｐｉｌｕｓ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ）または生物によって認識されるシグ
ナル及びアンカー配列の合成前駆体（Ｓｙｎｔｈｅｔｉ
ｃｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）との融合が考えられる。ま
た、前記免疫原性ポリペプチドは、所望であればより大
きなものの一部として、免疫感作される動物内に放出さ
れることも可能である。このような場合の全てにおい
て、１種以上の免疫原性産物を発現させ、種々の病原体
及び／または所与の病原体の種々の抗原に対する防御を
与えることも可能である。本発明のワクチンは、本発明
の核酸配列を含むベクターウイルスに感染させた宿主細
胞を培養することにより製造することができ、次いでウ
イルス含有細胞及び／または細胞中で増殖させたベクタ
ーウイルスを、必要によっては純粋形態で回収し、必要
によっては凍結乾燥形態のワクチンに形成することがで
きる。本発明の核酸配列を含む上述の宿主細胞は、前記
核酸配列によってコードされるポリペプチドの発現に有
利な条件下に培養することもできる。ワクチンは、粗培
養液、宿主細胞溶解液または宿主細胞抽出物の試料を使
用して製造することもできるが、別の実施態様において
は、その目的とする用途に従って、より精製された本発
明のポリペプチドがワクチンに形成される。産生された
ポリペプチドを精製するためには、本発明の核酸配列を
含む宿主細胞を適当な培地（ｖｏｌｕｍｅ）中で培養
し、産生されたポリペプチドをかかる細胞から、または
タンパク質が分泌されていれば培地から単離する。培地
中に分泌されたポリペプチドは標準的な技法、例えば塩
析（ｓａｌｔｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、遠心分
離、限外▲ろ▼過、クロマトグラフィー、ゲル▲ろ▼過
またはイムノアフィニティークロマトグラフィーによっ
て単離及び精製することができるが、一方、細胞内のポ
リペプチドは、まず前記細胞を回収し、それらを例えば
超音波処理または他の機械的破壊手段（例えばフレンチ
プレス）によって破壊し、次いで他の細胞内成分からポ
リペプチドを分離し、ポリペプチドをワクチンに形成す
ることができる。細胞破壊は、化学的（例えばＥＤＴＡ
処理）またはリゾチーム消化のような酵素手段によって
も行なうことができる。本発明のポリペプチドに対する
抗体または抗血清は、受動免疫療法、診断イムノアッセ
イ及び抗イディオタイプ抗体の生産に潜在的用途を有す
る。上述のごときＭＤＶポリペプチドＭＤ１８またはＭ
Ｄ２０は、ポリクローナル、単一特異性及びモノクロー
ナルいずれの抗体を生産するのにも使用することができ
る。ポリクローナル抗体が所望であれば、ポリクローナ
ル血清を生産及び処理する技法が当分野において公知で
ある（例えばＭａｙｅｒ及びＷａｌｔｅｒ編，Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌ
ｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ロンドン，１９８７）。簡
単に言えば、選択した哺乳動物、例えばウサギに、上述
の免疫原の１種を、即ち免疫感作１回当たり約２０μｇ
〜約８０μｇのタンパク質を（複数回）注射する。免疫
感作は、許容可能なアジュバントと共に、一般には等量
の免疫原及びアジュバントを用いて与える。許容可能な
アジュバントとしては、完全フロイントアジュバント、
不完全フロイントアジュバント、ミョウバン沈降物また
は油中水型エマルジョンを挙げることができるが、一次
免疫感作には完全フロインアジュバントが好ましい。不
完全フロイントアジュバントは全ての二次免疫感作に好
ましい。一次免疫感作は、約１ｍｌのエマルジョンをウ
サギの背部の複数の皮下部位に投与することからなる。
等量の免疫原を使用する二次免疫感作は約１カ月の間隔
で与え、適当なレベルの抗体が個々のラビットの血清中
に存在するまで継続する。血液を採取し、当分野におい
ては公知の方法で血清を単離する。免疫原の各々に対す
る単一特異性抗体は、精製タンパク質を用い上述のごと
くウサギに免疫感作することにより製造され、次いで、
Ｈａｌｌらの方法（Ｎａｔｕｒｅ３１１，３７９−３
８７，１９８４）の改良方法によって多種特異性（ｐｏ
ｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）血清からアフィニティー精製す
る。本明細書中で使用される単一特異性抗体とは、関連
抗原に対して相同結合特性を有する単一の抗体種または
複数の抗体種と定義される。本明細書中で使用される相
同結合とは、特定の抗原またはエピトープに結合する抗
体種の能力を指す。ＭＤＶ免疫原の各々に対するモノク
ローナル抗体は、同血統交配マウス、好ましくはＢａｌ
ｂ／ｃを適当なタンパク質で免疫感作することにより製
造することができる。マウスを、等量の適当なアジュバ
ント中０．５ｍｌ当たり約１００ｎｇ〜約１０μｇの免
疫原を用い腹腔内免疫感作する。かかる許容可能なアジ
ュバントとしては、完全フロイントアジュバント、不完
全フロイントアジュバント、ミョウバン沈降物及び油中
水型エマルジョンを挙げることができる。マウスには、
一次免疫感作の約１４、２１及び６３日後に、アジュバ
ントを含まない等量の免疫原で静脈内二次免疫感作を与
える。最後の二次免疫感作の約３日後に、個々のマウス
の抗免疫原抗体を血清学的に試験する。抗体産生マウス
由来の脾臓細胞を単離し、ＳＰ−２／０などのマウス骨
髄腫細胞と当分野においては公知の技法（Ｋｏｈｌｅｒ
及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６；４９５
−４９７，１９７５）によって融合する。ヒポキサンチ
ン、チミジン及びアミノプテリンを含むダルベッコ改良
イーグル培地（ＤＭＥＭ）のような適当な細胞培養培地
中で増殖させることによりハイブリドーマ細胞を選択
し、抗体産生ハイブリドーマを、好ましくはＭａｃＰｈ
ｅｒｓｏｎの軟寒天法（ＳｏｆｔＡｇａｒＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ，ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔ
ｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕ
ｓｅａｎｄＰａｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，２７６，１９７３）を使用してクローニ
ングし、適当な培地中で培養するために、個々のコロニ
ーを培養プレートの別個のウェル中に移す。抗体産生細
胞は、適当な免疫原を用いてスクリーニングすることに
より同定される。免疫原陽性ハイブリドーマ細胞は当分
野においては公知の方法によって維持される。特定のモ
ノクローナル抗体は、ハイブリドーマをｉｎｖｉｔｒ
ｏで培養するか、または当分野においては公知の手順に
よってハイブリドーマを注入してからマウスの腹水を調
製することにより生産される。抗イディオタイプ抗体
は、防御が所望される病原体の抗原の“内部像（ｉｎｔ
ｅｒｎａｌｉｍａｇｅ）”を担うと共にワクチンにお
ける免疫原として使用することができる免疫グロブリン
である（Ｄｒｅｅｓｍａｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ
ｓｅａｓｅ１５１、７６１，１９８５）。抗イディオ
タイプ抗体を生産する技術は当分野においては公知であ
る（ＭａｃＮａｍａｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２６，
１３２５，１９８４）。本発明のワクチンは、通常の能
動免疫感作スキームにおいて投与することができる。即
ち、投与製剤と相入れる方法で、また予防及び／または
治療に有効で且つ免疫原性であるような量で一回または
複数回投与することができる。ワクチンの投与は、例え
ば皮内、皮下、筋肉内、静脈内または鼻腔内に行なうこ
とができる。更に本発明のワクチンは、例えば活性を増
大するため及び／または保存寿命を延ばすために、多く
は他の成分と混合された水性媒質または水含有懸濁液を
含むこともできる。かかる成分は、塩、ｐＨ緩衝液、安
定剤（例えばスキムミルクまたはカゼイン加水分解産
物）、乳化剤、免疫応答を向上するためのアジュバント
（例えばオイル、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニ
ウム、トコール誘導体、サポニン、ポリアニオン及び両
親媒性物質）及び保存剤とすることができる。本発明の
ワクチンは、家禽の他の病原体に関係する免疫原を含む
こともできるし、多価ワクチンを製造するために、感染
性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、本明
細書に記載のものとは異なるマレック病ウイルスの感染
性骨液嚢疾患ウイルスの抗原のような、かかる免疫原を
コードする核酸配列を含むこともできることは明らかで
ある。本発明はまた、本発明のポリペプチドを少なくと
も１種含むかまたはその抗原性フラグメントを含む「免
疫化学的試薬」に係る。「免疫化学的試薬」なる用語
は、本発明のポリペプチドが適当な担体に結合されてい
るかまたは標識物質で標識されていることを意味する。
使用できる担体の例は、マイクロテストウエルの内壁、
または、キュベット、試験管もしくは毛細管、膜、フィ
ルター、試験片、あるいは、ラテックス粒子、赤血球、
ドライゾル、金属ゾルまたはゾル粒子状金属化合物のよ
うな粒子の表面である。使用できる標識物質の例は、放
射性同位体、蛍光化合物、酵素、ドライゾル、金属ゾル
またはゾル粒子状金属化合物である。本発明の核酸配列
はまた、任意の種類の組織においてＭＤＶ関連核酸を検
出するハイブリダイゼーション実験用の特異的プローブ
を設計するために使用され得る。本発明はまた、ＭＤＶ
感染の診断に有用な前記核酸配列を含む試験キットを提
供する。本発明はまた、本発明の免疫化学的試薬を１種
以上含有するイムノアッセイ用試験キットに係る。この
試験キットを用いて生起される免疫化学的反応は好まし
くは、サンドイッチ反応、凝集反応、競合反応または阻
止反応である。サンドイッチ反応を実施するための試験
キットは、例えば、マイクロテストウエルの内壁のよう
な固休担体に結合された本発明のポリペプチドと、標識
された本発明のポリペプチドまたは標識抗抗体とから構
成され得る。

【実施例】実施例１回復期ニワトリ血清による細菌発現ライブラリーのスク
リーニングライブラリーの樹立に使用したベクターはλｇｔ１１
（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．＆Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，１１９４
〜１１９８，１９８３）である。この発現ベクターのゲ
ノムは、カルボキシ末端の近傍に非反復ＥｃｏＲＩ制限
部位を有する酵素βガラクトシダーゼをコードする機能
性ＬａｃＺ遺伝子を含む。ＭＤＶゲノムに由来のＤＮＡ
フラグメントをこの部位に挿入すると、βガラクトシダ
ーゼの主要部に融合したＭＤＶ特異的ポリペプチドから
成るタンパク質が発現し得る。多様なＤＮＡフラグメン
トを示すライブラリーから、ＭＤＶ感染鳥類に由来の血
清のような抗体プローブによって認識される融合タンパ
ク質を産生する組換えクローンを、密度に基づいてスク
リーニングし得る。これらの実験用ライブラリーは、Ｍ
ＤＶ菌ＧＡ株（Ｆｕｋｕｃｈｉ他，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５
１，１０２，１９８４）のウイルスゲノムの約９０％を
示すＢａｍＨＩプラスミドクローンのプールのＤＮＡを
用いて作製した。これらのプラスミドに由来のＤＮＡを
ＢａｍＨＩで消化し、音波処理でフラグメント化し、シ
ョ糖勾配上で遠心してサイズ選択した。０．５〜４．０
ｋｂのサイズを有するフラグメントを単離し、ｄＧ残基
をテイルにつなぎ、合成アダプターを用いてλｇｔ１０
ベクター（ＬｅＢｏｕｃ他，ＦＥＢＳｌｅｔｔ．１
９６，１０８，１９８６；Ｈｕｙｎｈ他，Ｃｌｏｎｉｎ
ｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．編、４９〜７
８，１９８５）の非反復ＥｃｏＲＩ部位に挿入すると、
５×１０^４ｐｆｕの有効サイズを有するライブラリーが
得られた。ファージを増殖させ、ＣｓＣｌ勾配で精製
し、ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで制限することによっ
てインサートを回収した。最後に、これらのインサート
をλｇｔ１１ベクターのＥｃｏＲＩ部位に結合させ、Ｍ
ＤＶに対するニワトリの血清で組換えファージをスクリ
ーニングした。この回復期血清は、Ｄｒ．Ｃａｌｎｅｋ
（ＣｏｒｎｅｌｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＹ，ＵＳ
Ａ）から提供されたＭＤＶ菌ＧＡ株のビルレントな継代
を、シングルコームホワイトレグホン（ＳＰＡＦＡＳ）
に感染させることによって得られたものである。血清を
１２週間収集し、ニワトリの胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の
組織培養物中のＭＤＶプラークに対する個々のサンプル
の結合を間接蛍光法で検査した。力価及び特異性に基づ
いて６つの血清を選択した。Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．他
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
２，２５８３，１９８５）に従って、ニトロセルロース
フィルターでλｇｔ１１ライブラリーをスクリーニング
するために、これらのサンプルの混合物を１：１００に
希釈して使用した。フィルターのインキュベーション用
の第２抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）
は、ウサギ抗ニワトリ血清に結合したアルカリ性ホスフ
ァターゼであり、ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート呈色反
応（ＭｃＧａｄｅｙ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ２３，
１８０，１９７０）によって陽性シグナルを検出した。
有望な一連のサンプルを選択し、組換え体を均質になる
までプラーク精製した。試験サンプル中の４つのサンプ
ルから、λｇｔ１１組換え体中のＤＮＡインサートがＥ
ｃｏＲＩフラグメントとして回収されたので、これら
を、プラスミドベクターｐＵＣ８（Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．
＆Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ１９，２５９，
１９８２）、または、ｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）に転移させた。得られた構築
物をｐＭＤ１８、ｐＭＤ２０及びｐＭＤ２１と命名し
た。実施例２ＭＤ１８遺伝子のクローニング及び抗原ＭＤ１８の構造
解析ＭＤＶ菌ＧＡ株のゲノムを示すλＥＭＢＬ３ライブラリ
ーをスクリーニングすることによって、抗原ＭＤ１８の
完全アミノ酸配列をコードする遺伝子を単離した。この
ライブラリーの樹立に使用されたＤＮＡは、ニワトリ胚
線維芽細胞（ＣＥＦ）に、Ｄｒ．Ｎｏｎｏｙａｍａ，Ｓ
ｈｏｗａＵｎｉｖ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ．
ＵＳＡから提供されたＭＤＶ菌ＧＡ株の組織培養適応継
代を感染させることによって調製されたものである。９
０％細胞変性効果に達するまで培養物をインキュベート
し、プロテイナーゼＫ消化及びフェノール／クロロホル
ム抽出によって総ＤＮＡを調製した。ＤＮＡを、Ｓａｕ
３Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）で
部分消化し、０．８％アガロースゲル分離後に約２０ｋ
ｂのサイズ分画を単離した。ＤＮＡフラグメントを、Ｂ
ａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化したλＥＭＢＬ３ＤＮＡ
（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）につな
ぎ、ｉｎｖｉｔｒｏでパッケージし、大腸菌ＬＥ３９
２株にプレートした。このライブラリー（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．他，１９８９，前出）を、ｐＭＤ１８に由来
のインサートでスクリーニングすると、特に、制限分析
によってＵ_Ｌ構造エレメントのほぼ中央のＭＤＶウイル
スゲノムの領域に局在することが認められる２１ｋｂの
ＤＮＡを含むλＧＡ１２が単離された。この２１ｋｂの
ＤＮＡの内部で、ｐＭＤ１８とハイブリダイズする配列
の位置は、３．８ｋｂＢａｍＨＩフラグメントに限定
された。このフラグメントをそのままで、ベクターｐＧ
ＥＭ３Ｚを用いて両方向でサブクローニングし、夫々プ
ラスミドｐＭＤ４１及びｐＭＤ４２を作製した。Ｈｅｎ
ｉｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ２８．３５７，１９８
４）に記載されているように、得られたサブクローン
を、酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩによって漸進的に欠
失させ、これらのサブクローンのＤＮＡの両方向のヌク
レオチド配列解析を行なった。全部の配列データを総合
し、問題の領域の配列を翻訳した後で、回復期ニワトリ
血清を用いたイムノスクリーニングによって最初に同定
された抗原の一次構造を推定した。ＭＤ１８と命名され
たこの抗原の完全アミノ酸配列をＳＥＱＩＤＮＯ：
２に示す。実施例３ＭＤ２０遺伝子のクローニング及び抗原ＭＤ２０の構造
解析ｐＭＤ２０及びｐＭＤ２１のインサートを直接解析する
と、ヌクレオチド配列の部分的オーバーラップが判明
し、これは、双方のインサートが同じ抗原を示すことを
示唆する。ＭＤＶ菌ＧＡ株のゲノムを示すλＥＭＢＬ３
ライブラリーをスクリーニングすることによって、この
抗原の完全アミノ酸配列をコードする遺伝子を単離し
た。このライブラリーの樹立に使用されたＤＮＡは、ニ
ワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に、Ｄｒ．Ｎｏｎｏｙａ
ｍａ，ＳｈｏｗａＵｎｉｖ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＵＳＡから提供されたＭＤＶ菌ＧＡ株の組織培
養適応継代を感染させることによって調製したものであ
る。９０％細胞変性効果（ＣＰＥ）に達するまで培養物
をインキュベートし、プロテイナーゼＫ消化及びフェノ
ール／クロロホルム抽出によって総ＤＮＡを調製した。
ＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，ＵＳＡ）で部分消化し、０．８％アガロースゲル
分離後に約２０ｋｂのサイズ分画を単離した。ＤＮＡフ
ラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化したλＥＭ
ＢＬ３ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｕ
ＳＡ）に結合し、ｉｎｖｉｔｒｏでパッケージし、大
腸菌ＬＥ３９２株にプレートした。このライブラリー
（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．他，１９８２，前出）を、ｐ
ＭＤ２１に由来のインサートでスクリーニングすると、
クローンλＧＡ０９が単離された。このクローンは、Ｍ
ＤＶウイルスゲノムのＵ_ＬとＩＲ_Ｌとの接合の近傍に局
在する１７ｋｂのＤＮＡインサートを含んでいた。Ｆｕ
ｋｕｃｈｉ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１，１０２，１９８
４）によって発表された制限地図を参照すると、この１
７ｋｂのインサートは、Ｓ及びＩ_２ＢａｍＨＩフラグ
メント間の中間領域を含んでいた。λＧＡ０９に由来の
ＤＮＡに関する制限地図作成及びｐＭＤ２１に由来のイ
ンサートとのハイブリダイゼーションによって、遺伝子
の位置が７．５ｋｂのＳａｌＩフラグメント内にあるこ
とが確認された。このフラグメントをそのままで、ｐＧ
ＥＭ３Ｚ中でサブクローニングすると、ｐＭＤ２６が得
られた。得られたサブクローンに対し、エキソヌクレア
ーゼＩＩＩ処理（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ
２８，２５７，１９８４）及び適当な制限部位の使用の
双方によってヌクレオチド列解析を行なった。両方向で
行なった反応のデータ全部を総合した後に得られた最終
配列を抗原の完全アミノ酸配列に翻訳し、ＭＤ２０と命
名した。この配列をＳＥＱＩＤＮＯ：４に示す。実施例４ＭＤＶ抗原ＭＤ１８及びＭＤ２０をコードする遺伝子の
ターキーヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のウイルスゲノム
ヘの挿入Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｔ．他（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５
７，３５１，１９８７）によって発表されたＨＶＴのゲ
ノム構造に基づいて、外来遺伝子を挿入するために、ウ
イルスの短い非反復配列エレメント（Ｕｓ）の領域を選
択した。ＭＤＶ菌ＧＡ株に対する前述の手順に準じて、
ＨＶＴ感染ＣＥＦに由来の総ＤＮＡを部分消化すること
によって、対応するＤＮＡフラグメントをλＥＭＢＬ３
ライブラリーからスクリーニングした。ＢａｍＨＩ制限
部位が完全に欠如しているという特性を有する１つのλ
単離物に由来のインサートをλＨＶＴ０４と命名し、物
理的マッピングによって詳細に解析した（図１）。１
７．５ｋｂの挿入フラグメントに存在する配列は、逆方
向反復構造の部分（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｔ．他，１９８
７，前出）を含むＵｓ領域の主要部を示した。λＨＶＴ
０４に由来の１．２ｋｂのＸｈｏＩ制限フラグメントの
１つを、ＳａｌＩで消化したｐＧＥＭ３Ｚ中でサブクロ
ーニングすると、ＤＮＡフラグメントの挿入に利用でき
る非反復ＢｇｌＩＩ部位を含むプラスミドｐＭＤ０７が
得られた。ＡＴＧイニシエータに先行する余分なヌクレ
オチド配列を除去し、コーディング領域につながるＳａ
ｌＩまたはＸｈｏＩのような適当な制限部位を形成する
ことによって、ｐＭＤ４１及びｐＭＤ２６から、抗原Ｍ
Ｄ１８またはＭＤ２０を夫々コードする遺伝子を組立て
た。この結果、ｐＭＤ４１からｐＭＤ４６、ｐＭＤ２６
からｐＭＤ４７が得られた。双方の制限地図を図２に示
す。ＨＶＴウイルスのゲノムに挿入された外来遺伝子の
発現を支配する強力なプロモーターをラウス肉腫ウイル
ス（ＲＳＶ）のＬＴＲ配列から選択した。プロモーター
を、ｐＲＳＶｃａｔ（Ｇｏｒｍａｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９．６７７７，１９８２）
に由来の５８０ｂｐのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限フ
ラグメントにマッピングし、フラグメントの両側で二重
鎖合成リンカーを用いてｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｓｔＩ部位との間に挿入
した。ベクターｐＧＥＭ３Ｚに由来のＨｉｎｄＩＩＩ部
位とＬＴＲプロモーターを担うＲＳＶフラグメントのＮ
ｄｅＩ部位とを結合させるために、一方でＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位及び他方でＮｄｅＩ部位に適合性の付着端を有す
る３０ｂｐのリンカーを用いた。しかしながら、結合後
に、６ｂｐの認識配列の外側のヌクレオチドに故意に修
飾を導入したので、双方の制限部位が回復しなかった。
これらの２つの部位の除去に加えて、リンカー自体の内
部に存在する新しい制限部位（ＢａｍＨＩ）が、対応す
る位置に形成された。ＬＴＲフラグメントに由来のＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位をｐＧＥＭ３Ｚに由来のＰｓｔＩ部位に
結合させる２０ｂｐの第２リンカーを合成した。この場
合、両方の末端の認識配列は破壊されず、ｐＧＥＭ３Ｚ
のポリリンカー中に既に存在していた制限部位、例えば
ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位に適
当な３つの非反復制限部位ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ及びＥ
ｃｏＲＶが追加された。従って、ｐＶＥＣ０１と命名さ
れた得られたｐＧＥＭ３Ｚの誘導体は、外来遺伝子の挿
入に利用できる７つの制限部位を直後に含むＬＴＲプロ
モーター配列を担う６５０ｂｐの制限フラグメントを含
んでいた。６５０ｂｐのフラグメントの両端には、Ｂａ
ｍＨＩ制限部位がつながっており、そのままで、ｐＭＤ
０７に由来の１．２ｋｂのＨＶＴインサートに存在する
非反復ＢｇｌＩＩ部位に転移した。これらの２つの制限
酵素によって形成された付着端は適合性であるが、結合
後に、ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩの初期認識配列を回
復しない。ＴＲｓの方向でＬＴＲを担う構築物の１つを
ｐＶＥＣ０４と命名し、制限地図作成によって研究した
（図３）。この汎用性ＨＶＴ組換えベクターは、ＬＴＲ
プロモーターの直ぐ下流に外来遺伝子を挿入でき、その
後で、ｉｎｖｉｖｏ組換えによってＨＶＴゲノムに完全
発現カセットを組み込むことができるような構造を有す
る。ＬＴＲの下流の種々の制限部位の位置、特に酵素Ｂ
ｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＶの位置は、遺伝子の
多重挿入も可能であるように設計されている。ＭＤ１８
遺伝子を担うｐＭＤ４６に由来の２．５ｋｂのＳａｌＩ
／ＸｈｏＩ制限フラグメントを、ＬＴＲプロモーターの
下流のｐＶＥＣ０４の非反復ＢｇｌＩＩ部位に挿入する
と、ｐＭＤ４８が得られた。ＭＤ２０遺伝子を担うｐＭ
４７に由来の３．６ｋｂのＳａｌＩ制限フラグメント
を、ＬＴＲプロモーターの下流のｐＶＥＣ０４の非反復
ＸｈｏＩ部位に挿入すると、ｐＭＤ４９が得られた。プ
ラスミドｐＭＤ４８またはｐＭＤ４９のＤＮＡを、ＨＶ
Ｔ感染細胞から調製した総ＤＮＡと共に、ＣＥＦに導入
した。この挿入には、Ｇｒａｈａｍ，Ｆａｎｄｖ．
ｄ．Ｅｂ，Ａ．，（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２，４５６，
１９７３）に記載のリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法に基
づき、Ｍｏｒｇａｎ他（ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ
３４，３４５，１９９０）に記載の修正を加えた方法を
用いた。構築物に由来の２μｇのプラスミドＤＮＡを、
ＨＶＴ感染細胞に由来の１５μｇのＤＮＡと最終容量５
６０μｌのＨ_２Ｏ中で混合し、７５０μｌのＨＢＳＰ
（２０ｍＭのＫＣｌ、５６０ｍＭのＮａＣｌ、２４ｍＭ
のグルコース、３ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１００ｍＭの
ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０）に加えた。１９０μｌの１Ｍ
のＣａＣｌ_２を徐々に添加し、混合物を室温で３０分間
インキュベートすることによって沈殿物を形成させた。
他方で、２％のウシ胎仔血清を補充したＥａｇｌｅの最
小必須培地にＧｌａｓｇｏｗの修正を与えた組成を有す
る培地６／Ｂ８に、１０日齢の胚に由来の二次ＣＥＦを
浮遊させた１５ｍｌの浮遊液を、５×１０^５細胞／ｍｌ
の密度で直径１０ｃｍの皿に播種した。リン酸カルシウ
ムで沈殿したＤＮＡを細胞浮遊液に静かに添加し、空気
中に５％のＣＯ_２を含む湿潤インキュベータ内で皿を３
７℃でインキュベートした。５時間後、培地を除去し
て、等容のＨＢＳＰと３０％グリセロールとを含む１０
ｍｌの溶液を細胞の上に流した。１〜２分間のインキュ
ベーション後に、溶液を除去し、細胞を培地６／Ｂ８で
洗浄し、皿を新しい培地でウイルスＣＰＥが増殖するま
で３〜５日間インキュベートした。これらのＭＤＶ抗原
に対する一価または多価の特異的血清を用いた免疫蛍光
染色法によって、ＭＤ１８またはＭＤ２０ポリペプチド
を発現するＨＶＴ組換え体を検出した。

【配列表】

（１）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０１５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）起源：（Ａ）生物名：マレック病ヘルペスウイルス（Ｂ）株名：ＧＡ（ｉＶ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）位置：１４．．２００５（Ｃ）他の情報：／ラベル＝ｐＭＤ１８

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６６３（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種：タンパク質

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】（３）ＳＥＱＩＤＮＯ：３：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３２６５（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）起源：（Ａ）生物名：マレック病ヘルペスウイルス（Ｂ）株名：ＧＡ（ｉｖ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）位置：４１．．３２６５（Ｃ）他の情報：／ラベル＝ｐＭＤ２０

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【表２３】

【表２４】

【表２５】

【表２６】

【表２７】

【表２８】

【表２９】

【表３０】

【表３１】（４）ＳＥＱＩＤＮＯ：４：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１０７４（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種：タンパク質

【表３２】

【表３３】

【表３４】

【表３５】

【表３６】

【表３７】

【表３８】

【表３９】

【表４０】

【表４１】

【表４２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＶＴゲノムのＵｓ領域に本質的に対応するＤ
ＮＡフラグメントの制限酵素地図であり、４つの読取り
枠からなる挿入領域とその間の非コーディング配列との
相対位置を示している。

【図２】Ａは、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ制限部位によって
挟まれたＭＤ１８抗原をコードする遺伝子を含むｐＭＤ
４６の制限酵素地図である。ベクタープラスミドは、Ｓ
ａｌＩへのポリリンカーのＣｌａＩ制限部位の修飾によ
ってｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から誘導した。Ｂは、ＳａｌＩ制限
部位に挟まれたＭＤ２０抗原をコードする遺伝子を含む
ｐＭＤ４７の制限酵素地図てある。ベクタープラスミド
は、ＳａｌＩへのポリリンカーのＣｌａＩ制限部位の修
飾によってｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から誘導した。

【図３】ｐＭＤ０７に由来する１．２ｋｂＸｈｏＩ
ＨＶＴフラグメントの非反復性ＢｇｌＩＩ部位に挿入し
たＬＴＲプロモーターを示すｐＶＥＣＯ４の制限酵素地
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 8413−4Ｃ 39/255 8413−4ＣＣ０７Ｋ 13/00 8619−4Ｈ 15/04 8619−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 7/01 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7236−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 (72)発明者マルタ・ヤコバ・ウイレムスオランダ国、6523・エヌ・イエー・ネイメヘン、ソフイアウエヒ・26 (72)発明者パウルス・ヤコブス・アントニウス・ソンデルメイエルオランダ国、5831・アール・エヌ・ボツクスメール、マホニー・21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＭＤＶポリペプチドをコードする核酸配列
であって、この配列がａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されているアミノ酸配
列を有するＭＤ１８、ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されているアミノ酸配
列を有するＭＤ２０、及びこれらの機能的等価物から選
択したポリペプチドの少なくとも一部分をコードするこ
とを特徴とする核酸配列。
【請求項２】前記配列が、少なくとも、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１又はＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されているデオ
キシリボ核酸配列の一部分を含んでいることを特徴とす
る請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】請求項１又は２に記載の核酸配列を含む組
換え核酸分子。
【請求項４】核酸配列が発現制御配列に機能可能なよう
に結合されていることを特徴とする請求項３に記載の組
換え核酸分子。
【請求項５】請求項１又は２に記載の核酸配列を含むベ
クターウイルス。
【請求項６】請求項１もしくは２に記載の核酸配列か又
は請求項３もしくは４に記載の組換え核酸分子で形質転
換した、又は請求項５に記載のベクターウイルスを含む
宿主細胞。
【請求項７】ＳＥＱＩＤＮＯ：２もしくはＳＥＱ
ＩＤＮＯ：４に示されているアミノ酸配列又はこれら
の機能的等価物の少なくとも一部分を含み、ＭＤＶ免疫
特性を示すポリペプチド。
【請求項８】請求項１又は２に記載の核酸配列によって
コードされるＭＤＶポリペプチド。
【請求項９】請求項７又は８に記載のポリペプチドと免
疫反応する抗体又は抗血清。
【請求項１０】家禽をＭＤＶ感染から防護するワクチン
であって、請求項４に記載の組換え核酸分子、請求項５
に記載のベクターウイルス、請求項６に記載の宿主細
胞、又は請求項７もしくは８に記載のポリペプチドを含
むことを特徴とするワクチン。
【請求項１１】請求項６に記載の宿主細胞を培養し、そ
の後でＭＤＶ含有物質を回収して、免疫活性を有する医
薬組成物に加工することを特徴とするＭＤＶワクチンの
製造方法。
【請求項１２】請求項７又は８に記載のポリペプチド
を、免疫活性を有する医薬組成物に加工することを特徴
とするＭＤＶワクチンの製造方法。
【請求項１３】請求項１０に記載のワクチンを有効量動
物に投与することを特徴とする家禽をＭＤＶ感染から防
護する方法。