JPH05292981A

JPH05292981A - リン脂質の製造法

Info

Publication number: JPH05292981A
Application number: JP12799592A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Tsubaki; 信之椿; Keiichi Yoshimura; 啓一吉村; Noriko Fujio; 則子藤尾; Yoshiro Nakano; 善郎中野
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1992-04-22
Filing date: 1992-04-22
Publication date: 1993-11-09

Abstract

(57)【要約】【構成】ストレプトマイセス属の微生物を起源とするホ
スホリパーゼＤを用いて、特定の反応条件で塩基交換反
応を行なって、目的とするリン脂質を得たのち、特定の
組成の混合溶媒で晶析を行なうリン脂質の製造法。【効果】簡単な操作で高純度、粉末状のリン脂質が高収
率で得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高純度、粉末状のリン
脂質を高収率で得られるリン脂質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】リン脂質の製造方法としてホスファチジ
ルコリン（以下、ＰＣという）にホスフォリパ−ゼＤを
任意の受容体の存在下に反応させ、塩基交換反応により
目的とする塩基を持つリン脂質を製造する方法として
は、次のものが知られている。［S.F.Yang,et al.,J.Bi
ol.Chem.,Vol.242,p477-484(1967)］［R.M.C.Dawson,B
iochem.J.,Vol102,p205ー210(1967)］［特開昭６２−３
６１９５号公報］［特開昭６３−３６７９１号公報］

【０００３】しかしこれらの方法において目的とするリ
ン脂質の生成率は極めて低く、また水を大量に用いるた
め副生成物としてホスファチジン酸（以下、ＰＡとい
う）が生成する。したがって高純度のリン脂質を得るに
は、カラムクロマトグラフイーを行なう等未反応のＰＣ
やＰＡ、さらにはアシル基が加水分解されたリゾ体の
リン脂質等の不純物を除去する操作が必要となり煩雑な
うえ工業的に大量のリン脂質を製造するのは困難であ
る。

【０００４】また、塩基交換能の高いストレプトマイセ
ス属由来のホスフォリパーゼＤを用いたリン脂質の塩基
交換反応（特開昭６３−３６７９０号公報）もあるが、
ホスフォリパーゼの使用量がホスファチジルコリン１g
に対し１００〜５００単位と多量使用しているが、目的
とするリン脂質の塩基交換反応での生成率が７０〜９０
％と低い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題点を
解決し、高純度のリン脂質を高収率かつ粉末状で得られ
るリン脂質の製造法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は下記の（イ），
（ロ），（ハ），（ニ）の工程よりなるリン脂質の製造
法である。（イ）ホスファチジルコリン１gに対し、有機溶媒を５
〜１００g、ストレプトマイセス属由来のホスフォリパ
−ゼＤを５〜９０単位、受容体としてのアルコール類を
ホスファチジルコリン１モルに対し５〜１００モル、水
の量がホスファチジルコリンの有機溶媒溶液に対して
０．１〜２重量倍の条件で塩基交換反応する工程。（ロ）(イ)の工程で得られた有機溶媒溶液をリン脂質濃
度５〜５０重量％にし、この有機溶媒溶液の１〜１０重
量倍のアセトンを加え、０〜３０℃でリン脂質を晶析さ
せる工程。（ハ）(ロ)の工程で得られたリン脂質の結晶を５〜２０
重量倍のクロロホルム：メタノ−ル：水＝６５〜１０
０：０〜３０：０〜５（容量比）の混合溶媒に溶解し、
０〜１０重量倍のアセトンを加え、０〜３０℃でリン脂
質を晶析させて、瀘過してリン脂質粉末を得る工程。（ニ）必要により(ハ)の工程を繰り返す工程。

【０００７】本発明の（イ）の工程で用いるＰＣは、一
般に市販されているもので良いが、純度の低いものは塩
基交換反応時に副生成物が多く生成するので、純度９８
％以上のものが好ましい。

【０００８】有機溶媒としてはＰＣを溶解するものであ
れば良く、たとえばクロロホルム、ジクロルメタン、四
塩化炭素、ヘキサン、ベンゼン、キシレン、ジメチルエ
ーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル等が
挙げられる。有機溶媒の使用量は、ＰＣの５〜１００重
量倍であり、５重量倍未満では溶液の粘度が高くなり、
１００重量倍を超えると生産効率が悪くなる。

【０００９】ストレプトマイセス属由来のホスフォリパ
−ゼＤは、たとえばストレプトマイセス・クロモフオス
カス、ストレプトマイセス・ハチジヨウエンシス、スト
レプトマイセス・プルニコーラ等のホスフォリパ−ゼＤ
生産菌から得られるホスフォリパ−ゼＤであり、一般に
市販されているもので良い。ホスフォリパ−ゼＤの使用
量は、ＰＣ１gに対して５〜９０単位であり、好ましく
は１０〜８０単位ある。５単位未満では反応率が低く、
９０単位を超えても反応率が高くならず、経済性が悪く
なる。

【００１０】受容体のアルコール類としては一般に市販
されているもので良く、たとえばメタノール、エタノー
ル、プロパノール等の脂肪族アルコール類、エタノール
アミン、セリン、１−アミノ−２−プロパノール等の含
窒素アルコール類、エチレングリコール、プロピレング
リコール、グリセロール等のポリオール類が挙げられ
る。アルコールの使用量は、ＰＣ１モルに対して５〜１
００モルであり、好ましくは２０〜８０モルである。５
モル未満では反応率が低く、１００モルを超えると収率
が低下することがある。

【００１１】水は酵素反応を阻害するような金属イオン
を含まない蒸留水が好ましく、また緩衝剤を添加して、
ｐＨ５．０〜７．０の緩衝液とするのがより好ましい。
たとえば酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸アン
モニウム緩衝液が好ましい。水の使用量はＰＣの有機溶
媒溶液の０．１〜２重量倍である。

【００１２】本発明の(ロ）の工程は、(イ)の工程で得ら
れた有機溶媒溶液をリン脂質濃度５〜５０重量％に調整
し、この有機溶媒溶液の１〜１０重量倍のアセトンを加
え、０〜３０℃でリン脂質を晶析させる工程である。こ
の限定条件の範囲外では目的とするリン脂質の純度ある
いは収率が低下する。

【００１３】本発明の(ハ）の工程は、(ロ)の工程で得ら
れたリン脂質の結晶を５〜２０重量倍のクロロホルム：
メタノ−ル：水＝６５〜１００：０〜３０：０〜５（容
量比）の混合溶媒に溶解し、０〜１０重量倍のアセトン
を加え、０〜３０℃でリン脂質を晶析させて、瀘過して
リン脂質粉末を得る工程である。結晶を溶解する混合溶
媒は目的とするリン脂質のクロロホルムに対する溶解性
に応じてメターノルまたは水を加える。アセトンを加え
る量も目的とするリン脂質のクロロホルムに対する溶解
性に応じて加える。この限定条件の範囲外では目的とす
るリン脂質の純度あるいは収率が低下する。

【００１４】本発明の(ニ）の工程は、必要により(ハ)の
工程を繰り返す工程であり、目的とするリン脂質の純度
をさらに高くすることができる。

【００１５】

【発明の効果】本発明により、高純度の粉末状のリン脂
質を容易な方法でしかも高収率で得ることができる。本
発明により得られるリン脂質は、高純度であるので化粧
品、医薬品分野での利用に適している。

【００１６】

【実施例】以下、実施例および比較例に基づいて本発明
を具体的に説明する。尚、リン脂質の組成分析、純度測
定は薄層クロマトグラフィ−（以下、ＴＬＣという）で
行なった。ＴＬＣはKieselgel 60（Merck & Co.Inc.）
を用い、５重量％の試料２マイクロリツトルをスポットし、クロ
ロホルム：メタノ−ル：蒸留水：２８％アンモニア水＝
６５：２５：４：０．３（容量比）で展開し、硫酸銅
（無水）１０gとリン酸（８５％）８ミリリツトルを蒸留水で
１００ミリリツトルとしたものを噴霧後加熱する方法により行
なった。

【００１７】実施例１ジミリストイルホスファチジルコリン（以下、ＤＭＰＣ
という）１g(1.5ミリモル)をクロロホルム４０gに溶解し
た。酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(0.4モル,pH5.5)２０ミリリ
ツトルにグリセロ−ル９．５g（１０３ミリモル）、ストレプト
マイセス属の微生物由来のホスフォリパ−ゼＤ（東洋醸
造（株）；ホスフォリパ−ゼＤＰ）２０単位を加えて、
ＤＭＰＣのクロロホルム溶液に添加し、４０℃で６時間
反応した。反応系を２０℃に冷却し、１２時間静置後の
クロロホルム層をＴＬＣで分析した。ジミリストイル
ホスファチジルグリセロ−ル（以下、ＤＭＰＧという）
９７．５重量％、ＤＭＰＣ１重量％、遊離脂肪酸０．５
重量％、リゾ体０．５重量％、ＰＡ０．５重量％であっ
た。

【００１８】このクロロホルム層をＤＭＰＣ換算で３０
重量％となるように３．３gまで濃縮し、濃縮溶液の５
重量倍のアセトン１６．５gを加えて、２０℃で晶析さ
せたのち濾過し、溶媒を留去して結晶０．９５gを得
た。

【００１９】結晶を８重量倍のクロロホルム：メタノ−
ル（97.5:2.5）７．６gに溶解し、結晶の３重量倍のア
セトン２．８５gを加えて、１５℃で晶析させて瀘過
し、溶媒を留去して結晶０．９gを得た。

【００２０】この結晶０．９gを８重量倍のクロロホル
ム：メタノ−ル：蒸留水（80:18:2）７．２gに溶解し結
晶と同量のアセトン０．９gを加えて、５℃で晶析させ
て瀘過し、溶媒を留去して粉末状のＤＭＰＧ０．８８g
を得た。純度９９．８％、収率８８％であった。

【００２１】実施例２ジパルミトイルホスファチジルコリン（以下、ＤＰＰＣ
という）１００g(0.14モル)をクロロホルム４kgに溶解
し、エタノールアミン５８g(0.95モル)を１リツトルの蒸留水
に溶解して酢酸でpH6.0に調製したのち、ホスフォリパ
−ゼＤ８０００単位を加え、実施例１と同様に反応し
た。ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
（以下、ＤＰＰＥという）９７．０％、ＤＰＰＣ１．５
％、遊離脂肪酸０．５％、リゾ体０．５％、ＰＡ０．５
％であった。

【００２２】このクロロホルム層を実施例１と同様にし
て３３０gまで濃縮し、アセトン１６５０gを加えて、２
０℃で晶析させたのち濾過し、溶媒を留去して結晶９５
gを得た。結晶を１０重量倍のクロロホルム：メタノ−
ル（97.5:2.5）９５０gに溶解し、結晶と同量のアセト
ン９５gを加えて、１０℃で晶析させて瀘過し、溶媒を
留去して結晶９２gを得た。この結晶９２gを１０重量倍
のクロロホルム：メタノ−ル（95:5）９２０gに溶解
し、５℃で晶析させて瀘過し、溶媒を留去する操作を２
回繰り返して、粉末状のＤＰＰＥ８２gを得た。純度９
９．５％、収率８２％であった。

【００２３】実施例３ジステアリルホスファチジルコリン（以下、ＤＳＰＣと
いう）１g(1.3ミリモル)をクロロホルム４０gに溶解し、セ
リン９．３g（８９ミリモル）、ホスフォリパ−ゼＤを１０
単位とした以外は実施例１と同様に反応した。ジステア
リルホスファチジルセリン（以下、ＤＳＰＳという）９
６．０％、ＤＳＰＣ２．０％、遊離脂肪酸０．５％、リ
ゾ体０．５％、ＰＡ１．０％であった。

【００２４】このクロロホルム層を実施例１と同様にし
て、結晶０．９５gを得た。結晶を１５重量倍のクロロ
ホルム：メタノ−ル：水（80:18:2）１４．２５gに溶解
し、５重量倍のアセトン４．７５gを加えて、２５℃で
晶析させて瀘過し、溶媒を留去して結晶０．８９gを得
た。この結晶を１０重量倍のクロロホルム：メタノ−
ル：水（80:18:2）８．９gに溶解し、８重量倍のアセト
ン７．１２gを加えて、２０℃で晶析させて瀘過し、溶
媒を留去して粉末状のＤＳＰＳ０．８３gを得た。純度
９８．５％、収率８３％であった。

【００２５】実施例４酢酸ナトリウムを酢酸アンモニウムに変え、アルコール
をプロパノール６．２g（１０３ミリモル）、ホスフォリパ
−ゼＤを１０単位とした以外は実施例１と同様に反応し
た。ジミリストイルホスファチジルプロパノール（以
下、ＤＭＰＰという）９８％、ＤＭＰＣ１％、遊離脂肪
酸０．１％、リゾ体０．１％、ＰＡ０．８％であった。
このクロロホルム層を実施例１と同様に晶析操作を行な
って結晶０．９４gを得た。

【００２６】結晶を８重量倍のクロロホルム：メタノ−
ル：水（70:26:4）７．５２gに溶解し、３重量倍のアセ
トン２．８２gを加えて、５℃で晶析させて瀘過し、溶
媒を留去して結晶０．９１gを得た。この結晶を８重量
倍のクロロホルム７．２８gに溶解し、同量のアセトン
０．９１gを加えて、５℃で晶析させて瀘過し、溶媒を
留去して粉末状のＤＭＰＰ０．８９gを得た。純度９
９．７％、収率８９％であった。

【００２７】比較例１キャベツ由来のホスフォリパ−ゼＤ（Boehringer Mannh
eim製）を使用し、反応時間を２０時間とした以外は実
施例１と同様に反応した。ＤＭＰＧ３２％、ＤＭＰＣ２
０％、遊離脂肪酸４％、リゾ体４％、ＰＡ４０％、であ
った。本発明の範囲外のホスフォリパ−ゼＤを使用する
と、反応時間を約３倍にしても目的とするリン脂質の収
率が非常に低い。

【００２８】比較例２ＤＰＰＣを１gとし、エタノールアミンをＤＰＰＣの２
倍モルにした以外は実施例２と同様の反応条件で反応し
た。ＤＰＰＥ４０％、ＤＰＰＣ２０％、遊離脂肪酸５
％、リゾ体５％、ＰＡ３０％であった。アルコールの使
用量が本発明の範囲未満では、目的とするリン脂質の収
率が低い。

【００２９】比較例３緩衝液の蒸留水を３倍にし、反応時間を１２時間にした
以外は実施例３と同様にして反応した。ＤＳＰＳ６５
％、ＤＳＰＣ５％、遊離脂肪酸５％、リゾ体５％、ＰＡ
２０％であった。水の使用量が本発明の範囲を超えると
目的とするリン脂質の収率が低い。

【００３０】比較例４実施例１と同様にして得たクロロホルム層を３．３gま
で濃縮し、濃縮溶液と同量のアセトン３．３gを加え
て、２０℃で晶析させたのち濾過し、溶媒を留去して結
晶０．９２g得た。結晶０．９２gをその８重量倍のクロ
ロホルム：メタノール（95:5）７．３６gに溶解し、結
晶と同量のアセトン０．９２gを加えて、５℃で晶析さ
せたのち濾過し、溶媒を留去して結晶０．８９gを得
た。

【００３１】この結晶０．８９gを３０重量倍のクロロ
ホルム：メタノール（90:10）２６．７gに溶解し、結晶
の２倍量のアセトン１．７８gを加えて、５℃で晶析さ
せたのち濾過し、溶媒を留去して粉末状のＤＭＰＧ０．
５１gを得た。純度９４．５％、収率５１％であった。
(ハ)の工程の混合溶媒量が本発明の範囲を超えると、粉
末状のリン脂質は得られるが、収率が低くなる。

【００３２】比較例５実施例２と同様にして得たクロロホルム層を３３０gま
で濃縮し、濃縮溶液の５重量倍のアセトン１６５０gを
加えて、２０℃で晶析させたのち濾過し、溶媒を留去し
て結晶９５gを得た。結晶９５gを８重量倍のクロロホル
ム：メタノ−ル：水（50:40:10）７６０gに溶解し、結
晶と同量のアセトン９５gを加えて、５℃で晶析させた
のち濾過し、溶媒を留去して結晶７０gを得た。さら
に、同条件の操作を繰り返して粉末状のＤＰＰＥ２１g
を得た。純度９８．０％、収率２１％であった。(ハ)の
工程の混合溶媒組成が本発明の範囲外では、粉末状のリ
ン脂質は得られるが、収率が極端に低くなる。

【００３３】比較例６実施例３と同様にして得たクロロホルム層を３．３gま
で濃縮し、濃縮溶液の５重量倍のアセトン１６．５gを
加えて、２０℃で晶析させたのち濾過し、溶媒を留去し
て結晶０．９５gを得た。結晶０．９５gを８重量倍のク
ロロホルム：メタノ−ル（90:10）７．６gに溶解し、結
晶の３０重量倍のアセトン２８．５gを加えて、１０℃
で晶析させたのち濾過し、溶媒を留去して結晶０．９３
gを得た。さらに、同条件の操作を繰り返して粉末状の
ＤＳＰＳ０．８９gを得た。純度９６．３％、収率８９
％であった。 (ハ)の工程で添加するアセトンの量が本
発明の範囲を超えると純度が反応直後とほとんど変わら
ず純度を高めることができない。

【００３４】比較例７実施例４と同様にして得たクロロホルム層を３．３gま
で濃縮し、濃縮溶液の５重量倍のアセトン１６．５gを
加えて、５℃で晶析させたのち濾過し、溶媒を留去して
結晶０．９４g得た。結晶０．９４gを８重量倍のクロロ
ホルム：メタノ−ル（90:10）７．５２gに溶解し、結晶
の３重量倍のアセトン２．８２gを加えて、５℃で晶析
させたのち濾過し、溶媒を留去して結晶０．８５gを得
た。この結晶を１５重量倍のクロロホルム：メタノ−
ル：蒸留水（70:26:4）１２．７５gに溶解し、結晶と同
量のアセトン０．８５gを加えて、４０℃にしたとこ
ろ、結晶は析出しなっかた。(ハ)の工程での温度が本発
明の範囲を超えると、目的とするリン脂質の粉末が得ら
れない。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の（イ），（ロ），（ハ），（ニ）の
工程よりなるリン脂質の製造法。（イ）ホスファチジルコリン１gに対し、有機溶媒を５
〜１００g、ストレプトマイセス属由来のホスフォリパ
−ゼＤを５〜９０単位、受容体としてのアルコール類を
ホスファチジルコリン１モルに対し５〜１００モル、水
の量がホスファチジルコリンの有機溶媒溶液に対して
０．１〜２重量倍の条件で塩基交換反応する工程。（ロ）(イ)の工程で得られた有機溶媒溶液をリン脂質濃
度５〜５０重量％にし、この有機溶媒溶液の１〜１０重
量倍のアセトンを加え、０〜３０℃でリン脂質を晶析さ
せる工程。（ハ）(ロ)の工程で得られたリン脂質の結晶を５〜２０
重量倍のクロロホルム：メタノ−ル：水＝６５〜１０
０：０〜３０：０〜５（容量比）の混合溶媒に溶解し、
０〜１０重量倍のアセトンを加え、０〜３０℃でリン脂
質を晶析させて、瀘過してリン脂質粉末を得る工程。（ニ）必要により(ハ)の工程を繰り返す工程。