JPH05297000A - インスリン抗体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト血清等の被検試料、およびヒト以外の動
物（例えばモルモット）由来のインスリン抗体を含む標
準試料を、並列的に、固相上に配置したインスリンと反
応させ、次いで固相上のインスリンに結合したインスリ
ン抗体と酵素標識プロテインＡとを反応させた後、酵素
活性を測定することにより、被検試料中のインスリン抗
体量を求める。 【効果】 抗インスリン抗体量を正確に計算可能な標準
試料（スタンダード）と、ＩｇＧのＦｃフラグメントと
特異的に結合する酵素標識プロテインＡとの組合せに基
づき、ヒト体液中の抗インスリン抗体量を安全且つ簡便
に、しかもインスリン投与の明確な指標となり得る程度
に定量的に測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はインスリン抗体の測定方
法に関し、より具体的には、ヒト体液中のインスリン抗
体を定量的に測定し得るインスリン抗体の測定方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】インスリン(insulin) は真性糖尿病の治
療、コントロール（特に感染時、手術時、妊娠時）およ
び合併症（網膜症、血管障害、神経障害）の予防等に汎
用される重要な医薬であるが、この使用に際しては、
（抗）インスリン抗体の産生がしばしば問題となる。

【０００３】すなわちヒト（患者）の体液中にインスリ
ン抗体が産生されると、その後当該患者にインスリンを
投与してもその効力が著しく減殺されるため、インスリ
ン抗体量は患者へのインスリンの投与量と密接な関係が
ある（インスリン抗体価が高い場合には、薬効を得るた
めにはインスリンの多量投与が必要となる）。したがっ
て、このインスリン抗体量を正確に測定することは臨床
上、極めて重要な意義を有する。

【０００４】従来、インスリン抗体の測定においては、
自己抗体の検査等に一般的に用いられているところの体
液中の抗原特異抗体の測定法（いわゆるイムノアッセイ
法）がそのまま用いられて来た。

【０００５】この分野の従来の測定法は、技術的に二つ
に分類が可能である。

【０００６】第一の技術としては、ラジオアイソトープ
（ＲＩ）で標識された抗原を、抗体を含有する被検検体
（被検試料）と反応させ、生じた免疫複合体を沈殿剤
（例えば、抗ヒトイムノグロブリン、ポリエチレングリ
コール、メタノール、硫酸アンモニウム等）を用いて沈
殿させ、この沈殿物中の放射能活性を測定してインスリ
ン抗体量を求める方法（臨床成人病、１０巻、２４９−
２５５（１９８０））があり；また、固相担体等に特異
抗体を固定化し、これに対してラジオアイソトープ標識
抗原および被検検体を同時に加え、固相抗体とアイソト
ープとの反応に対する阻害活性を求めて、インスリン抗
体量を相対的濃度として測定する方法（糖尿病、３０
巻、５４９−５５４（１９８７））がある。

【０００７】一方、第二の技術としては、抗原を固相担
体に固定化し、これに抗原特異抗体を含む被検検体を反
応させ、更にラジオアイソトープ又は酵素等で標識され
た抗イムノグロブリン抗体（第２抗体）を反応させ、特
異抗体を測定する方法がある(JOURNAL OF IMMUNOLOGICA
L METHODS,７６，１８５−１９４（１９８５）；EXP.AN
IM. ３７，６７−７２（１９８８）；CLIN. CHEM. ２
７，１７５３−１７５７（１９８１））。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
うちラジオアイソトープを使用する第１の技術において
は、安全性、設備面、試薬の有効期間等の面で問題があ
った。また、第１および第２の技術に共通した問題とし
て、これらの測定では抗体量は相対的なものとならざる
を得ず、経時的なインスリン治療の指標とはなり難いと
いう欠点もあった。

【０００９】より具体的には、従来法においては、イン
スリン抗体を有するヒト血清自体を標準試料（スタンダ
ード）として用いているため、測定データは必然的に、
標準血清との比較における「抗インスリン抗体の有無」
あるいは「標準血清中の抗体量に対して何倍（希釈倍
数）」という相対比となる。

【００１０】しかしながら、ヒト由来の抗ヒト・インス
リン抗体はそれ自体の入手が極めて困難である（ヒト自
体にもともと存在するヒト・インスリンの抗体は、ヒト
中には本来産生されにくい）のみならず、該標準血清中
の抗インスリン抗体量自体がその由来の如何（ドナーた
るヒトの個人差）によって大きく変動し、同一患者の抗
体量測定のための標準血清自体が測定の度に異なる可能
性があるため、従来の方法による測定データを、経時
的、継続的なインスリン投与のための指標とすることは
困難であった。したがって、患者に実際に投与すべきイ
ンスリンの量は、現実には、これに関与する医師の「経
験」と「カン」によって決められていた。

【００１１】他方、上記した従来の酵素標識抗体（第２
抗体）を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡないしＥＬＩＳ
Ａ）においては、測定データを光学濃度ないし吸光度
（ＯＤ値）として求めていたため、該酵素標識抗体の使
用に基づくＥＩＡ特有の問題があった。

【００１２】すなわち、酵素標識抗体自体の酵素活性の
経時的変化、ないしは酵素標識物の作製方法、あるいは
反応収率により上記ＯＤ値が変動することは（現実に
は）避け難いため、上記光学濃度自体を測定データとす
ることは、データの正確性および再現性（いわゆる日差
の再現性）の点で問題があった。

【００１３】したがって、本発明の目的は、上述した従
来法の欠点を解消し、ヒト体液中の抗インスリン抗体量
を定量的に（ないしは、インスリン投与の明確な指標と
なり得る程度に実質的に定量的に）測定可能なインスリ
ン抗体の測定方法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、標準試料として、従来法におけるヒト由来の標準
血清を用いることなく、ヒト以外の動物由来の抗インス
リン抗体を含有する試料を用い；且つ、従来法における
第２抗体（ラジオアイソトープ又は酵素で標識した抗ヒ
ト・イムノグロブリン抗体）を用いることなく、酵素標
識プロテインＡを用いることが、ヒト体液中の抗インス
リン抗体の定量に極めて効果的なことを見出した。

【００１５】本発明のインスリン抗体の測定法は上記知
見に基くものであり、より詳しくは被検試料、およびヒ
ト以外の動物由来のインスリン抗体を含む標準試料を、
固相上に配置したインスリンと反応させ、次いで固相上
のインスリンに結合したインスリン抗体と酵素標識プロ
テインＡとを反応させることを特徴とするものである。

【００１６】本発明においては、固相上のインスリンに
結合した抗インスリン抗体と、更に結合すべき試薬（本
発明において、従来法における第２抗体に相当する機能
を有する）として、ヒトあるいはマウス、ウサギ、モル
モット等の動物のＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）のＦｃフ
ラグメントと特異的に結合するプロテインＡ（以下「Ｐ
Ａ」という）を用いているため、ヒト以外の動物由来の
抗インスリン抗体を含む標準試料を用いているにもかか
わらず、該標準試料とヒト由来の被検試料（検体）とを
並列的に（実質的に同じ環境下で）反応させることがで
きる。

【００１７】上記動物由来の標準試料中の抗インスリン
抗体の量は、後述するように、例えば、スキャッチャー
ド・プロット(Scatchard plot)法により定量的に求める
ことができる。したがって、本発明によれば、上記ＰＡ
と動物由来の抗インスリン抗体との組合せに基づき、ヒ
ト体液中の抗インスリン抗体の量を定量的に（少くと
も、インスリン投与量の客観的且つ明確な指標となり得
る程度に実質的に定量的に）測定することが可能とな
る。

【００１８】なお、上述したような本発明の効果は、上
記ＰＡと動物由来の抗インスリン抗体との組合せに基づ
いてのみ得られるものであり、これらのうち一方が欠け
ても定量的測定は不可能である。すなわち、例えば上記
ＰＡに代えて、従来法におけるような第２抗体を単に用
いようとしても、従来法におけるよりも、むしろ不確実
なデータしか得られない。

【００１９】より具体的には、例えば、もし標準試料と
して（一定の抗インスリン抗体を含む）モルモット血清
を用いた場合、被検試料は通常はヒト体液（例えば血
清）であるから、上記第２抗体としては酵素標識抗モル
モットＩｇＧ抗体と、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体とがと
もに必要となる。これら２種の第２抗体は、通常、力価
のみならず標識酵素その他の測定データに影響する特性
がまったく異なるため、標準試料（モルモット血清）と
ヒト血清とを「並列的に」測定する意義は、まったくな
いこととなる。

【００２０】以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本
発明を詳細に説明する。

【００２１】（固相）本発明においては固相として、通
常のＥＩＡ（酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡともいう）に
用いられる固相を特に制限なく用いることができる。該
固相の材質としては、抗原および／又は抗体の物理吸着
（疎水結合に基くと考えられている）の点からは、ポリ
スチレン等のプラスチックが通常好ましく用いられる。
固相の形状も特に制限されず、例えばマイクロプレート
状、ビーズ（ないしボール）状、リング状、チューブ
状、あるいはゲル状のものが使用可能であるが、例えば
複数のウェル(well)を有するプラスチック製のマイクロ
プレート（９６−ウェル−マイクロプレート等）が、多
数の試料（検体）を迅速に測定可能な点から好ましく用
いられる。この場合、必要に応じて９６穴プレート用の
吸光度計と組合わせることにより、測定の迅速性は更に
向上させることが可能である。

【００２２】（インスリン）次に、上記固相に配置（な
いしコート）すべきインスリンについて説明する。本発
明においては、固相にコートすべきインスリンは、測定
対象たるヒトの状態（例えば、過去の治療用に用いたイ
ンスリンの由来）に応じて適宜決定することができる
（例えば、ウシ・インスリンを用いて治療中のヒト由来
の検体の測定用には、ウシ・インスリンを固相にコート
して用いることが好ましい）が、通常は、ヒト・インス
リン及び／又は哺乳動物（入手し易さの点からは、ウ
シ、ブタ等が好ましい）由来のインスリンを用いること
が好ましい。本発明に用いるインスリンとしては、２０
ＩＵ／ｍｇ以上、更には２５ ＩＵ／ｍｇ以上（特
に、２５〜２８ ＩＵ／ｍｇ程度）のものを用いること
が好ましい。ここに、「ＩＵ」は、「国際単位」の意味
である（「生化学辞典」（第２版）１４２頁（１９９
０）東京化学同人）。

【００２３】例えば、ヒト・インスリンは、図１に示す
ように、２１個のアミノ酸残基から成るＡ鎖と、３０個
のアミノ酸残基から成るＢ鎖から構成されるペプチドホ
ルモンであり、この２本のポリペプチド鎖はＡ鎖の７番
目とＢ鎖の７番目間、およびＡ鎖の２０番目とＢ鎖の１
９番目間で、ジスルフィド結合で結合されている（Ａ鎖
内では６番目と１１番目で、Ａ、Ｂ鎖間では７番目と７
番目、２０番目と１９番目のシステインによりＳ−Ｓ結
合が形成されている）。分子量は５８０７、等電点は
５．３〜５．４である。（「生化学辞典」（第２版）１
４２頁（１９９０）東京化学同人）。

【００２４】他方、ブタ・インスリンは、上記ヒト・イ
ンスリンのＢ鎖３０番目がＴｈｒ→Ａｌａに変化したも
のであり；ウシ・インスリンは、上記ヒト・インスリン
のＡ鎖８番目がＴｈｒ→Ａｌａ、Ａ鎖１０番目がＩｌｅ
→Ｖａｌ、Ｂ鎖３０番目がＴｈｒ→Ａｌａに変化したも
のである。

【００２５】本発明においては、このインスリンとして
は、ヒトあるいは動物から採取したものはもちろん、化
学的及び／又は生化学的に合成したもの、あるいは遺伝
子工学等の、いわゆるバイオテクノロジーの技術により
得たもののいずれもが使用可能である。

【００２６】（ヒト以外の動物）インスリンを免疫し
て、抗インスリン抗体を得る際には、ヒト以外の動物と
して、哺乳動物を用いることが好ましい。より具体的に
は、モルモット（テンジクネズミ、guinea pig）、マウ
ス、ウサギ等の哺乳動物が好ましく用いられるが、取扱
い易さ、価格等の点からはモルモット、マウス、あるい
はウサギを用いることが好ましい。

【００２７】抗体産生の容易さの点からは、上記インス
リン抗体を得る際には、ヒト・インスリンを（ヒト以外
の）動物に免疫するか、あるいは動物由来のインスリン
を他の動物に免疫（例えば、ウシ・インスリンをモルモ
ットに免疫）することが好ましい。

【００２８】（標準試料）標準試料（スタンダ−ドない
しレファレンス）としては、インスリンを免疫して抗イ
ンスリン抗体を産生させた上記動物の体液（通常は血
清）が用いられる。本発明においては、このインスリン
抗体として、プロ・インスリン（Pro-insulin）、グル
カゴン、ソマトスタチン等との交差性が少ないものを用
いることが好ましい。

【００２９】（被検試料）被検試料（ないし検体）とし
ては、血液等のヒト体液（通常は血清）が好ましく用い
られる。

【００３０】（酵素標識プロテインＡ）ＰＡ（プロテイ
ンＡ）とは、黄色ブドウ球菌細胞壁成分の約５％を占め
る分子量約４２，０００のタンパク質で、ヒト、マウ
ス、ウサギなどの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃフ
ラグメントと特異的に結合するタンパク質をいう。本発
明においては、このＰＡとしては、該ＰＡ１ｍｇに対
し、ヒト、マウス、ウサギ、及び／又はモルモットＩｇ
Ｇが７ｍｇ以上、更には８ｍｇ以上（特に９ｍｇ以上）
の反応性を有するＰＡを用いることが好ましい（ファル
マシア社、セパレーション・ニュース（Separation New
s）１９７９年４月号；「プロテインＡ−抗・抗体試
薬」の項参照）。

【００３１】本発明で用いる酵素標識ＰＡは、上記ＰＡ
をＥＩＡ法で使用可能な酵素で標識して得られるもので
ある。ここに標識に用いられる酵素としては、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ等が好ましく用いられ
るが、後述のように基質および比色法を用いて簡便且つ
高感度な酵素活性の測定が可能な点からは西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼを用い
ることが好ましい。

【００３２】ＰＡを上記酵素で標識する方法は公知の方
法（例えばグルタルアルデヒド法）を用いることがで
き、特に制限されない。

【００３３】（スキムミルク）本発明のインスリン抗体
測定法において、被検試料（検体）の希釈には、スキム
ミルク添加緩衝液が好ましく用いられる。このようにス
キムミルク添加緩衝液を用いた場合、本発明者らの検討
によれば、検体中の非特異結合因子（従来のＥＩＡサン
ドイッチ法における特異性低下の原因の一つであった）
の影響を最小限に抑制することが可能である。ここに
「スキムミルク」とは、いわゆる脱脂粉乳のことであ
り、牛乳をクリーム分離機にかけた際に得られる脂肪含
量の小さい方の部分である脱脂乳から、水分を除いて粉
末として得られるものをいう。

【００３４】上述したスキムミルクは、固相のインスリ
ン非付着部分をブロックする、いわゆるブロッキング剤
としての作用をも有する。このようなブロッキング剤と
しては、従来よりＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等が用
いられて来たが、本発明者らの検討によれば、被検検体
中には抗ＢＳＡ抗体を有するものがあるため、該抗体が
ブロッキング剤と結合して非特異反応の一因となる場合
がある。このような場合においても、上記スキムミルク
は、好適に用いることが可能である。

【００３５】上記スキムミルクとともに用いる緩衝液と
しては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の一般的な緩衝液を
特に制限なく用いることができる。上記スキムミルクの
緩衝液への添加量は、該緩衝液の重量を基準として５〜
１１％程度（更には８〜１１％程度、特に９〜１１％程
度）であることが好ましい。

【００３６】（ＥＩＡ測定法）次に本発明における抗イ
ンスリン抗体測定法の好ましい一態様について述べる。

【００３７】なお、以下に述べる抗インスリン抗体測定
法においては、インスリン、抗インスリン抗体、標準試
料、被検試料（検体）等の材料ないし試薬は、適宜リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）等の緩衝液で希釈して用いてもよい
ものとする。また、下記測定においては、スイ臓由来の
分解酵素を阻害する分解酵素阻害剤（例えば、アプロチ
ン）を被検試料に添加することが、データの正確性を高
める上で好ましい。

【００３８】インスリン（例えばウシ・インスリン）を
１０〜１００μｇ／ｍＬ程度に緩衝液で希釈した後、固
相（例えば、９６穴（ウェル）マイクロプレート）上
に、各ウェル当たり（以下、使用量は１ウェル当たりで
記述する）５０〜２００μＬずつ加え、低温（例えば４
℃）では１晩（１０〜２０時間）程度（室温では１〜２
時間程度）放置して、該固相をインスリンで被覆する。
過剰のインスリン溶液を回収した後、上記固相を緩衝液
で数回（例えば２〜４回程度）洗浄する。

【００３９】この後、必要に応じてブロッキング溶液
（例えば、ゼラチン含有緩衝溶液）１００〜２００μＬ
をウェル中に注入し、２５℃で１〜２時間程度放置し
て、固相表面のインスリン非付着部分をブロックするこ
とが、バックグランドを低くして測定の正確性、再現性
を高める上で好ましい。

【００４０】次いで、抗インスリン抗体を含む標準試料
（スタンダード；ヒト以外の動物由来のもの）を緩衝液
で希釈して、希釈液中の抗体量が０〜２０ｎｇ／ｍＬ程
度（通常は、検量線作成のために、この範囲内で数ポイ
ント作成する）となるようにしたスタンダード溶液５０
〜２００μＬ程度、および被検検体（例えばヒト血清）
を緩衝液で５０〜１００倍程度に希釈した検体溶液５０
〜２００μＬ程度を、それぞれ別のウェル中に注入し、
４℃では１晩程度（２５℃では１〜２時間程度）放置し
て、プレート上のインスリンと、スタンダード溶液およ
び検体溶液中の抗インスリン抗体とを反応させる（第１
反応）。

【００４１】過剰の検体溶液およびスタンダード溶液を
除いた後、各ウェルを緩衝液で３〜５回程度洗浄する。

【００４２】次いで、プロテインＡ（ＰＡ）に換算して
１００〜２００ｎｇ／ｍＬ程度を含む酵素（例えば西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））標識抗体ＰＡ緩衝
溶液を５０〜２００μＬ程度各ウェルに注入し、２５℃
で１〜３時間放置して、抗インスリン抗体（Ｆｃフラグ
メント）とＰＡとを反応させる（第２反応）。

【００４３】過剰のＰＡ溶液を除き、緩衝液で３〜５回
程度洗浄した後、上記酵素の活性を測定することによ
り、スタンダードおよび検体中の抗インスリン抗体量を
求めることができる。

【００４４】より具体的には、上記酵素活性の測定は、
以下のようにして行うことができる。例えば、上記酵素
に対応する基質（酵素がＨＲＰの場合、例えばオルトフ
ェニレンジアミン（ＯＰＤ）を０．３〜０．６ｍｇ／ｍ
Ｌ程度の濃度で５０〜２００μＬ各ウェルに注入し、２
５℃で１０分〜１時間程度基質と酵素とを反応させ、陽
性スタンダードのウェルが充分発色したことを確認した
後、反応を停止させ、（例えば９６穴プレート用の吸光
度計を用いて）各ウェルの吸光度を測定する。

【００４５】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。実施例１ ウシインスリン（Sigma 社製、Ｉ−３５００）を１０ｍ
Ｍ 炭酸緩衝液（Ｎａ₂ ＣＯ₃ −ＮａＨＣＯ₃ ，ｐＨ
９．９）で５０μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴（ウェル）
−イムノプレート（Coster社製マイクロプレート）へウ
ェル当たり１００μＬ添加し、４℃で２０時間インキュ
ベートした。その後、上清を捨て、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０とを含有する洗浄用
ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８）で３回洗
浄した。

【００４６】次にブロッキング剤（大日本製薬製 Ｂｌ
ｏｃｋ Ａｃｅ）を２５％含む０．０１Ｍ−ＰＢＳ（リ
ン酸緩衝液）からなるブロッキング溶液を、各ウェルに
１００μＬづつ加え、２５℃で２時間放置してブロッキ
ング操作を行った。

【００４７】過剰のブロッキング溶液を除いた後、各ウ
ェルにスタンダード溶液、および被検ヒト血清希釈液
を、それぞれ１００μＬづつ注入した後、４℃で１晩反
応させた（第１反応）。

【００４８】ここで、スタンダード溶液としては、抗イ
ンスリン抗体含有モルモット血清(Linco Research 社、
Ｎｏ．４０１１）を希釈用ＰＢＳ（０．１Ｍ ＰＢＳ
（ｐＨ６．８）、１０％スキムミルク（Difco Laborato
ries 0032-02）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（半井化
学）およびアプロチン（Basel，２５０００ＫＩＵ／ｍ
Ｌ）５００ＫＩＵ／ｍＬを含む）で抗体量が０〜２０ｎ
ｇ／ｍＬとなるように希釈したものを６ポイント用い
た。また、被検ヒト血清としては、ヒト血清を上記希釈
用ＰＢＳで５０〜１００倍に希釈したものを用いた。

【００４９】スタンダード溶液および検体溶液を除去し
た後、各ウェルを上記した洗浄用ＰＢＳで４回洗浄し
た。次いで、ＰＡ（プロテインＡ）用希釈ＰＢＳ（０．
１ＭＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％Ｂｌ
ｏｃｋ Ａｃｅ およびアプロチン５００ＫＩＵ／ｍＬを
含む）により希釈して１００〜２００ｎｇ／ｍＬとした
ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダ−ゼ）標識ＰＡ（Capp
ell社製）を１００μＬづつ各ウェルに加え、２５℃で
２時間放置した（第２反応）。

【００５０】過剰のＨＲＰ−ＰＡ溶液を除き、上記洗浄
用ＰＢＳで３回洗浄した後、基質溶液を１００μＬづつ
各ウェルに加え、２５℃で２０分間放置した（発色反
応）。ここで、基質溶液としては、３０ｍｇのＯＰＤ
（オルトフェニレンジアミン、Sigma 社）を０．０１Ｍ
ＰＢＳ（ｐＨ５．０）５０ｍＬに溶解し、３０％Ｈ₂
Ｏ₂ を２５μＬ加えたものを用いた。

【００５１】上記発色反応を、１００μＬ／ウェルの５
Ｎ−硫酸で停止させた後、吸光度計（イムノリーダー、
Dinatec社製 ＭＲ５０００）で測定し、スタンダード
から検量線を求め、これを用いて、ヒト血清中の抗イン
スリン抗体の量を求めた。ここで求められた抗インスリ
ン抗体測定用の検量線の例を図２に示す。

【００５２】実施例２ 実施例１で用いたスタンダード（市販の抗インスリン抗
体）中の抗体量は、ヨード標識インスリン（¹²⁵Ｉ−イ
ンスリン）を使用したScatchard plotから以下のように
して求めた。すなわち、抗体（Ａｂ）として上述した抗
ヒト・インスリンモルモット血清を用い、抗原（Ａｇ）
としては¹²⁵Ｉ−インスリン（９３１４ｃｐｍ／１００
μＬ／tube １２．６ｐｇ）を用いた。

【００５３】上述したＡｂ１００μＬ、及びＡｇ１００
μＬを緩衝液（０．０１Ｍ ＰＢ、ｐＨ６．８）３００
μＬ中で、４℃、一晩反応させた後、結合（Bound）と
非結合（Free）とを分離（いわゆるＢ／Ｆ分離）を行っ
た。上記条件下で、抗体を一定とし、¹²⁵Ｉ−インスリ
ンの添加量を変化させた場合の反応性からScatchard pl
otを求めた。

【００５４】Ａｇ濃度（Hot）を［Ａ］、Ａｂ濃度を
［Ｚ］、Ａｇ・Ａｂ complex濃度を［Ｂ］ とすると、結合定数Ｋをもって以下の式が成り立つ。 （Ａ−Ｂ）を結合しなかったＡｇ（Hot）freeとして
［Ｆ］と表すと、上記式は次のように書き直すことがで
きる。 K＝［Ｂ］／［Ｆ］（［Ｚ］−［Ｂ］） ［Ｂ］／［Ｆ］＝−k［Ｂ］＋K［Ｚ］ ここで［Ｂ］／［Ｆ］をＹ軸に、［Ｂ］をＸ軸にとる
と、−Kを傾きとする一次式が得られる。

【００５５】添加した抗体［Ｚ］がすべて結合に使われ
たとすると［Ｚ］＝［Ｂ］となり、［Ｂ］／［Ｆ］＝０
となる。すなわち、上記一次式において、ｙ＝０の時
に、つまりＸ軸切片が添加抗体の濃度となる。

【００５６】このような方法で求めたScatchard plotを
図３に示す。ここで、ｙ＝０の時、すなわちＸ軸切片
は、７．１×１０⁴ ｃｐｍ／tubeを示しているため、
これを抗体の濃度に換算することができる（但し、Ａｇ
とＡｂが１：１で反応することを条件とする）。

【００５７】７．１×１０⁴ ｃｐｍを濃度換算する
と、 インスリンの分子量は５８００、抗体ＩｇＧの分子量は
１６００００であり、使用時に１５０００倍とし０．１
ｍＬ使用しているから、抗体濃度は、 すなわち、抗体量は、約４００μｇとなる。このような
抗体量の求め方に関しては、参考文献（須藤忠満ら、抗
体の結合定数測定法−Ｋ値及び抗体濃度、免疫実験操作
法、２６９１〜２７０６ｐ．（１９７０〜１９８０）日
本免疫学会編）を参照することができる。

【００５８】尚、実施例１のＥＩＡ（ないしＥＬＩＳ
Ａ）測定においてマイクロプレートにコートしたインス
リン(coat insulin)としてporcine、bovine及びhuman
を用いた場合、図４及び図５に示すように、抗体(anti-
human ginea pig)に対する反応性は３者ともほとんど変
わらなかった。

【００５９】実施例３ インスリン抗体陽性検体（ヒト血清）を緩衝液により異
なる希釈倍率で希釈したサンプル（Ａ、Ｂ，及びＣ）を
用い、実施例１の測定系で測定した結果を図６に示す。
図６から明らかなように、測定した検体については、い
ずれも原点を通る直線関係が得られ、上記測定系の正確
性が証明された。この測定系において、系統的誤差とし
て表される日差再現性があり、変動係数として１．９〜
８．４％であった。

【００６０】実施例４ 実施例１の測定方法により、健常者（Normal、９４
例）、抗核抗体陽性患者（ＡＤＮＡ（＋）、２５例）、
リュウマチ因子陽性患者（ＲＡＨＡ（＋）、２７例）、
および糖尿病患者（ＤＭ、１９８例）の各検体につい
て、抗インスリン抗体量を測定した結果を図７に示す。
図７中、ＤＭ（糖尿病患者）でinsulin（＋）とあるの
は、インスリン治療中の患者の検体、insulin（−）と
あるのは、食事療法のみを行った患者の検体を示す。

【００６１】図７から明らかなように、本発明の測定法
による測定結果においては、健常者、抗核抗体陽性患
者、リュウマチ因子陽性患者では総て抗体陰性を示し、
糖尿病患者のみに抗体陽性を示した。したがって本発明
の抗インスリン抗体測定法は、糖尿病の自己抗体および
インスリン抗体陽性患者のインスリン治療の指標として
有用であることが判明した。

【００６２】実施例５（添加回収テスト） ３種類の血清（ヒト血清、サンプルＤ、Ｅ、及びＦ）に
対して、濃度の異なる（５ポイントづつ）の標準インス
リン抗体を添加して、実施例１の測定系によりインスリ
ン抗体量（回収率）を求めた。結果を図８に示す。この
試験においては、添加回収率は、平均で９６．９％（傾
きの平均＝０．９６９）であった。

【００６３】実施例６（スキムミルク及び／又はTween
−２０の添加の効果） 実施例１の測定系において、スキムミルク（ＳＭ）及び
Tween−２０の濃度を種々変化させて、インスリン抗体
測定値の変動を調べた。その結果、スキムミルク（Ｓ
Ｍ）及びTween−２０をともに加えた場合のTween−２０
の濃度については、０．１〜０．５％の濃度で非特異反
応が少なく、インスリン抗体量が同一に測定された。固
相インスリンの「はがれ易さ」を考慮した場合、Tween
−２０の濃度は、０．１％が最も好ましかった。一方、
ＳＭについては、５〜１０％の濃度範囲で、非特異反応
が効果的に抑制された。

【００６４】

【発明の効果】上述したように、本発明のインスリン抗
体の測定方法によれば、ヒト以外の動物に由来し、その
中に含まれる抗インスリン抗体量を正確に計算可能な標
準試料（スタンダード）と、ＩｇＧのＦｃフラグメント
に特異的に結合する酵素標識プロテインＡとの組合せに
基づき、ヒト体液中の抗インスリン抗体量を安全且つ簡
便に、しかもインスリン投与の明確な指標となり得る程
度に定量的に測定することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト・インスリンのアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図２】実施例１で求めた抗インスリン抗体測定用の検
量線の例を示すグラフである。

【図３】スキャッチャード解析結果を示すグラフであ
る。Ｙ軸は特異的抗体−標識体結合複合物量／遊離標識
体量を示し、Ｘ軸は、特異的抗体−標識体結合複合物量
（ｃｐｍ）を示す。

【図４】本発明のインスリン抗体の測定法において、固
相にコートすべきインスリンとしてブタ・インスリン、
ウシ・インスリン又はヒト・インスリンを用いた場合の
測定結果の比較を示すグラフである。

【図５】本発明のインスリン抗体の測定法において、固
相にコートすべきインスリンとしてブタ・インスリン、
ウシ・インスリン又はヒト・インスリンを用いた場合の
測定結果の比較を示す棒グラフである。

【図６】実施例３で行ったヒト被検血清の希釈テストの
結果を示すグラフである。

【図７】健常者、抗核抗体陽性患者、リュウマチ因子陽
性患者、および糖尿病患者の血清について本発明の測定
法により抗インスリン抗体を測定した結果を示すプロッ
トである。

【図８】実施例５の添加回収テストの結果を示すグラフ
である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検試料、およびヒト以外の動物由来の
   インスリン抗体を含む標準試料を、固相上に配置したイ
   ンスリンと反応させ、次いで固相上のインスリンに結合
   したインスリン抗体と酵素標識プロテインＡとを反応さ
   せることを特徴とするインスリン抗体の測定方法。
2. 【請求項２】 前記ヒト以外の動物が哺乳動物である請
   求項１記載のインスリン抗体の測定方法。
3. 【請求項３】 前記哺乳動物がモルモット、又はマウス
   である請求項２記載のインスリン抗体の測定方法。
4. 【請求項４】 前記動物由来のインスリン抗体が、該動
   物に他の動物のインスリンを免疫して得たインスリン抗
   体である請求項１記載のインスリン抗体の測定方法。
5. 【請求項５】 前記動物由来のインスリン抗体が、該動
   物にヒト・インスリンを免疫して得たインスリン抗体で
   ある請求項１記載のインスリン抗体の測定方法。
6. 【請求項６】 前記固相上に配置したインスリンが、ヒ
   ト・インスリンである請求項１記載のインスリン抗体の
   測定方法。
7. 【請求項７】 前記固相上に配置したインスリンが、動
   物由来のインスリンである請求項１記載のインスリン抗
   体の測定方法。
8. 【請求項８】 スキムミルク添加緩衝液で希釈した被検
   試料を用いる請求項１記載のインスリン抗体の測定方
   法。
9. 【請求項９】 前記酵素がペルオキシダーゼである請求
   項１記載のインスリン抗体の測定方法。