JPH05304983A - ヒト尿中蛋白質分解酵素阻害蛋白質の定量のための物質および定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】癌疾患との関連を有する尿中に含まれるヒト尿
中蛋白質分解酵素阻害蛋白質(UTI) を認識するモノクロ
ーナル抗体、および前記抗体を用いたUTI の定量方法を
提供する。 【構成】UTI を含む抗原でマウスを免疫処置する。免疫
処置したマウスの脾臓細胞とマウス由来のミエローマ細
胞で細胞融合を行い、抗UTI モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ細胞を選択する。ハイブリドーマ細胞をマ
ウス腹腔内に投与し、マウスの腹水を採取し、採取画分
を精製して UTIを認識するモノクローナル抗体を取得す
る。このモノクローナル抗体と尿蛋白質を含む検体を反
応させた後、発色のための標識分子を結合させた抗体を
前記モノクローナル抗体に結合させ、前記標識分子を発
色させて UTIの比色定量を行う。 【構成】癌患者の病状の診断や治療経過の指標として臨
床上有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト尿中蛋白質分解酵
素阻害蛋白質（以下、「UTI 」と称する）、さらに、ヒ
ト癌組織中のヒト尿中蛋白質分解酵素阻害蛋白質様の抗
原を認識するマウスモノクローナル抗体、前記マウスモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、およ
び前記マウスモノクローナル抗体を用いたUTI の免疫学
的定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】動植物は、蛋白質分解酵素の活性を阻害
する蛋白質性の阻害物質を保有しており、これら阻害物
質が蛋白質分解酵素の生理作用を制御していると考えら
れているが、UTI の生理的役割についてはまだ不明な点
が多い。

【０００３】UTI もこれら蛋白質分解酵素阻害蛋白質の
一つとして、Bauer とReich によって1909年に発見され
た〔Med. Klin., vol.46, pp.1744-1747 (1909) 〕。

【０００４】尿蛋白質の多くは、各臓器の代謝産物を含
む血清成分に由来することから、疾患との関わりも深
く、臨床医学の分野において重要な診断材料となってい
る。

【０００５】また、妊娠や手術時等のストレス状態や感
染症、腎・尿路疾患、癌患者等において尿中UTI 量が有
意に増加することも報告されている〔Cancer Res., vo
l.36,pp.1837-1846 (1976); J. Immunol., vol.121, p
p.1636-1639 (1978); 西日本泌尿, vol.42, pp.35-43
(1980); Acta Haemat., vol.67, pp.109-113 (1982);Sc
and. J. Clin. Lab. Invest., vol.43, pp.151-155 (19
83);臨床病理, vol.13, pp.445-449 (1985);広島大学医
学雑誌, vol.34, pp.857-864 (1986) 〕。

【０００６】癌患者における尿中UTI 量の増加は、泌尿
器系腫瘍、血液系腫瘍、頭頸部腫瘍、消化器系腫瘍、肺
−縦隔腫瘍、乳癌等の多くの癌腫で認められており〔臨
床病理, vol.13, pp.445-449 (1985) 〕、また、肺癌患
者の癌組織中にUTI 様抗原が存在すること〔Cancer Re
s., vol.44, pp.2011-2015 (1984); 広島大学医学雑誌,
vol.33, pp.1-16 (1985)〕も報告されている。

【０００７】UTI の生合成機構については未だ解明され
ていないが、上記した各種文献の報告からして尿中UTI
量の増加と癌は密接な関連性が認められる。

【０００８】従って、癌患者の尿中または血中のUTI 量
の定量値は、単なる腫瘍の指標としてのみでなく、病状
の診断や治療経過の指標として臨床上有用である。 ま
た、上記したように、癌組織中に存在するヒト尿中蛋白
質分解酵素阻害蛋白質様抗原を検出することは、癌の病
理診断において有用であると考えられる。

【０００９】UTI の検出測定法としては、酵素学的定量
法や精製UTI をウサギ等に免疫して得られるポリクロー
ナル抗体を用いた免疫測定法〔西日本泌尿, vol.42, p
p.35-43 (1980);西日本泌尿, vol.74, pp.1641-1652 (1
983);臨床薬理, vol.19, pp.259-260 (1988)〕がよく用
いられている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記酵
素学的定量法は、測定系に用いるトリプシンが不安定な
酵素であり、また定量法自体が酵素阻害活性を指標にし
ていることから、定量値は試料中の総トリプシン阻害活
性を示すことになるため、UTI のみの定量が難しく、さ
らに前記ポリクローナル抗体を用いた免疫測定法は、UT
I への特異性、抗体の均一性の観点からして、UTI の正
確な定量には不適切と指摘されていた。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題に鑑
みて、ポリクローナル抗体よりもUTI への特異性、抗体
の均一性の点において優れた特性を有するモノクローナ
ル抗体に着目して完成されたものであり、その要旨とす
るところは、UTI および癌組織中のUTI 様抗原を特異的
に認識するモノクローナル抗体、前記モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞、および前記UTI を特
異的に認識するモノクローナル抗体を用いたUTI の免疫
学的定量方法である。

【００１２】本発明のヒトUTI 特異的モノクローナル抗
体は、下記手順に従い調製される。

【００１３】(1) 動物の免疫処置とハイブリドーマの作
製 免疫動物としては、マウスを用いる。

【００１４】抗原は精製ヒトUTI 、ヒトUTI 由来のフラ
グメント、および適当なキャリアー分子に結合した合成
ペプチド等をアジュバントと共に、免疫動物の腹腔や皮
下に投与する。 なお、抗原物質のみを静脈内に投与し
てもよい。

【００１５】一週間から二週間の間隔で、さらに３〜５
回の免疫処置を行った後に、眼底静脈よりパスツールピ
ペットを用いて採血を行う。 得られた血清中のヒトUT
I に対する抗体活性を酵素免疫測定法（以下、「ELISA
」と称する）にて測定し、十分な抗体活性が認められ
れば、最終免疫を行って、マウス脾臓細胞を細胞融合用
に供する。

【００１６】(2) ミエローマ細胞の調製 細胞融合に用いるミエローマ細胞は、BALB/cマウスから
確立されたヒポキサンチングアニンホスフォリボシルト
ランスフェラーゼ(HGPRT) 欠損細胞株を使用する。 例
えば、 P3-X63-Ag8-U1、 X63-Ag8.653、SP2/o-Ag14等の
ミエローマ細胞を、8-アザグアニンまたは6-チオグアニ
ンを含む10％FCS 加 RPMI 1640培地にて培養し、HGPRT
欠損株の維持継代を行う。

【００１７】実験の一週間前より通常の10％FCS 加 RPM
I 1640培地にてミエローマ細胞の培養を行い、培養細胞
を細胞融合用に供する。

【００１８】(3) 細胞融合 最終免疫してから３〜４日後に、免疫マウスより無菌的
に脾臓を摘出し、RPMI1640培地中で脾臓細胞浮遊液を調
製する。

【００１９】ミエローマ細胞、免疫脾臓細胞共に、 RPM
I 1640培地中にて十分に洗浄し、ポリエチレングリコー
ル法あるいは電気的細胞融合法等の常法を用いて細胞融
合を行う。

【００２０】細胞融合は、HAT 培地（ヒポキサンチン10
^-4M 、アミノプリテン４×10^-7M 、チミジン 1.6×10^-5
M 、10％FCS 加 RPMI 1640培地）に懸濁し、96穴プレー
トに0.2ml ずつ分注する。

【００２１】細胞の培養は５％CO₂ 存在下、37℃で行
い、１日後、３日後それぞれに培地の半分を新鮮なHAT
培地と交換する。

【００２２】(4) 抗ヒトUTI モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ細胞の選択 ハイブリドーマ細胞選択培地(HAT培地) にて培養した細
胞が増殖してきたウェルより、無菌的に培養上清を採取
し、96穴プレートを用いて抗体活性をELISA にて測定す
る。

【００２３】すなわち、UTI 蛋白質またはUTI 蛋白質の
フラグメントをプレートへ吸着させ、１％BSA-PBS(-)溶
液にて抗体のプレートへの非特異的結合部位をブロッキ
ングした後、一次抗体としてハイブリドーマ細胞の培養
上清を加える。

【００２４】反応後、抗体溶液を除去して、PBS(-)溶液
にてウェルに残存する一次抗体を洗浄し、１％BSA-PBS
(-)溶液を用いて、抗体のプレートへの非特異的結合部
位の再度のブロッキングを行う。

【００２５】１％BSA-PBS(-)溶液で調製した酵素標識抗
マウスイムノグロブリン抗体を二次抗体として、抗原に
対して特異的に反応している抗体のスクリーニングを行
う。

【００２６】そして、酵素反応により抗原特異的一次抗
体を検出し、ELISA 用マイクロプレートリーダーを用い
て抗体活性を数値化する。 陽性のウェルが確認される
と、BALB/cマウス胸腺細胞を支持細胞とする限界希釈法
にしたがってハイブリドーマ細胞のクローニングを行
い、目的とするハイブリドーマクローンを確立する。

【００２７】(5) モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体の精製は、培養上清およびマウス腹
水を利用して行う。

【００２８】すなわち、培養上清の場合、無血清培地ま
たは牛胎児血清添加培地を用いてハイブリドーマ細胞の
大量培養により獲得した培養上清を、またマウス腹水の
場合、プリスタン処理BALB/cマウスに、抗体産生ハイブ
リドーマ細胞５〜10×10⁶ 個を腹腔内に投与して得られ
た腹水を硫酸アンモニウムで塩析した粗画分を、それぞ
れモノクローナル抗体精製の出発材料とする。

【００２９】精製操作は高速液体クロマトグラフィー(H
PLC)およびオープンカラムを用いた陰イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過・アフィニティークロマトグラ
フィー等を用いて行う。

【００３０】なお、精製したモノクローナル抗体に酵素
（β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、
ペルオキシダーゼ、グルコシダーゼ等）やラジオアイソ
トープを標識して、二次抗体を用いずに直接法による抗
原の検出も可能である。

【００３１】

【実施例】以下に、本発明の実施例を詳細に説明する。

【００３２】実施例１：抗UTI モノクローナル抗体の確
立 (1) 免疫処置 ６週齢の雌BALB/cマウス（販売元：日本チャールズリバ
ー社）を無菌室にて数日飼育した後、実験に用いた。

【００３３】ヒトUTI(日本ケミカルリサーチ社製）を用
いて、ヒトUTI-PBS(-)溶液(1mg/ml)とフロイント完全ア
ジュバント（容量比1:1)を混合してエマルジョンを作製
し、マウス腹腔内に 500μl を投与した。

【００３４】３週間後、ヒトUTI-PBS(-)溶液(1mg/ml)と
フロイント不完全アジュバント（容量比1:1)を混合した
免疫原を作製し、この 250μl を腹腔内に投与した。
さらに、これより４週間後、同様にフロイント不完全ア
ジュバントを用いて調製した抗原で最終免疫を行い、免
疫マウスの脾臓細胞を細胞融合に供した。

【００３５】(2) マウスミエローマ細胞の調製 BALB/cマウス由来、６−チオグアニン耐性のSp2/o-Ag14
ミエローマ細胞を10％FCS 加 RPMI 1640培地（日水製薬
社製）にて培養し、約６×10⁷ 個のミエローマ細胞を細
胞融合に用いた。

【００３６】(3) ハイブリドーマ細胞の作製とクローニ
ング 上記(1) および(2) にて調製された脾臓細胞とSp2/o-Ag
14ミエローマ細胞を、RPMI 1640 培地で洗浄し、50％ポ
リエチレングリコール (分子量：4000、Merck社製)-RPM
I 1640 溶液を用いて細胞融合を行った。

【００３７】融合した後、RPMI 1640 培地を注ぎ、低速
遠心分離(800rpm)によって細胞を回収し、100ml のHAT
培地に懸濁した後、96穴プレート(Nunclon, Nunc社製)
５枚に分注した。 そして、５％CO₂ 存在下37℃にて培
養を行った。 培養開始から１日後、３日後それぞれに
培地の半分を新鮮なHAT 培地と交換した。

【００３８】ハイブリドーマ細胞の増殖が盛んなウェル
から順に、96穴プレート（イムノプレートIIマキシソー
プ、Nunc社製) を用いて、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスイムノグロブリンＧ＆Ｍ抗体 (Jacson Immunores
earch Laboratories社製) を二次抗体としたELISA によ
ってハイブリドーマ細胞のスクリーニングを行った。

【００３９】抗原としたヒトUTI との間に陽性反応が認
められたウェルに増殖しているハイブリドーマ細胞に対
して、BALB/cマウス胸腺細胞を巻き込んだ96穴プレート
を用いた限界希釈法に従ってクローニングを行い、モノ
クローナル抗体4G12（以下、「MAb4G12 」と称する）を
産生するハイブリドーマ細胞を確立した。

【００４０】本実施例にて確立されたハイブリドーマ細
胞をハイブリドーマ細胞4G12（FERMP-12930)として寄託
した。

【００４１】得られたハイブリドーマクローン細胞は、
10％FCS 加 RPMI 1640培地にて培養を行い、培養細胞を
その後の実験に供した。 MAb4G12 のクラスは、抗マウ
スイムノグロブリン抗体 (Jacson Immunoresearch Labo
tatories社製）と酵素標識抗マウスイムノグロブリンク
ラス・サブクラス特異抗体(SEROTEC社製）を用いたサン
ドイッチELISA により、IgG1と決定した。

【００４２】(4) MAb4G12 の調製 10cmディッシュ(Corning社製）上で、ハイブリドーマ細
胞4G12を細胞濃度限界まで培養し、この細胞浮遊液を、
50ml遠沈管に移して、2800rpm にて遠心し、培養上清を
採取した。 得られた培養上清に、0.1%となるようにNa
N₃を添加し、使用時まで−20℃の温度条件下で凍結保存
した。

【００４３】次に、MAb4G12 を産生するハイブリドーマ
細胞をプリスタン処理BALB/cマウス腹腔内に投与し、そ
の腹水を得た。 得られた腹水を33％硫酸アンモニウム
にて塩析して、透析し、試料をプロテインＡカラム (Af
fi-Gel Protein A MAPS IIKit, BioRad 社製）に通し
て、余分な蛋白質を除去し、PBS(-)溶液(pH 7.2)にて溶
出される画分を採取した。

【００４４】この溶出画分のPBS(-)溶液に対する透析物
をプロテインＡカラム精製MAb4G12試料とし、この精製M
Ab4G12 を実験時まで−80℃に凍結保存した。

【００４５】蛋白質の定量は、ウシ血清アルブミンを標
準試料として吸光光度計（吸収波長280nm) で測定し
た。

【００４６】培養上清中に含まれるMAb4G12 とマウス腹
水由来の精製MAb4G12 は、同一の抗原特異性を示すが、
培養上清試料は、MAb4G12 の他に牛血清蛋白質やハイブ
リドーマ細胞由来の蛋白質成分を含むことから、実験目
的に従ってこれらの試料を使い分けた。

【００４７】実施例２：UTI に対する反応性 PBS(-)溶液にて至適濃度に希釈したUTI 抗原溶液50μl
を、96穴プレート（イムノプレートIIマキシソープ、Nu
nc社製）のウェルに注ぎ、４℃にて一夜静置した。 な
お、以後の操作はすべて室温で行った。

【００４８】抗原溶液を捨て、PBS(-)溶液 100μl をウ
ェルに注ぎ、余分な抗原溶液を洗浄した後、１％BSA-PB
S(-)溶液（ブロッキング溶液)100μl を各ウェルに注
ぎ、15分間、抗体のプレートへの非特異的吸着部位のブ
ロッキングを行った。

【００４９】次いで、ブロッキング溶液を除去し、ハイ
ブリドーマ細胞4G12の培養上清（一次抗体）50μl を各
ウェルに注ぎ、抗体反応を行った。

【００５０】抗体反応が始まってから30分後、各ウェル
をPBS(-)溶液にて３回洗浄し、さらに上記ブロッキング
溶液にてブロッキングを行った後、１％BSA-PBS(-)溶液
にて400ng/mlに希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マ
ウスイムノグロブリンＧ＆Ｍ抗体（二次抗体）50μl を
各ウェルに注ぎ、一次抗体と同様に30分間反応を行っ
た。

【００５１】反応終了後、各ウェルをPBS(-)溶液にて３
回洗浄を行い、基質溶液 100μl(オルトフェニレンジア
ミン 0.4mg/ml 、0.01％H₂O₂−クエン酸燐酸緩衝液、pH
5.0)を各ウェルに注ぎ酵素反応を行った。 反応を開始
してから２分後、2M硫酸30μl を各ウェルに加え酵素反
応を停止し、マイクロプレートリーダー (CORONA MTP-1
00、コロナ社製）を用いて比色定量（吸収波長492nm)を
行い、抗体活性を数値化し、その結果を下記表１にまと
めた。 表１から明らかなように、１ng/ml 以下の濃度
のUTI でも検出ができた。

【００５２】

【表１】

【００５３】実施例３：ヒト尿中蛋白質に対する特異性 健常人男性８人より採取した新鮮尿とSDS サンプルバッ
ファー(8M Urea、0.5MTris-HCl、pH 6.8) を混合（容量
比1:1)し、試料のSDS 化を行ってから、その20μl を用
いてSDS ポリアクリルアミドゲル (16％）電気泳動を行
った。

【００５４】泳動された蛋白質をミリポアフィルター
（イモビロン、ミリポア社製）上に電気的に転写し、５
％スキムミルク-PBS(-) 溶液に浸してブロッキングを行
った。

【００５５】ハイブリドーマ細胞4G12の培養上清（一次
抗体）を用いて室温で１時間、抗体反応を行い、PBS(-)
溶液にて未反応のMAb4G12 を洗浄除去した後、５％スキ
ムミルク-PBS(-) 溶液に浸して再びブロッキングを行っ
た。

【００５６】そして、１％BSA-PBS(-)溶液にて500ng/ml
に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグ
ロブリンＧ＆Ｍ抗体を二次抗体として、室温で１時間、
反応を行った。

【００５７】PBS(-)溶液にて二次抗体を洗浄した後に、
コニカイムノステインHRP キットを用いて酵素反応を行
った。 その結果、尿蛋白質を抗原としたMAb4G12 のウ
エスタンブロティングの結果を示した図１から明らかな
ように、染色バンドの濃淡に個人差はあるものの、標準
UTI と同じ泳動位置に特異的な染色バンドが認められ、
MAb4G12 は尿蛋白質中のUTI を特異的に認識することが
確認された。

【００５８】実施例４：イヌ血清中のUTI の定量 UTI の定量を、ウサギ抗UTI ポリクローナル抗体とMAb4
G12 を用いた二次抗体サンドイッチELISA によって行っ
た。

【００５９】生理食塩水（大塚生食、大塚製薬社製）で
10000 単位/ml (3.5mg/ml)となるよう溶解したUTI 溶液
を、雄ビーグル犬の前肢静脈からビーグル犬体重１kg当
たり2000単位投与した。

【００６０】投与直前（０分）、投与後５分、10分、20
分、30分、60分、 120分および 180分後にUTI を投与し
た反対側の前肢から２mlの血液を採取、セパラビットチ
ューブ（積水化学工業社製）を用いて血清を分離し、使
用時まで−20℃の温度条件下で凍結保存した。

【００６１】定量に備えて、37℃の温度条件下で、素早
く血清を融解し、さらにPBS(-)溶液で 100倍に希釈し
た。 UTI の投与を開始して５分後から30分後までに採
取した血清については、PBS(-)溶液で 100倍希釈した正
常ビーグル犬血清溶液でさらに10倍に希釈して定量に用
いた。

【００６２】なお、検量線は、PBS(-)溶液にて 100倍希
釈した正常ビーグル犬血清溶液で、0.1、 0.3、１、
３、10、30、 100、 300、1000ng/ml の濃度に調製した
UTI(日本ケミカルリサーチ社製）溶液を用いて作成し
た。

【００６３】プロテインＡカラムを用いて精製した20μ
g/mlのウサギ抗UTI 抗体IgG-PBS(-)溶液50μl を96穴プ
レート（イムノプレートIIマキシソープ、Nunc社製）の
ウェルに注ぎ、４℃にて一夜静置した。 以後の操作は
すべて室温で行った。

【００６４】PBS(-)溶液で余分な抗体を洗浄し、各ウェ
ルに１％BSA-PBS(-)溶液 100μl を注ぎ１時間ブロッキ
ングを行った。 ブロッキング溶液を取り除き、至適濃
度に希釈した血清試料と検量線作成用UTI 標準試料各50
μl をウェルに注ぎ、２時間、反応を行った。 PBS(-)
溶液にて３回洗浄した後、１％BSA-PBS(-)溶液で１μg/
mlに調製した精製MAb4G12(50μl)を各ウェルに注ぎ、30
分間、反応を行った。

【００６５】PBS(-)溶液で過剰の抗体を洗浄後、各ウェ
ルに１％BSA-PBS(-)溶液 100μl を注ぎ30分間ブロッキ
ングを行った。 そして、１％BSA-PBS(-)溶液で400ng/
mlに希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノ
グロブリンＧ＆Ｍ抗体50μlを各ウェルに注ぎ、30分
間、反応を行った。

【００６６】未反応の二次抗体をPBS(-)溶液で洗浄後、
基質溶液 100μl(オルトフェニレンジアミン 0.4mg/m
l、0.01％ H₂O₂−クエン酸燐酸緩衝液、pH 5.0) を各
ウェルに注ぎ酵素反応を２分間行った。 2M硫酸30μl
を各ウェルに加え、酵素反応を停止した後、マイクロプ
レートリーダー (CORONA MTP-100、コロナ社製）を用い
て比色定量（吸収波長492nm)を行い、定量結果（表２）
を基に検量線（図２）を作成した。

【００６７】

【表２】

【００６８】検量線より、モノクローナル抗体を用いた
二抗体サンドイッチELISA でのUTI検出感度は１ng/ml
以下であり、UTI 濃度300pg/mlから100ng/mlの間でUTI
の定量的測定は可能であった。

【００６９】ビーグル犬血清中のUTI 濃度は下記表３に
示すように、投与してから５分後は、12.6μg/mlを示し
たが、１時間後には1.26μg/ml、２時間後には140ng/m
l、３時間後には100 倍希釈試料の検出限界に近い30ng/
ml にまで低下した。

【００７０】

【表３】

【００７１】実施例５：ヒト肺癌組織中のUTI 様抗原の
検出 (1) 免疫組織染色 ヒト低分化型肺偏平上皮癌のパラフィンブロックから癌
組織を含んだ組織片をミクロトームで薄切し、エッグア
ルブミンをコートしたスライドグラス上に置いた。 組
織を十分に乾燥した後、キシレンを用いてパラフィンを
除去し、エタノール、PBS(-)溶液の順に洗浄を行った。

【００７２】組織中の内在性ペルオキシダーゼを不活化
するために、 0.6％H₂O₂・ 0.2％NaN₃- メタノール溶液
中に１時間浸し、PBS(-)溶液で組織片を洗浄した後、
0.2％NaN₃-5％ヤギアルブミン-1％BSA-PBS(-)溶液にて
ブロッキングを行った。

【００７３】次いで、一次抗体である精製MAb4G12(46μ
g/ml) 溶液を用いて、室温で１時間、反応を行った。
一次抗体をPBS(-)溶液にて十分に洗浄し、5%ヤギアルブ
ミン-1%BSA-PBS(-) 溶液にてブロッキングを行い、10μ
g/mlに希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイム
ノグロブリンＧ＆Ｍ抗体を二次抗体として、室温で１時
間、反応を行った。

【００７４】反応後、PBS(-)溶液にて十分に組織片を洗
浄した後に、基質溶液（ジアミノベンジジン0.2mg/ml、
0.003% H₂O₂ Tris-HCl緩衝液、pH 7.6）中にスライドグ
ラスを浸して染色反応を行い、PBS(-)溶液で組織を洗浄
することで、染色反応を停止させた。 続いて、ヘマト
キシリン染色により細胞の核を染色し、封入剤を滴下し
てカバーグラスにて染色組織を封入した。

【００７５】光学顕微鏡を用いて染色組織を観察したと
ころ、MAb4G12 に特異的な染色像が認められた。 すな
わち、染色像は、癌細胞が増殖侵潤している肺組織の間
質に多く認められ、肺癌組織の間質にはMAb4G12 によっ
て認識される抗原が存在することが確認された。

【００７６】(2) 抗原の抽出 ヒト低分化型肺偏平上皮癌のパラフィンブロックから削
り出した薄片をキシレン、エタノール処理してパラフィ
ンを除去し、乾燥癌組織 0.35gを得た。 この乾燥組織
をハサミで細断し、0.1%SDS-PBS(-)溶液中でテフロンホ
モジナイザーを用いてホモゲナイズした後、遠心分離を
行って上清 8.7mlを得た。

【００７７】上清の一部をモルカット（M.W. 5000 カッ
ト、ミリポア社製）を用いて約10倍に濃縮して実施例３
と同様に電気泳動を行い、ハイブリドーマ細胞4G12の培
養上清を抗体溶液として用いてウエスタンブロッティン
グを行った。

【００７８】その結果、肺癌組織抽出液を抗原としたMA
b4G12 のウエスタンブロッティングの泳動状態を示した
図３から明らかなように、肺癌組織抽出液（図３のレー
ン２）中にMAb4G12 によって認識されるUTI と同じ泳動
位置を示す抗原が確認された。

【００７９】

【発明の効果】本発明により、種々の尿蛋白質のうちUT
I を特異的に認識するモノクローナル抗体MAb4G12 およ
びモノクローナル抗体MAb4G12 を産生するハイブリドー
マ細胞4G12が提供され、その結果、均一な抗原特異性を
有するモノクローナル抗体を用いたUTI の微量定量を可
能ならしめ、臨床上有用な癌疾患の診断手段の実現が期
待されるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】尿蛋白質を抗原としたMAb4G12 のウエスタンブ
ロッティングの結果を示す図である。

【図２】二抗体サンドイッチELISA による標準UTI 試料
の検量線を示す図である。

【図３】肺癌組織抽出液を抗原としたMAb4G12 のウエス
タンブロッティングの結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/573 Ｚ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト尿中蛋白質分解酵素阻害蛋白質を認
   識するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 前記モノクローナル抗体が、癌組織中の
   蛋白質様抗原を認識する請求項１に記載のモノクローナ
   ル抗体。
3. 【請求項３】 ヒト尿中蛋白質分解酵素阻害蛋白質を認
   識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
   胞。
4. 【請求項４】 前記ハイブリドーマ細胞が、ハイブリド
   ーマ細胞4G12（FERMP-12930)である請求項３に記載のハ
   イブリドーマ細胞。
5. 【請求項５】 ヒト尿中蛋白質分解酵素阻害蛋白質の定
   量方法であって、下記工程を含む。 すなわち、(a) 尿
   蛋白質を含む検体を固定し、(b) 前記検体に、ヒト尿中
   蛋白質分解酵素阻害蛋白質を認識するモノクローナル抗
   体を結合させ、(c) 前記モノクローナル抗体に、酵素、
   色素などの標識分子を結合した抗体を結合させ、(d) 前
   記標識分子を定量する。