JPH05310800A - 新規エーテル置換フルオレセイン化合物の複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 図示の構造式を有する９−（２′，４′また
は５′−ジカルボキシフエニル）−４，５−ジメトキシ
−６−ヒドロキシサンテン−３−オンとポリ（アミノ
酸）との複合体、特にポリ（アミノ酸）が抗原、もしく
は抗体である、そのような複合物。 【効果】 この複合体は、キサンテン誘導体部分が５０
０ｎｍより上の最大吸収を有し、かつ高い量子効率を有
するため、蛍光イムノアツセイ用試薬として優れてい
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】けい光発生性化合物（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉ
ｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）は、或るエネルギー範囲内
のエネルギーにより励起されると光を放出することがで
きる能力の故に広範な用途を有する。この能力のためけ
い光発生剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）は新規な品物の
広告において及び化学又は生物学的プロセス、たとえば
アツセイにおける標識としての使用が見出された。即ち
種々の化合物をけい光発生化合物に複合する（ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ）ことができ、複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ）はいくつかのタイプの分配に付され、そして複合体
のゆくえは試料に光を照射しそして該複合体が存在する
ゾーンを検出することによって決定される。

【０００２】この方法は抗原と抗体の如き特異的結合対
を含むイムノアツセイに使用することができる。特異的
結合対の構成員の一つにけい光発生剤を複合しそして種
々の工程成績表（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）を使用すること
によって未知の試料の抗原の量に関して固相と液相間に
けい光発生剤複合体を分配させることができる。該相の
何れかのけい光を測定することによって試料中の抗原の
濃度に対して観測されたけい光のレベルを関連させるこ
とができる。

【０００３】別に、液体媒体中の標識環境に依存して標
識のけい光を変える機構を設けることによってけい光標
識（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ）の分配を回
避することができる。たとえば、特異的結合対の構成員
の一つにけい光発生体を標識することに加えて、他の構
成員に消光剤（ｑｕｅｎｃｅｒ）即ち、光子の放出を防
止するけい光発生剤分子の励起エネルギーを吸収するこ
とができる分子を標識することができる。次いで特異的
結合対の二つの構成員がけい光発生剤及び消光剤が消光
のための必要な空間的近接を有するように一緒になると
き（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）にのみ消光は起こる。

【０００４】けい光発生剤を製造することにおいて多く
の切実な要求がある。けい光発生剤として、高い消光係
数、好ましくは１に近い又は１に等しい高い量子効率、
化学的安定性、大きなストークスシフト（Ｓｔｏｋｅｓ
ｓｈｉｆｔ）が所望され、そしてけい光が他の試薬に
よって影響される場合、かかる試薬に対する有効な応答
が所望される。更に、それ自体けい光発生性である血清
又は他の組成の存在下にけい光発生剤を使用するべき場
合には、けい光発生剤は媒体中の他化合物により吸収さ
れたエネルギーとは実質的に異なる範囲のエネルギーを
吸収することが望ましい。血清の場合には、４５０ｎｍ
を実質的に越える好ましくは５００ｎｍを越える光を吸
収するけい光発生剤を有することが望ましい。

【０００５】消光剤分子に対しては、消光剤はけい光発
生剤分子を有効に消光すること、即ち、けい光発生剤の
放出の波長範囲と消光剤による吸収の波長範囲間での実
質的重なりがあることが望ましい。更に、消光剤は化学
的に安定であり、好ましくは非けい光性であるべきであ
り、そしてけい光発生剤−消光剤対に高い消光効率を与
えるべきである。

【０００６】更に、有利な化合物は実質的に純粋な形態
の所望の生成物を与えるように合成の合理的な様式に鋭
敏であるべきである。

【０００７】米国特許第３，９９８，９４３号は、けい
光発生剤に対する抗体が実質的にけい光を消光する場合
に、リガンド（ｌｉｇａｎｄ）に対する抗体とけい光発
生剤に対する抗体の同時的結合の光体障害を使用してリ
ガンド−けい光発生剤複合体が関与するイムノアツセイ
を開示する。米国特許第３，９９６，３４５号は、けい
光発生剤が特異的結合対の一つの構成員に結合しそして
消光剤が特異的結合対の同じ又は異なった構成員に結合
する場合けい光発生剤−消光剤対が関与するイムノアツ
セイを記載している。アツセイは消光剤およびけい光発
生剤が媒体中のアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）の量に基
づき消光範囲内に近接せしめられている程度に依存す
る。

【０００８】けい光発生剤の誘導体を含む化合物の広範
なリストがある。既知の化合物は４′，５′−ジヒドロ
キシフルオレセイン及び４′，５′−ジヒドロキシ
２′，７′−ジブロモフルオレセイン（Ｃ．Ａ．６１，
７４０７ｄ）を含む。フルオレセインのイソチオシアネ
ート誘導体は商業的に入手可能であり、一方イソシアネ
ート誘導体はＣ．Ａ．５９，５６３ｂに記載され、そし
てスルホン基を含む誘導体はＣ．Ａ．５８，９０１２ａ
に記載されている。

【０００９】少なくとも一個のアニオン基及び他の分子
に結合するための一つの官能性を有するジ（カルコゲン
エーテル）対称置換フルオレセイン［Ｄｉ（ｃｈａｌｃ
ｏｇｅｎ ｅｔｈｅｒ）ｓｙｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｓ
ｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ］が
提供される。該化合物はイムノアツセイ、特に血清試料
を含むイムノアツセイにおける試薬のための他の物質に
結合される。フルオレセイン化合物はハロゲン化されて
いてもよい。

【００１０】けい光発生剤は大きい消光係数、高い量子
収率を有し、５００ｎｍより高い最大吸収を有し、普通
１０ｎｍを越えるストークスシフトを有し、そしてそれ
自体安定であり又他の化合物に結合したときに安定であ
る。消光剤は５００ｎｍより上の最大吸収を有し、観測
できるけい光を殆んど又は全然持たずそしてけい光性化
合物の広いスペクトルを有効に消光する。

【００１１】本発明は、イムノアツセイにおける試薬と
して使用するための他の化合物、特にポリペプチド又は
可溶性もしくは不溶性支持体に複合する（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅｄ）場合に特定的に使用される。電子エネルギー
を受取り又は供与することができる発色性（ｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｉｃ）ジ（カルコゲンエーテル）対称置換フル
オレセイン化合物に関する。フルオレセイン化合物は
１′，８′が置換されておらずそして４′，５′−又は
２′，７′−位置の何れかにおいてキサンテン環が対称
的に二置換されている。該化合物は通常は２，７−ジ
（脂肪族エーテル置換された）又は４，５−ジ（脂肪族
エーテル置換された）−９−フェニル−６−ヒドロキシ
−３Ｈ−キサンテン−３−オン類である。

【００１２】この分子は少なくとも１５個の炭素原子、
通常少なくとも１６個の炭素原子を且つ約４５個以下、
通常約３５個以下の炭素原子を有する。少なくとも５個
のカルコゲン原子（８乃至１６の原子番号、酸素及び硫
黄）が存在し、その少なくとも３個は酸素である。カル
コゲン原子に加えて、０乃至８個、通常０乃至６個のヘ
テロ原子、たとえば窒素、原子番号９乃至５３、特に１
７乃至５３のハロゲン、即ち、フッ素、塩素、臭素及び
ヨウ素或いは特異的効果を与えるように存在し得る他の
ヘテロ官能性（ｈｅｔｅｒｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉ
ｔｉｅｓ）が存在し得る。通常少なくとも一個のアニオ
ン性基、通常カルボキシレート及びスルホネート並びに
一個の結合基、中でもイソチオシアネート及びイソシア
ネートを包含する非オキソカルボニル（ｎｏｎ−ｏｘｏ
−ｃａｒｂｏｎｙｌ）；スルホンアミド、メルカプト及
びアミノが存在し、これは環の炭素原子に直接結合して
いてもいなくてもよい。多くは、結合基はキサンテンの
９位置で置換された基、通常はフェニル基上にあるが結
合基はエーテル基上の置換基として存在していてもよ
い。これらの化合物はハプテン及び抗原に複合して、け
い光発生することができ又は消光剤がけい光発生剤に密
接な空間距離にあるときけい光発生剤を消光することが
できる複合体を与える。

【００１３】本発明の組成物は５００ｎｍより上の、通
常５１０ｎｍより上の比較的狭いバンドの最大吸収を有
し、通常は最も長い波長吸収の面積の少なくとも５０％
は約５０ｎｍの波長範囲を越える。該けい光発生性化合
物は、良好な化学安定性、大きなストークスシフト及び
６５，０００を越える、通常は７５，０００を越える消
光係数を有することを特徴とする。ストークスシフトは
少なくとも１０ｎｍ好ましくは少なくとも約２０ｎｍで
ある。消光性化合物は、最大吸収の光で照射されるとき
０．０５モルホスフエート中で１０％より小さい、好ま
しくは５％より小さい量子効率でけい光発生する。

【００１４】本発明の化合物は、重要な分光学的及び物
理的特性を有する新規な化合物を与える。該化合物は５
００ｎｍより上の最大吸収を有する。オキシ置換基に対
する位置を選ぶことによって、高度にけい光性化合物又
は実質的に非けい光性であり且つ消光剤として使用する
ことができる化合物を与えることができる。２′，７′
−位置（フルオレセイン位置番号）にエーテル置換基を
有する化合物は高い量子効率を有するけい光性化合物を
与える。４′，５′−位置にエーテル置換基を有する化
合物はけい光を発せず有効な消光剤として作用するよう
に長い波長で吸収する化合物を与える。

【００１５】大抵は、本発明の化合物は、下記式

【００１６】

【化８】

【００１７】式中、αの各々及びδの各々は同一又は相
異っていてもよく、α又はδのいずれかはカルコゲン
（原子番号８〜１６、酸素及び硫黄）を介して環の炭素
原子に結合しており、カルコゲン結合対でない場合には
αはカルコゲン以外の置換基であることができそしてδ
はカルコゲンを含む都合の良い官能性であることがで
き；エーテルを介して結合したα又はδの一つ或いはω
はΛと一緒になって結合のための活性な官能性を与える
ことができ、又はΛと一緒にならない場合にはΛに対す
る結合官能性であることができ；Ａと一緒にならない場
合にωは非妨害性官能性（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉ
ｎｇ）又は水素であることができ；Λは一緒にならない
で結合のための活性官能性を形成しない場合はリガンド
又は受容体であり、γは結合又は約１〜２０個原子、通
常１〜１６個の炭素原子のスペーサーアーム、普通は、
６〜１６個、通常６〜１０個の環原子の環状脂肪族又は
芳香族基の場合に４個より多くの環炭素原子を有する１
〜７個の炭素原子の脂肪族（環状脂肪族を含む）基であ
り、Λがリガンド又は受容体である場合Ａに結合したか
っこ内の１個又はそれより多くの基が存在する、を有す
る水又は塩基に可溶性化合物である。

【００１８】消光剤分子、４，５−ジエーテル−６−ヒ
ドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オンに関しては、２
及び７位置に置換基のあるなしは消光に影響ないが分子
の吸収特性を修正するのに使用することができる。故
に、αがエーテルである場合には、δは水素又は１〜６
個の炭素原子のアルキルの如き都合の良い置換基、オキ
シ（ヒドロキシ及び１〜６個の炭素原子のアルコキ
シ）、チオ（メルカプト、１〜６個の炭素原子のアルキ
ルチオ及びスルホン酸、エステル及びアミド）、１〜６
個の炭素原子の非オキソカルボニル（酸、エステル及び
アミドを含む）、シアノ、ニトロ、ハロ、１〜６個の炭
素原子のオキソカルボニル、又はその組合せであること
ができる。置換の選択は得られる最大吸収、合成の便宜
及び分子の物理的及び化学的性質、たとえば水溶性、化
学反応性、酸化感受性等に対する効果により支配され
る。

【００１９】けい光発生剤分子に関して、４，５−位置
の置換基はけい光効率が十分に不利に影響されない限り
広く変わることができる。故に、広く変わることができ
るが、４，５−位置はカルコゲンによって置換されるべ
きではなく、これは分子のけい光を実質的に減じるとい
う効果を有する。故に、けい光発生剤の４，５−位置に
対する置換基の範囲は消光剤の２，７−位置に対する置
換基の範囲より更に制限される。

【００２０】芳香族としてγを有する本発明の化合物
は、主として、下記式；

【００２１】

【化９】

【００２２】式中、二つのΛは同一又は相異なり、通常
は結合のための官能性以外は同一であり、二つのＤは同
一又は相異なり、通常は結合のための官能性以外は同一
であり、Λ又はＤのいずれかはカルコゲンエーテル（原
子番号８〜１６のカルコゲン）、通常は式−ＪＭＸ、こ
こでＪは酸素又は硫黄である、のオキシエーテルであ
り、−ＪＭＸ以外のものであるときは、Λは水素又は原
子番号９−５３のハロゲン、即ちフッ素、塩素、臭素、
又はヨウ素、特に塩素及びヨウ素であり、一方Ｄは水素
又は、特に炭素と水素及びヘテロ原子として酸素、硫
黄、窒素及びハロゲンを有し、通常は使用の条件下に化
学的に不活性である任意の置換基であることができ、Ｍ
は二価の炭化水素基、普通、１〜８個、通常は１〜６
個、好ましくは１〜３個の炭素原子の通常は直鎖の飽和
脂肪族であり、Ｘの一つはリガンド、受容体又は支持体
に結合するための活性官能性（ａｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎａｌｉｔｙ）であるか又は該リガンド又は支持
体に結合した官能性であり、ＸはＷと一緒になって結合
のための活性官能性を与え、ＸＷはその硫黄及び窒素類
似体を含む非オキソカルボニル官能性、たとえばカルボ
ン酸、カルボン酸エステル、たとえば低級アルキル（１
〜３炭素原子）又は水性媒体中でアミド結合を形成する
ことができる活性エステル、たとえばＮ−オキシスクシ
ンイミド及びｐ−ニトロフェニル、イソシアネート、イ
ソチオシアネート、イミデート低級アルキルエステル、
活性化されたオレフィン、たとえば、マレイミド、メル
カプタン（−ＳＨ）、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホニ
ルクロライド、アミノ、活性ハロ、たとえばハロアセチ
ル又はハロトリアジンであることができ、但しＸＷはＭ
に結合している場合には非オキソカルボニル又はスルホ
ニルであるものとし、ＸがＷと一緒になっていないと
き、Ｘの一つはＷに結合した結合官能性でありそして特
定の活性官能性に依存して、炭素に対する一の原子価を
有する非オキソカルボニル（その窒素及び硫黄類似体を
含む）、カルバミル、チオカルバミル、活性化されたオ
レフィンからの置換されたエチレン、チオ、メチレン
（ホルミルから還元アミノ化による）、アミド窒素又は
第二級アミノ、スルホニル、又は活性ハロからのオキソ
カルボニルメチル、であり、ＸがＭに結合した結合官能
性である場合にはＸは非オキソカルボニルであり、結合
基でない場合にはＸは水素又は非オキソカルボニル、た
とえばカルボン酸、エステル又はアミド、スルホンアミ
ド、スルホン酸又は特に環炭素原子に結合している場合
にはハロであり、ｐはＷがＸと一緒になっている場合に
は１であり、そうでなければ平均して１乃至Ｗの分子量
を５００、通常１０００、より普通には１５００、最も
普通には２０００で除した値であり、一般にｐは約１乃
至２００、通常は１乃至１００の範囲にあり、ＷがＸと
一緒になっていない場合には、Ｗは少なくとも約１２５
の分子量のハプテン性（ｈａｐｔｅｎｉｃ）又は抗原性
の（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ）受容体を包含するリガンドで
あり、一般にハプテン性である場合には約１２５乃至２
０００の分子量であり、そして抗原性である場合には約
５０００×１×１０⁷の分子量であるが、抗原と他の物
質との組合せははるかに高い複合分子量（ｃｏｍｐｏｓ
ｉｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）を有する
ことができ、リガンドは他の結合を使用することができ
るが通常アミノ、ヒドロキシ、メルカプト又は活性エチ
レンを介してＸに結合せしめられてアミド、アミジン、
チオアミド、エーテル又はチオエーテルを形成し、又は
Ｗは、天然に存在する又は合成の、変性したもしくは変
性されていない多糖、天然に存在する又は合成重合体、
ガラス、無機固体、リポゾーム等であることができる可
溶性又は不溶性支持体であり、Ｑは結合又はスペーサー
アーム（結合鎖）であり、通常は、脂肪族、芳香族、複
素環式又はその組合せであり、一般に脂肪族的に飽和さ
れており（ａｌｉｐｈａｔｉｃａｌｌｙ ｓａｔｕｒａ
ｔｅｄ）、ここで該アームは１〜１６個、より普通には
１〜１２個好ましくは１〜８個の原子を鎖中に有し、該
原子は炭素、窒素、酸素及び硫黄であり、ここで窒素は
アミドであるか又は炭素と水素とにのみ結合しており、
たとえば第三級アミノであり、酸素はオキシであり、そ
して硫黄はチオエーテルであり、カルコゲンは炭素にの
み結合しており、そしてヘテロ原子は飽和炭素原子に結
合しているときは少なくとも二つの炭素原子によって隔
離され；炭素原子の総数は一般に１〜２０、通常１〜１
２であり、ヘテロ原子の総数は０〜１０、通常は０〜８
であり、酸素は非オキソカルボニル又はオキシとして存
在してもよく、０〜９、通常は０〜４のヘテロ官能性が
存在し、Ｘが結合官能性又は基でない場合にはＱは普通
は結合であり、Ｙは原子番号９〜５３のハロゲン、特に
塩素であり、ｎは０〜４の整数でり、ここでｍ＋ｎは４
より大きくなく、Ｚは酸性のアニオン性基、たとえばカ
ルボン酸又はスルホン酸であり、そしてｍは０〜３、通
常は１〜３の整数である、を有する。

【００２３】極め明らかに、本発明の化合物は該化合物
の性質に有意に影響を与えることなく、上式の範囲内に
ないように変性することができる。たとえば、一個又は
それより多くの酸性アニオン性基はエステル化又はアミ
ド化することができ、又はアルキル基及び他の基、たと
えばシアノ、ニトロ等はフェニル基上に置換することが
できる。しかしながら、これらの変化は大抵の場合に追
加の合成段階を必要とし、これは得られる生成物の分光
学的又は化学的特性においてもしあれば強化の程度によ
り是認されない。

【００２４】本発明の化合物は多くの望ましい性質を有
する。生成物はポリペプチドの水溶解性に有意に不利に
影響することなく又ポリペプチドが本発明の化合物の分
光学的性質に不利に影響されることなく広範な種類のポ
リペプチドに複合されることを許容する相当な水溶解性
を有する。

【００２５】本発明の化合物の分光学的性質に関して、
該化合物は一般に５００ｎｍを越え、もっと普通には５
１０ｎｍを越える比較的長い波長で吸収する。かくし
て、生理学的流体で作業するとき遭遇し得る自然に起こ
るけい光は天然に存在するけい光発生剤を有意に励起し
ない波長範囲の励起光を使用することによって実質的に
回避される。更に、該化合物は比較的鋭い吸収ピークを
有し、けい光発生剤は比較的鋭い発光ピークを有する。
この故に、けい光発生剤と消光剤との間で有効な重なり
合いが得られ、これは約７０Åの距離までの有効な消光
を許容する。けい光発生性化合物は、吸収バンド及び発
光バンドピークが少なくとも１０ｎｍ、しばしば少なく
とも１５ｎｍ離れるように大きなストークスシフトも有
する。大きなストークスシフトは観測されたけい光によ
るバックグラウンド干渉（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を最小にする。

【００２６】消光剤は、それらが観測された信号による
バックグラウンド干渉に寄与しないようにけい光を殆ん
ど又は全然持たない。消光剤の吸収バンドがけい光発生
剤の発光バンドに実質的に重なる場合に、けい光発生剤
−消光剤カップルを与えることによって、消光剤が免疫
学的に関連した物質の結合によりけい光発生剤に密接に
接近せしめられる場合に、けい光の消光に頼るイムノア
ツセイを遂行するための有効な系が与えられる。

【００２７】本発明を説明するにあたり、複合した使用
される簡単な分光学的に活性なモノマー化合物を先ず考
察し、続いて種々の複合体について考察する。該化合物
は、それらが使用中それらの分光学的性質を保持するよ
うに塩基性ｐＨにおいてすら化学的に安定である。

【００２８】他の化合物に複合するために使用される化
合物は他の化合物との安定な共有結合、通常はアミド結
合又はチオエーテル結合を形成する活性な官能性を有す
ることを特徴とする。大抵は、結合官能性は、その窒素
及び硫黄類似体を包含する非オキソカルボニルを含み、
そしてフルオレセインのフェニル基の環の炭素原子に直
接結合するか、又は結合基を介して結合するか、或いは
オキシ−もしくはチオエーテル官能性に直接結合するか
又は結合基を介して結合することができる。分子中の他
の官能性と比較し得る種々の官能性を使用することがで
きる。官能性はカルボン酸を含み、これはカルボジイミ
ド又は活性化アルコールにより活性化されて活性エステ
ル基、イソシアネート、イソチオシアネート、イミデー
ト等を与えることができ、該基はアミノ官能性と反応し
てアミド、チオアミド又はアミジンを形成する。別態と
して、官能性としてアミノ基を有することができ、これ
はカルボン酸又は誘導体と組合わせてアミド結合を与え
ることができる。最後にメルカプト官能性を使用するこ
とができ、これはエチレン系基、特に活性化されたエチ
レン系基、たとえばマレイン酸誘導体と組合わせ又は逆
に組合わせてチオエーテルを与えることができる。

【００２９】好ましい群の化合物は主として下記式

【００３０】

【化１０】

【００３１】式中、二つのＡ¹は同一又は相異なり、通
常は一つが結合のための官能性である場合以外には同一
であり、二つのＤ¹は同一又は相異なり、通常は一つが
結合のための官能性である場合以外は同一であり、Ａ¹
又はＤ¹の何れかは式−ＯＭ¹Ｘ^bのオキシエーテルであ
り、ここでＭ¹は１〜６個、通常は１〜３個の炭素原子
の飽和脂肪族ハイドロカルビレン基好ましくは直鎖の且
つ１〜２個の炭素原子の飽和脂肪族ハイドロカルビレン
基、即ち、メチレン又はエチレン（ハイドロカルビレン
は炭素と水素とのみから成る二価の有機基を意図する）
であり、オキシエーテルではない場合にはＡ¹は好まし
くは水素又は特に原子番号９〜５３のハロ、更に特定的
にはクロロ又はヨードであり、Ｄ¹は好ましくは水素、
ハロ又は６個までの炭素原子のアルキルであり、Ｘ^a又
はＸ^bの一つ、通常Ｘ^aはＷ¹と一緒になって活性官能性
を形成し、該官能性は−ＸＷと同じ定義を有していても
よいが、通常はたとえばブチルクロロホルメート、カル
ボン酸、活性化エステル、イソシアネート又はイソチオ
シアネートと共に、混合無水物の如き官能性（その硫黄
−チオノ−類似体）を含有する非オキソカルボニルであ
り、但しＸ^bはＷ¹と一緒になる場合はカルボン酸又はそ
の誘導体であり、Ｗ¹と一緒にならない場合は、Ｘ^a又は
Ｘ^bの一つはＷ¹とアミド又はエステルを形成するカルボ
ニル、Ｗ¹と尿素を形成するカルバミル又はＷ¹とチオウ
レアを形成するチオカルバミルであるＷ¹への結合基で
あり、活性官能性又は結合官能性でない場合Ｘ^aは水素
又は非オキソカルボニル、たとえばカルボキシであり、
Ｘ^bは水素又はカルボキシル、通常は水素であり、Ｑ¹は
Ｑと同じであってもよく、結合又はスペーサーアームで
あることができるが通常は鎖中に１〜１２個、通常は２
〜１２個の原子を有する結合又はスペーサーアームであ
り、該原子は炭素、窒素及び酸素であり、一般に１〜１
０個、通常は１〜８個の炭素原子及び０〜８個のヘテロ
原子を有し、該ヘテロ原子は窒素、酸素及び硫黄であ
り、酸素は炭素にのみ結合して存在し、たとえば非オキ
ソカルボニル又はオキシエーテルであり、硫黄は酸素に
類似し、窒素はアミドであるか又は炭素にのみ結合して
おり、たとえば第三級アミノであり、Ｑ¹は通常はＸ^aが
反応性官能性又は結合官能性以外である場合には結合で
あり、Ｗ¹がＸ^a又はＸ^bと一緒にならない場合には、Ｗ¹
は通常はアミノ又はヒドロキシル、特に結合のためのア
ミノ官能性を有するリガンド、受容体又は支持体であ
り、ｐ¹はｐと同じであってもよく、Ｘ^a又はＸ^bの一つ
がＷ¹と一緒になっている場合は１であり、そうでなけ
れば、１乃至Ｗ¹の分子量を５００、通常は１５００で
除した値であり、一般に１〜２００の範囲、通常は１〜
１００の範囲、もっと普通には１〜５０の範囲であり、
Ｚ¹はカルボン酸又はスルホン酸の如き酸性アニオン性
基であり、ｍ¹は１〜３の整数であり、Ｙ¹は原子番号９
〜５３のハロゲン、特にクロロであり、ｎ¹は０〜３の
整数であり、ここでｍ¹＋ｎ¹は４より大きくはない、を
有する。

【００３２】該化合物は０〜６個、通常は０〜５個の原
子番号９〜５３のハロゲン、好ましくは塩素又はヨウ素
を有し、通常は０〜４個の塩素、しばしば２〜４個の塩
素を有する。該化合物は普通は、少なくとも２個の且つ
５個までのカルボン酸基を有し、好ましくは２〜３個の
カルボン酸基を有する。非オキソカルボニル結合官能性
は炭素原子に結合していてもいなくてもよいが、好まし
くは炭素原子に結合している。

【００３３】活性官能性を有する好ましい化合物は主と
して下記式

【００３４】

【化１１】

【００３５】式中、Ａ¹又はＤ¹のいずれかは１〜３個、
通常は１〜２個の炭素原子のアルコキシであり、アルコ
キシでない場合はそれらはＡ及びＤに対して前記した通
りであり、Ｙ¹′、Ｚ¹′，ｍ¹′及びｎ¹′はダッシュの
ない記号と同じ範囲を有し、Ｗ¹′は非オキソカルボニ
ル基又は硫黄類似体（チオノ）を有する活性官能性であ
り、そしてハロゲン化アシル、混合無水物及び活性化エ
ステル、並びにイソシアネート及びイソチオシアネート
を含み、Ｑ¹′は１〜１２個、通常は１〜１０個の原子
の結合又はスペーサーアームであり、該原子は炭素、窒
素及び酸素であり、通常は炭素及び窒素であり、そして
約１〜１２個通常は１〜１０個の炭素原子と、０〜８
個、通常は０〜６個のヘテロ原子であり、該原子は窒
素、酸素及び硫黄、特に窒素及び酸素であり、窒素はア
ミドとして存在するか又は炭素にのみ結合しており、カ
ルコゲン（酸素及び硫黄）は炭素にのみ結合し、二重結
合（オキソ及びチオノ）しているか又は単結合しており
（オキシ又はチオ）、スペーサーアームとしてＱ¹′は
１〜８個、通常１〜４個の炭素原子のアルキレン、グリ
シル又は１〜４個のグリシル単位のポリグリシルであ
り、ここで最終のカルボキシはＷ¹′等である、を有す
る。

【００３６】下記のものは複合のために使用される本発
明の化合物のリストである。

【００３７】表 Ｉ 該化合物は置換された９−フェニル−６−ヒドロキシ−
３Ｈ−キサンテン−３−オンであり、又は該化合物が２
−カルボキシ基を有するフルオレセインである場合に
は、該化合物は３′，６′−ジヒドロキシスピロ［イソ
ベンゾフラン−（３Ｈ），９′−［９Ｈ］−キサンテ
ン］−３−オンである。このリストの番号は前者の呼名
に基いている。

【００３８】２，７−ジメトキシ−９−（２′，４′−
ジカルボキシフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサ
ンテン−３−オン、２，７−ジエトキシ−９−（２′，
３′，４′−トリカルボキシフェニル）−６−ヒドロキ
シ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７−ジエトキシ
−９−（２′，４′，５′−トリカルボキシ−３′，
６′−ジクロロフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キ
サンテン−３−オン、２，７−ジプロポキシ−４，５−
ジクロロ−９−（２′，４′−ジカルボキシ−６−スル
ホナトフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン
−３−オン、２，７−ジメトキシ−４，５−ジブロモ−
９−（２′，４′，５′−トリカルボキシ−フェニル）
−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，
７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−９−（２′，
４′，５′−トリカルボキシフェニル）−６−ヒドロキ
シ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７−ジメトキシ
−９−（３′，４′−ジカルボキシフェニル）−６−ヒ
ドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７−ジメ
トキシ−９−（３′，４′−ジカルボキシ−２′，
５′，６′−トリクロロフェニル）−６−ヒドロキシ−
３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７−（２″−カルボ
キシエトキシ）−９−（２′−カルボキシフェニル）−
６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７
−ジエトキシ−４，５−ジブロモ−９−（２′，４′，
５′−トリカルボキシフェニル）−６−ヒドロキシ−３
Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７−ジメトキシ−９−
［２′−カルボキシ−４′−フルオロ−５′−（Ｎ−カ
ルボキシメチルカルボキサミド）フェニル］−６−ヒド
ロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７−ジメト
キシ−９−（２′，４′−ジカルボキシ−５′−アミノ
フェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−
オン、２，７−ジメトキシ−９−（２′−カルボキシ−
４′−イソチオシアナトフェニル）−６−ヒドロキシ−
３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７−ジエトキシ−９
−（２′−カルボキシ−４′−メルカプトフェニル）−
６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７
−ジメトキシ−４，５−ジブロモ−９−（２′−カルボ
キシ−４′−メルカプトメチルフェニル）−６−ヒドロ
キシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、２，７−ジメトキ
シ−４，５−ジクロロ−９−（２′−カルボキシ−４′
−シアノフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテ
ン−３−オン、４，５−ジメトキシ−９−（２′，
４′，５′−トリカルボキシフェニル）−６−ヒドロキ
シ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、４，５−ジメトキシ
−９−（２′，５′−ジカルボキシフェニル）−６−ヒ
ドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、４，５−ジメ
トキシ−２，７−ジョード−９−（２′，４′，５′−
トリカルボキシフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キ
サンテン−３−オン、４，５−ジメトキシ−２，７−ジ
クロロ−９−（２′，４′，５′−トリカルボキシフェ
ニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オ
ン、４，５−ジメトキシ−２，７−ジクロロ−９−
（２′，４′，５−トリカルボキシ−３′，６′−ジク
ロロフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン−
３−オン、４，５−ジ（２″−カルボキシエトキシ）−
２，７−ジョード−９−（２′−カルボキシ−４′−ス
ルホナトフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテ
ン−３−オン、４，５−ジプロポキシ−２，７−ジブロ
モ−９−（２′，４′−ジカルボキシ−３′，５′，
６′−トリクロロフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−
キサンテン−３−オン、４，５−ジエトキシ−２，７−
ジクロロ−９−（２′−カルボキシ−４′−アミノ−
５′−スルホナトフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−
キサンテン−３−オン、４，５−ジメトキシ−２，７−
ジョード−９−（２′−カルボキシ−４′−イソチオシ
アナトフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンテン
−３−オン、４，５−ジエトキシ−２，７−ジョード−
９−［２′，４′−ジカルボキシ−５′−（Ｎ−カルボ
キシメチルホルムアミド）フェニル］−６−ヒドロキシ
−３Ｈ−キサンテン−３−オン、４，５−ジメトキシ−
２，７−ジクロロ−９−（２′，４′−ジカルボキシ−
３′，５′，６′−トリクロロフェニル）−６−ヒドロ
キシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、４，５−ジエトキ
シ−２，７−ジクロロ−９−（４′，５′−ジカルボキ
シ−２′，３′，６′−トリクロロフェニル）−６−ヒ
ドロキシ−３Ｈ−キサンテン−３−オン、４，５−ジメ
トキシ−２，７−ジョード−９−（２′−カルボキシ−
４′−メルカプトメチルフェニル）−６−ヒドロキシ−
３Ｈ−キサンテン−３−オン。

【００３９】上記リストは単に例示することを意図する
ものであり、本発明の範囲内に含まれた化合物のすべて
を示すものではない。

【００４０】活性官能性を有する本発明の化合物は、補
助的ヘテロ官能性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｈｅ
ｔｅｒｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）を有する
リガンド又は支持体に複合することができる。下記表は
例示的リガンド官能性、本発明の化合物をリガンドと結
合するための活性官能性及び得られる結合単位を示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】大抵の場合に、リガンド官能性及び分光学
的化合物官能性は切替えることができる。

【００４３】主としてリガンド複合体は下記式を有す
る：

【００４４】

【化１２】

【００４５】式中、Ａ²は同一又は相異り、普通は結合
部位を除いて同じであり、Ｄ²は同一又は相異り、普通
は結合部位を除いて同じであり、Ａ²又Ｄ²のいずれかは
エーテルであり、通常式−ＨＭ²Ｘ^dここでＨは酸素又は
硫黄であり、Ｍ²はＭと同じであってもよいが通常は１
〜６個、通常１〜３個の炭素原子のアルキレン基であ
り、Ｘ^dはカルボキシ又は水素、通常水素である、のオ
キシエーテルであり、そしてエーテルでない場合にはＡ
及びＤに対して前記した通りであり、Ｙ²、Ｚ²、ｍ²及
びｎ²はそれぞれＹ、Ｚ，ｍ及びｎと同じであり、Ｑ²は
Ｑと同じであってもよいが通常はＱ¹と同じであり、Ｘ^c
はＷ²をＷとみなしてＸと同じ定義内に入ることができ
るが通常は窒素及び硫黄類似体を包含する官能性を含む
非オキソカルボニル、たとえばカルボニル、イミド、そ
れぞれアミドを形成するカルバミル及びチオカルバミ
ル、アミジン、リガンドのアミノと組合さっている場合
尿素及びチオ尿素であり、ｐ²は１乃至Ｗ²の分子量を５
００、通常は１０００で除した値であり、約１２５乃至
２０００分子量のハプテン性リガンドの場合、ｐ²は通
常は１であり、２０００の分子量より大きい、通常５０
００の分子量より大きい抗原性リガンドの場合、ｐ²は
一般に平均して約１乃至２００、通常１乃至１００、更
に普通には２乃至５０であり、Ｗ²はリガンド、受容体
又は支持体であり、リガンドとしてのＷ²はハプテン性
又は抗原性であり、ハプテン性リガンドは一般に約１２
５乃至２０００の分子量であり、そして少なくとも一つ
の極性官能性を有し、該官能性は結合の部位であっても
なくてもよく、抗原性リガンドはポリエピトピック（ｐ
ｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）であり、普通はポリ（アミノ
酸）、核酸、多糖及びその組合せであり、一般に少なく
とも２０００、通常は少なくとも５０００の分子量であ
り、そして１０００万以上の分子量であることができ、
支持体は不明確な分子量、通常は少なくとも１０，００
０、もっと普通には少なくとも２０，０００の分子量で
あり、そして１０００万以上であることができ、可溶性
支持体は一般に１０００万の分子量以下であり、支持体
は天然に存在するものでも合成のものでもよく、粒状で
あってもよく又は有形形態であってもよく、水性媒体に
より膨潤可能であり又は非膨潤性であってもよく、支持
体は架橋していてもいなくてもよく、単一物質でも混合
物質であってもよく、天然に存在する支持体は多糖、核
酸、ポリ（アミノ酸）、たとえば、ポリペプチド及びタ
ンパク質、ゴム、リグニン、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ
ｓ）、その組合せ等を包含し、合成支持体は付加及び縮
合重合体、たとえばポリスチレン、ポリアクリル樹脂、
ビニル化合物、ポリエステル、ポリエーテル及びポリア
ミド、チャーコール、金属カルコゲニド、ガラス、リポ
ゾーム等を包含する。

【００４６】リガンド複合体の好ましい群は下記式

【００４７】

【化１３】

【００４８】式中、消光剤分子に対しては、Ａ³は１〜
２個の炭素原子のアルコキシであり、Ｄ³は水素又はハ
ロ、特にクロロ、ブロモ又はヨード或いは１〜６個の炭
素原子のアルキルであり、けい光発生剤分子に対して
は、Ｄ³は１〜２個の炭素原子のアルコキシであり、Ａ³
は水素又はハロ、特にクロロ又はブロモであり、Ｚ³は
カルボキシルであり、Ｙ³はハロ、特にクロロであり、
Ｑ³は結合又は鎖中に１〜９個、通常は２〜９個の原子
のスペーサーアームであり、該原子は炭素及び窒素、ア
ミド窒素であり、スペーサーアームは炭素、酸素、窒素
及び水素のみから成り、酸素は炭素にのみ結合してお
り、そしてオキシ又はオキソ、特に非オキソカルボニル
であり、有用なスペーサーアームは１〜６個、通常２〜
４個の炭素原子のアルキレン、モノ−又はポリ−アミド
メチレン（−ＣＯＮＨＣＨ₂−）アミノモノ−又はアミ
ノポリ−アミドメチレン（−ＮＨ(ＣＯＮＨＣＨ₂−)
x）、又はアミノチオノモノ−又はポリ（アミノメチレ
ンカルボニル）アミノ−メチレン−（−ＮＨＣＳ(ＮＨ
ＣＨ₂ＣＯ)x′ＮＨＣＨ₂−）、ここでｘは１乃至３であ
る、を包含し、Ｘ^eは非オキソカルボニル、カルバミル
又はチオカルバミルであり、Ｗ³のアミノに結合してア
ミド結合を形成し、Ｗ³は通常は約１２５〜１０００の
分子量のハプテン性の受容体又はリガンド、或いは約２
０００乃至１０００万、通常５０００乃至２００万、も
っと普通には５０００乃至１００万分子量の抗原であ
り、Ｗ²は特にポリ（アミノ酸）又は多糖抗原であり、
そしてハプテンであってもよく、ｐ³は１乃至Ｗ³の分子
量を５００、通常は約２０００で除した値であり、一般
に約１乃至２００の範囲、更に普通には約２乃至１５０
の範囲に、そしてしばしば約１乃至７５の範囲にあり、
５００，０００以下の分子量のリガンドに対してはｐ³
は一般に約２乃至５０の範囲にあり、ｍ³は１乃至２の
整数であり、ｎ³は０乃至３の整数であり、ｍ³＋ｎ³は
４より大きくない、を有する。

【００４９】或る例においては、リガンド及びけい光発
生剤の複合体が支持体に共有結合により又は非共有結合
により結合せしめられていることが望ましい。支持体へ
の複合体の結合はリガンド又は本発明のけい光発生剤上
の官能性への共有結合によってもよく又は通常ポリエピ
トピックなリガンドと支持体に共有結合により又は非共
有結合により結合していてもよい受容体、通常抗体との
間の非共有結合によってもよい、支持体に結合したリガ
ンド−けい光発生剤複合体は主として下記式を有する：

【００５０】

【化１４】

【００５１】式中、二つのＡ⁴は同一又は相異なり、普
通は一つが結合官能性である場合を除いて同じであり、
二つのＤ⁴は同一又は相異なり、普通は一つが結合官能
性である場合を除いて同じであり、Ａ⁴又はＤ⁴のいずれ
かは式−ＪＭ⁴Ｘ⁴、ここでＪは酸素又は硫黄、通常は酸
素である、のエーテルであり、−ＪＭ⁴Ｘ⁴以外である場
合にはＡ⁴及びＤ⁴はＡ及びＤに対して前記した通りであ
り、Ｍ⁴は二価の炭化水素基、普通は１〜８個、通常１
〜６個、好ましくは１〜３個の炭素原子を有し、通常直
鎖の飽和脂肪族であり、Ｘ⁴の一つはリガンドへの結合
官能性であり、炭素に対して一つの原子価を有する非オ
キソカルボニル（窒素及びその硫黄類似体を含む）、カ
ルバミル、チオカルバミル、イミド、チオエーテル、ア
ルキルアミノ、チオ−又はオキシアセチルであり、但し
結合基としてのＸ⁴はＭ⁴に結合している場合には非オキ
ソカルボニルであり、Ｘ⁴が結合官能性でない場合に
は、Ｍ⁴に結合したＸ⁴は水素又は非オキソカルボニルで
あり、そしてＱ⁴に結合したＸ⁴は水素、非オキソカルボ
ニル、又はハロであり、ここでＱ⁴は結合であり、Ｑ^４
は結合又は通常は、約１〜１６個、通常１〜１２個、更
に普通には１〜８個の原子を鎖中に有する脂肪族、芳香
族、複素環又はその組合せのスペーサーアームであり、
該原子は炭素、窒素、酸素及び硫黄であり、窒素はアミ
ド又はアミノであり、アミノとしては通常第三級アミノ
であり、酸素はオキシであり、硫黄はチオエーテルであ
り、カルコゲンは炭素にのみ結合しており、ヘテロ原子
は、飽和炭素原子に結合している場合には少なくとも二
つの炭素原子により隔離されており、炭素原子の総数は
約１乃至２０、通常約１乃至１２であり、ヘテロ原子の
総数はオキシ又は非オキソカルボニルとしての酸素と共
に０乃至１０、通常は０乃至８であり、０乃至９個、通
常は０乃至４個のヘテロ官能性、たとえばアミド、アミ
ノ及びオキシが存在し、Ｚ⁴はアニオン性基、たとえば
カルボン酸又はスルホン酸であり、Ｙ⁴は原子番号９乃
至５３のハロゲン、通常はクロロであり、ｍ⁴は０乃至
３の整数、通常は１乃至３であり、ｎ⁴は０乃至４の整
数であり、ｍ⁴＋ｎ⁴の和は４より大きくなく、ｐ⁴はＷ⁴
の分子量を５００、通常は１０００、更に普通には１，
５００で除した値に等しく、一般には１乃至２００の範
囲にあり、通常は１乃至１００、更に普通には１乃至５
０の範囲にあり、Ｗ⁴は一般に少なくとも約１２５の分
子量を有し、ハプテン性又は抗原性であってもよい受容
体又はリガンドであり、ハプテン性リガンドは通常は約
１２５乃至２０００の分子量であり、そして抗原性リガ
ンド及び受容体は約５０００乃至１×１０⁷の分子量で
あり、結合は一般に、リガンドのアミノ、チオ又はオキ
シ基により、Ｅの一つは結合基であり、そして結合基で
ない場合には、意味を有さず、Ｗ⁴がハプテンである場
合には、フエニルに結合したＥは普通は結合基であり、
一方Ｗ⁴が抗原性である場合には、Ｗ⁴に結合したＥは通
常結合基であり、ＥはＸ⁴と同じ制限を有するが、好ま
しくは非オキソカルボニル、アミノ又はチオエーテルで
あり、Ｔは可溶性又は不溶性支持体であり、そしてＷに
関して前記されており、そしてｒ⁴は少なくとも１乃至
Ｔの分子量を５００、通常は１０００、更に普通には１
５００で除した値である。

【００５２】キサンテン環の９個の位置が脂肪族置換基
を有する場合には、主として該化合物は下記式を有す
る；

【００５３】

【化１５】

【００５４】式中、Ａ′及びＤ′は前記されており、こ
こで−ＯＭＸは−ＯＭＸ′と同じであり、Ｇは０又は５
〜７個の環員を有する２〜７個の飽和炭化水素基であ
り、Ｘ′はＸの定義内に入るが、通常は非オキソカルボ
ニルであり、そしてＷと一緒になる場合には特にカルボ
キシであり、Ｗ及びｐは前記したと同じ定義を有する。

【００５５】イムノアツセイ又は他の診断状況に使用す
るため、本発明の分光学的に活性な化合物は、アナライ
ト又はリガンドに対する受容体を包含する有利な化合物
に複合される。（受容体とは、特定の空間的及び極性の
分子構成に特定的に結合する化合物を意図し、そしてリ
ガンドはかかる構成を有する有機分子である）。アナラ
イトは普通はハプテン性又は抗原性である。これらの化
合物が結合のため使用できる官能性を持たない場合に
は、それらは、得られる生成物における受容体認知特性
を依然として保持しながらかかる官能性を導入するよう
に変性される。リガンドと称することもできるアナライ
トの類似体であるこれらの化合物はリガンド類似体と呼
ぶ。

【００５６】前記した通り、本発明の化合物は、公知の
イムノアツセイ法により測定することができる化合物に
複合させることができる。得られる複合体は、試料中の
問題の化合物又はアナライトとアツセイ媒体中で競合す
る試薬である。故に、複合体は受容体、通常は抗体に対
する問題の化合物と競合することができるのに十分な問
題の化合物の構造の割合を保持する。

【００５７】本発明の分光学的に活性な化合物に複合さ
れるアナライト又はその類似体、受容体又はリガンドは
モノエピトピック（ｍｏｎｏｅｐｉｔｏｐｉｃ）又はポ
リエピトピック（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）であるこ
とを特徴とする。

【００５８】アナライト（Ａｎａｌｙｔｅ） 本発明の配位子のアナライトは、モノエピトピック（ｍ
ｏｎｏｅｐｉｔｏｐｉｃ）またはポリエピトピック（ｐ
ｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）であることにより特徴づけら
れる。ポリエピトピック配位子のアナライトは通常ポリ
（アミノ酸）すなわちポリペプチドおよびたんぱく質、
多糖類、核酸、およびそれらの組み合わせである。この
ような群の組み合わせは、バクテリア、ウイルス、染色
体、遺伝子、糸粒体、核、細胞膜などを包含する。

【００５９】ほとんどの部分に対して、本発明において
使用するポリエピトピック配位子のアナライトは分子量
が少なくとも約５，０００、いっそう通常少なくとも約
１０，０００である。ポリ（アミノ酸）カテゴリーにお
いて、興味あるポリ（アミノ酸）は一般に約５，０００
〜５，０００，０００の分子量、より通常約２０，００
０〜１，０００，０００の分子量であろう。興味あるホ
ルモンのうちで、分子量は通常約５，０００〜６０，０
００の分子量範囲であろう。

【００６０】広範なたんぱく質は、同様な構造的特徴を
もつたんぱく質の族、特定の生物学的機能を有するたん
ぱく質、特別の微生物、とくに疾患を生ずる微生物に関
係するたんぱく質などとして考えることができる。

【００６１】次は構造によって関係づけられるクラスで
ある： プロタミン ヒストン アルブミン グロブリン スクレロプロテイン ホスホプロテイン ムコプロテイン クロモプロテイン リポプロテイン ヌクレオプロテイン グリコプロテイン プロテオグリカンス 未分類のたんぱく質、たとえば、ソマトトロピン、プロ
ラクチン、インシュリン、ペプシン 人間の血漿中に存在するある数のたんぱく質は、臨床的
に重要であり、次のものを包含する： プレアルブミン アルブミン α₁−リポプロテイン α₁−酸グリコプロテイン α₁−アンチトリプシン α₁−グリコプロテイン トランスコルチン ４，６Ｓ−ポストアルブミン トリプトフアン−プーア（ｐｏｏｒ） α₁−グリコプロテイン α₁ｘ−グリコプロテイン チロキシ結合グロプリン インター−α−トリプシン−抑制因子 Ｇｃ−グロブリン （Ｇｃ１−１） （Ｇｃ２−１） （Ｇｃ２−２） ハプトグロビン （Ｈｐ１−１） （Ｈｐ２−１） （Ｈｐ２−２） セルロプラスミン コリネステラーゼ α₂−リポプロテイン（類） ミオグロビン Ｃ−反応性たんぱく質 α₂−マクログロブリン α₂−ＨＳ−グリコプロテイン Ｚｎ−α₂−グリコプロテイン α₂−ネウラミノ−グリコプロテイン エリスロポイエチン β−リポプロテイン トランスフエリン ヘモペキシン フイブリノゲン プラスミノゲン β₂−グリコプロテインＩ β₂−グリコプロテインＩＩ イミユノグロブリンＧ （ＩｇＧ）またはγＧ−グロブリン 分子式： γ₂κ₂またはγ₂λ₂ イミユノグロブリンＡ（ＩｇＧ）またはγＡ−グロブリ
ン 分子式： （α₂κ₂)ⁿまたは（α₂λ₂)ⁿ イミユノグロブリンＭ （ＩｇＧ）またはλＭ−グロブリン 分子式： （μ₂κ₂)⁵または（μ₂λ₂)⁵ イミユノグロブリンＤ（ＩｇＤ） またはλＤ−グロブリン（γＤ） 分子式： （δ₂κ₂）または（δ₂λ₂） イミユノグロブリンＥ（ＩｇＥ） またはγＥ−グロブリン（γＥ） 分子式： （ε₂κ₂）または（ε₂λ₂） 遊離のκおよびλの短い鎖 補体因子： Ｃ′１ Ｃ′１ｑ Ｃ′１ｒ Ｃ′１ｓ Ｃ′２ Ｃ′３ β₁Ａ α₂Ｄ Ｃ′４ Ｃ′５ Ｃ′６ Ｃ′７ Ｃ′８ Ｃ′９ 重要な凝血因は、次のものを包含する：

【００６２】

【表２】 凝 血 因 子 国際表示 名 前 I フイブリノゲン (Fibrinogen) II プロスロンビン (Prothrombin) IIa スロンビン (Thrombin) III 組織スロンボプラスチン (Tissue thromboplastin) V及びVI プロアクセレリン (Proaccelerin)、 促進因子グロブリン VII プロコンベルチン (Proconvertin) VIII 親血液性 (Antihemophilic)グロブリン (AHG) IX クリスマス (Christmas) 因子、 血漿スロンボプラスチン成分 (PTC) X スツアルト−プロワー (Stuart-Prower)因子 XI アントプロスロンビン (Antoprothrombin) III 血漿スロンボプラスチン前駆物 (PTA) XII ハゲマン (Hagemann)因子 XIII フイブリン安定化因子

【００６３】

【表３】重要なたんぱく質ホルモンは、次のものを包含
する：ペプチドおよびたんぱく質ホルモン 上皮小体ホルモン (parathromone) サイロカルシトニン (Thyrocalcitonin) インシュリン グルカゴン (Glucagon) レラキシン (Relaxin) エリスロポイエチン (Erythropoietin) メラノトロピン (Melanotoropin) (巨赤血球刺激ホルモン；インテルメジン） ソマトトロピン (Somatotropin) (生長ホルモン） コルチコトロピン (Corticotropin) (向副腎皮質性ホルモン） サイロトロピン (Thyrotropin) 卵胞刺激ホルモン (Follicle-stimulating hormone) 黄体形成ホルモン (Luteinizing hormone) (間質細胞刺激ホルモン)

【００６４】

【表４】 ルテオマンモトロピックホルモン (Luteomammotropic hormone) (ルテオトロピン、プロラクチン) ゴナドトロピン (Gonadotropin) (脈絡膜ゴナドトロピン)組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオスチン (Angiotensin)ＩおよびＩＩ ブラジキニン (Bradykinin) ヒトの胎盤ラクトジェン (placental lactogen)下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン (Oxytocin) バソプレシン (Vasopressin) 解放因子 (Releasing factors) (RF) CRF, LRF, TRF, ソマトトロピン−RF， GRF, FSH-RF, PIF, MIF

【００６５】

【表５】他の興味ある重合体物質は、ムコ多糖類および
多糖類である。

【００６６】微生物から誘導される抗原性多糖類の例
は、次の通りである： 次の物質中に存在 するヘモセンシチン 微生物の種 (Hemosensitin) ストレプトコックス・パイオゲンス (Streptococcus pyogenes) 多糖類 ジプロコックス・ネウモニアエ (Diplococcus pneumoniae) 〃 ネイセリア・メニンジチジス (Neisseria meningitidis) 〃 ネイセリア・ゴノルヘアエ (Neisseria gonorrheae) 〃 コリネバクテリウム・ジフテリアエ (Corynebacterium diphtheriae) 〃 アクチノバシルス・マレイ (Actinobacillus mallei) 粗抽出液 アクチノバシルス・ウイテモリ (Actinobacillus whitemori) フランシセラ・ツラレンシス (Francisella tularensis) リポ多糖類 パステウレラ・ペスチス (Pasteurella pestis) 多糖類 パステウレラ・ペスチス (Pasteurella pestis) 〃 パステウレラ・ムルトシダ カプスラー抗原 (Pasteurella multocida) (Capsular antigen) ブルセラ・アボルツス (Brucella abortus) 粗抽出液 ヘモフイルス・インフルエンザエ (Haemophilus influenzae) 多糖類 ヘモフイルス・ペルツシ (Haemophilus pertussis) 粗製物質 (Crude) トレポネマ・レイテリ (Treponema reiteri) 多糖類 ベイロネラ (Veillonella) リポ多糖類 エリシペロトリクス (Erysipelothrix) 多糖類 リステリア・モノシトゲネス (Listeria monocytogenes) 〃 クロモバクテリウム (Chromobacterium) リポ多糖類 ミコバクテリウム・ツベルクロシス 細胞およびツルベルクリン (Mycobacterium tuberculosis) (turberculin)の９０％フェ ノール抽出ミコバクテリア および多糖類フラクション の塩抽出液 クレブシエラ・アエロゲネス (Klebsiella aerogenes) 多糖類 クレブシエラ・クロアカエ (Klebsiella cloacae) 〃 サルモネラ・チホサ (Salmonella typhosa) リポ多糖類 サルモネラ・チフイ−ムリウム (Salmonella typhi-murium) 多糖類 サルモネラ・テルビイ (Salmonella derby) 〃 サルモネラ・プロルム (Salmonella pullorum) シゲラ・ジセンテリアエ (Shigella dysenteriae) 〃 シゲラ・フレクスネリ (Shigella flexneri) シゲラ・ソンネイ (Shigella sonnei) 粗、 多糖類 リケツチアエ (Rickettsiae) 粗抽出液 カンジダ・アルビカンス (Candida albicans) 多糖類 エンタモエバ・ヒストリチカエ (Entamoeba histolytica) 粗抽出液 効力検定できる微生物は無傷、溶解、粉砕または他の方
法で破片化されているものであることができ、そして生
ずる組成または部分は、たとえば、抽出により、効力検
定できる。興味ある微生物は次のもの包含する：

【００６７】

【表６】

【００６８】

【表７】

【００６９】

【表８】ブルセラアエ (Brucellae) ブルセラ・メリテンシス (Brucella melitensis) ブルセラ・アルツス (Brucella abortus) ブルセラ・スイス (Brucella suis)好気性胞子形成菌類 ベシルス・アントラシス (Bacillus anthracis) バシルス・スブチリス (Bacillus subtilis) バシルス・メガテリウム (Bacillus megaterium) バシルス・セレウス (Bacillus cereus)嫌気性胞子形成菌類 クロストリジウム・ボツリヌム (Clostridium botulinum) クロストリジウム・テナニ (Clostridium tetani) クロストリジウム・ペルフリンゲンス (Clostridium perfringens) クロストリジウム・ノビイ (Clostridium novyi) クロストリジウム・セプチクム (Clostridium septicum) クロストリジウム・ヒストリチクム (Clostridium histolyticum) クロストリジウム・テルチウム (Clostridium tertium) クロストリジウム・ビフエルメンタンス (Clostridium bifermentans) クロストリジウム・スポロゲネス (Clostridium sporogenes)ミコバクテリア (Mycobacteria) ミコバクテリウム・ツベルクロシス (Mycobacterium tuberculosis ・ホミニス hominis) ミコバクテリウム・ボビス (Mycobacterium bovis) ミコバクテリウム・アビウム (Mycobacterium avium) ミコバクテリウム・レプラエ (Mycobacterium leprae) ミコバクテリウム・パラツベルクロシス (Mycobacterium paratuberculosis) アクチノミセテス (Actinomycetes)(バクテリアに似た菌) アクチノミセス・イスラエリイ (Actinomyces israelii) アクチノミセス・ボビス (Actinomyces bovis) アクチノミセス・ナエスルンジイ (Actinomyces naeslundii) ノカルジア・アステロイデス (Nocardia asteroides) ノカルジア・ブラシリエンシス (Nocardia brasiliensis)スピロセテス (Spirochetes) トレポネマ・パリジウム (Treponema pallidum) トレポネマ・ペルテヌエ (Treponema pertenue) トレポネマ・カラテヌム (Treponema carateum) スピリルム・ミヌス (Spirillum minus) ストレプトバシルス・モニリホルミス (Streptobacillus moniliformis) ポルレリア・レクルレンチス (Borrelia recurrentis) レプトスピラ・イクテロヘモルハギア (Leptospira icterohemorrhagiae) レプトスピラ・カニコラ (Leptospira canicola)ミコプラスマス (Mycoplasmas) ミコプスマ・ネウモニアエ (Mycoplasma pneumoniae)他の病原体 リステリア・モノシトゲネス (Listeria monocytogenes) エリシペロトリツクス・ルシオパシアエ (Erysipelothrix rhusiopathiae) ストレプトバシルス・モニリホルミス (Streptobacillus moniliformis) ドンバニア・グラヌロマチス (Donvania granulomatis) バルトネラ・バシリホルミス (Bartonella bacilliformis)リケツチアエ (Rickettsiae)(寄生虫に似たバクテリア) リケツチア・プロワゼキイ (Rickettsia prowazekii) リケツチア・モオセリ (Rickettsia mooseri) リケツチア・リツケテイ (Rickettsia rickettsii) リケツチア・コノリ (Rickettsia conori) リケツチア・アウストラリス (Rickettsia australis) リケツチア・シビリクス (Rickettsia sibiricus) リケツチア・アカリ (Rickettsia akari) リケツチア・ツツガムシ (Rickettsia tsutsugamushi) リケツチア・ブルネツチ (Rickettsia burnetii) リケツチア・キンタナ (Rickettsia quintana)クラミジア (Chlamydia)(分類できない寄生虫のバク テリア/ウイルス) クラミジア・アゲンツ (Chlamydia agents)(名前不確定)菌 類 (Fungi) クリプトコツクス・ネオホルマンス (Cryptococcus neoformans) ブラストミセス・デルマチジス (Blastomyces dermatidis) ヒストプラズマ・カプスラツム (Histoplasma capsulatum) コシジオイデス・イミチス (Coccidioides immitis) パラコシジオイデス・ブラシリエンシス (Paracoccidioides brasiliensis) カンジダ・アルビカンス (Candida albicans) アスペルギルス・フミガツス (Aspergillus fumigatus) 傘状ケカビ (Mucor corymbifer) (Absidia corymbifera) リゾウプス・オリザエ (Rhizopus oryzae) ┐ リゾウプス・アルヒズス (Rhizopus arrhizus) ｜藻菌類(Phycomycetes） リゾウプス・ニグカンス (Rhizopus nigricans)┘ スポロトリクム・シエンキイ (Sporotrichum schenkii) フオンセカエア・ペドロソイ (Fonsecaea pedrosoi) フオンセカエア・コンパクタ (Fonsecaea compacta) フオンセカエア・デルマチジス (Fonsecaea dermatidis) クラドスポリウム・カリオニイ (Cladosporium carrionii) フイアロホラ・ベルコサ (Phialophora verrucosa) アスペルギルス・ニズランス (Aspergillus nidulans) マズレラ・ミセトミ (Madurella mycetomi) マズレラ・グリセア (Madurella grisea) アレスケリア・ボイジイ (Allescheria boydii) フイアロスホラ・ジエアンセルメイ (Phialosphora jeanselmei) ミクロスポルム・ジプセウム (Microsporum gypseum) トリコフイトン・メンタグロフイテス (Trichophyton mentagrophytes) クラチノミセス・アジロイ (Keratinomyces ajelloi) ミクロスポルム・カニス (Microsporum canis) トリコフイトン・ルブルム (Trichophyton rubrum) ミクロスポルム・アンドウイ (Microsporum andouini)ウイルス (Viruses)アデノウイルス (Adenoviruses)ヘルペス・ウイルス (Herpes Viruses) ヘルペス・シンプレツクス (Herpes simplex) バリセラ (Varicella)(Chicken pox) ヘルペス・ソステル (Herpes Zoster)(Shingles) ウイルス (Virus) B シトメガロウイル (Cytomegalovirus)ポクス・ウイルス (Pox Viruses) バリオラ (Variola)(smallpox) バシニア (Vaccinia) ポクスウイルス・ボビス (Poxvirus bovis) パラバシニア (Paravaccinia) モルスクム・コンタジオスム (Molluscum contagiosum)ピコルナウイルス (Picornaviruses) ポリオウイルス (Poliovirus) コクスサツキエウイルス (Coxsackievirus) エコウイルス (Echoviruses) リノウイルス (Rhinoviruses)ミクソウイルス (Myxoviruses) インフルエンザ (Influenza)(A，B，および C) パラインフルエンザ (Parainfluenza)(1−4) ムンプス・ウイルス (Mumps Virus) ネウカスル病ウイルス (Newcastle Disease Virus) メアスレス・ウイルス (Measles Virus) リンデルペスト・ウイルス (Reinderpest Virus) カニン・デイステンペル・ウイルス (Canine Distemper Virus) レスピラトリ・シンシチアル・ウイルス (Respiratory Syncytial Virus) ルベラ・ウイルス (Rubella Virus)アルボウイルス (Arboviruses) イステルン・エクイン (Eastern Equine Eucephalitis ・エウセフアリチス・ウイルス Virus) ウステルン・エクイン (Western Equine Eucephalitis ・エウセフアリチス・ウイルス Virus) シドビス・ウイルス (Sindbis Virus) チクグンヤ・ウイルス (Chikugunya Virus) セムリキ・フオレスト・ウイルス (Semliki Forest Virus) マヨラ・ウイルス (Mayora Virus) St.ルイス・エンセフアリチス・ウイルス (St.Louis Encephalitis Virus) カリフオルニア・エンセフアリチス (California Encephalitis Virus) ・ウイルス コロラド・チツク・フエバー・ウイルス (Colorado Tick Fever Virus) イエロー・フエバー・ウイルス (Yellow Fever Virus) デングエ・ウイルス (Dengue Virus)レオウイルス (Reoviruses) レオウイルス型 (Reovirus Types) 1-3ヘパチチス (Hepatitis) ヘパチチス (Hepatitis) A ウイルス ヘパチチス (Hepatitis) B ウイルス腫瘍ウイルス (Tumor Viruses) ラウスケル・レウケミア・ウイルス (Rauscher Leukemia Virus) グロス・ウイルス (Gross Virus) マロネイ・レウケミア・ウイルス (Maloney Leukemia Virus) モノエピトピツク配位子アナライトは、分子量が一般に
約１００〜２,０００、いつそう通常１２５〜１,０００
である。興味あるアナライトは、薬物、代謝物、殺虫
剤、汚染物質などを包含する。興味ある薬物にはアルカ
ロイドが含まれる。アルカロイドの例は次の通りであ
る：モルヒネアルカロイド、たとえば、モルヒネ、コデ
イン、ヘロイン、デキストロメトルフアン、それらの誘
導体および代謝物；コカインアルカロイド、たとえば、
コカインおよびベンゾイルエクゴニン、それらの誘導体
および代謝物；エルゴツトアルカロイド、たとえば、リ
セルギン酸（lysergic acid）のジエチルアミド；ステ
ロイドアルカロイド；イミナゾイルアルカロイド；キナ
ゾリンアルカロイド、イソキノリンアルカロイド；キノ
リンアルカロイド、たとえば、キニンおよびキニジン；
ジテルペンアルカロイド；それらの誘導体および代謝
物。

【００７０】薬物の次の群は、以下のものを包含する：
ステロイド、たとえば、エストロゲン、ゲストゲン、ア
ンドロゲン、アンドレノコルチカル（andrenocortica
l）ステロイド、バイル酸（bileacids）、強心性グリコ
シドおよびアグリコン、たとえば、ジゴキシン（digoxi
n）およびジゴキシゲニン（digoxigenin）、サポニンお
よびサポゲニン、それらの誘導体および代謝物。また、
ステロイドミメチツク（mimetic）物質、たとえば、ジ
エチルスチルベストロール。

【００７１】薬物の次の群は、５〜６環員のラクタム、
たとえば、バルビツレート、例、フエノバルビタールお
よびセコバルビタール、ジフエニルヒダントニン、プリ
ミドン、エトスキシイミド、および代謝物である。

【００７２】薬物の次の群は、２〜３炭素原子のアルキ
ルを有するアミノアルキルベンゼン、たとえば、アンフ
エタミン、カテコールアミン、例、エフエドリン、Ｌ−
ドーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリン、それ
らの代謝物である。

【００７３】薬物の次の群は、２〜３炭素原子のアルキ
ルを有するアミノアルキルベンゼン、たとえば、エフエ
ドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパ
ベリン、それらの代謝物および誘導体である。

【００７４】薬物の群は、ベンズ複素環式物質、たとえ
ば、オキサゼパム、クロルプロマジン、テグレトール、
イミプラミン、それらの誘導体および代謝物であり、複
素環はアゼピン、ジアゼピンおよびフエノチアジンであ
る。

【００７５】薬物の次の群は、プリン、たとえば、テオ
フイリン、カフエイン、それらの代謝物および誘導体で
ある。

【００７６】薬物の次の群は、マリジユアナ（marijuan
a）から誘導されたもの、たとえば、カンナビノールお
よびテトラヒドロカンナビノールを包含する。

【００７７】薬物の次の群は、ビタミン、たとえば、
Ａ、Ｂ、例、Ｂ₁₂、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、チアミ
ンである。

【００７８】薬物の次の群は、ヒドロキシル化および不
飽和の程度および部位が異なるプロスタグランジンズで
ある。

【００７９】薬物の次の群は、抗生物質、たとえば、ペ
ニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テ
トラサイクリン、テラマイシン、それらの代謝物および
誘導体である。

【００８０】薬物の次の群はヌクレオシドおよびヌクレ
オチド、たとえば、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシ
ン、グアノシン、チミジン、およびシチジン、それらの
適当な糖およびホスフエート置換基をもつものである。

【００８１】薬物の次の群は種々の個々の薬物、たとえ
ば、メタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジ
ン、アミトリフチリン、ノルトリプチリン、リドカイ
ン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プ
ロパノロール、グリセオフルビン、バルプロン酸（valp
roi acid）、ブチロフエノン、抗ヒスタミン、抗コリン
剤、たとえば、アトロピン、それらの代謝物および誘導
体である。

【００８２】化合物の次の群はアミノ酸および小さいペ
プチド、たとえば、ポリヨードチロニン、オキシトシ
ン、ＡＣＴＨ、アンギオテンシン、メトエンケフアリ
ン、レウエンケフアリン、それらの代謝物および誘導体
である。

【００８３】病気の状態に関係する代謝物には、スペル
ミン、ガラクトース、フエニルピルビン酸およびポリフ
イリン型１が含まれる。

【００８４】薬の次の群はアミノグリコシド、たとえ
ば、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンお
よびアミカシンである。

【００８５】興味ある殺虫剤の例は、ポリハロゲン化ビ
フエニル、ホスフエートエステル、チオホスフエート、
カルバメート、ポリハロゲン化スルフエンアミド、それ
らの代謝物および誘導体である。

【００８６】受容体は分子の空間的および極性の有機化
に結合できる化合物である。ほとんどの部分に対して、
受容体は抗生物質、とくにＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよ
びＩｇＭである。受容体はアナライトであるか、あるい
は免疫検定において試薬として使用できる。いずれの場
合においても、受容体は本発明の分光学的に活性な化合
物に結合できる。

【００８７】受容体のアナライトについて、分子量は一
般に１０,０００〜２×１０⁶、より通常１０,０００〜
１０⁶の範囲であろう。イミユノグロブリン、ＩｇＡ、
ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭについて、分子量は一般に
約１６０,０００〜約１０⁶で変化するであろう。酵素は
分子量が通常約１０,０００〜６００,０００であろう。
天然の受容体は、分子量が広く変化し、一般に少なくと
も約２５,０００であり、１０⁶以上であることがあり、
このような受容体の例はアビジン、シロキシン結合グロ
ブリン、シロキシン結合プレアルブミン、トランスコル
チンなどである。本発明の化合物は広範な配位子、ハプ
テンおよび抗原、および受容体に結合して、複合体を形
成することができ、これらの複合体は種々の検定、とく
に免疫検定に使用される。特定の配合体は、アナライト
において、たとえば、薬物として大きい重要性をもち、
本発明の化合物を用いる定量が容易である、などの理由
で興味がある。次は特に重要な複合体の式である。

【００８８】重要な第１の複合体は、次式のラクタム−
発色団複合体である：

【００８９】

【化１６】

【００９０】式中ａは１であり、ただしＲおよびＲ^aが
フエニルであるとき、ａは０または１であり、Ｚはカル
コーゲン、酸素またはイオウであり、通常酸素であり、
ＲおよびＲ^aは１〜７炭素原子、通常１〜６炭素原子の
炭化水素であり、芳香族以外のときエチレン性不飽和の
０〜１部位を有し、たとえば、ａが１であるとき、メチ
ル、エチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ブチル、α−メチル
ブチル、イソアミル、ヘキシル、△¹−シクロヘキセニ
ルおよびフエニル、とくにアルキルとα−メチルブチル
との組み合わせまたはエチルとフエニルとの組み合わ
せ、そしてａが０であるとき、２つのフエニルであり、
Ｌの一方は単結合、Ｃｈへ結合する官能基または基であ
り、通常オキシ、アミノ、非オキシカルボニルまたはメ
ルカプトにおいて終り、そして０〜６、通常０〜４の炭
素子の鎖を有し、結合部位外のとき、Ｌは水素であり、
Ｃｈは、次式をもち、

【００９１】

【化１７】

【００９２】式中、α、δおよびγは前に定義した通り
であり、そしてＣＯ′はＬへ結合してアミド、アミジ
ン、尿素、チオ尿素、エステル、オキシエーテルまたは
チオエーテルを形成する適当な官能基、あるいは配位子
および発色団に結合する第二−アミノ官能基であり、上
の式には狭い範囲の前式のすべてが包含され、ここでＸ
は結合官能基である。

【００９３】次の重要な発色団配位子複合体は、次式を
もつであろうテオフイリンについてのものである：

【００９４】

【化１８】

【００９５】式中ＬおよびＬ¹の一方は単結合あるいは
Ｃｈへ結合する官能基または基であり、通常オキシ、ア
ミノ、非オキソカルボニルまたはメルカプトで終り、そ
して０〜６、通常０〜４の炭素原子の鎖を有し、結合部
位以外であるとき、Ｌは水素であり、そしてＬ¹はメチ
ルであり、そしてＣｈは上に定義した通りである。

【００９６】次の重要な発色団配位子の複合体は、ほと
んどの部分について次式を有する、アミノグルコキシ
ド、とくに抗微生物性アミノグルコシドについてのもの
である：

【００９７】

【化１９】

【００９８】式中ＬはＲ基のいずれの１つにも結合する
ことができ、そうでない場合、Ｒ²はアミノ（−ＮＨ₂）
であり、ただしカナマイシンおよびアミカシンについて
は、それはヒドロキシルであり、Ｒ³、Ｒ⁷およびＲ⁹は
ヒドロキシルであり、Ｒ⁴およびＲ⁵はアミノであり、た
だしアミカシンについては、Ｒ⁴は２−ヒドロキシ−４
−アミノブチルアミドであり、Ｒ⁶は水素またはメチル
であり、ゲンタミシンであるときメチルであり、そして
トブラマイシン、カナマイシンまたはアミカシンである
とき、水素であり、Ｒ⁸はアミノまたはメチルアミノで
あり、ゲンタミシンであるときメチルアミノであり、他
の場合はアミノであり、Ｒ¹⁰は水素またはヒドロキシメ
チルであり、ゲンタミシンのとき水素であり、他の場合
はヒドロキシメチルであり、Ｒ¹¹およびＲ¹²は水素また
はヒドロキシルであり、ゲンタミシンについて水素であ
り、カナマイシンおよびアミカシンについてヒドロキシ
ルであり、そしてトブラマイシンについてＲ¹¹はヒドロ
キシルであり、そしてＲ¹²は水素であり、そして Ｌお
よびＣｈは上に定義した通りである。

【００９９】次の重要な発色団配位子複合体は、次の式
をもつであろう三環式抗抑うつ剤についてのものであ
る：０〜１の部位のエチレン性不飽和

【０１００】

【化２０】

【０１０１】式中Ｌ¹の一方は前に定義したような結合
基であり、そうでない場合、水素であり、Ｇ¹はＮ−、
Ｃ＝またはＣＨ−であり、残りの２つの原子価は隣接す
る環炭素原子に向かい、Ｒ^cは単結合または二重結合で
ありＬ−をＧに結合するか、あるいは窒素へ結合する０
〜２メチル基を有するアミノプロピルまたは−イリデン
である。

【０１０２】次の重要な発色団配位子複合体は次式を有
するであろうベンゾジアゼピンについてのものである：

【０１０３】

【化２１】

【０１０４】式中ＬおよびＣｈは上に定義した通りであ
り、Ｒ^αはＬが水素であるとき単結合またはメチレンで
あり、Ｒ^eは単結合またはオキシであり、そしてφは０
〜１個のオルトの原子番号９〜１７のハロゲンである。

【０１０５】Ｌで表わされる結合基は、Ｌが結合するＲ
の性質、Ｌが結合する基に依存して変化するであろう。
前に示したように、Ｌは単結合、官能基または結合基で
あることができ、この結合基はＣｈ上に存在する官能基
と共有結合を形成できる官能基において終る。Ｌが単結
合であるとき、それは炭素原子を異種原子、とくに窒素
原子および酸素原子に通常結合するであろう。Ｌが官能
基であるとき、それは通常炭素に結合し、通常オキシ、
チオ、アミノまたは非オキシカルボニルである。Ｌが結
合基であるとき、それは通常１〜８、とくに１〜６、こ
とに１〜４の原子の鎖を有し、それらの原子のうち０〜
２、通常０〜１は異種原子、すなわち、酸素、イオウお
よび窒素であり、カルコーゲンは主として炭素へ結合
し、窒素は主として炭素および水素へ結合し、鎖はメチ
レンとしてまたは異種官能基（Ｌについて上に定義した
ような）で終り、Ｌは合計１〜１０、通常１〜６個の炭
素原子と０〜４、通常１〜３個の異種原子、すなわち、
酸素、イオウおよび窒素を有し、カルコーゲンは通常エ
ーテルまたは非オキソカルボニルであり、そして窒素は
アミノまたはアミドである。

【０１０６】主題の複合体は、試料中の問題の化合物の
存在を定性的に、半定量的に、または定量的に決定する
種々な方法で使用できる。化合物を生理学的流体中で検
出する場合、流体は血清、尿、唾液、リンパ液などを包
含できる。問題の化合物が化学的処理または環境衛生に
関係するものであるとき、試料は水性媒質、有機媒質、
土壌、無機混合物などを含むことがある。

【０１０７】検定は、通常、分光学的に活性な化合物の
まわりの環境が変化するための分光学的変化、あるいは
蛍光発生剤−消光剤の対を消光剤が蛍光発生剤と相互作
用するのに十分な近い範囲内に接近させることを含む。

【０１０８】第１の検定において、立体的排除を含み、
ここで配位子および蛍光発生剤のための受容体または抗
体を用い、配位子の受容体と蛍光発生剤の受容体の同時
結合は阻止される。さらに、蛍光体の受容体（抗蛍光発
生剤）を蛍光発生剤へ結合するとき、蛍光発生剤の蛍光
は実質的に減少する。それ以上の減少は、蛍光の抑制が
完結されない場合、消光剤を抗蛍光発生剤に結合するこ
とによつて達成できる。この検定は、１９７６年１２月
２１日発行の米国特許第３,９９８,９４３号に詳しく説
明されている。そこで使用する蛍光の代わりに、本発明
の蛍光化合物を代わりに使用する。検定は前記特許の欄
３〜５に記載されており、その記載を引用によつてここ
に加える。

【０１０９】一般に、この方法はアナライトを含有する
と思われる試料、配位子と蛍光発生剤、抗蛍光発生剤、
および配位子がアナライトであるとき、配位子の受容体
すなわち抗配位子を合わせることからなる。これらの物
質を５〜１０、通常６〜９の範囲のｐＨおよび約１０〜
４５℃の範囲の温度において水性媒質中で合わせ、そし
て蛍光を速度または平衡のモードで決定し、すべての物
質を速度のモードで合わせた後読みは約１秒〜１時間以
内に取り、一方平衡のモードにおいて、読みは約２４時
間以上までの長い時間にわたつて取ることができる。

【０１１０】次の免疫検定技術において、蛍光発生剤−
消光剤の対を用い、ここで対の構成員の一方が特定の結
合する対、すなわち配位子および抗配位子の一構成員へ
結合し、そして他方の発色団の構成員は特定の結合する
対の同一または異なる構成員へ結合する。たとえば、蛍
光発生剤は抗配位子へ結合し、そして消光剤は抗配位子
の異なる分子へ結合できるので、２つの複合した抗配位
子が抗原と一緒にされるとき、蛍光発生剤と消光剤は消
光距離内に接近させられる。別法として、発色団の一方
を配位子へ結合し、他方の発色団を抗配位子へ結合する
ことができる。この検定は米国特許第３,９９６,３４５
号に詳しく記載されている。この検定技術は欄１７から
欄２３にかけて説明されており、その記載を引用によつ
てここに加える。発色団対配位子および受容体の比は欄
４〜６に説明されており、その記載を引用によつてここ
に加える。

【０１１１】この検定は上と実質的に同じ方法で実施す
るが、ただしこの検定において、蛍光複合体と消光複合
体を試料と一緒に加え、そして蛍光を既知量のアノライ
トを有する検定媒質と比較して決定する。

【０１１２】他の技術を主題化合物とともに使用するこ
とができ、このような技術は１９７７年８月１３日付け
米国特許出願第８２４,５７６号に記載されるように重
い原子の消光を含み、あるいは分析すべき生理学的流体
または他の試料中に天然に存在する蛍光化合物が発する
光よりも実質的に上の波長の光を発する蛍光化合物を望
む場合、他の決定を使用できる。

【０１１３】実験 下記の実施例は限定のためではなく、例示のため示す。

【０１１４】（とくにことわらないかぎり温度はすべて
せつ氏である。とくにことわらないかぎり部及び百分率
はすべて重量によるが、リガンドの混合物については容
量による。下記の省略語を使用する。ＴＨＦ−テトラヒ
ドロフラン；ＮＨＳ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；
ＤＭＦ−Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＣＣ−ジシ
クロヘキシルカルボジイミド；ＰＥＧ−ポリエチレング
リコール６０００。）

【０１１５】

【実施例】

実施例１２−クロロ−４−メトキシレゾルシノールの製造 反応フラスコの中に５０ｍｌのメチレンジクロライド中
の２ｇの２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシベ
ンズアルデヒドを過剰のｍ−クロロ過安息香酸と共に入
れ、２.５時間還流させた。溶媒を除去した後、固体の
残渣を１０ｍｌのメタノール中に溶解し、約１０重量パ
ーセントの水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）ととも
に１時間撹拌した。希ＨＣｌでｐＨ１の酸性にした後、
この溶液を濾過し、沈殿を１０ｍｌの冷水で洗浄した。
濾液を合わせ、洗浄物をエーテルで抽出し、このエーテ
ル溶液を５％ＮａＨＣＯ₃（２×１０ｍｌ）及び飽和Ｎ
ａＣｌ溶液（１×１０ｍｌ）で洗浄し、次いで蒸発させ
て固体を残し、この固体を酢酸エチルーヘキサン混合物
から結晶化させ、生成物を白色絹様針状物として得た
（１.３５ｇ）。融点６９−７０°。

【０１１６】実施例２３′,６′−ジヒドロキシ−４′,５′−ジクロロ−
２′,７′−ジメトキシスピロ［イソベンゾフラン−１
（３Ｈ）,９′−［９Ｈ］キサンテン］−５又は６−カ
ルボキシ−３−オン 実施例１の生成物（２００ｍｇ）及び１００ｍｇの１,
２,４−ベンゼントリカルボン酸無水物の混合物を１８
０−８５°で３０分間１５ｍｇの塩化亜鉛と加熱した。
生成した赤色混合物を５％水酸化ナトリウム水溶液中に
溶解し希ＨＣｌでｐＨ１にして沈殿させた。次いで沈殿
物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ−９：１：０.５
を使用してクロマトグラフ処理した。

【０１１７】実施例３３′,６′−ジヒドロキシ−４′,５′−ジメトキシスピ
ロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）,９′−［９Ｈ］キ
サンテン］−５又は６−カルボキシ−３−オン ピロガロール−２−メチルエーテル（４ｇ）及び１,２,
４−ベンゼントリカルボン酸無水物（２.３ｇ）の混合
物を、１９０〜１９５°（外部油浴温度）に予じめ加熱
した油浴中の開口した試験管中で３時間加熱した。暗赤
色の物体が得られた。それを冷却し、５％ＮａＯＨ（３
５ｍｌ）に溶解し、濃ＨＣｌでｐＨ１の酸性にした。暗
赤色の油が分離した。この溶液を固体ＮａＣｌで飽和
し、冷たい部屋で一晩撹拌した。濃厚な黒色タール状物
質を分離し、このタールを飽和ＮａＣｌ溶液で溶かした
（macerated）（２×１５ｍｌ）。このタールのＴＬＣ
（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ ８５：１５：１）
試験は赤色スポツト及びより低いＲ_fをもついくつかの
他のスポツトの存在を示した。このタールを５ｇのＲＰ
−２シリカゲル６０シラン化物（E．Merck Cat．No.７
７１９）に吸収させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂：メタノール（１０
０：０.２５）中に調製したＲＰ−２シリカゲル（３５
ｇ）を使用する通常の重力カラムにより精製した。溶離
は同じ溶媒ＣＨ₂Ｃｌ₂：メタノール（１００：０.２
５）を用いて行つた。溶離につづきＴＬＣを行つた。同
じ赤色スポツトを含有する画分を合わせ、溶媒を除去し
て赤色の残渣を得、これを２０ｍｌのＣＣｌ₄：ＣＨ₂Ｃ
ｌ₂（９５：５）の混合物で溶かした。生成した赤色固
体（１.１ｇ）を濾過した。これはＴＬＣ上の唯一のス
ポツト ｎｍ、ε７８,２００を有する。それは発光を有しな
い。

【０１１８】実施例４３′,６′−ジヒドロキシ−４′,５′−ジメトキシ−
２′,７′−ジイオドスピロ［イソベンゾフラン−１
（３Ｈ）,９′−［９Ｈ］−キサンテン］−５又は６−
カルボキシ−３−オン ４′,５′−ジメトキシ−６−カルボキシフルオレセイ
ン（実施例３）（１.０５ｇ）を無水エチルアルコール
（１５ｍｌ）中に溶解し、これにＩ_２粉末（１ｇ）及び
固体炭酸水素ナトリウム（０.５ｇ）を加えた。内容物
を１時間窒素下で還流した（外部浴温度８０−８５
°）。還流混合物のＴＬＣ試験（ＣＨ₂Ｃｌ₂：メタノー
ル：酢酸８５：１４：１）はモノ沃素化誘導体及び少量
のジ沃素化誘導体の生成ならびに出発物質を示した。

【０１１９】さらにＩ₂（５００ｍｇ）及びＮａＨＣＯ₃
（２５０ｍｇ）を加え、さらに１時間加熱を続けた。Ｔ
ＬＣはモノ−及びジ−沃素化生成物がさらに生成したこ
とを示した。さらにＩ₂（５００ｍｇ）及びＮａＨＣＯ₃
（２５０ｍｇ）を加え、続いて１時間加熱することをあ
と２回繰り返した。最終混合物のＴＬＣは多量のジ沃素
化誘導体並びにごく少量のモノ沃素化誘導体の存在を示
した。

【０１２０】エチルアルコールをロトバツプ（Rotova
p）上で除去した。残渣に対し２０ｍｌの水を加え、溶
液を希ＨＣｌでｐＨ１の酸性にした。かつ色の油が分離
した。これをエーテル（３×５０ｍｌ）で抽出した。暗
赤色のエーテル層を５％チオ硫酸ナトリウム溶液（２×
２０ｍｌ）、水（１×２０ｍｌ）及び塩水（１×２０ｍ
ｌ）で洗浄した。エーテルをロトバツプ上で除去し、残
渣を４％ＮａＯＨ（２０ｍｌ）中に溶解し濾過した。濾
液を希ＨＣｌで酸性にした暗赤色の固体（２.１ｇ）を
得た。

【０１２１】この赤色の固体（２.１ｇ）をアセトンを
用いて４ｇのＲＰ−２シリカゲルシラン化物（E．Merck
Cat．No.９９１７）上に吸着させ、次いで（ＣＨ₂Ｃｌ
₂を用いて３０ｇのＲＰ−２シリカゲルから調製した）
ＲＰ−２シリカゲルの重力カラム上に注ぎ、ＣＨ₂Ｃｌ₂
で溶離した。溶離につづきＴＬＣを行つた。同じＲ_fを
有する画分を合わせ、溶液を除去した。この残渣（１.
１ｇ）を１０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（９９：１）
に溶解し、ｎ−ヘキサン（７ｍｌ）を加えた。厚い沈殿
が分離した。これを濾過し、母液を濃縮した。これにさ
らにヘキサンを加え、さらに固体を得た。固体を合わせ
（０.９５ｇ）、非常に淡く着色した長い針状物として
２′,７′−ジイオド−４′,５′−ジメトキシ−６−カ
ルボキシフルオレセインを得た。このものは放置すると
橙赤色になつた。

【０１２２】 ｎｍ及びε８１,７８０を有する。

【０１２３】実施例５９−（２′,５′,６′−トリクロロ−３′,４′−ジカ
ルボキシフエニル）−２,７−ジメトキシ−４,５−ジク
ロロ−６−ヒドロキシ−３−イソキサンテノン Ａ．２５ｍｌの２０％発煙硫酸中に１０ｇの４−メチル
フタル酸無水物及び０.５ｇの粉末沃素を溶解した。こ
の混合物を９０〜１００°に加熱し、塩素ガスを連続的
にこの溶液にバブルさせた。２４時間加熱後、さらに
０.５ｇの沃素を加え、さらに２４時間加熱を続けた。
白色固体が沈殿した後この溶液を冷却し、１００ｍｌの
氷冷水中で希釈し、白色固体を濾過した。この固体を２
０ｍｌの冷水で洗浄し真空中で乾燥した。この生成物は
３,５,６−トリクロロ−４−メチルフタル酸及び無水物
の混合物であると考えられた。

【０１２４】Ｂ．反応フラスコ中に２０ｇ（０.０７５
モル）の上記生成物及び４００ｍｌの１０％炭酸カリウ
ム水溶液を導入した。約１時間１２０°で還流した後、
２０ｍｌのｔ−ブタノールを加え、つづいて３３ｇ
（０.２モル）の粉末過マンガン酸カリウムを一部ずつ
加え過マンガン酸塩の蓄積を防止した。さらに１００ｍ
ｌの１０％炭酸カリウム水溶液を使用して過マンガン酸
塩中で洗浄した。反応コースをＴＬＣで追跡し、出発物
質の実質的不存在を観察したときに、蒸留によりｔ−ブ
タノールを除去し、生成したスラリーを６Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄
でｐＨ１の酸性にした。過剰の過マンガン酸塩を、硫酸
を加えてｐＨを１に維持しつつ、固体しゆう酸を用いて
分解させた。真空中での濃縮後、白色沈殿が生成し、６
Ｍ ＨＣｌを加えて最終容量を３００ｍｌとした。３０
分間室温で撹拌した後、細かい白色沈殿が生成した。こ
のスラリーをエーテル（３×４００ｍｌ）で抽出し、エ
ーテル溶液を分離し、そのエーテルを真空中で蒸発させ
た。ベンゼンを用いる共沸乾燥後、２０ｇの白色粉末を
単離し、これを酢酸エチル−ＣＣｌ₄から再結晶し、１
９.５ｇの生成物を得た。融点、２３８−２４０°。

【０１２５】Ｃ．上記生成物（１０ｇ）を３０ｍｌの無
水酢酸に溶解し、１４０−１４５°で窒素下で４５分間
加熱した。この無水酢酸を真空中で約３５−４０°の温
度で除去した。白色固体の重量は９.５ｇであつた。こ
の生成物は１,２−ジカルボン酸の基の酢酸との混合無
水物及び分子内無水物である。

【０１２６】この生成物（９.５ｇ）は１２ｇの２−ク
ロロ−４−メトキシレゾルシノール及び１ｇの無水塩化
亜鉛と混合し、１８５〜１９０°に約１.５時間加熱す
ることができる。次いでこの生成物を前記のように処理
する。

【０１２７】実施例６実施例３の生成物と抗（人ＩｇＧ）（Anti(human Ｉｇ
Ｇ））との複合 １ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の２５ｍｇの実施例３の生成物の
溶液を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０ｍｇ）
と１０ｍｇのＮＨＳと一晩撹拌した。この溶液を濾過し
た後、溶媒を除去し、残渣を１０ｍｌのｎ−ヘキサンで
２０分間溶した。生成した固体を濾過しこの固体を５ｍ
ｌのｎ−ヘキサンで洗浄した後、生成したエステルをさ
らに精製することなく使用した。１ｍｌの０.０５Ｍり
ん酸塩緩衝液、ｐＨ８中の１％抗（人ＩｇＧ）（１０ｍ
ｇ蛋白質）の溶液に、２５μｌのＤＭＦ中の０.７ｍｇ
の上記ＮＨＳエステルをゆつくり加え、この混合物を１
時間０〜５°で撹拌し、次いでさらに１時間室温で撹拌
した。この生成物は、０.０５Ｍりん酸塩緩衝液、ｐＨ
８を使用してＧ２５セフアデツクス（Sephadex）カラム
をとおしてクロマトグラフ処理することにより精製し
た。全生成容量は２.２ｍｌであつた。５１９ｎｍでの
ＵＶ吸収に基づき、染料／蛋白質比は約５と評価され
た。

【０１２８】実施例７実施例４の生成物と抗（人ＩｇＧ）の複合 新しく蒸留した乾燥ＴＨＦ（３ｍｌ）中の４′,５′−
ジメトキシ−２′,７′−ジイオド−６−カルボキシフ
ルオレセイン（実施例４）（２５０ｍｇ）、ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（８０ｍｇ）及びＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド（５０ｍｇ）の溶液を６時間室温で撹拌
した。この間に白色固体が少し分離したので、これを濾
別した。濾液をロトバツプ上で濃縮し、残渣を５分間真
空中で乾燥し、溶媒の最後の痕跡を除去した。生成した
深赤色の固体を１２ｍｌのベンゼン−ヘキサン混合物
（１：１）を用い２０分間撹拌し、生成した深紫色固体
を濾過した。この固体はＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ：ＡｃＯ
Ｈ（８５；１５：１）中のＴＬＣにより殆んどすべてＮ
ＨＳエステル（ＮＨＳエステルはメタノールと反応し対
応するメチルエステルを与えるので、出発物質と比較し
てより高いＲ_fにより示される）であることがわかつ
た。この紫色の固体はそのままで蛋白質に対する複合の
ために使われた。この固体は約９０重量％の純度である
と考えられる。

【０１２９】Ｂ．氷浴中で０〜５°に冷却した人−Ｉｇ
Ｇ（１％コール酸を含有する０.５ｍｌの０.０５Ｍ Ｐ
Ｏ₄ ³⁻緩衝液ｐＨ８.０中の５ｍｇ）の溶液に、２５μ
ｌの乾燥ＤＭＦ中の上で製造したＮＨＳエステル（０.
４ｍｇ）の溶液を２０分間でゆつくり加えた。冷室で一
晩撹拌を続けた。次の日、この溶液を２分間遠心分離に
かけ、この深赤色溶液を、１％コール酸を含有する０.
０５Ｍ ＰＯ₄ ³⁻緩衝液ｐＨ８.０を使用してセフアデツ
クスＧ−２５カラム（１×３０ｃｍ）上で精製した。よ
り速く移動する複合体は容易に分離された。

【０１３０】ハプテン数（すなわち、染料／蛋白質比）
の計算は次のように行つた。特定の希釈のＵＶスペクト
ルから染料の量は、５３９におけるＯＤを吸光係数（ex
tinction cofficient）８１.７８０で除することにより
決定される。蛋白質の量は複合の前に出発する蛋白質の
濃度を知つて（蛋白質が複合及びセフアデツクスクロマ
トグラフ処理の間に失われないと仮定して最終複合体に
ついて適当な希釈較正を行つた）その濃度数を使用する
ことにより決定する。

【０１３１】上記方法に従つてラベルする場合、本消光
剤のＮＨＳエステルのラベリング効率は約８０〜９０％
であることが見出される。

【０１３２】実施例８４,５−ジメトキシ−６−ヒドロキシ−９−（２′−カ
ルボキシエチル）キサンテン−３Ｈ−３−オンの製造 反応フラスコの中にＯ²−メチルピロガロール（３００
ｍｇ）、無水コハク酸（１００ｍｇ）及びＺｎＣｌ
₂（２０ｍｇ）を導入し、混合物を１８０−８５°に１
５分間加熱した。この生成物をプレパラテイブＴＬＣ
（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、９０：１０：０.
５）により精製した。精製した生成物は０.０５ 光は有しなかつた。

【０１３３】無水コハク酸を他の酸無水物、たとえば無
水グルタル酸、２,３−ジメチルコハク酸無水物、１,２
−シクロペンタンジカルボン酸無水物及び無水アジピン
酸で置きかえて上記方法に従うと、適当に置換された
４,５−ジメトキシ−６−ヒドロキシ−９−置換キサン
テン−３Ｈ−３−オンが得られる。

【０１３４】実施例９３′,６′−ジヒドロキシ−４′,５′−ジクロロ−
２′,７′−ジメトキシスピロ［イソベンゾフラン−１
（３Ｈ）,９′−［９Ｈ］キサンテン］−４,７−ジクロ
ロ−５又は６−カルボキシ−３−オンの製造 Ａ．２−クロロ−４−メトキシレゾルシノール（０.４
ｇ）及び３,６−ジクロロトリメリツト酸無水物（０.２
７ｇ）をＺｎＣｌ₂（１０ｍｇ）と１８５°で１５分間
加熱し、生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、９
０：１０：１を使用してＴＬＣにより精製した。この生
成物は０.０５Ｍ ＰＯ₄ ³⁻緩衝液、ｐＨ８

【０１３５】

【０１３６】機械的撹拌器を備えた三つ口フラスコ中で
０°に維持された、希ＨＣｌ（４Ｎ、３０ｍｌ）中の
２,５−ジクロロ−３,６−ジメチルアニリン（５ｇ）の
溶液に、亜硝酸ナトリウムの溶液（５０ｍｌの水中１.
８５ｇ）を滴下して加えた。添加が完了した後、このジ
アゾ溶液をＮａ₂ＣＯ₃を用いてｐＨ７に中和し、ベンゼ
ン（１００ｍｌ）を加えた。次いでこれに激しく撹拌し
ながら［塩化第１銅とシアン化ナトリウムの溶液から製
造した］シアン化第１銅の新しく製造した溶液を加え
た。この混合物を放置して室温にし、次いで一晩撹拌し
た。次の日、ベンゼン層を分離濃縮して、ニトリルとし
て約４.５ｇの粗かつ色固体を得た。これは精製せず、
直接加水分解してアミドにした。ジオキサン（３０ｍ
ｌ）及び４％ＮａＯＨ水溶液（７０ｍｌ）の混合物中の
ニトリル（４.５ｇ）の溶液を８時間還流した。この溶
液を冷却し、エーテルで抽出し、このエーテル溶液を濃
縮してかつ色の油を得、これをクロロホルムを用いて浸
しかつ色の固体を得た。これをクロロホルム−石油エー
テルから結晶化しアミド（２.３ｇ）を得た。

【０１３７】濃Ｈ₂ＳＯ₄（４ｍｌ）中の上記アミド
（０.９ｇ）の溶液に亜硝酸ナトリウムの溶液（１ｍｌ
の水中０.３７ｇ）をゆつくりと加え、その間溶液の温
度を３０°以下に維持した。添加が完了した後、この混
合物を氷で希釈し、白色沈殿を得、これを濾過し、さら
に１０％Ｋ₂ＣＯ₃溶液中に溶解し、濾過し及び１Ｎ Ｈ
Ｃｌで酸性にすることにより精製し、２,５−ジクロロ
−３,６−ジメチル安息香酸を得た。

【０１３８】上で製造した酸（０.５６ｇ）にアルカリ
性ＫＭｎＯ₄（１０ｍｌの１０％Ｋ₂ＣＯ₃中１.８１ｇ）
を加え、この混合物を１１０°で３時間加熱した。生成
した混合物を６Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨ１の酸性とし、過剰
のＫＭｎＯ₄はしゆう酸を用いる処理により除去した。
エーテルで抽出し、所望の三酸生成物、融点２３２−３
３°を得た。

【０１３９】実施例１０２,７−ジ（メチルチオ）−６−ヒドロキシ−９−
（２′−カルボキシフエニル）キサンテン−３Ｈ−３−
オンの製造 反応フラスコの中へ４−チオメチルレゾルシノール（２
００ｍｇ）、無水フタル酸（１０４ｍｇ）及び塩化亜鉛
（１０ｍｇ）を入れ、この混合物を１８０°で５分間加
熱した。この生成物をＣＨ₃ＯＨ：ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＨＯＡ
ｃ（９：１：０.１）を使用するプレパラテイブＴＬＣ
により精製した。得られた生成物は０.０ ５４０ｎｍを有していた。

【０１４０】本化合物の有用性を示すため、米国特許第
３,９９６,３４５号に記載のようにこの蛋白質複合体を
免疫評価において使用した。第１の評価では、約７のフ
ルオレセイン／蛋白質モル比を有するフルオレセインイ
ソチオシアネート及び入ＩｇＧの複合体を０.０３ｍｇ
／ｍｌの濃度で使用した。実施例６の生成物を０.０５
Ｍりん酸塩緩衝液、ｐＨ８中４.９ｍｇ／ｍｌの濃度で
使用した。実施例６の生成物の種々の希釈物を一定量の
フルオレセイン複合体に加え、評価緩衝液として０.０
１Ｍりん酸塩、０.１５Ｍ ＮａＣｌ及び２％ＰＥＧ、ｐ
Ｈ８.０を使用し１０分間保温した。下記の成績表では
２５０μｌの緩衝液中の２５μｌのフルオレセイン複合
体を２５０μｌの緩衝液中の２５μｌの実施例６の適当
に希釈した生成物と合わせ、この混合物を１０分間保温
し、２ｍｌの緩衝液を加え、次いでけい光信号を決定し
た。実施例６の生成物からのバツクグラウンドを得るた
め、フルオレセイン−ＩｇＧ複合体を緩衝液で置きかえ
た場合、実施例６の生成物の種々の希釈物についてけい
光信号は０から６へ変化したが、このことはけい光がな
かつたことを示しており、観察されたけい光は装置の誤
差内に入つていた。

【０１４１】下表はその結果、すなわち種々の希釈物と
観察されたけい光を示す。

【０１４２】

【表９】 第ＩＩ表 実施例６の希釈物 けい光信号 １：４０ ７２２ １：２０ ５９８ １：１０ ３８２ １：５ １９８ １：２.５ １２２ ∞ ９２８ 上記の結果は、媒体中に存在するフルオレセインに関し
て消光剤複合体の濃度に依存して本発明の複合体がけい
光の変化における大きな動的範囲（dynamic range）を
与えることを示す。本データはガンマーグロブリンに対
する鋭敏な評価が得られることを示す。なぜならばガン
マーグロブリンをふの媒体に加えることによりけい光剤
複合体に結合させるために利用できる消光剤複合体の量
は評価媒体中に存在する抗原の量に比例して減少するか
らである。さらに、本発明の複合体を使用することによ
り、本消光剤複合体からのバツクグラウンド放射は本質
的に存在しない。

【０１４３】実施例６の消光剤複合体を実施例７の消光
剤複合体で置き換えて、第２の評価を行つた。消光剤対
蛋白質のモル比は約１.５であり、消光剤溶液の濃度は
約４ｍｇ／ｍｌであつた。フルオレセインの代りに使用
したけい光剤は２,７−ジメチル−９（２′,５′,６′
−トリクロロ−３′,４′−ジカルボキシフエニル）−
６−ヒドロキシ−３−イソキサンテノンであつた。この
化合物はカルボキシル基の１つによりＩｇＧにグリシン
結合基を介して結合した。けい光剤／蛋白質のモル比は
約７.５であり、この溶液は約０.０３ｍｇ／ｍｌの濃度
を有した。前に記載した評価は、本発明、実施例７の消
光剤及び抗ＩｇＧに複合した市販のローダミンイソチオ
シアネートの両方について行つた。下の表はこれら二つ
の消光剤について観察された結果の比較を示す。

【０１４４】

【表１０】 第ＩＩＩ表 実施例７ ローダミン複合体 λ励起、ｎｍ ５２０ ５２０ λ発光（ａｂｓ）、ｎｍ ５５０ ５５０ 消光剤/蛋白質（モル比） 〜１.５ 〜７ Ｍａｘ.消光 ｗ／１：５抗体希釈物、％ ６５−７０ ９４ 消光剤によるバツクグラウンド信号、 けい光剤信号の％ ６−１０ ６０−９０ （上記のけい光剤化合物は、フルオレセイン誘導体の製
造のために前に記載した方法で、４−メチルレゾルシノ
ール及び２,５,６−トリクロロ−１,３,４−フエニルト
リカルボン酸無水物から製造した。） 行われた次の評価はハプテン、モルフインに対するもの
であつた。６−カルボキシフルオレセインＮＨＳエステ
ルはＯ³−（２′−アミノエチル）モルフインに複合さ
れ、実施例３の化合物は抗モルフインに、実施例６に記
載のように染料／抗体比を変えて複合された。

【０１４５】モルフイン複合体からのけい光信号を抗モ
ルフイン複合体の濃度に対してプロツトした。この評価
混合物は８.７５ｎｇ／２.５５ｍｌのけい光剤−モルフ
イン複合体を含有した。抗モルフイン複合体を、０〜１
２５μｇの量で変化させ、消光剤対抗モルフインの比を
変えて加えた。評価混合物に対して緩衝液０.０１ＭＰ
Ｏ₄ ^3- ０.１５Ｍ ＮａＣｌ及び２％ＰＥＧ６０００を使
用した。このフルオレセインは５０μｇ／２.５５ｍｌ
の（蛋白質をベースとした）抗モルフイン−消光剤複合
体の濃度でパーキン−エルマー１０００（Perkin-Elmer
１０００）で測定した。

【０１４６】

【表１１】 Ｄ／Ｐ比¹ けい光信号² １ ７１５ ３.４ ４００ ７.８ １１０ １０ ８０¹ Ｄ／Ｐ−消光剤／蛋白質モル比。

【０１４７】² 抗モルフイン−消光剤複合体が存在し
ない場合の１０００に基づく信号。

【０１４８】評価混合物にモルフインを加えることによ
り、けい光が強められたが、このことは消光効果の特異
性を示している。

【０１４９】消光剤として一般に使用されているローダ
ミンと比較して、本消光剤は、消光剤として使用される
ローダミン及び同等の染料の欠点の多くを有しない。ロ
ーダミンは、蛋白質と複合させた場合、２個の吸収極大
を有し、この２個の極大の比はラベリングの程度ととも
に変わる。効果的な消光のためには、高いローダミン／
抗体比が要求され、これは不溶化をひきおこす。このこ
とは望ましからざる可溶化剤、たとえばコール酸又はグ
リセリンの添加を必要とする。

【０１５０】上記の結果から、本発明に従がう複合体を
用いてローダミンよりもはるかにかるいラベリングで、
高い効率の消光が達成されることは明らかである。さら
に、バツクグラウンドへの寄与はローダミンについて観
察されるそれよりもはるかに小さい。従つて、高い消光
度及び消光剤により放出される光からの最小量の干渉で
もつて効率的な評価を行なうことができる。

【０１５１】この消光剤複合体は、フルオレセインに対
する消光剤として従来教示され普通使用されているロー
ダミンと比較して、効率よく複合され評価媒体中に完全
に溶解するという点で、更に利点を有する。さらに、け
い光剤の放出及び消光剤の吸収の間の優れた重なりのた
めに、高効率の転移が達成される。同時に、この化合物
は容易に合成され、蛋白質及びその他のリガンドに簡単
に複合する。最後に、使用するラベリングの水準におい
ては沈殿は観察されず、ローダミンについて観察される
この問題は排除される。

【０１５２】上記の結果から、本発明の組成物、親のフ
ルオレセイン誘導体消光剤及び蛋白質とのそれらの複合
体の両方は、評価における使用に対してきわめて有利で
あることは明らかである。該化合物は水溶性であり、容
易に蛋白質と複合させることができる。蛋白質、例えば
抗体と複合させた場合、それらはけい光剤の消光が必要
である免疫評価における有用な試薬を提供する。本発明
の消光剤はけい光剤の高度に効率的な消光を提供し、一
方、評価媒体から観察される光の量にはほんのわずかの
又は無視しうる寄与をするだけである。

【０１５３】本発明のけい光化合物はより長波長で吸収
するので、評価試料、例えば血清中でであう天然に存在
するけい光物質に対し、たとえあたえるとしても、ほん
の少しの励起作用をあたえるにすぎない光で励起するこ
とができる。該化合物は水溶性であり、蛋白質と複合さ
せた場合、関心のある分光的性質における重要な変化を
受けない。更に、該化合物は、大きなストークスシフト
（Stokes shifts）、鋭い吸収及び放出ピーク及び良好
な化学的及び熱的安定性を有する。

【０１５４】前記の発明は明瞭な理解の目的で例示及び
実施例によりかなり詳細に記載されているけれども、特
許請求の範囲内である程度の変化及び修正を行つてもよ
いことは明らかであろう。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式、 【化１】 で表わされる化合物とポリ（アミノ酸）の複合体。
2. 【請求項２】 式 【化２】 式中、 Ｗはポリ（アミノ酸）であり、ｎはＩ〜Ｗの分子量を５
   ００で除した数である、 で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の複合体。
3. 【請求項３】 式 【化３】 式中、 Ｗはポリ（アミノ酸）であり、ｎはＩ〜Ｗの分子量を５
   ００で除した数である、 で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の複合体。
4. 【請求項４】 【化４】 式中、 Ｗはポリ（アミノ酸）であり、ｎはＩ〜Ｗの分子量を５
   ００で除した数である、 で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の複合体。
5. 【請求項５】 【化５】 式中、 Ｗはポリ（アミノ酸）であり、ｎはＩ〜Ｗの分子量を５
   ００で除した数である、 で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の複合体。
6. 【請求項６】 化合物が下記式 【化６】 で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の複合体。
7. 【請求項７】 【化７】 式中、 Ｗはポリ（アミノ酸）であり、ｎはＩ〜Ｗの分子量を５
   ００で除した数である、 で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の複合体。
8. 【請求項８】 該ポリ（アミノ酸）が抗原である特許請
   求の範囲第２、３、４、５及び７項のいずれかに記載の
   複合体。
9. 【請求項９】 該ポリ（アミノ酸）が抗体である特許請
   求の範囲第２、３、４、５及び７項のいずれかに記載の
   複合体。
10. 【請求項１０】 Ｗが少くとも１０，０００の分子量の
    巨大分子支持体に結合したリガンドである特許請求の範
    囲第１項記載の複合体。