JPH05317085A

JPH05317085A - 免疫学的検出方法

Info

Publication number: JPH05317085A
Application number: JP4353662A
Authority: JP
Inventors: Jean-Marc Schlaeppi; シュラエッピジーン−マルク; Dietmar Hueglin; ヒュークリンディートマール
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1991-12-12
Filing date: 1992-12-14
Publication date: 1993-12-03
Also published as: DK0549525T3; EP0549525A3; NZ245428A; BR9204982A; US5516938A; DE59208724D1; EP0549525B1; GR3024441T3; AU664219B2; HU9203946D0; ATE155797T1; ZA929621B; EP0549525A2; HUT65371A; ES2106163T3; US5756683A; CA2085089A1; AU3008692A; MX9207176A

Abstract

(57)【要約】【目的】土壌、水や空気の試料中または生体材料の抽出
物中のスルホニル尿素除草剤の検出を迅速で信頼性の高
い免疫学的手法で行う。【構成】下記式Ａのスルホニル尿素除草剤に対する高度
の特異性および親和性を有し、該除草剤の構造的類似体
とは交差反応性を実質的に示さないモノクローナル抗体
およびその製法、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞
系（例えばＥＣＡＣＣ９１１２０６１９）、該抗体を用
いるスルホニル尿素除草剤の免疫学的検出方法、該方法
にそのまま使用できる試験キット。【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、スルホニル尿素の群からの除草
剤、特に次式Ａ：

【化１１】（式中、Ｘは１ないし３個の窒素原子を有し、そして炭
素原子を介して結合される一置換または二置換６員複素
環式基を表すが、しかし好ましくは一置換または二置換
ｓ−トリアジン基またはピリミジン基を表し、そしてｎ
は０ないし４の整数、好ましくは１の数を表す）で表さ
れるスルホニル尿素除草剤に対して高度の選択性および
親和性により区別され、そしてそれ故に土壌、水もしく
は気体試料中または植物抽出物中に前記スルホニル尿素
除草剤の迅速で有効な検出のためのイムノアッセイに使
用するのに極めて適当であるモノクローナル抗体および
該モノクローナル抗体の製造方法に関する。

【０００２】本発明は特に次式Ｉ：

【化１２】〔式中、Ｒ¹およびＲ²は互いに独立して水素原子、ハ
ロゲン原子、炭素原子数１ないし４のアルキル基、炭素
原子数１ないし４のハロアルキル基、炭素原子数２ない
し４のハロアルコキシ基、炭素原子数１ない４のアルキ
ルチオ基、炭素原子数１ないし４のハロアルキルチオ
基、炭素原子数２ないし４のアルコキシアルキル基、メ
トキシ基、エトキシ基または次式：−ＮＲ³Ｒ⁴（式
中、Ｒ³およびＲ⁴は互いに独立して水素原子または炭
素原子数１ないし４のアルキル基を表す）で表される基
を表し、Ｅは窒素原子またはメチン橋を表し、そしてｎ
は０ないし４、好ましくは１の整数を表す〕で表される
化合物に対して高度の選択性および親和性により区別さ
れるモノクローナル抗体に関する。

【０００３】上記定義中、アルキル基は直鎖または分岐
アルキル基、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル
基、イソプロピル基および４種の異性体ブチル基を意味
するものと理解されるべきである。メチル基およびエチ
ル基が好ましい。アルコキシ基はメトキシ基、エトキシ
基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基および４種の
異性体ブトキシ基、特にメトキシ基、エトキシ基および
イソプロポキシ基を意味するものと理解されるべきであ
る。アルキルチオ基の例はメチルチオ基、エチルチオ
基、ｎ−プロピルチオ基、イソプロピルチオ基およびｎ
−ブチルチオ基、特にメチルチオ基およびエチルチオ基
である。ハロゲン原子は、それ自身であるか、ハロアル
キル基、ハロアルコキシ基またはハロアルキルチオ基の
一部であるかにかかわらず、フッ素原子、塩素原子およ
び臭素原子、好ましくはフッ素原子および塩素原子を意
味するものと理解されるべきである。ハロアルキル基の
例はクロロメチル基、フルオロメチル基、ジフルオロメ
チル基、トリフルオロメチル基、２−クロロエチル基、
２，２，２−トリフルオロエチル基、１，１，２，２−
テトラフルオロエチル基、ペンタフルオロエチル基、
１，１，２−トリフルオロ−２−クロロエチル基、２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジクロロエチル基、ペ
ンタクロロエチル基、３，３，３−トリフルオロプロピ
ル基、２，３−ジクロロプロピル基、１，１，２，３，
３，３−ヘキサフルオロプロピル基、特にフルオロメチ
ル基、クロロメチル基、ジフルオロメチル基およびトリ
フルオロメチル基である。

【０００４】次式ＩＩ：

【化１３】で表される化合物に対して高度の選択性および親和性に
より区別され、そしてそれ故に土壌、水もしくは気体試
料中または植物抽出物中に式ＩＩで表される化合物の迅
速で有効な検出のためのイムノアッセイに使用するのに
極めて適当であるモノクローナル抗体および該モノクロ
ーナル抗体の製造方法が特に好ましい。

【０００５】本発明はさらに、前記モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞系、および該モノクロー
ナル抗体を用いて、土壌、水もしくは気体試料中および
生物学的材料、例えば植物抽出物中に式Ａで表されるス
ルホニル尿素除草剤を検出するための免疫学的方法、お
よびそれらの検出方法に使用され得る試験キットに関す
る。

【０００６】スルホニル尿素は植物保護、特に穀物栽培
における広葉雑草の選択的で効果的な防除のために使用
される新しい部類の特に有効な除草剤である。この部類
の代表は上記式ＩＩで表される化合物、Ｎ−〔２−
（３，３，３−トリフルオロプロピル）フェニルスルホ
ニル〕−Ｎ’−（４−メトキシ−６−メチル−１，３，
５−トリアジン−２−イル）尿素であり、これは特にト
ウモロコシ栽培における広葉雑草、例えばアマランツス
・レトロフレクスまたはケノポディウム・アルブムの選
択的防除のために使用される。土壌および水の試料にお
けるスルホニル尿素の群からの除草剤の検出は主として
ガスまたは液体クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）
〔ＧＣ：１；ＨＰＬＣ：２１；８；１９，以下〔〕内
の数字は本明細書末尾にまとめて示す表１の参考文献の
番号と一致する〕およびバイオアッセイにより現在行わ
れている。いくつかの場合において、土壌中のこれらの
除草剤のごく少量の残留は高度の残留活性を依然として
示し、スルホニル尿素に対して感受性である後に生じる
作物に特に有害であるから、残留分析のための信頼性が
高く、非常に感度の高い検出方法を利用可能にすること
は非常に重要である。合成除草剤を検出するための上記
方法のほとんどは残留分析に必要な感度をもつけれど
も、それらの使用は一般に非常に多くの欠点を有する。
例えば、土壌試料中のスルホニル尿素除草剤をガスクロ
マトグラフィーまたはＨＰＬＣにより検出するために、
実際にクロマトグラフィー分析する前に骨の折れる精製
および濃縮段階が行われなければならない。それ故に、
これらの方法はかなりの量の装置が必要であるので、野
外条件下で行うことができない。これらの方法のその他
の欠点は、例えば、特定元素の検出器がガスクロマトグ
ラフィーにおいて使用され、一方比較的非特異的である
光度検出器がＨＰＬＣにおいて使用されることであると
みなされてもよい。質量スペクトル検出を除いて、クロ
マトグラフィー分析の基本は特定物質の保持時間の決定
である。しかしながら、これらの値は相対的であり、そ
れ故に構造に特異的ではない。同様に、上記したバイオ
アッセイ法はさほど苦労せずに行われ得るが、十分に特
異的でない。確立された分析法の上記欠点を解消するた
め、広範囲の抗原を検出するための臨床的な治療に既に
日常使用されているもののように、農業領域、特に土
壌、水または空気の試料中の農薬の定量および定性分析
のための免疫学的方法を開発することが最近の試みられ
てきた。例えば、ある種の除草剤例えば２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸〔６〕またはクロロスルフロン〔１
０〕ならびに種々の殺虫剤例えばジフルベンズロン〔２
０〕、メタラキシル〔１４〕、アラクロル〔５〕または
パラチオン〔４〕の検出のための免疫学的方法の開発が
既に進行中である。このようにスルホニル尿素の群から
の除草剤の免疫学的検出のための方法は既に記載されて
いるが〔１０〕、しかしそれらは上記した方法と同様
に、相当する抗原で予め免疫感作された動物から得られ
たポリクローナル抗血清の使用に基づいている。そし
て、標的物質に対して十分に高度な親和性を有し、それ
故に公知イムノアッセイの一つにおいて本発明に係る使
用に適しているスルホニル尿素除草剤に対するモノクロ
ーナル抗体の調製は今まで成功していない。ポリクロー
ナル抗血清は非常に不均一な組成物であり、すなわちそ
れらは特定の抗原の異なるエピトープと反応する極めて
多くの異種抗体を含有する。実験動物が特定の抗原で免
疫感作されるとき、種々の抗体産生細胞クローンを同時
に刺激し、そのクローンの各々が抗原分子上の異なるエ
ピトープを認識し、その結果、異なる抗体が刺激された
細胞クローンにより産生されるから、ポリクローナル抗
血清の不均一な組成物が生じる。これが、免疫感作され
た動物からの血清が常にポリクローナルであり、それ故
にそれらの特異性および免疫グロブリンの個々のクラス
の構成に関して不均一である理由である。従って、ポリ
クローナル抗血清の組成物における不均一性は、不十分
な親和性のためにそれらの検出感度が標的物質の選択的
検出に不適当であるとか、またはこれらのポリクローナ
ル抗体がイムノアッセイにおいて使用される場合に、構
造的に極めて近似の化合物、例えば標的物質〔式ＩＩで
表される化合物〕とその水酸化物を十分に識別できない
という状態を導く。ポリクローナル抗血清のこれらの欠
点を克服するために、農業領域でもモノクローナル抗体
の開発に多くの努力がはらわれている。そして、酵素結
合イムノアッセイにおけるアトラジンおよびヒドロキシ
アトラジンに対するモノクローナル抗体の調製および使
用が報告されている〔１６〕。

【０００７】本発明の範囲内で解決しようとする課題
は、例えば土壌、水および空気の試料中の式Ａで表され
るスルホニル尿素除草剤、特に式Ｉで表されるスルホニ
ル尿素除草剤、とりわけ次式ＩＩ：

【化１４】で表される化合物の迅速で信頼できる検出のための、操
作が容易で、効率的で、そして選択性の高いイムノアッ
セイを提供することである。上記課題は、それ自体公知
のハイブリドーマ／モノクローナル抗体技術を使用し
て、式Ａで表されるスルホニル尿素除草剤に対する、特
に式ＩＩで表される化合物に対する高度の特異性および
親和性を有するモノクローナル抗体を提供することによ
り、本発明の範囲内で驚くべきことに今解決された。

【０００８】非常に特定された抗原に対する抗体の供給
源としてのハイブリッド体細胞系（ハイブリドーマ）の
使用はケーラーおよびミルシュタインの研究〔１１〕に
由来する。これに記載された方法により得ることができ
る抗体は、通常の免疫感作動物の抗血清から得られたも
のとは全く異なる。ハイブリドーマ／モノクローナル抗
体技術の原理は、２種の体細胞の融合から生じるハイブ
リッド細胞が両方の親タイプの特徴を有するという観察
に基づいている。モノクローナル抗体産生の場合には、
特定の抗体を合成する能力は、予め免疫感作された供与
動物から採取された免疫適格Ｂ細胞（通常脾臓細胞）に
由来し、一方、細胞が培養液中で連続的に分裂する能力
は他方の融合相手である腫瘍細胞系（しばしばミエロー
マ）により付与される。一般に、供与動物は標的分子と
それらに連結された高分子量担体分子とからなる複合体
を用いて免疫感作される。これらのハイブリッド細胞系
の各々は、抗原に応答して動物により生体内で合成され
得る非常に多くの可能な抗体の単一の代表種だけを提示
する均一な免疫グロブリンを合成する。各々の免疫グロ
ブリン産生クローンは単一型の抗体を特徴とするから、
「モノクローナル抗体」という表現が採用された。モノ
クローナル抗体のポリクローナル抗体に対する利点を以
下に示す：ａ）モノクローナル抗体は数多く、そして高純度で得ら
れる、ｂ）モノクローナル抗体の調製は抗原反応性に関して均
一であり、経時的に変化しない、ｃ）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはそ
れらの特異性、すなわちそれによる特定のモノクローナ
ル抗体の産生能を失うことなく数年および数十年間貯蔵
できる、ｄ）ポリクローナル抗血清は例えば以下の点： α）抗血清を得るための免疫感作動物からの血液採取 β）追加の免疫感作のための材料の一定の入手可能性 γ）供与動物の限定された寿命に関する広範囲の変動により悪影響を受けるから、モノ
クローナル抗体は標準試薬として使用するのにポリクロ
ーナル抗血清に比べより適当である。非常に多くの抗原
に対して今調製されたモノクローナル抗体は主として医
学的治療において十分に確立され、そしてもはやそれな
しで済ますことはできない。

【０００９】本発明の範囲内で、それ自体公知でありそ
して簡単に上記したハイブリドーマ／モノクローナル抗
体技術を用いて、式Ａで表されるスルホニル尿素除草
剤、特に式ＩＩで表される化合物に対する高度の特異性
および親和性を有し、公知のイムノアッセイの一つにお
いて本発明に係る使用のための標的物質に対する高度の
親和性により適当であるモノクローナル抗体の製造を可
能にする方法が初めて今可能になった。詳しくは、式Ａ
で表されるスルホニル除草剤に対するモノクローナル抗
体の製造において、操作は以下のように行われる：免疫
感作に意図される免疫原の調製において分子のスルホン
アミド部分を特に含む断片が使用され、そしてこの断片
は慣用の高分子量担体分子の一つに連結されている。免
疫応答が供与動物中に誘発された後、抗体産生に関連す
る細胞が供与動物から単離され、そしてハイブリドーマ
細胞を製造するために、以下に詳細に記載する方法で、
適当なミエローマ細胞と融合される。

【００１０】従って、本発明は、（ａ）標的分子のスル
ホンアミド部分から実質的になる連結性成分が適当な高
分子量担体分子と複合され、（ｂ）供与動物が（ａ）に
従って製造された複合体で免疫感作され、（ｃ）免疫適
格Ｂ細胞が免疫感作された供与動物から単離され、
（ｄ）該免疫適格Ｂ細胞が連続的に細胞分裂し得る腫瘍
細胞と融合され、（ｅ）生成する融合物が単離され、そ
して選択の後、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細
胞がクローン化され、そして（ｆ）該ハイブリドーマ細
胞が試験管内または生体内で培養されてモノクローナル
抗体を製造する、ことからなる１種またはそれ以上の式
Ａで表されるスルホニル尿素除草剤に対して高度の特異
性および親和性を有するモノクローナル抗体の製造方法
に関する。上記の操作は式Ｉで表される化合物に対する
モノクローナル抗体の製造、特に式ＩＩで表される化合
物に対するモノクローナル抗体の製造にも使用され得
る。また、この場合には、全体の分子が免疫原として作
用することも可能であり、それはスペーサー分子を介し
て慣用の高分子量担体分子の一つに連結されている。

【００１１】本発明はまた、本発明に係る方法から得ら
れるモノクローナル抗体に関する。式Ａで表されるスル
ホニル尿素除草剤、特に式Ｉで表されるスルホニル尿素
除草剤、とりわけ式ＩＩで表される化合物に対して高度
の特異性および親和性を有するモノクローナル抗体が好
ましく、それらは非常に多くの構造的に関連する化合物
との低い交差反応性により、上記スルホニル尿素除草剤
の迅速で信頼できる検出のためのイムノアッセイにおけ
る使用に特に適しており、そしてそれ故に標的物質を構
造的に関連する化合物、例えばその水酸化物や不活性代
謝物と識別するために使用され得る。それ故に、本発明
の範囲内で、式ＩＩで表される化合物に対して高度の特
異性および親和性を有し、そして非常に多くの構造的に
関連する化合物、例えばトリアスルフロン、プリミスル
フロンおよびキノスルフロン、および第２表中の化合物
Ａと交差反応性を実質的に示さないモノクローナル抗体
およびその誘導体が特に好ましい。同様に、式ＩＩで表
される化合物に対して高度の特異性および親和性を有
し、そして非常に多くの構造的に関連する化合物、例え
ばトリアスルフロン、プリミスルフロンおよびキノスル
フロン、および第２表中の化合物Ａとは１．０％未満、
特に０．４％未満、とりわけ０．１％未満の交差反応性
を示すモノクローナル抗体が特に好ましい。ＥＣＡＣＣ
９１１２０６１９の特徴を有するハイブリドーマ細胞系
から得られるモノクローナル抗体並びに該モノクローナ
ル抗体の誘導体が特に好ましい。

【００１２】本発明の範囲内でモノクローナル抗体の誘
導体とは、例えば、式Ａで表されるスルホニル尿素除草
剤の抗原決定基、特に式ＩＩで表される化合物の抗原決
定基に対する高度の特異性および親和性を依然有する抗
体断片、さらに例えば放射性ヨウ素（¹²⁵Ｉ，
¹³¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム
（³Ｈ）等で標識される放射標識モノクローナル抗体、
モノクローナル抗体とビオチンまたはアビジン、酵素例
えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロ
ゲナーゼまたはグルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼとの複合体、モノクローナル抗体と生物発光剤
（例えばルシフェラーゼ）、化学発光剤（例えばアクリ
ジンエステル）または蛍光剤（例えばフィコビリタンパ
ク質）との複合体を意味する。二重特異性の、そしてい
わゆる交差結合抗体も同様に本発明に包含される。ここ
に挙げた抗体の例は本発明を説明するためのものであ
り、これにより本発明の対象をなんら限定しようとする
ものではない。

【００１３】「交差反応性を実質的に示さない」という
用語は本発明の範囲内では式Ａで表されるスルホニル尿
素除草剤、特に式ＩＩで表される化合物に対して特異的
なモノクローナル抗体とその他の化合物、特に構造的に
関連した化合物、例えばその水酸化物の非特異的エピト
ープとの反応性が多くの場合１０％未満、好ましくは
１．５％未満、そして特に０．１％未満であることを意
味することを意図する。交差反応性の百分率（％）は本
発明の範囲内では下の式により規定される：〔５０％阻害のための抗原濃度（Ｉ₅₀）／５０％阻害の
ための抗原類似体の濃度（Ｉ₅₀）〕×１００。Ｉ₅₀値は、例えば競合エリザアッセイ（実施例８参照）
によって決定され得る。この際にＩ₅₀値は担体結合抗原
への抗体の結合の５０％阻害を導く抗原濃度に相当す
る。

【００１４】本発明はさらに、上で詳細に特徴づけられ
たモノクローナル抗体を合成し、そして好ましくは周囲
の培地に分泌するハイブリドーマ細胞系に関する。本発
明は特に、式Ａで表されるスルホニル尿素除草剤、特に
式Ｉで表されるスルホニル尿素除草剤、とりわけ式ＩＩ
で表される化合物に対して高度の特異性および親和性を
有し、そしてその低い交差反応性により、式Ａで表され
るスルホニル尿素除草剤、特に式Ｉで表されるスルホニ
ル尿素除草剤、とりわけ式ＩＩで表される化合物の迅速
で信頼できる検出のためのイムノアッセイにおける使用
に特に適しており、そしてそれ故に標的物質を構造的に
関連する化合物、例えばその水酸化物や不活性代謝物と
識別するために使用され得るモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞系に関する。本発明の範囲内
で、式ＩＩで表される化合物に対して高度の特異性およ
び親和性を有し、そして非常に多くの構造的に関連する
化合物、例えばトリアスルフロン、プリミスルフロンお
よびキノスルフロン、および第２表中の化合物Ａと交差
反応性を実質的に示さないモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞系が特に好ましい。同様に、式Ｉ
Ｉで表される化合物に対して高度の特異性および親和性
を有し、そして非常に多くの構造的に関連する化合物、
例えばトリアスルフロン、プリミスルフロンおよびキノ
スルフロン、および第２表中の化合物Ａとは１．０％未
満、特に０．４％未満、とりわけ０．１％未満の交差反
応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系が特に好ましい。本発明に係るモノクローナル
抗体を産生し、そしてＥＣＡＣＣ９１１２０６１９の特
徴を有するハイブリドーマ細胞系、ならびにそのクロー
ンおよびサブクローンがとりわけ好ましい。

【００１５】本発明はまた、自然に生じるか、または公
知方法を用いて人工的に製造され得、そして出発物質の
特徴を依然として有する、すなわち本発明に係る抗体ま
たはその誘導体を依然として産生し得、そして好ましく
は周囲の培地にそれらを分泌する、上に詳細に記載した
ハイブリドーマ細胞系の突然変異体および変種に関す
る。本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞系の製造方法
および該モノクローナル抗体の製造方法に関する。ハイ
ブリドーマ細胞系のクローンおよびサブクローンは、出
発クローンから反復クローニングにより製造され、そし
て該出発クローンの本発明に必須の特性を依然有するハ
イブリドーマであると理解されるべきである。

【００１６】本発明は、本発明に係るモノクローナル抗
体を用いて、例えば土壌、水または空気の試料中および
生物学的材料例えば植物または動物抽出物中の式Ａで表
されるスルホニル尿素除草剤、特に式Ｉで表されるスル
ホニル尿素除草剤、とりわけ式ＩＩで表される化合物の
免疫学的検出方法にも関する。

【００１７】本発明はまた、試薬として本発明に係るモ
ノクローナル抗体を少なくとも１種含有し、そして式Ａ
で表されるスルホニル尿素除草剤、特に式Ｉで表される
スルホニル尿素除草剤、とりわけ式ＩＩで表される化合
物の迅速で信頼できる検出のために野外条件下での使用
に適している、使用のために調整されている試験キット
の形態にある上記スルホニル尿素除草剤の定性および定
量分析のための手段を包含する。

【００１８】本発明に係るモノクローナル抗体はそれ自
体公知の方法により調製され、ケーラーおよびミルシュ
タインにより開発された方法〔１１〕に本質的に基づい
ている。分析されるべき、そしてそれに対する抗体が開
発されるべきである標的物質（式Ａで表されるスルホニ
ル尿素除草剤）例えば式ＩＩで表される化合物は、それ
を実験動物に投与した後に適当な免疫応答を誘発するこ
とができないような比較的小さくそして単純な分子であ
るから、実際の免疫感作の前に予備手段を施すことが最
初に必要である。この種の化合物は、それらの大きさと
単純な構造のために免疫反応を誘導できず、ハプテンま
たは不完全抗原と呼ばれ、それ故に抗原として作用しそ
して免疫応答を誘導し得る完全抗原（＝免疫原）と区別
される。この種のハプテン分子は高分子量化合物（担体
分子）に複合され得、その結果、それらは自身の特性に
関して完全抗原に匹敵するものとなる、すなわちハプテ
ン分子はその時免疫応答を誘発し得る。免疫感作反応の
間に形成される抗体のいくつかは、ハプテン分子がそれ
自体の上にあるか、または担体分子に結合されたままで
あるかにかかわらず、次にハプテン分子上の特定のエピ
トープと反応し得る。従って、本発明の範囲内で、実験
動物が免疫感作される前に、ハプテンとして作用する標
的物質は、ハプテンとして作用する該標的物質に完全抗
原の活性を付与するのに適当である高分子量担体に結合
される。本発明の範囲内で適当な担体分子は主として、
ハプテンとの連結反応に自由に利用され得る反応基を有
し、そして該ハプテンに連結されることによりそれに免
疫原性を付与し得るか、または既に存在するそれらの免
疫原性を高め得る巨大分子化合物であると理解されるべ
きである。自由に利用可能な反応性アミノ基を含む巨大
分子化合物が本発明の範囲内で特に好ましい。分子量が
１００００と１５０００００の間のリシンに富むタンパ
ク質、例えば市販のものが入手され得、それ故にあらゆ
る所望量で利用できるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：分
子量６６２００）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：分子
量５８０００）、またはキーホールカサガイヘモシアニ
ン（ＫＬＨ：分子量＞１００００００）が本発明に係る
使用に適した担体分子として特に好ましい。その他の巨
大分子化合物が上記の要求に合致しさえすれば、それら
を担体分子として使用することは本発明の範囲内でもち
ろん可能であり、そのような化合物には例えばブタチロ
グロブリン、Ｂ２ミクログロブリン、ヘモシアニン、免
疫グロブリン、毒素（コレラ毒素、破傷風毒素、ジフテ
リア毒素その他）、多糖、リポ多糖、天然または合成ポ
リアデニル酸およびポリウリジル酸、ポリアラニルおよ
びポリリシンポリペプチド、または細胞膜成分例えばホ
ルマリンまたはグルタルアルデヒド処理赤血球細胞膜が
ある。例えば、文献

〔９〕に記載された方法に従ってウ
サギからのマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する精製または
ＩｇＧ画分も同様に本発明に係る方法において担体分子
として使用するのに適当である。担体分子に対するハプ
テンの複合は直接、または好ましくは適当である場合に
ハプテン分子に最初に付加される橋員（スペーサー断
片）を介して行われ得る。

【００１９】分析すべき物質の担体分子への連結は、標
的物質の関連構造成分が自由に利用可能のままであり、
そしてそれ故に特異的な免疫応答を誘発し得る、すなわ
ち特異的な抗体の形成を誘導するような方法で行われな
ければならない。従って、スルホニル尿素誘導体、特に
式ＩＩで表される誘導体の製造において、それらの構造
成分が保持されるように留意されなければならない。こ
れは、例えば、式Ａで表されるスルホニル尿素除草剤、
特に式ＩＩで表される化合物を上記担体分子の一つに上
記関連構造要素を損傷することなく連結するような方法
で誘導体化することにより行われ得る。誘導化の範囲内
では、全体のそのままのスルホニル尿素分子の代わりに
分子の選択された断片の使用が特に好ましい。そのよう
にして、式Ａで表されるスルホニル尿素除草剤、特に式
ＩＩで表される化合物に対して高度の特異性および親和
性を有するモノクローナル抗体はスルホンアミド部分、
尿素橋および複素環式部分からなる複雑な全体の分子で
はなく、スルホンアミド部分を連結性成分として排他的
に用い、そのスルホンアミド部分を上記したように適当
な担体分子に連結して製造され得る。それは、前記分子
の断片が非常に複雑な全体の分子に比べより取扱いが容
易であるから、技術的な面から大きな利点である。本発
明の範囲内で示されたように、１種の慣用の高分子量担
体と式Ａで表されるスルホニル尿素除草剤のスルホンア
ミド部分とからなる上記複合体での供与動物の免疫感作
は驚くべきことに高度に特異的な抗体の産生を生ずる。

【００２０】本発明の重要な面は、従って、供与動物の
免疫感作に使用され得、そして式Ａで表されるスルホニ
ル尿素除草剤、特に式Ｉで表されるスルホニル尿素除草
剤、とりわけ式ＩＩで表される化合物に対して高度の親
和性を有するモノクローナル抗体の産生を最終的に導く
複合体製造用の前記除草剤のスルホンアミド部分の使用
である。前記スルホンアミド部分は好ましくは置換アリ
ールスルホニルであり、そのアリール基は好ましくはフ
ェニル基である。式Ａの範囲内のスルホニル尿素除草剤
の典型的な例は、例えばＥＰ０１２０８１４に記載され
ている。それ故に本発明の好ましい実施態様において、
それは、担体分子に連結される全体のスルホニル尿素分
子でなく、非常に特異的な免疫応答を誘発し得る形態に
ある特に望ましい決定基を含む上記分子の選択された部
分である。スルホンアミド部分に限定されたままである
式ＩＩで表される化合物の断片が本発明の範囲内で特に
好ましい。上記スルホンアミド部分は、例えば、相当す
るスルホニル尿素除草剤をそれ自体公知の方法によりス
ルホンアミド官能部分で加水分解的に切断することによ
り得られる。従って、そのようにして得られるスルホン
アミド連結性断片は−ＳＯ₂ＮＨ₂末端基を有し、次い
で該末端基には、ハプテン分子の引き続く複合に使用さ
れ得る適当なスペーサー断片を連結することが極めて容
易である。スペーサー断片の連結は、例えば、上記−Ｓ
Ｏ₂ＮＨ₂基を反応性カルボン酸誘導体例えばコハク酸
誘導体、または好ましくは相当する無水物と反応させる
ことにより達成され得る。コハク酸誘導体が使用される
場合、基−ＳＯ₂ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯ
Ｈが形成される。反応は好ましくは塩基性媒体中、特に
適当な触媒、例えば実施例１．１で使用される１，８−
ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデセ−７−エンの存
在下で行われる。本発明に係る分子の断片は公知出発化
合物および化学合成による反応体から製造され得ること
はもちろんである。カルボキシ末端基はまた、文献に頻
繁に記載されている公知方法を用いて、ハプテン分子を
連結するには十分な反応性を同様に有するアミノ基（Ｎ
Ｈ₂）またはＳＨ基に変換され得る。それ故に特に、ハ
プテンの担体分子への複合のための適当な橋員は担体分
子の自由に利用可能な反応基と相互作用し得る少なくと
も１種またはそれ以上の反応基を含む化合物である。２
個と１０個の間の架橋性炭素原子を含み、そして反応基
として１個またはそれ以上の反応基例えばアミノ基、カ
ルボキシル基またはＳＨ基を有するスペーサー断片を使
用することが本発明の範囲内で特に好ましい。これらの
反応基はそれ自体公知の方法を用いてハプテン分子およ
び担体分子の反応基と反応してハプテン−担体複合体を
形成し得る。例えば、スペーサー断片を反応性アミノ基
を介してジアルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）に
より担体分子の遊離アミノ基の一つに結合することも可
能である。スペーサー断片が反応性ＳＨ基を有する場
合、ハプテンの担体分子への複合は担体上の遊離ＳＨ基
を含めた酸化により行われ得る。担体分子の遊離アミノ
基に水結合性剤、例えばカルボジイミド、好ましくは
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドによって連
結され得るカルボキシル基を有するスペーサー断片を使
用することが本発明の範囲内で特に好ましい。抗原を担
体タンパク質に連結するために、その連結を起こし得る
誘導体を製造することがまず有利である。

【００２１】本発明の好ましい実施態様において、供与
動物の免疫感作の後に特異的免疫応答および最終的に式
Ａで表されるスルホニル尿素除草剤に対して高度の親和
性を有するモノクローナル抗体の産生を導く複合体の製
造のために、上記スルホニル尿素除草剤のスルホンアミ
ド部分から実質的になる断片が使用される。該断片が誘
導化された後、式Ａで表されるスルホニル尿素除草剤に
対して高度の親和性を有するモノクローナル抗体の産生
に極めて適したほぼ理想的な連結性成分が得られる。

【００２２】次式ＩＩＩ：

【化１５】（式中、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ₂またはＳＨ、特にＣＯＯ
Ｈを表し、ｎ’は１ないし１０の整数、好ましくは１な
い６を表し、そしてｎは０ないし４の整数、好ましくは
１を表す）で表される、トリアジンアミン基をＲ’−
（ＣＨ₂）_{n '}−基で置換することにより形成されたも
のと考えられ得、そしてそれ故にスルホンアミド部分に
制限されるスルホニル尿素誘導体が特に好ましい。本発
明の範囲内では、上記式ＩＩＩ中、ＲがＮＨ₂を表し、
そしてｎ’が２ないし６の整数、特に３を表す連結性成
分が好ましい。また、上記式ＩＩＩ中、ＲがＣＯＯＨを
表し、そしてｎ’が１ないし６の整数、好ましくは２を
表す連結性成分が特に好ましい。本発明の範囲内で次式
ＩＶ：

【化１６】で表される、トリアジンアミン基を−（ＣＨ₂）（ＣＨ
₂）ＣＯＯＨ基で置換することにより形成されたものと
考えられ得、そして実施例１．１に記載の方法に従って
製造され得る誘導体が特に好ましい。上記方法に使用さ
れ得る出発物質および反応体は公知であるか、または公
知の構造的に類似した化合物と同様に製造され得る。ま
た、式Ｉで表されるスルホニル尿素除草剤に対するモノ
クローナル抗体の製造のために、全体のそのままのスル
ホニル尿素分子を誘導化することにより製造され得る下
記式Ｖで表される誘導体を使用することも可能である。

【化１７】（式中、Ｒ¹、ｎおよびＥは式Ｉで定義されたものと同
じ意味を表し、Ｙは０ないし４個の炭素原子を有するア
ルキレン橋を表すが、それはＣ₂位以降で酸素原子によ
り中断されていてもよく、そして非置換であるか、また
はハロゲン原子または炭素原子数１ないし３のアルキル
基により一置換または多置換されており、そして直接ま
たは硫黄原子または酸素原子を介して複素環炭素原子に
結合しており、Ｒ’はｍが１ないし１０、好ましくは１
ないし６の整数を表すときＣＯＯＨを表し、そしてＲ’
はｍが２ないし１０、好ましくは２ないし６の整数を表
すときＣＯＯＨ、ＮＨ₂またはＳＨ、特にＮＨ₂を表
す）次式ＶＩ：

【化１８】（式中、Ｒ’’はｍが１ないし１０、好ましくは１ない
し６の整数を表すときＣＯＯＨを表し、Ｒ’’はｍが２
ないし１０、好ましくは２ないし６の整数を表すときＣ
ＯＯＨ、ＮＨ₂またはＳＨ、特にＮＨ₂を表す）で表さ
れるトリアジン環の４位にＲ’’−（ＣＨ₂）_m−Ｏ−
基を有する誘導体が好ましい。連結し得る生成スルホニ
ル尿素誘導体は新規であり、そしてそれらの特異的連結
能力のために、本発明に係るモノクローナル抗体製造に
おける重要な出発材料である。それ故に、それらは本発
明の重要な一部を構成する。

【００２３】スルホニル尿素誘導体に応じて、実際の連
結反応は活性エステル法またはジアゾニウム法〔１０〕
を用いて行われるのが好ましい。活性エステル法が使用
される場合、スルホニル尿素誘導体は最初に適当な溶媒
中に可溶化される。適当な溶媒は特に、低い蒸発率を有
する非プロトン性溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）である。予め可溶化されたスルホニル尿素誘導体を
例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ
スルホスクシンイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドもしくはＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾ
ールまたはこれら化合物の誘導体と反応させることによ
り、カルボキシル基が次に誘導されて活性エステルを形
成する。活性エステルを次に反応混合物から取り出し、
そしてＢＳＡまたはＫＬＨに添加する。０．１ないし１
２時間、好ましくは３ないし５時間保温した後、沈殿を
除去する。上澄みは次いで、必要ならばさらに精製段階
を挿入した後、実際の免疫感作反応に使用され得る。本
発明の範囲内で好ましい活性エステル法の他に、ハプテ
ンの担体分子への連結のためのその他の方法、例えば混
合無水物法を用いることも可能である。この方法におい
てスペーサー断片のカルボキシル基は無水酢酸またはカ
ルボジイミド誘導体１−エチル−３−（３’−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミドを用いて担体分子に連
結される。誘導体の連結が反応性ＮＨ₂基を介して起こ
るならば、文献〔１０〕に記載のジアゾニウム法を用い
ることが好ましい。その方法において、亜硝酸ナトリウ
ムが相当する反応性ＮＨ₂基に、好ましくは低下させた
温度、特に約０℃の温度で、強酸性溶液中で添加され
る。生成するジアゾニウム塩は次に担体分子の緩衝化塩
基性溶液にゆっくり添加される。必要ならば、さらに精
製段階の後、溶液は実際の免疫感作に使用され得る。

【００２４】供与動物の免疫感作は、高分子量の担体分
子に結合されたハプテンの１回またはそれ以上の投与に
より行われる。７ないし３０日、特に１２ないし１６日
間隔で２または３回の投与が特に好ましい。静脈内、腹
膜腔内もしくは皮下に行われ得る注射が本発明の範囲内
での好ましい投与形態である。皮下注射と腹膜腔内注射
との組合せが好ましい。この場合に免疫原（スルホニル
尿素複合体）は適当な緩衝液、例えば慣用のアジュバン
トの１種を含有するＰＢＳ緩衝液中に存在する。フロイ
ントのアジュバントを使用することが本発明の範囲内で
特に好ましい。０．５ないし４ヵ月間処置せずに放置し
た後、１０μｇないし１０００μｇ、特に５０μｇない
し５００μｇの投与量でハプテン複合体のもう１回の投
与〔「ブースター」〕が行われる。最後の投与の１ない
し６日後に供与動物は殺され、脾臓が取り出され、そし
て脾臓細胞懸濁液が調製される。単離された脾臓細胞は
適当な緩衝液（例えばＢＳＳ緩衝液）中に懸濁され、そ
してそれらが適当なミエローマ細胞と融合されるまで細
胞懸濁液の形態で保存される。これらの融合は、ミエロ
ーマ細胞系もまたモノクローナル抗体を合成し、結果と
してハイブリッドは２種のモノクローナル抗体、１つは
ミエローマ細胞に由来し、第２は免疫適格細胞の遺伝情
報により決定される、という事実により最初は複雑だっ
た。

【００２５】従って、本発明の範囲内で好ましく使用さ
れる腫瘍細胞はそれ自体モノクローナル抗体を産生でき
ないもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４〔１７〕、Ｘ６
３−Ａｇ８．６５３またはＰＡＩ〔１８〕であり、これ
らは生成する融合物の分析を極めて単純にする。脾臓細
胞がミエローマ細胞に対して２ないし２０倍過剰に存在
するならば融合の成功のために有利である。脾臓細胞と
ミエローマ細胞との融合は意図される細胞融合に最適で
ある条件を提示する組成を有する特別な融合培地中で行
われる。該融合培地は、細胞を融合するために慣用の融
合促進剤の一つ、例えば適当である場合には紫外線不活
性の形態にあるセンダイウイルスまたはその他のパラミ
クソウイルス、カルシウムイオン、表面活性脂質例えば
リゾレシチン、またはポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）特に平均分子量６００ないし６０００で濃度が３０
％ないし６０％のＰＥＧを含有する緩衝液が好ましい。
約５０％の濃度のＰＥＧ４０００が特に好ましい。最適
融合温度は１８℃と３９℃の間である。３７℃の温度が
特に好ましい。

【００２６】免疫適格脾臓細胞とミエローマ細胞との融
合の後、融合された抗体産生ハイブリッド細胞はそれ自
体公知の方法により選択される。融合が成功したもの
（ハイブリッド細胞）を２種の親細胞から選択するため
の種々の手段が存在する。１００万またはそれ以上の各
親細胞が融合プロトコルにおいて通常使用されている。
融合率が１００％でないから、大過剰の未融合または自
己融合細胞から融合物を分離することは困難な仕事であ
るかもしれない。上記したように、ハイブリドーマ細胞
は短寿命の抗体産生（脾臓）Ｂ細胞と長寿命のミエロー
マ細胞の融合により製造される。所望の結果は抗体を産
生する長寿命の細胞系である。脾臓細胞は培養液中では
限られた寿命を有するから、未融合または自己融合脾臓
細胞が死滅するまでただ待つことは原理的には可能であ
る。しかしながら、この後に、抗体を産生しない長寿命
の細胞から長寿命の抗体産生細胞を分離する仕事が残っ
ている。実行可能な選択系は酵素ヒポキサンチン−グア
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）
が利用可能かまたは利用不可能かに基づいている。この
酵素は哺乳類細胞中のプリン再利用経路の構成要素であ
る。これらの細胞はまたさらにプリンを新たに合成する
ことができる。通常の環境中ではおそらく両方の合成経
路はある範囲まで平行に作用する。しかしながら、細胞
がＨＧＰＲＴを有しない場合、再利用経路はブロックさ
れ、そしてプリンは非プリン物質から製造されなければ
ならない。プリンであるグアニンに非常に類似の構造を
有し、それ故にいくつかの通常の反応においてプリンを
代替する８−アザグアニンのようないわゆるプリン抗代
謝物質が、ＨＧＰＲＴ陰性のミエローマ細胞の選択のた
めに一般に使用される。アザグアニンがＤＮＡ中に取り
込まれると、それは通常の成長反応に関与し、最終的に
細胞の死を導く。アザグアニンは再利用経路を介して置
換されなければならないから、ＨＧＰＲＴ活性を有しな
いそれら全ての細胞はアザグアニンを利用することがで
きず、それ故にその存在下で成長する。同じ酵素に作用
するが、しかし反対の徴候を示す選択系はジェイ．ダブ
リュ．リトルフィールドにより報告されている〔１３〕
が、この場合にはＨＧＰＲＴ陽性細胞が選択される。こ
の選択系は、特にヒポキサンチン、アミノプテリンおよ
びチミジン（ＨＡＴ培地）を構成要素として含有するい
わゆるＨＡＴ培地の使用に基づいている。アミノプテリ
ンは生体内でのプリン合成ならびにデオキシウリジレー
トのチミジレートへのメチル化を阻害する抗代謝物質で
ある。ヒポキサンチンはアミノプテリンが新たなプリン
合成を阻害し、一方でチミジンが不要なデオキシウリジ
レートのメチル化を行う場合における別のプリンとして
作用し得る。従って、アミノプテリンの存在下では全て
のＨＧＰＲＴ陽性細胞が増殖し、一方ＨＧＰＲＴ陰性細
胞が死滅するであろう。本発明の範囲内での選択のため
に使用されるハイブリッド系において、ミエローマ細胞
はアザグアニンに対して耐性であり、アミノプテリンに
対して感受性である、すなわちそれらがＨＧＰＲＴ陰性
であることが好ましい。抗体産生細胞はこれに対してＨ
ＧＰＲＴ陽性である。細胞の融合およびＨＡＴ培地中で
の培養により、増殖に関与するミエローマ細胞がＨＧＰ
ＲＴ活性の存在下でのみ成長し、そしてこの活性はＨＧ
ＰＲＴ陽性細胞系により提供されるはずであるから、成
功裏に融合した細胞を選択することは可能である。ＨＧ
ＰＲＴ陽性抗体産生細胞系がこの培地中で死滅しないこ
とは真実である。しかしながら、それらはある一定の期
間だけ生き残り、そして増殖することができない。ＨＡ
Ｔ培地中での細胞の融合は、ミエローマ細胞と抗体産生
細胞とはハイブリッド細胞の製造に十分である期間成長
することができるが、ハイブリッド細胞だけが生き残
り、そして増殖し得る系を提供する。

【００２７】本発明の特定の実施態様において、融合さ
れたハイブリッド細胞は、未処理の非免疫感作実験動物
の腹膜から予め単離されたマクロファージ、いわゆる食
細胞の存在下で培養される。融合されたハイブリッド細
胞の培養および選択のために、細胞懸濁液は少量ずつい
くつかに分けられ、そして個々の部分がハイブリッド細
胞培養物の開発および抗体の産生のために連続的に調べ
られる。ミクロタイタープレート上で融合ハイブリッド
細胞を培養することが本発明の範囲内で特に好ましい。
これは、ミクロタイタープレートの個々のウエルにわた
り分配され、そして融合ハイブリッド細胞の成長を促進
する適当な条件下（例えばＨＡＴ／ＨＴ培地）で７ない
し３０日の期間培養される融合の後に得られる細胞懸濁
液を必要とする。成長したハイブリッド培養物の上澄み
は抗体の産生を連続的に調べる。陽性ハイブリッド細胞
培養物は次に公知の方法、好ましくは限界希釈法を用い
て選び出され、そして引続き適当な培養培地中でクロー
ン化される。成長した細胞クローンからの上澄みも同様
に抗体の産生を調べる。

【００２８】上記のように製造された本発明に係るハイ
ブリドーマ細胞クローンは、好ましくはこの目的のため
に慣用のイムノアッセイの一つ、例えば酵素結合イムノ
アッセイまたはラジオイムノアッセイを用いて適当なモ
ノクローナル抗体の産生に対してスクリーニングされ
る。酵素結合イムノアッセイにおいて、上に詳細に特徴
づけたハプテン複合体をまず固体支持材に吸着させる。
担体分子を添加することにより残りの遊離結合部位を次
に飽和させ、それによりブロックする。モノクローナル
抗体を検出するために、上記ハイブリドーマ細胞クロー
ンの上澄みの一部を担体結合ハプテン複合体と保温す
る。

【００２９】本発明はさらに、本発明に係る抗体を合成
しそして好ましくは周囲の培地中にそれらを分泌する上
で詳細に特徴づけられた本発明に係るハイブリドーマ細
胞系またはそれらのクローンもしくはサブクローンが公
知の方法により試験管内または生体内で培養されること
を特徴とする、それ自体公知の方法を用いることによる
モノクローナル抗体の製造に関する。本発明に係るハイ
ブリドーマ細胞の試験管内培養は適当な培養培地、特に
慣用の標準化培養培地例えば適当である場合には哺乳類
の血清、例えばウシ胎児血清の添加、成長促進添加剤ま
たは微量成分により補足されてもよいダルベッコの変形
イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地
中で行われる。モノクローナル抗体の単離はハイブリド
ーマ培養液の特定の上澄みからの免疫グロブリン画分
の、例えば硫酸アンモニウムを用いることによる沈殿で
始めるのが好ましい。次いで仕上げ、および当業者には
公知であり、例えばクロマトグラフィー法、例えばゲル
ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロ
ースクロマトグラフィー、プロテインＡまたはイムノア
フィニティクロマトグラフィーの使用を包含する精製段
階を行う。しかしながら、生体内法を用いて本発明に係
るモノクローナル抗体を大量に得ることをまた可能であ
る。従って、例えば、抗体産生ハイブリドーマ細胞クロ
ーンを適当な哺乳類に注射することが可能であるが、こ
れは処置動物中に抗体産生腫瘍の進展を誘導する。１な
いし３週間の後、抗体はこの方法で処置された動物の体
液から単離され得る。

【００３０】本発明の特定の実施態様において、適当で
ある場合には炭化水素例えばプリスタンで前処理された
メスのＢａｌｂ／ｃマウスが本発明に係るハイブリドー
マ細胞クローンの腹膜腔内注射を受容する。ハイブリド
ーマ細胞クローンの注射の１なしい３週間後、腹水を集
め、そしてさらに処理するまで保存する。試験管内で培
養されたハイブリドーマの上澄みからの上記単離と同様
の方法でモノクローナル抗体を単離する。

【００３１】本発明はまた、式Ａで表されるスルホニル
尿素除草剤、特に式Ｉで表されるスルホニル尿素除草
剤、とりわけ式ＩＩで表される化合物の検出のための、
および上記スルホニル尿素除草剤を構造的に関連する化
合物、例えばトリアスルフロン、プリミスルフロンおよ
びキノスルフロン、および第２表中の化合物Ａと識別す
るための慣用のイムノアッセイの一つにおいて本発明に
係る抗体を使用する方法にも関する。本発明に係るモノ
クローナル抗体は従って、抗原と相当するモノクローナ
ル抗体との特異的結合に基づいた全ての公知イムノアッ
セイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結
合イムノアッセイ（エリザ）、免疫蛍光試験その他に使
用され得る。本発明に係るモノクローナル抗体はＲＩＡ
試験における放射標識誘導体の形態で使用され得る。こ
れに関連して、本発明の範囲内に関する標的物質を検出
するためのＲＩＡ試験のこれまで公知の全ての変形、例
えば均質または固相でのＲＩＡ試験および抗原の直接ま
たは間接（競合）検出を伴う単一または二重（サンドイ
ッチ）ＲＩＡ試験を使用することも可能である。同様の
ことが酵素結合イムノアッセイの使用にも当てはまる。

【００３２】式Ｉで表されるスルホニル尿素除草剤、特
に式ＩＩで表される化合物を検出するための競合イムノ
アッセイにおいて本発明に係るモノクローナル抗体を使
用することは本発明の範囲内で好ましい。競合イムノア
ッセイの原理は標識抗原または固体支持材に結合される
抗原と、抗体分子上の関連結合部位のための遊離抗原と
の競合に基づいている。原理的にその競合イムノアッセ
イを行う２つの可能な方法がある：ａ）第１の方法は固体支持材に結合される抗原と標識が
施されている抗体上での遊離結合部位への遊離抗原との
競合に基づいている。これに関連して、固体支持材への
抗原の結合は直接、または担体分子を介して起こり得
る。この場合、遊離抗原の濃度は支持材上に固定された
抗原に結合される標識抗体中での減少を通じて決定され
る。この減少は試料中に含まれていた遊離抗原の量に比
例する。ｂ）別の方法は遊離および標識抗原は、ある場合には固
体支持材に結合される抗体上の関連結合部位に対して互
いに競合するという事実に基づいている。抗原の濃度
は、遊離抗原の濃度の関数として変化する標識抗原中の
減少を通じて決定される。抗原または抗体の結合に適当
である固体支持材の例はミクロタイタープレートまたは
試験管のプラスチック表面、ポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリ塩化ビニル、ガラスまたはプラスチック等か
らなるビーズ表面、濾紙、デキストラン、セルロースも
しくはニトロセルロースまたはその他の類似の材料の細
片の表面である。最後に記載した細片の表面は、単純吸
着等により生じる支持材への結合が可能である、本発明
に係るモノクローナル抗体の一種で、または抗原で被覆
され、そして適当である場合にはこの被覆操作は予め例
えばグルタルアルデヒドまたは臭化シアンでの支持材の
活性化を行った後に行う。

【００３３】酵素結合イムノアッセイ（エリザ；酵素結
合イムノソルベントアッセイ）において本発明に係るモ
ノクローナル抗体を使用することが本発明の範囲内で特
に好ましい。これは、そのまま、または酵素結合誘導体
の形態で使用される本発明に係るモノクローナル抗体を
必要とする。エリザアッセイは本発明に係る抗体の酵素
結合誘導体またはその他のそれ自体公知でありそして本
発明に係る抗体のエピトープを認識し結合する酵素結合
抗体の使用のいずれかに基づいている。上記の支持材の
一つが抗原で最初に被覆されているエリザアッセイを使
用することが本発明の範囲内で特に好ましい。担体結合
抗原は次に、検出すべき抗原および本発明に係る抗体の
一種を含有する試験溶液と保温される。検出すべき抗原
はこの際に遊離の形態で、または水もしくは土壌の試料
の構成成分として存在し得る。１０分ないし２時間の保
温時間の後に、全体の混合物は、本発明に係るモノクロ
ーナル抗体を認識し、そして結合する酵素標識抗体と保
温される。この種の酵素標識抗体の一例はホスファター
ゼ標識ヤギ抗ヒツジ免疫グロブリン、または相当するヤ
ギ抗マウス抗体であり、両方とも市販されている。結合
された抗体タンパク質の量は酵素−基質反応、例えば分
光法を用いて決定される。上記の支持材の一つに結合し
た抗体に対する標識および遊離抗原の競合に基づいたエ
リザ試験も同様に本発明の範囲内で好ましい。特定の試
料中に存在する抗原の量はこの場合標識抗原における減
少により決定される。これはは試料中に含有される遊離
抗原の量が多いほど、より正確である。

【００３４】本発明はさらに、本発明に係るモノクロー
ナル抗体および／またはそれらの誘導体の他に、適当で
ある場合にはさらにその他のモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体、特に標識モノクローナルまたはポリク
ローナル抗体、およびその他の添加剤を含有し得る試験
キットの形態にある、式Ａで表されるスルホニル尿素除
草剤、特に式Ｉで表されるスルホニル尿素除草剤、とり
わけ式ＩＩで表される化合物の定性および定量試験のた
めの手段に関する。ラジオイムノアッセイ、酵素結合イ
ムノアッセイおよび化学発光アッセイからなる群から選
択される慣用のイムノアッセイの一つに基づいた試験キ
ットが本発明の範囲内で特に好ましい。本発明の範囲内
で特に好ましい試験キットはスルホニル尿素除草剤の検
出が競合イムノアッセイ、特に酵素結合直接または間接
イムノアッセイ（エリザ）に基づいたものである。本発
明の範囲内で好ましい式ＩＩで表される化合物の放射免
疫学的検出のための試験キットは、例えば以下の構成成
分を含有し得る：（ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび／また
はそれらの放射標識誘導体または放射標識抗原の適当な
場合には凍結乾燥または濃縮された溶液または抗原の標
準化溶液、（ｃ）緩衝液、（ｄ）適当である場合には、
例えば非特異的吸着および凝集体の形成を防止するポリ
ペプチド、界面活性剤およびその他の添加剤、および
（ｅ）ピペット、反応容器、計算曲線、封入ラベルその
他。酵素結合イムノアッセイ（エリザ）に基づいた式Ｉ
Ｉで表される化合物の免疫学的検出のための試験キット
は、例えば以下の構成成分を含有し得る：（ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび／また
は決定すべき抗原に対して反応するか、または抗原を認
識する抗体に対して反応する第２の酵素標識モノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体の適当な場合には凍結乾
燥または濃縮された溶液、（ｃ）固体または溶解した形
態の酵素基質、（ｄ）抗原または抗原の標準化溶液、
（ｅ）緩衝液、（ｆ）適当である場合には、例えば非特
異的吸着および凝集体の形成を防止するポリペプチド、
界面活性剤およびその他の添加剤、および（ｇ）ピペッ
ト、反応容器、計算曲線、カラーチャート、封入ラベル
その他。化学発光試験に基づいた式ＩＩで表される化合
物の検出のための試験キットは、例えば以下の構成成分
を含有し得る：（ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、（ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび本発明
に係る第１の抗体を認識し得そして化学発光標識に結合
される第２のポリクローナル抗体の適当な場合には凍結
乾燥または濃縮された溶液、（ｃ）光放射を誘導する成
分、例えばＨ₂Ｏ₂またはＮａＯＨを含有する溶液、
（ｄ）緩衝液、（ｅ）適当である場合には、例えば非特
異的吸着および凝集体の形成を防止するポリペプチド、
界面活性剤およびその他の添加剤、および（ｆ）ピペッ
ト、反応容器、封入ラベルその他。本発明の範囲内で使
用され得る支持材は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、
ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、ニトロセルロー
ス、架橋デキストラン、フッ化樹脂、アガロース、架橋
アガロース、多糖その他からなる群から選択される不溶
性ポリマー材料から主として構成される。しかしなが
ら、これらの他に、例えばガラス、金属、ナイロンベー
スネット等も使用し得る。上記の特定の支持材は非常に
広範囲の形態にあり、そして使用の特に意図された特定
の目的に応じて非常に異なる形状を有し得る。それらは
例えば皿、球、プレート、小さいロッド、セル、小さい
ボトル、小さいチューブ、ファイバー、ネットその他か
らなる。被覆されていなくても、または本発明に係る抗
体の一つ、遊離抗原もしくは抗原複合体で被覆されてい
てもよい透明プラスチック材料、例えばポリ塩化ビニル
またはポリスチレンからなるミクロタイタープレートが
試験キットを製造するために頻繁に使用される。ポリス
チレンおよびポリスチレンラテックスの小球、チューブ
またはロッドもまた使用され得、この場合には周囲のラ
テックス材料は遠心分離によりポリスチレン粒子から分
離することが可能である。本発明に係る試験キットのも
う一つの成分は、複合体形成性反応、特に免疫学的反応
の存在の検出を可能にする、好ましくは抗原抗体複合体
またはリガンドレセプター複合体を生じ、その場合に適
当であるならば定性情報の他に定量情報が検出されるべ
き抗原について得られるであろうマーカーまたはインジ
ケーターからなる。適当なマーカーまたはインジケータ
ーは、検出可能な信号を直接または間接的に生じ得る単
一の原子および分子である。これらのマーカーまたはイ
ンジケーターは検出すべき抗原または本発明に係るモノ
クローナル抗体に直接結合しているか、または後者のモ
ノクローナル抗体に包含されていてもよい。しかしなが
ら、それらは単一物質の形態であっても、またはそれ自
体検出すべき抗原でも本発明に係るモノクローナル抗体
の一つでもないがレセプター分子と反応できる分離した
化合物の成分の形態、例えば錯体形成物であってもよ
い。これらの分離化合物は好ましくは、モノクローナル
およびポリクローナルであり得る第２の抗体分子、補体
タンパク質もしくはその断片、ストレプトコッカス・ア
ウレウスプロテインＡ等である。これらの分離化合物は
レセプター分子、例えば検出すべき抗原または本発明に
係るモノクローナル抗体の一つ、特に複合体の形態で存
在するレセプター分子を特異的に認識し、結合する。多
くの場合において、次いでマーカーと協調してのみ検出
可能な信号を導くさらに別の試薬に対する要求がある。
このことは、酵素が含まれるときに特に当てはまる。

【００３５】本発明の範囲内で使用され得るマーカーま
たはインジケーターは、免疫学および免疫化学の分野の
熟練者には非常によく知られている。それらは、例えば
放射性マーカー元素もしくは物質、酵素または化学発光
物質からなる。可能なマーカーまたはインジケーターの
以下のリストは、実施例により使用され得る広範囲の物
質および試薬を説明するためのものであり、これにより
本発明の対象物質を制限するものではない。適当なマー
カーまたはインジケーターの例は放射性元素の群の中に
見出され得る。これに関連する特に好ましい元素はそれ
自体γ線を放射するもの、例えば¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹²⁸
Ｉ、¹³²Ｉまたは⁵¹Ｃｒ、これらの線の放射を誘導する
もの、例えば¹¹Ｃ、¹⁸Ｆまたは、¹³Ｎである。いわゆる
β放射体、例えば¹¹¹Ｉｎ、¹⁴Ｃおよび³Ｈも同様に適
当である。その他の適当なマーカーは、化学的手段によ
り非常に簡単に抗原に、または抗原を変性させることな
く抗体に連結され得る、化学発光物質、特に蛍光物質か
らなる。生成するフルオロクロムは蛍光定量法を用いて
容易に検出され得る。フルオレセインイソシアネート、
フルオレセインイソチオシアネート、５−ジメチルアミ
ノ−１−ナフタレンスルホニルクロリド、テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート、リザミン、ローダミン
８２００スルホニルクロリドその他がこの点において特
記する価値がある。その他の蛍光剤および分析技術の記
載は、デルカ(DeLuca)編『免疫蛍光分析』(Immunofluor
escence Analysis) ジョン・ワイリー・アンド・サンズ
社(John Wiley & Sons, Ltd.) 刊（１９８２年）の第１
８９−２３１頁の「道具としての抗体」マルシャロニス
等〔３〕に見出される。マーカーまたはインジケーター
物質として酵素を使用することは本発明の範囲内で特に
好ましい。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレ
ートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ等である。酵素がマーカー物質として
使用される場合、酵素活性を通して続けられる免疫複合
体の形成を可能にする追加の試薬、および適当である場
合には酵素反応が停止され得る停止試薬を添加すること
が必要である。呈色反応を生じる試薬が本発明の範囲内
で特に好ましい。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合に
は、この点に関して記載され得る例は過酸化水素であ
り、これは追加の酸化された顔料前駆体例えばジアミノ
ベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンと組み合わさ
って褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼ
がマーカー用物質として使用される場合、例えば２，
２’−アジド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質として使用すること
ができる。

【００３６】本発明はさらに、式Ａで表されるスルホニ
ル尿素除草剤、特に式Ｉで表されるスルホニル尿素除草
剤、とりわけ式ＩＩで表される化合物の迅速で効率的な
定性および／または定量分析のために、およびそれらの
化合物を構造的に関連する化合物、例えば例えばトリア
スルフロン、プリミスルフロンおよびキノスルフロン、
並びに第２表中の化合物ＡおよびＢと識別するために本
発明に係るモノクローナル抗体の少なくとも１種を試薬
として含む試験キットの使用に関する。

【００３７】本発明に係るモノクローナル抗体はまた、
残留物の分析に特に使用される、いわゆる「免疫精製」
分析に非常に有利に使用され得る。それらの分析におい
て、本発明に係る抗体はマトリックス、好ましくはゲル
マトリックスに共有結合し、次いでその結合した形態で
ミニカラムに設置される。該カラムは次に土壌抽出物の
精製に使用され得る。それ故に、本発明はさらに（ａ）
本発明に係るモノクローナル抗体が固体支持体に固定化
され、（ｂ）該支持体がミニカラム内に設置され、
（ｃ）精製または分析されるべき試料を含む緩衝液が該
カラムに注入され、（ｄ）場合により、１またはそれ以
上の洗浄段階が行われ、そして（ｅ）分析物が適当な溶
離液でカラムから溶離される、免疫精製法において本発
明に係るモノクローナル抗体を使用する方法に関する。

【００３８】

【実施例】次に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。Ｉ．実験例実施例１：ハプテン／タンパク質複合体の製造実施例１．１：２−（３，３，３−トリフルオロプロピ
ルフェニル）−Ｎ−（１，４−ジカルボン酸アミド）ス
ルホンアミドの製造担体タンパク質に連結し得る式ＩＩで表される化合物の
誘導体の製造は下の反応スキームに従って行われ得る。

【化１９】上記方法の個々の段階は以下のように行われる：室温に
てわずかに冷却しながら、ジオキサンに溶解した１，８
−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデセ−７−エン３
１．４ｇを、２−（３，３，３−トリフルオロプロピ
ル）フェニルスルホンアミド２５．３ｇおよびコハク酸
無水物１０．０ｇのジオキサン２５０ｍｌの溶液に３０
分かけて滴下して添加する。生成する懸濁液を２０ない
し２５℃の温度で１５時間攪拌し、２ＮＨＣｌで酸性
化し、濾過し、次いで乾燥する。沈殿する生成物を次に
溶離液としてトルエン／酢酸エチル（３：１）を用いて
シリカゲルカラム上で精製すると、融点１３８ないし１
３９℃を有する式ＩＶで表される表題化合物９．５ｇが
得られる。上記本方法において使用される出発化合物お
よひ反応体は公知であるか、公知方法と同様に製造され
得る。実施例１．２：ハプテン／タンパク質複合体実施例１．１に従って製造した式ＩＩで表される化合物
の誘導体を文献〔１２〕に記載された活性化エステル法
によりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；フルカ）か、キー
ホールカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ；カルビオケム）
のいずれかに複合させる。１．２．１：式ＩＶで表される化合物のＢＳＡまたはＫ
ＬＨへの活性化エステル法による連結詳細には、式ＩＶで表される化合物のカルボキシ基を室
温でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（７．２
ｍｇ／２００μｌ）に溶解し、次に４モル過剰のＮ−ヒ
ドロキシスクシンアミド（９．１ｍｇ／２００μｌ）お
よびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１６
ｍｇ／２００μｌ）をその中に添加する。反応混合物を
最初に２２℃で１時間、次に４℃で１８時間攪拌する。
反応の間に形成された沈殿を室温、１２０００ｇで３分
間遠心分離することにより除去し、そして透明な上澄み
中に存在する活性化エステルを、リン酸緩衝液（ＰＢＳ
緩衝液）３．３ｍｌ中に予め溶解させたＢＳＡ〔１２ｍ
ｇ〕またはＫＬＨ〔１２ｍｇ〕に添加する。４℃の温度
で４時間保温した後、形成する沈殿を４℃、２０００ｇ
で１０分間遠心分離することにより除去し、そしてタン
パク質複合体を含む上澄みをＰＢＳに対して十分に透析
し、その後、免疫感作のために使用する。連結反応の範
囲は吸光光度法により決定される。ハプテン：ＢＳＡの
モル比は約２０：１、好ましくは２３：１である。

【００３９】実施例２：免疫感作４週齢ないし６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス〔チエ
ルファルム・ズィゼルン(Tierfarm Sisseln)，スイス
国〕各群５匹（２群）はＫＬＨ複合体の３回の腹膜腔内
または皮下の一連の注射を２週間間隔で受容する。実施
例１．２．１で製造した複合体の投与量は２５μｇ／注
射である。第１の注射はＰＢＳ中に複合体０．１ｍｌを
含み、完全フロイントのアジュバント０．１ｍｌと１：
１の比率で混合されている。この注射液５０μｌは腹膜
腔内に注射され、そして残りの１５０μｌは皮下に注射
される。第２および第３の注射はそれぞれ第１の投与の
１４日および３０日後に行われ、完全フロイントのアジ
ュバントの代わりに不完全フロイントのアジュバントを
用いる。最後の注射の１週間後、血清を実験動物から採
取し、そして血液滴定は、ＢＳＡ複合ハプテン（項６参
照）で予め被覆したミクロタイタープレートを用いるエ
リザ試験により決定される。２ヵ月の放置期間の後に、
ＫＬＨ複合体のもう１回の腹膜腔内注射が２２０μｇ／
２００μｌＰＢＳ〔ハプテン／タンパク質複合体〕の投
与量で行われる。３ないし４日後、マウスを殺し、そし
て脾臓細胞を単離し、それをミエローマ細胞系ＰＡＩ
〔１８〕と融合させる〔実施例３．４参照〕。

【００４０】実施例３：融合プロトコル３．１．食細胞（腹膜マクロファージ）の入手約６週齢ないし８週齢の未処置Ｂａｌｂ／ｃマウスを融
合１日前に殺し、そして７０％のアルコール中に浸漬す
ることにより殺菌する。次に殺菌切開は腹膜を傷つける
ことなく柔毛および上部腹皮になされる。滅菌５ｍｌプ
ラスチックシリンジおよび滅菌１８ゲージ注射針がＢＳ
Ｓ（Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺なし）４ｍｌおよび空気１ｍｌ
を腹腔内に注射するために使用される。腹部をゆるやか
に揉んだ後（シリンジおよび針は腹腔内に残ってい
る）、前に注射されたＢＳＳ緩衝液を腹膜腔内から再び
引き出し、そして滅菌ファルコンチューブ中に入れる。
この操作をさらに２回繰り返す。この方法で得られたマ
クロファージは氷で冷し、そして引続きＢＳＳ各回２０
ｍｌで２回洗浄する。マクロファージを各回３００ｇお
よび５℃の温度で１０分間遠心分離する。ペレットを次
にＨＡＴ培地５０ｍｌ中に再懸濁し、そして細胞懸濁液
を全部で２４ウエルの４つのコスタープレートに分配す
る（０．５ｍｌ／ウエル）。この方法で調製したマクロ
ファージを３７℃の温度および６％のＣＯ₂濃度でイン
キュベータに保存する。約４×１０⁶マクロファージが
各融合あたり必要である。

【００４１】３．２．ミエローマ細胞系ＰＡＩの培養上記ミエローマ細胞系ＰＡＩは、それ自体抗体を分泌せ
ず、そして文献〔１８〕に記載されているミエローマ細
胞系である。少なくとも１０００万個の細胞を含む十分
に成長した培養液５０ｍｌが各融合に必要である。ミエ
ローマ細胞は好ましくはＴ１７５ファルコンボトル（ベ
クトン・アンド・ディケンソンにより供給される）中で
培養される。融合１日後、培養培地（ＲＰＭＩ１６４
０）を新鮮ＲＰＭＩ１６４０培地に代える。融合１日目
にＰＡＩ細胞を集め、５０ｍｌ滅菌プラスチックチュー
ブに入れ、そして３００ｇおよび５℃の温度で１０分間
遠心分離する（ＭＳＥ遠心分離機，チルスピン型，英
国）。遠心分離後、上澄みを吸い出し、そして捨てる。
細胞をＢＳＳ緩衝液（Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺なし）各回約
３０ｍｌで２回洗浄し（３００ｇ，５℃で１０分）、そ
してＢＳＳ５ｍｌ中に再懸濁する。細胞懸濁液の一部を
細胞数決定のために除去し、そしてフルオレセインジア
セテート（ＦＤＡ）で染色する。さらに使用するまでミ
エローマ細胞を氷上に保存する。

【００４２】３．３．脾臓細胞懸濁液の調製実施例２に記載されたように予め免疫感作されたＢａｌ
ｂ／ｃマウスから滅菌条件下および氷上で冷却しながら
脾臓を除去する。予め免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウ
スを断頭により殺し、そして滅菌条件下で脾臓を除去す
る。このためにマウスは７０％のエタノール中に短時間
浸漬され、滅菌器具で解剖される。脾臓を注意深く除去
し、そして細かいナイロンネット上に置く。そこでハサ
ミで小片に切断され、次に５ｍｌのシリンジプランジャ
ーを用い、この操作であまりにも多くの細胞を破壊する
ことなく注意深くネットを通す。ネットはこの操作を通
じてＢＳＳですすがれる。この方法で得られた細胞懸濁
液を５０ｍｌのプラスチックチューブに入れ、そして３
００ｇおよび５℃の温度で１０分間遠心分離する（ＭＳ
Ｅ遠心分離機，チルスピン型，英国）。次に細胞をＢＳ
Ｓ各回約２０ｍｌで２回洗浄し（３００ｇ，５℃で１０
分，ＭＳＥ遠心分離機，チルスピン型）、そして遠心分
離後の細胞ペレットをＢＳＳ１０ｍｌ中に再懸濁する。
脾臓細胞はＰＡＩミエローマ細胞と融合されるまで氷上
に保持される。

【００４３】３．４．融合：脾臓細胞とＰＡＩミエロー
マ細胞融合のためのミエローマ細胞：脾臓細胞の比率は１：１
０にすべきである。脾臓細胞（ＢＳＳ緩衝液中）および
ＰＡＩミエローマ細胞（ＢＳＳ緩衝液中）を上記比率で
混合し、そして３００ｇおよび５℃の温度で１０分間遠
心分離する（ＭＳＥ遠心分離機，チルスピン型）。ペレ
ットをＢＳＳ緩衝液中に再懸濁し、そして次に懸濁液を
再び遠心分離する。ペレットを注意深い攪拌によりばら
ばらにし、そして水浴中に３７℃で入れる。次いで予備
加熱した滅菌ＰＥＧ４０００（メルク）１ｍｌを６０秒
かけて細胞に滴下し、この間全体の混合物は絶えずかき
混ぜる。細胞を次にさらに３０秒間揺動した後、予め加
熱したＢＳＳ緩衝液（Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺なし）５ｍｌ
を同様に約５分かけて絶えず攪拌しながら滴下する。上
記のようにして融合させた細胞は次に遠心分離され（３
００ｇ，２０℃で１０分，ＭＳＥ遠心分離機，チルスピ
ン型）、そして上澄みが吸い出され、廃棄される。細胞
ペレットをＨＡＴ培地５０ｍｌ中に再懸濁し、そしてこ
のようにして得られた細胞懸濁液は準備された４つのコ
スタープレート（各ウエルの直径２４ｍｍの２４ウエル
のミクロタイタープレート；細胞成長のための全表面積
２．０ｃｍ²）に分配される（０．５ｍｌ／ウエル）。
コスタープレートを３７℃の温度および６％のＣＯ₂濃
度で保温する。

【００４４】実施例４：ハイブリッド細胞の培養細胞融合１日後、ＨＡＴ培地１ｍｌを培養プレートの各
ウエルに添加する。細胞融合３ないし４日後、顕微鏡下
で融合された細胞を調べる。同時に使用された培地を吸
い出し、そして新鮮ＨＡＴ培地１ｍｌに置き換える。さ
らに３日後（細胞融合６−７日後）、培養培地を再び変
える。細胞融合７ないし１０日後、各ウエルを顕微鏡下
でハイブリッドを求めて追跡し、そして培地を１週間に
２または３回交換する。ハイブリッドがウエル中で成長
するとすぐ（通常２ないし４週間後）、その中のＨＡＴ
培地はＨＴ培地に代えてもよい。成長したハイブリッド
培養液からの上澄み（ウエルの少なくとも１０％）が滅
菌パスツールピペットで除去され、そして抗体の存在に
対して試験される。ウエルが陽性ハイブリッドコロニー
の成長により被覆されるとすぐに、該ハイブリッドコロ
ニーをＲＰＭＩ１６４０培地中の新たなコスタープレー
トに移してもよく、このとき成長して被覆されている１
つのウエルの内容物は新たな２または３個のウエルに分
配される。

【００４５】実施例５：陽性ハイブリッド細胞のクロー
ニングピペットを用いて陽性ウエル中の細胞を分離し、そして
チューブ内の培地１ｍｌ中に移す。細胞数の決定のため
に一部を次に除去し、そしてＦＤＡで染色する（ＦＤＡ
で希釈１：２，細胞５０μｌ＋染料５０μｌ）。好まし
い細胞数は１０⁵ないし１０⁶細胞／ｍｌである。ハイ
ブリッド細胞を次にＨＴ培地で１：１００の比率で希釈
する（例えば細胞１００μｌ＋ＨＴ培地９．９ｍｌ）。
ＨＴ培地２５ｍｌを２本の５０ｍｌファルコンチューブ
に入れ、各々のチューブをマクロファージ懸濁液５ｍｌ
で全量３０ｍｌとする。マクロファージはマウスから予
め単離され、そしてＨＴ培地１０ｍｌ中に再懸濁されて
いた（項３．１参照）。細胞濃度が（ｉ）２７０細胞／
３０ｍｌまたは（ｉｉ）９０細胞／３０ｍｌに達するま
でハイブリッド細胞をマクロファージ含有ファルコンチ
ューブ中で希釈する。これらの混合物を次にコスタープ
レート（９６ウエルのミクロタイタープレート）上に、
各ウエルが２００μｌとなるように分配する。これはそ
れぞれ細胞数（ｉ）１．８細胞／ウエルまたは（ｉｉ）
０．６細胞／ウエルに相当する。１．５ミクロタイター
プレートが各希釈のためのこの方法において必要とされ
る。７日後、個々のウエルを顕微鏡下で調べ、そして細
胞クローンを含むウエルが記録される。ウエルの約５０
％が細胞クローンを含む希釈がエリザ試験のために用い
られる。これは一般に０．６細胞／ウエルの希釈である
ことが望ましい。約７−１０日後、陽性ウエルの上澄み
（クローンと共に）がモノクローナル抗体の存在に対し
てエリザ試験で試験され、そして陽性クローンをＲＰＭ
Ｉ１６４０培地中コスタープレート（２４ウエル）上で
成長させる。これら陽性クローンの一部は液体窒素中に
保存される。

【００４６】実施例６：ハイブリドーマスクリーニング
（エリザ試験）炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．６）中のＢ
ＳＡ複合ハプテン溶液（２μ／ｍｌ）１００μｌを最初
にミクロタイタープレートの個々のウエル中に入れ、そ
してこの混合物を湿度室中４℃で一晩保温する。次いで
各ウエルを０．１％ＰＢＳツイーン緩衝液で５回洗浄す
る。ミクロタイタープレート上の未占有結合部位をブロ
ックするために、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液（１％）２００μ
ｌを各ウエル中に入れる。この混合物を室温で１−２時
間保温し、次に０．１％強度のＰＢＳツイーン緩衝液で
洗浄する。ＰＢＳツイーン緩衝液（０．１％）で１：２
の比率に希釈したハイブリドーマ上澄み２００μｌを次
に各ウエル中に入れ、そして全体の混合物を室温で２時
間保温する。次いでウエルを０．１％ＰＢＳツイーン緩
衝液で５回洗浄する。この次にホスファターゼ複合ヤギ
抗マウス抗体（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラ
トリー）と保温する。アフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製され、そしてＰＢＳツイーン（０．１％）
（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリー）中
１：１５００の希釈で存在し、そしてアルカリホスファ
ターゼで標識されているマウスＩｇＧに対するヤギ抗体
１００μｌを最初に各ウエルに添加する。保温時間は室
温で１．５時間である。個々のウエルを次に再び０．１
％ＰＢＳツイーン緩衝液で５回洗浄する。基質含有溶液
（１ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスフェート）１
５０μｌを各ウエル中に入れる。暗所中２時間の保温の
後、４０５ｎｍでの分光分析を行う。特異的な抗体を分
泌する陽性ハイブリドーマ細胞は選択された波長で強い
陽性信号を与える。これらの細胞を次に限界希釈法[God
ing (1980)] によりクローン化する。純粋なモノクロー
ナル抗体は適切に処置されたマウスの腹水から得られる
〔２〕。

【００４７】実施例７：ハイブリドーマ細胞のマウス中
での増殖腹水産生を刺激するために、メスのＢａｌｂ／ｃマウス
（２０ｇ−２５ｍｇ）（チエルファルム・ズィゼルン，
スイス国）を腹膜腔内注射によりプリスタン油（アルド
リッチ・ケミカル）０．３ｍｌで前処理する。プリスタ
ン投与の１ないし３週間後、マウスに第２の注射（プリ
スタン油０．２ｍｌ，腹膜腔内）を行う。該第２の注射
と同時に、動物はＰＢＳ０．２ｍｌ中の２×１０⁶のハ
イブリドーマ細胞を受容する。この処置から生じる腹水
を集め、８００ｇで遠心分離し、そして−２０℃の温度
で保存する。解凍後、腹水を３００００ｇで１時間遠心
分離する。主に脂質を含む上層を廃棄する。次いでタン
パク質濃度を決定し、ＰＢＳを添加することにより１０
ｍｇ／ｍｌの値に調整する。免疫グロブリンＧ画分（Ｉ
ｇＧ）を飽和硫酸アンモニウム溶液０．９容量部の０℃
での滴下により沈殿させる。１時間後、ＩｇＧ画分を２
２０００ｇで１時間遠心分離することによりペレット化
する。次いでペレットを５０ｍＭＮａＣｌ含有の２０
ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．９中に溶解させ、そし
て同様の緩衝液に対して４℃で透析する。ＩｇＧ画分の
引き続く仕上げはＤＥ−５２ジエチルアミノエチルセル
ロース（ホワットマン）上での陰イオン交換クロマトグ
ラフィーにより行う。試料は、最終ＮａＣｌ濃度が２５
ｍＭになるまで２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．９
で１：２（ｖ／ｖ）に希釈され、そしてタンパク質１０
ｍｇ／ゲルｍｌをカラムに注入する。溶出はＮａＣｌ濃
度を２５ｍＭないし２００ｍＭまで増加させる（リニア
グラジエント）ことにより行われる。モノクローナル抗
体は一般に８０ｍＭＮａＣｌの領域に溶出される。その
画分をＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、そして−７０
℃で保存する。純度をドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および等
電点電気泳動により決定する。この場合の純度は９０％
を越えている。

【００４８】実施例８：式ＩＩで表される化合物の検出式ＩＩで表される化合物の検出は２段階競合エリザ試験
により行われ得る。５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９．６）中のＢＳＡ複合ハプテン（ＢＳＡ複合ハプテ
ン２００ｎｇ／５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液１００μ
ｌ）をマイクロタイタープレート（例えばダイナテッ
ク，タイプＭ１２９Ａ）上に最初に吸着させ、そして４
℃で一晩保温する。なお、このＢＳＡ複合ハプテンは実
施例１．２．１に従って製造されたものである。プレー
トを次に０．１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０（ツイ
ーン２０）を補足したＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−ツイー
ン）で５回洗浄する。ＰＢＳ−ＢＳＡを１％溶液（ｗ／
ｖ）の形態で添加することにより、固体支持材上に残る
遊離結合部位を次にブロックする。２２℃で２時間保温
した後、プレートをＰＢＳ−ツイーン（０．１％）で再
び洗浄する。予めクローン化したハイブリドーマ細胞
（１：１０００または１：２０００の希釈）の上澄み５
０μｌまたは予め精製したモノクローナル抗体（４０−
１２０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌをａ）抗原〔式ＩＩで表さ
れる化合物〕または抗原類似体の増加する量を含む標準
溶液９５０μｌ、ｂ）抗原含有水試料、またはｃ）抗原
含有土壌抽出物と保温する。〔ＰＢＳ−ツイーン（０．
１％）が全ての希釈のために使用される〕室温（２２℃）で１時間の保温後、抗原／抗体混合物２
００μｌをミクロタイタープレートの各ウエルに添加
し、そして全体の混合物をさらに１時間保温する。ウエ
ルを次にＰＢＳ−ツイーン（０．１％）で５回洗浄し、
アルカリホスファターゼ（希釈１：１５００）に複合さ
れているヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１００μｌ／ウエルを
入れ、そして１．５時間保温する。再び洗浄した後、１
ｍｇ／ｍｌジエタノールアミン緩衝液（１ｍＭ，ｐＨ
９．８，０．５ｍＭＭｇＣｌ₂×６Ｈ₂Ｏを補足）中
に溶解された基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート１５
０μｌ／ウエルをウエルに添加する。２２℃の温度で２
時間保温した後、固相に結合した抗原と反応した抗体量
に比例する色変化が観察される。起こった呈色反応の強
度は４０５ｎｍの波長で決定される。個々の試料の希釈
は、０．３と０．５の間の範囲の吸収が阻害剤（Ｂｏ）
を添加せずに得られるように選択される。Ａ₄₀₅≦０．
０１の値が対照（抗体を含まない）に対して得られる。
全ての試料が３回測定される。試料中に存在する抗原
〔式ＩＩで表される化合物〕の量を決定するために、Ｂ
／Ｂｏ×１００が阻害剤の濃度に対してプロットされて
いる計算曲線を最初に作成する。（Ｂｏは抗体に対して
抗原阻害剤を添加せずに計算された吸収を示し、そして
Ｂは抗原阻害剤の種々の濃度で添加されたときの吸収を
示す）Ｉ₅₀値は固相への抗体の結合が５０％に阻害され
ている抗原の濃度を示す。Ｉ₅₀値は本発明の条件に特に
適格化され、そして４パラメータ記号論理的曲線〔１
５〕に基づいたＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（レザーバロー，エ
ルゼビール−バイオソフト）曲線計算プログラムを用い
て計算される。エリザの範囲内での土壌または水の試料
中の抗原の定量測定はまた、各マイクロタイタープレー
ト上に含まれる標準に基づいて曲線を適格化したＥＮＺ
ＦＩＴＴＥＲプログラムを用いて行われる。

【００４９】実施例９．１：土壌試料の分析種々の採取地からの標準土壌試料の一部（２ｇ）は以下
の方法に従って抽出される。：方法（Ａ）（文献〔８〕に準拠）：試料１００ｇをメタ
ノール：リン酸緩衝液（ＰＢ）〔ｐＨ７．０，全体のリ
ン酸塩濃度０．０７Ｍ〕＝２：１（ｖ／ｖ）混合物３０
０ｍｌと震盪することにより抽出器中で２時間抽出す
る。ろ過およびリン酸での酸性化の後、スルホニル尿素
化合物をＣＨ₂Ｃｌ₂７５ｍｌで３回再び抽出する。溶
媒を蒸発させた後、試料をＰＢ緩衝液１０ｍｌ中に溶解
し、そしてろ過により精製する。方法（Ｂ）：方法（Ａ）による抽出を別の２種の試料で
繰り返し、そして最後の有機相を炭酸水素塩水溶液（５
％）と震盪することによりさらに精製する〔８〕。炭酸
水素テトラブチルアンモニウムの添加後、スルホニル尿
素化合物をジクロロメタン／ｎ−ヘキサン（８０：２
０）中に再抽出する。有機相を蒸発させた後、スルホニ
ル尿素化合物をＰＢ緩衝液１０ｍｌ中に採取する。試料
をエリザ試験に使用する前に、ＰＢＳツイーン０．１％
中に１：２０または１：４０の比率で希釈する。方法（Ｃ）：この場合、震盪による抽出はテトラブチル
アンモニウムヒドロキシドを用いてメタノール／ＰＢ抽
出物と直接行われる。水相を次に液−液分別カートリッ
ジ〔登録商標クリンエルット(ClinElut)No. 1010，アナ
リチケム・インターナショナル，カリフォルニア州ハー
バーシティ〕に移し、そしてｎ−ヘキサン３０ｍｌで洗
浄する。スルホニル尿素化合物をジクロロメタン／ｎ−
ヘキサン（６０：４０）で溶出させる。有機相を蒸発さ
せ、そして残る残渣をＰＢＳ中に取り出す。

【００５０】実施例９．２：水試料の分析競合エリザのために、１０倍濃度のＰＢＳツイーン緩衝
液１００μｌを水試料８５０μｌに添加する。このバッ
チを次に抗体５０μｌと保温する。

【００５１】実施例１０：免疫精製実施例７に従って製造したモノクローナル抗体を固体支
持体、好ましくは臭化シアン〔ＣＮ−Ｂｒ〕により活性
化されたセファロース４Ｂゲル上に固定化する。後者を
次に精製操作において通常使用されるミニカラム中に充
填する。分析すべき土壌試料を注入する前に、カラムを
ＰＢＳ緩衝液〔ｐＨ７．４〕５ないし１０ｍｌで洗浄す
ることにより調整する。水性土壌試料抽出物を緩衝液５
０ｍｌ中に採取し、そして前記カラムに滴下して注入す
る。カラムを、水または水とアセトニトリルの９：１混
合物からなる洗浄液２０ｍｌで１回以上洗浄する。分析
物の溶離は、好ましくは５％リン酸を補足したアセトニ
トリル溶離液の添加により行われる。溶離段階の効率は
溶離液の流速が低下するにつれて増加する。０．５％未
満の流速が理想的である。

【００５２】ＩＩ．結果１）モノクローナル抗体の製造（ａ）実施例１．２．１に従って製造されたＫＬＨ複合
体で免疫感作されたマウスを用いた４種の融合結果物か
ら始めて、式ＩＩで表される化合物に対して高度の親和
性を有するモノクローナル抗体〔ＭＡｂ４１９７−７０
−１２〕を産生する１個のハイブリドーマが得られる。
融合率は約９０％である。上記ＭＡｂに対して見られた
第１表の化合物との交差反応性は０．１％未満である。
このＭＡｂが構造的に非常に関連するトリアスルフロン
と交差反応性を示さないという事実は特に顕著である。
本発明に係るＭＡｂを用いる標的化合物〔式ＩＩで表さ
れる化合物〕のより低い検出限界（緩衝液中）は０．１
ｎｇ／ｍｌ緩衝液の範囲である。ＭＡｂ４１９７−７０
−１２に対する相当するＩ₅₀値はで０．８ｎｇ／ｍｌで
ある。

【００５３】ＩＩＩ．寄託本発明の範囲内で製造されそして使用されるハイブリド
ーマ細胞系は国際寄託機関に認められている英国サリス
バリィにあるヨーロピアン・コレクション・オブ・アニ
マル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
の要求に従って、寄託番号ＥＣＡＣＣ９１１２０６１９
の下に１９９２年１２月６日寄託された。寄託した試料
の生存の証明書は上記国際寄託機関により発行されてい
る。細胞系寄託日寄託番号生存証明日 ──────────────────────────────── ハイブリドーマ 1991年12月 6日 91120619 1991年12月 6日クローン4197-70-12 ────────────────────────────────

【００５４】ＩＶ．培地および緩衝液（Ａ）ＲＰＭＩ１６４０培地ＲＰＭＩ１６４０（セロメド）は以下の添加剤を含む：子牛血清１５％Ｌ−グルタミン４ｍＭゲンタマイシン０．０１％ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ２−メルカプトエタノール５０μＭインシュリン５μＭトランスフェリン５μＭセレニウム（ＩＴＳ）５μＭ（Ｂ）ＨＡＴ培地ベーリンガーからのＨＡＴ濃厚液（５０倍）２０ｍｌを
添加したＲＰＭＩ１６４０培地１リットルで以下の組成
を有する：ヒポキサンチン６８０５．０ｍｇ／ｌアミノプテリン８．８ｍｇ／ｌチミジン１９３．８ｍｇ／ｌ（Ｃ）ＨＴ培地ベーリンガーからのＨＴ濃厚液（５０倍）２０ｍｌを添
加したＲＰＭＩ１６４０培地１リットルで以下の組成を
有する：ヒポキサンチン６８０５．０ｍｇ／ｌチミジン１９３．８ｍｇ／ｌ（Ｄ）ＢＳＳ緩衝液（Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含まないイ
ーグル塩溶液，ｐＨ７．４）ＫＣｌ７．３ｍＭＮａＣｌ１１６．０ｍＭＮａＨＣＯ₃ ２６．０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ１．０ｍＭグルコース５．５ｍＭフェノールレッド４８．０μＭペニシリン／ストレプトマイシン溶液（セロメド）の１
％添加（ｖ／ｖ）（ペニシリン１００００Ｕ，１０ｍｇ
／ｍｌストレプトマイシン）（Ｅ）炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）Ｎａ₂ＣＯ₃ ４７７．０ｍｇＮａＨＣＯ₃ ８７９．０ｍｇＮａＮ₃ １．８ｍｇＨ₂Ｏ３００ｍｌ添加（Ｆ）ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）ＮａＣｌ８．５ｇＮａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ１．２８ｇＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ０．４３６ｇＨ₂Ｏ１０００ｍｌ添加（Ｇ）ＰＢＳ−ツイーン２０（０．１％）ツイーン２０（セルバ）１ｍｌ＋ＰＢＳ１０００ｍｌ（Ｈ）ＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）ＢＳＡ５．０ｇＮａＮ₃（０．５Ｍ）３．０ｍｌＰＢＳ５００ｍｌ添加（Ｉ）基質緩衝液（ジエタノールアミン緩衝液，ｐＨ
９．８）ジエタノールアミン９７．０ｍｌＮａＮ₃（０．５Ｍ）６．０ｍｌＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ１００．０ｍｇＨ₂Ｏ１０００ｍｌ添加濃ＨＣｌでｐＨ９．８に調整基質の調製：使用直前に、ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート基質（シグマ１０４）の基質タブレット１個（＝５
ｍｇ）を基質緩衝液５ｍｌ中に溶解する。

【００５５】Ｖ．参考文献

【表１】

【００５６】ＶＩ．表第１表：式ＩＩで表される種々の化合物類似体の交差反応性 ────────────────────────────── ＭＡｂ４１９７−７０−１２（ａ）（ｂ）化合物Ｉ₅₀（ｎｇ／ｍｌ）交差反応性（％） ────────────────────────────── 式ＩＩの化合物０．８１００Ａ＞１０００＜０．１Ｂ＞１０００＜０．１Ｃ＞１０００＜０．１Ｄ＞１０００＜０．１ ────────────────────────────── ａ）対照と比較して５０％までエリザ信号を低下させる
阻害剤濃度ｂ）（５０％阻害のための抗原濃度）／（５０％阻害の
ための抗原類似体濃度）×１００第２表：式ＩＩで表される化合物類似体ＡないしＤの構
造式

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）標的分子のスルホンアミド部分から
実質的になる連結性成分が適当な高分子量担体分子と複
合され、（ｂ）供与動物が（ａ）に従って製造された複
合体で免疫感作され、（ｃ）免疫適格Ｂ細胞が免疫感作
された供与動物から単離され、（ｄ）該免疫適格Ｂ細胞
が連続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞と融合され、（ｅ）
生成する融合物が単離され、そして選択の後、所望の抗
体を産生するハイブリドーマ細胞がクローン化され、そ
して（ｆ）該ハイブリドーマ細胞が試験管内または生体
内で培養されてモノクローナル抗体を製造する、ことか
らなる１種またはそれ以上の次式Ａ：【化１】（式中、Ｘは１ないし３個の窒素原子を有し、そして炭素原子を
介して結合される一置換または二置換６員複素環式基を
表し、そしてｎは０ないし４の整数を表す）で表される
化合物に対して高度の特異性および親和性を有するモノ
クローナル抗体の製造方法。
【請求項２】上記式Ａ中、Ｘが一置換または二置換ト
リアジン基またはピリミジン基を表す請求項１記載の方
法。
【請求項３】（ａ）標的分子のスルホンアミド部分から
実質的になる連結性成分が適当な高分子量担体分子と複
合され、（ｂ）供与動物が（ａ）に従って製造された複
合体で免疫感作され、（ｃ）免疫適格Ｂ細胞が免疫感作
された供与動物から単離され、（ｄ）該免疫適格Ｂ細胞
が連続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞と融合され、（ｅ）
生成する融合物が単離され、そして選択の後、所望の抗
体を産生するハイブリドーマ細胞がクローン化され、そ
して（ｆ）該ハイブリドーマ細胞が試験管内または生体
内で培養されてモノクローナル抗体を製造する、ことか
らなる１種またはそれ以上の次式Ｉ：【化２】〔式中、Ｒ¹およびＲ²は互いに独立して水素原子、ハロゲン原
子、炭素原子数１ないし４のアルキル基、炭素原子数１
ないし４のハロアルキル基、炭素原子数２ないし４のハ
ロアルコキシ基、炭素原子数１ない４のアルキルチオ
基、炭素原子数１ないし４のハロアルキルチオ基、炭素
原子数２ないし４のアルコキシアルキル基、メトキシ
基、エトキシ基または次式：−ＮＲ³Ｒ⁴（式中、Ｒ³
およびＲ⁴は互いに独立して水素原子または炭素原子数
１ないし４のアルキル基を表す）で表される基を表し、Ｅは窒素原子またはメチン橋を表し、そしてｎは０ない
し４の整数を表す〕で表される化合物に対して高度の特
異性および親和性を有するモノクローナル抗体を製造す
るための請求項２記載の方法。
【請求項４】（ａ）標的分子のスルホンアミド部分から
実質的になる連結性成分が適当な高分子量担体分子と複
合され、（ｂ）供与動物が（ａ）に従って製造された複
合体で免疫感作され、（ｃ）免疫適格Ｂ細胞が免疫感作
された供与動物から単離され、（ｄ）該免疫適格Ｂ細胞
が連続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞と融合され、（ｅ）
生成する融合物が単離され、そして選択の後、所望の抗
体を産生するハイブリドーマ細胞がクローン化され、そ
して（ｆ）該ハイブリドーマ細胞が試験管内または生体
内で培養されてモノクローナル抗体を製造する、ことか
らなる次式ＩＩ：【化３】で表される化合物に対して高度の特異性および親和性を
有するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】前記連結性成分が次式ＩＩＩ：【化４】（式中、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ₂またはＳＨを表し、ｎ’は１ないし１０の整数を表し、そしてｎは０ないし
４の整数を表す）で表される化合物である請求項１ない
し４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】スルホニル尿素連結性成分との連結反応
に自由に利用される反応基を含み、そして該スルホニル
尿素成分に免疫原性を付与し得る巨大分子化合物が担体
分子として使用される請求項１ないし４のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項７】スルホニル尿素連結性成分の担体分子へ
の複合が直接行われるか、または担体分子の反応基と相
互作用し得る１種またはそれ以上の反応基を有する橋員
（スペーサー）を介して行われる請求項１ないし４のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項８】供与動物の免疫感作が連結性成分と担体
分子とからなる複合体の１回またはそれ以上の投与によ
り行われる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項９】ＨＡＴ選択培地が融合ハイブリッド細胞
の選択のために使用される請求項１ないし４のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項１０】陽性モノクローナル抗体産生性ハイブ
リッド細胞培養物が限界希釈法により単離され、そして
そのようにして得られた純粋培養物が次に適当な培養培
地中でクローン化される請求項１ないし４のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項１１】請求項１０記載の方法に従ってクロー
ン化されたハイブリドーマ細胞クローンが適当なモノク
ローナル抗体の形成に対するイムノアッセイにより試験
される請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】式ＩＩで表される化合物に対して高度
の特異性および親和性を有し、そして非常に多くの構造
的に関連する化合物と交差反応性を実質的に示さないモ
ノクローナル抗体またはその誘導体。
【請求項１３】式ＩＩで表される化合物に対して高度
の特異性および親和性を有し、そしてトリアスルフロ
ン、プリミスルフロンおよびキノスルフロン、および第
２表中の化合物Ａからなる群から選択される構造的に関
連する化合物と交差反応性を実質的に示さない請求項１
２記載のモノクローナル抗体またはその誘導体。
【請求項１４】式ＩＩで表される化合物に対して高度
の特異性および親和性を有し、そしてトリアスルフロ
ン、プリミスルフロンおよびキノスルフロン、および第
２表中の化合物Ａからなる群から選択される構造的に関
連する化合物とは１．０％未満の交差反応性を示す請求
項１３記載のモノクローナル抗体またはその誘導体。
【請求項１５】０．１％未満の交差反応性を示す請求
項１４記載のモノクローナル抗体またはその誘導体。
【請求項１６】ＥＣＡＣＣ９１１２０６１９の特徴を
有するハイブリドーマ細胞系から得られる請求項１５記
載のモノクローナル抗体または該モノクローナル抗体の
誘導体。
【請求項１７】（ａ）標的分子のスルホンアミド部分か
ら実質的になる連結性成分を適当な高分子量担体分子と
複合させ、（ｂ）供与動物を（ａ）に従って製造された
複合体で免疫感作し、（ｃ）免疫感作された供与動物か
ら免疫適格Ｂ細胞を単離し、（ｄ）該免疫適格Ｂ細胞
を、連続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞と融合し、（ｅ）
生成する融合物を単離し、そして選択の後、所望の抗体
を産生するハイブリドーマ細胞をクローニングし、そし
て（ｆ）該ハイブリドーマ細胞を試験管内または生体内
で培養し、モノクローナル抗体を製造する、ことからな
る方法により得られる、１種またはそれ以上の次式Ａ：【化５】（式中、Ｘは１ないし３個の窒素原子を有し、そして炭素原子を
介して結合される一置換または二置換６員複素環式基を
表し、そしてｎは０ないし４の整数を表す）で表される
化合物に対して高度の特異性および親和性を有するモノ
クローナル抗体またはその誘導体。
【請求項１８】１種またはそれ以上の次式Ｉ：【化６】〔式中、Ｒ¹およびＲ²は互いに独立して水素原子、ハロゲン原
子、炭素原子数１ないし４のアルキル基、炭素原子数１
ないし４のハロアルキル基、炭素原子数２ないし４のハ
ロアルコキシ基、炭素原子数１ない４のアルキルチオ
基、炭素原子数１ないし４のハロアルキルチオ基、炭素
原子数２ないし４のアルコキシアルキル基、メトキシ
基、エトキシ基または次式：−ＮＲ³Ｒ⁴（式中、Ｒ³
およびＲ⁴は互いに独立して水素原子または炭素原子数
１ないし４のアルキル基を表す）で表される基を表し、Ｅは窒素原子またはメチン橋を表し、そしてｎは０ない
し４の整数を表す〕で表される化合物に対して高度の特
異性および親和性を有する請求項１７記載のモノクロー
ナル抗体またはその誘導体。
【請求項１９】次式ＩＩ：【化７】で表される化合物に対して高度の特異性および親和性を
有する請求項１８記載のモノクローナル抗体またはその
誘導体。
【請求項２０】段階（ａ）の前記連結性成分が次式Ｉ
ＩＩ：【化８】（式中、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ₂またはＳＨを表し、ｎ’は１ないし１０の整数を表し、そしてｎは０ないし
４の整数を表す）で表される化合物である請求項１７な
いし１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】式ＩＩで表される化合物に対して高度
の特異性および親和性を有し、そして非常に多くの構造
的に関連する化合物と交差反応性を実質的に示さないモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【請求項２２】式ＩＩで表される化合物に対して高度
の特異性および親和性を有し、そしてトリアスルフロ
ン、プリミスルフロンおよびキノスルフロン、および第
２表中の化合物Ａからなる群から選択される構造的に関
連する化合物と交差反応性を実質的に示さないモノクロ
ーナル抗体を産生する請求項２９記載のハイブリドーマ
細胞系。
【請求項２３】ＥＣＡＣＣ９１１２０６１９の特徴を
有する請求項２２記載のハイブリドーマ細胞系またはそ
のクローンもしくはサブクローン。
【請求項２４】（ａ）標的分子のスルホンアミド部分か
ら実質的になる連結性成分を適当な高分子量担体分子と
複合させ、（ｂ）供与動物を（ａ）に従って製造された
複合体で免疫感作し、（ｃ）免疫感作された供与動物か
ら免疫適格Ｂ細胞を単離し、（ｄ）該免疫適格Ｂ細胞
を、連続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞と融合し、そして
（ｅ）生成する融合物を単離し、そして選択の後、所望
の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をクローニングす
る、ことからなる方法により得られる、１種またはそれ
以上の次式Ａ：【化９】（式中、Ｘは１ないし３個の窒素原子を有し、そして炭素原子を
介して結合される一置換または二置換６員複素環式基を
表し、そしてｎは０ないし４の整数を表す）で表される
化合物に対して高度の特異性および親和性を有するモノ
クローナル抗体またはその誘導体を産生するハイブリド
ーマ細胞系。
【請求項２５】自然に生じるか、または公知突然変異
方法により製造され得、そして１種またはそれ以上の式
Ａで表される化合物に対して高度の特異性および親和性
を有するモノクローナル抗体またはその誘導体を依然と
して産生する請求項２１ないし２４のいずれか１項に記
載のハイブリドーマ細胞系の突然変異体または変種。
【請求項２６】請求項１７または１８のいずれか１項
に記載のモノクローナル抗体が公知イムノアッセイの一
つに使用される一般式Ｉで表されるスルホニル尿素除草
剤の免疫学的検出方法。
【請求項２７】請求項１２ないし１６および１９のい
ずれか１項に記載のモノクローナル抗体が公知イムノア
ッセイの一つに使用される式ＩＩで表される化合物の免
疫学的検出方法。
【請求項２８】ＥＣＡＣＣ９１１２０６１９の特徴を
有するハイブリドーマ細胞系またはそのクローンもしく
はサブクローンから得られるモノクローナル抗体が使用
される請求項２７記載の式ＩＩで表される化合物の免疫
学的検出方法。
【請求項２９】前記イムノアッセイが競合的イムノア
ッセイである請求項２６ないし２８のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項３０】慣用の支持材、試薬およびその他の添
加剤の他に、試薬として請求項１７または１８のいずれ
か１項に記載のモノクローナル抗体を少なくとも１種含
有する、使用のために調整されている試験キットの形態
にある一般式Ｉで表されるスルホニル尿素除草剤の免疫
学的検出用組成物。
【請求項３１】慣用の支持材、試薬およびその他の添
加剤の他に、試薬として請求項１２ないし１６および１
９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を少なく
とも１種含有する、使用のために調整されている試験キ
ットの形態にある式ＩＩで表される化合物の免疫学的検
出用組成物。
【請求項３２】慣用の支持材、試薬およびその他の添
加剤の他に、ＥＣＡＣＣ９１１２０６１９の特徴を有す
るハイブリドーマ細胞系またはそのクローンもしくはサ
ブクローンから得られるモノクローナル抗体を少なくと
も１種含有する、請求項３１記載の使用のために調整さ
れている試験キットの形態にある式ＩＩで表される化合
物の免疫学的検出用組成物。
【請求項３３】次式ＩＩＩ：【化１０】（式中、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ₂またはＳＨを表し、ｎ’は１ないし１０の整数を表し、そしてｎは０ないし
４の整数を表す）で表される連結性成分。
【請求項３４】（ａ）請求項１７または１８のいずれか
１項に記載のモノクローナル抗体が固体支持体に固定化
され、（ｂ）該支持体がミニカラム内に設置され、
（ｃ）精製または分析されるべき試料を含む緩衝液が該
カラムに注入され、（ｄ）場合により、１またはそれ以
上の洗浄段階が行われ、そして（ｅ）分析物が適当な溶
離液でカラムから溶離される、免疫精製法において請求
項１７または１８のいずれか１項に記載のモノクローナ
ル抗体を使用する方法。
【請求項３５】（ａ）請求項１２ないし１６および１９
のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体が固体支持
体に固定化され、（ｂ）該支持体がミニカラム内に設置
され、（ｃ）精製または分析されるべき試料を含む緩衝
液が該カラムに注入され、（ｄ）場合により、１または
それ以上の洗浄段階が行われ、そして（ｅ）分析物が適
当な溶離液でカラムから溶離される、免疫精製法におい
て請求項１２ないし１６および１９のいずれか１項に記
載のモノクローナル抗体を使用する方法。