JPH05322899A - Ｄｎａ分子の長さ計測方法および計測装置 - Google Patents
Ｄｎａ分子の長さ計測方法および計測装置Info
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- JPH05322899A JPH05322899A JP4238033A JP23803392A JPH05322899A JP H05322899 A JPH05322899 A JP H05322899A JP 4238033 A JP4238033 A JP 4238033A JP 23803392 A JP23803392 A JP 23803392A JP H05322899 A JPH05322899 A JP H05322899A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 微量のＤＮＡ等試料を用いて、高い精度で長
さ計測を可能とするＤＮＡ等生体高分子の長さ計測装置
を提供する。 【構成】 長いＤＮＡを酵素で切断し、断片の両末端を
標識するプロセス、標識されたＤＮＡをゲル電気泳動、
あるいは細孔流出などを用いＤＮＡ分子を直線状に配向
させる手段１およびレーザー光４ａ照射による蛍光を検
出する手段７から構成され、検出される蛍光の時間差分
布からＤＮＡ塩基長を決定する。また、ＤＮＡ断片の一
端に標識物を結合し、他端を担体に固定し、電界等の外
力によりＤＮＡ断片を伸長させ、ＤＮＡ断片長を測定す
る。 【効果】 ＤＮＡ断片分子集団の拡散による空間的広が
りなどの影響を受けずにＤＮＡ塩基長を測定できる。更
に、長いＤＮＡに蛍光標識ＤＮＡプローブをハイブリダ
イズさせ、その位置を片方の端から順次計測できる。
さ計測を可能とするＤＮＡ等生体高分子の長さ計測装置
を提供する。 【構成】 長いＤＮＡを酵素で切断し、断片の両末端を
標識するプロセス、標識されたＤＮＡをゲル電気泳動、
あるいは細孔流出などを用いＤＮＡ分子を直線状に配向
させる手段１およびレーザー光４ａ照射による蛍光を検
出する手段７から構成され、検出される蛍光の時間差分
布からＤＮＡ塩基長を決定する。また、ＤＮＡ断片の一
端に標識物を結合し、他端を担体に固定し、電界等の外
力によりＤＮＡ断片を伸長させ、ＤＮＡ断片長を測定す
る。 【効果】 ＤＮＡ断片分子集団の拡散による空間的広が
りなどの影響を受けずにＤＮＡ塩基長を測定できる。更
に、長いＤＮＡに蛍光標識ＤＮＡプローブをハイブリダ
イズさせ、その位置を片方の端から順次計測できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡなどのポリヌク
レオチドあるいは生体高分子の長さ（または分子量）を
測定する方法とその装置に関し、特に５０Ｋ（キロ）塩
基長以上、とりわけ１００Ｋ（キロ）塩基長以上の長さ
のポリヌクレオチドの長さの測定に関する。このような
ポリヌクレオチドの長さの測定は、医化学、生化学、遺
伝学等の分野に有用な遺伝子の分析手段の一つである。
レオチドあるいは生体高分子の長さ（または分子量）を
測定する方法とその装置に関し、特に５０Ｋ（キロ）塩
基長以上、とりわけ１００Ｋ（キロ）塩基長以上の長さ
のポリヌクレオチドの長さの測定に関する。このような
ポリヌクレオチドの長さの測定は、医化学、生化学、遺
伝学等の分野に有用な遺伝子の分析手段の一つである。
【０００２】
【従来の技術】従来、長いＤＮＡ鎖の塩基長（あるいは
分子量）の測定には一定方向に電場を与えるゲル電気泳
動が用いられていた。ポリアクリルアミドゲルは数塩基
〜２Ｋ（キロ）塩基のＤＮＡ分離に有効で、アガロース
ゲルは１Ｋ（キロ）〜２０Ｋ（キロ）塩基の分離に用い
られている。従来行なわれていた一定方向に電場を与え
る電気泳動では、ポリアクリルアミドゲルあるいはアガ
ロースゲルによる分子サイズの分離は分子の空間的な広
がりを利用して分離するものであった。すなわち空間的
に広がった分子がゲル網目を通り抜けられるか否かで分
離する。大きな分子はそのままでは通り抜けられず長く
伸びた状態となる。長く伸びた分子の短い径のサイズで
分離が行なわれるが、ＤＮＡ分子サイズは単に長さの差
となるので分子ふるいでは長いＤＮＡの分離はできな
い。更にアガロースゲルを用い泳動電場方向をパルス的
に変化させるパルスフィールド電気泳動により数十Ｍ
（メガ）〜数Ｍ（メガ）塩基の分離が行なわれている。
分子量）の測定には一定方向に電場を与えるゲル電気泳
動が用いられていた。ポリアクリルアミドゲルは数塩基
〜２Ｋ（キロ）塩基のＤＮＡ分離に有効で、アガロース
ゲルは１Ｋ（キロ）〜２０Ｋ（キロ）塩基の分離に用い
られている。従来行なわれていた一定方向に電場を与え
る電気泳動では、ポリアクリルアミドゲルあるいはアガ
ロースゲルによる分子サイズの分離は分子の空間的な広
がりを利用して分離するものであった。すなわち空間的
に広がった分子がゲル網目を通り抜けられるか否かで分
離する。大きな分子はそのままでは通り抜けられず長く
伸びた状態となる。長く伸びた分子の短い径のサイズで
分離が行なわれるが、ＤＮＡ分子サイズは単に長さの差
となるので分子ふるいでは長いＤＮＡの分離はできな
い。更にアガロースゲルを用い泳動電場方向をパルス的
に変化させるパルスフィールド電気泳動により数十Ｍ
（メガ）〜数Ｍ（メガ）塩基の分離が行なわれている。
【０００３】１００Ｋ（キロ）塩基長以上の大きさのＤ
ＮＡの分離測定については、カンター・チャールズ・ア
ールにより記載された特表昭５９−５０２０３７号公報
記載の「交番する交差電界を使用する電気泳動法」なら
びに、ビー・ダブリュー・ビッレン他、ニュークレイッ
ク アシッド リサーチ（B．W．Birren et al,Nucleic
Acid Research）、第１６巻（１９８８年）、第７５６
３頁から第７５８２頁がくわしい。この方法は、電解質
溶液を含む例えばアガロースなどの網目状高分子ゲル担
体中の孔に、測定対象物である巨大ＤＮＡ断片の混合液
を注入し、電界の方向をパルス状に変化させながら泳動
を行い、ＤＮＡを大きさの順に分離している。例えば、
０．７％の濃度のアガロース担体を用い、泳動方向にた
いして電界の方向を３０分おきにたとえば±１０６度変
化させながら、２Ｖ／ｃｍの電界強度で９５時間泳動す
ると、３Ｍ（メガ）塩基長から１０Ｍ（メガ）塩基長程
度のＤＮＡを分離できる。分離したＤＮＡのバンド幅か
ら、１０％程度の誤差でＤＮＡ長が測定できると考えら
れる。このようなパルスフィールド電気泳動では電場の
方向を変化させて与えることにより、長く配向した分子
の配向の方向を変化させ、この配向に要する時間が分子
の長さに依存することを利用している(長谷川、菊池、
実験医学、第５巻、３６４頁〜３７０頁(１９８
７））。
ＮＡの分離測定については、カンター・チャールズ・ア
ールにより記載された特表昭５９−５０２０３７号公報
記載の「交番する交差電界を使用する電気泳動法」なら
びに、ビー・ダブリュー・ビッレン他、ニュークレイッ
ク アシッド リサーチ（B．W．Birren et al,Nucleic
Acid Research）、第１６巻（１９８８年）、第７５６
３頁から第７５８２頁がくわしい。この方法は、電解質
溶液を含む例えばアガロースなどの網目状高分子ゲル担
体中の孔に、測定対象物である巨大ＤＮＡ断片の混合液
を注入し、電界の方向をパルス状に変化させながら泳動
を行い、ＤＮＡを大きさの順に分離している。例えば、
０．７％の濃度のアガロース担体を用い、泳動方向にた
いして電界の方向を３０分おきにたとえば±１０６度変
化させながら、２Ｖ／ｃｍの電界強度で９５時間泳動す
ると、３Ｍ（メガ）塩基長から１０Ｍ（メガ）塩基長程
度のＤＮＡを分離できる。分離したＤＮＡのバンド幅か
ら、１０％程度の誤差でＤＮＡ長が測定できると考えら
れる。このようなパルスフィールド電気泳動では電場の
方向を変化させて与えることにより、長く配向した分子
の配向の方向を変化させ、この配向に要する時間が分子
の長さに依存することを利用している(長谷川、菊池、
実験医学、第５巻、３６４頁〜３７０頁(１９８
７））。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術では非常
に大きなＤＮＡでも、パルスフィールドを用いて分離す
ることで長さの情報を得ることができる。しかし、ＤＮ
Ａ長が長くなればなるほど分離に要する時間が長くなる
問題点がある。たとえば、３Ｍ（メガ）塩基から１０Ｍ
（メガ）塩基程度の長さのＤＮＡを分離するには、通常
３日から４日かかる。この従来技術では、ゲル担体を構
成する網目分子の間に、ＤＮＡ端が出たり入ったりしな
がらゲル中を移動する間にＤＮＡが大きさ、すなわち長
さの違いにより分離される。よって、ゲル担体中での移
動距離が短いと分離が悪くなる。また、高電界強度下で
泳動を行うと発熱により分離が悪くなる。このため従来
技術では分析時間を短くすることは難しい。また、ＤＮ
Ａ長が長いほど泳動に時間がかかるため、数１０Ｍ（メ
ガ）塩基以上のＤＮＡの分離には実用に適さない。さら
に、泳動に長時間を要するため、分離したＤＮＡのバン
ド幅が広がるため、ＤＮＡが長いほど得られる長さの精
度が悪くなる。また、上記従来法の電気泳動ではパルス
フィールド電気泳動も含め、被測定物を異なる分子サイ
ズをもつ集団として、分子サイズと電気泳動速度の差を
利用して分離計測する。このため前述のように分子が長
くなるにつれ分離しにくくなると同時に、拡散などによ
り、同じ分子サイズをもつ集団の占める体積が空間的に
広がるため、ＤＮＡなどの長い分子の分離は良くない。
に大きなＤＮＡでも、パルスフィールドを用いて分離す
ることで長さの情報を得ることができる。しかし、ＤＮ
Ａ長が長くなればなるほど分離に要する時間が長くなる
問題点がある。たとえば、３Ｍ（メガ）塩基から１０Ｍ
（メガ）塩基程度の長さのＤＮＡを分離するには、通常
３日から４日かかる。この従来技術では、ゲル担体を構
成する網目分子の間に、ＤＮＡ端が出たり入ったりしな
がらゲル中を移動する間にＤＮＡが大きさ、すなわち長
さの違いにより分離される。よって、ゲル担体中での移
動距離が短いと分離が悪くなる。また、高電界強度下で
泳動を行うと発熱により分離が悪くなる。このため従来
技術では分析時間を短くすることは難しい。また、ＤＮ
Ａ長が長いほど泳動に時間がかかるため、数１０Ｍ（メ
ガ）塩基以上のＤＮＡの分離には実用に適さない。さら
に、泳動に長時間を要するため、分離したＤＮＡのバン
ド幅が広がるため、ＤＮＡが長いほど得られる長さの精
度が悪くなる。また、上記従来法の電気泳動ではパルス
フィールド電気泳動も含め、被測定物を異なる分子サイ
ズをもつ集団として、分子サイズと電気泳動速度の差を
利用して分離計測する。このため前述のように分子が長
くなるにつれ分離しにくくなると同時に、拡散などによ
り、同じ分子サイズをもつ集団の占める体積が空間的に
広がるため、ＤＮＡなどの長い分子の分離は良くない。
【０００５】また、電場の方向が変化するように与える
パルスフィールド電気泳動では検出にラジオアイソトー
プ標識やエチジウムブロマトド染色を用いるが、十分な
検出感度を得るには多くの同じ長さをもつ分子（コピ
ー）が多数必要であり、多くのコピーを準備する必要が
ある。分子の熱拡散の影響などにより分離能はあまり高
くなく分子の長さの測定精度はひくい。本発明の目的
は、上記従来技術の難点を解消し、分子長の長いＤＮＡ
等の生体高分子でも短時間に高い精度でそれらの塩基長
を計測する方法とその装置を提供することにあり、とく
に同じ長さをもつ分子（コピー）が少ない場合の上記方
法と装置を提供することにあり、さらに特に１Ｍ（メ
ガ）塩基以上のＤＮＡ分子の長さを精度良く、短時間で
測定できる方法と装置を提供することにある。
パルスフィールド電気泳動では検出にラジオアイソトー
プ標識やエチジウムブロマトド染色を用いるが、十分な
検出感度を得るには多くの同じ長さをもつ分子（コピ
ー）が多数必要であり、多くのコピーを準備する必要が
ある。分子の熱拡散の影響などにより分離能はあまり高
くなく分子の長さの測定精度はひくい。本発明の目的
は、上記従来技術の難点を解消し、分子長の長いＤＮＡ
等の生体高分子でも短時間に高い精度でそれらの塩基長
を計測する方法とその装置を提供することにあり、とく
に同じ長さをもつ分子（コピー）が少ない場合の上記方
法と装置を提供することにあり、さらに特に１Ｍ（メ
ガ）塩基以上のＤＮＡ分子の長さを精度良く、短時間で
測定できる方法と装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の一つの方法として本発明では、ＤＮＡ等の生体高分子
の少なくとも2ケ所、たとえば両末端に蛍光分子を標識
し、一定方向に電場を与える電気泳動によって、あるい
は細孔流出によって、これら高分子をひきのばし直線に
近い状態にした後、高分子がその長さによらず一定速度
で泳動するゲル等のないバッファー液中に導き、分子の
長さを計測する。分子の長さの計測は生体高分子の両末
端に標識した蛍光体を付加し、これをレーザー光で励起
し発する蛍光を検出することによって行なう。ＤＮＡ等
の生体高分子の両末端に蛍光分子を標識することは周知
である。また、生体高分子の泳動速度は、ＤＮＡ鎖が引
きちぎれない速度未満であればよく、この上限速度はそ
の生体高分子の長さに依存するものであり、具体的には
実験的に定められる。上記の生体高分子の長さは、被測
定生体高分子を直線状に配向して移動させる手段、生体
高分子の両待ったに標識された蛍光体を励起する光源、
励起された蛍光体から発せられた蛍光を生体高分子を直
線状に検出する手段、及び生体高分子の一方の末端から
蛍光が検出されてから他方の末端から蛍光が検出される
までの時間を計測する手段を有する、長さ計測装置によ
り測定される。生体高分子を直線状に配向して移動させ
る手段は、電気泳動および／もしくはバッファー液流を
発生させる手段を有し、かつ生体高分子の移動路には直
径数μｍ望ましくは直径１μｍ以下もしくはこれに相当
する形状の領域を有するものである。生体高分子の移動
路に、直径が数μｍ〜１μｍ以下の領域を設ける理由
は、生体高分子の長さを、単分子によりすなわち、ＤＮ
Ａ分子を１本づつ引き出して測定するためである。
の一つの方法として本発明では、ＤＮＡ等の生体高分子
の少なくとも2ケ所、たとえば両末端に蛍光分子を標識
し、一定方向に電場を与える電気泳動によって、あるい
は細孔流出によって、これら高分子をひきのばし直線に
近い状態にした後、高分子がその長さによらず一定速度
で泳動するゲル等のないバッファー液中に導き、分子の
長さを計測する。分子の長さの計測は生体高分子の両末
端に標識した蛍光体を付加し、これをレーザー光で励起
し発する蛍光を検出することによって行なう。ＤＮＡ等
の生体高分子の両末端に蛍光分子を標識することは周知
である。また、生体高分子の泳動速度は、ＤＮＡ鎖が引
きちぎれない速度未満であればよく、この上限速度はそ
の生体高分子の長さに依存するものであり、具体的には
実験的に定められる。上記の生体高分子の長さは、被測
定生体高分子を直線状に配向して移動させる手段、生体
高分子の両待ったに標識された蛍光体を励起する光源、
励起された蛍光体から発せられた蛍光を生体高分子を直
線状に検出する手段、及び生体高分子の一方の末端から
蛍光が検出されてから他方の末端から蛍光が検出される
までの時間を計測する手段を有する、長さ計測装置によ
り測定される。生体高分子を直線状に配向して移動させ
る手段は、電気泳動および／もしくはバッファー液流を
発生させる手段を有し、かつ生体高分子の移動路には直
径数μｍ望ましくは直径１μｍ以下もしくはこれに相当
する形状の領域を有するものである。生体高分子の移動
路に、直径が数μｍ〜１μｍ以下の領域を設ける理由
は、生体高分子の長さを、単分子によりすなわち、ＤＮ
Ａ分子を１本づつ引き出して測定するためである。
【０００７】上記目的を達成するための他の方法とし
て、本発明では、ＤＮＡの一端あるいはＤＮＡ分子中の
所定の部位に標識物を結合し、他の一端を担体に物理的
または化学的に固定し、ＤＮＡを電界あるいは液流など
により伸長させ、標識物の結合した末端位置を検出する
ことによりＤＮＡ長を測定する。このようにＤＮＡを外
力により伸長させて、両末端間の距離を測定すること
で、ＤＮＡの長さを一分子ごと測定する。ここで、ＤＮ
Ａを必ずしも完全に伸長させて、絶対的な長さを求める
必要はない。特にＤＮＡが長いと熱振動等に起因するゆ
らぎが存在するために、完全に伸長させることは困難に
なる。このような場合は、既知の長さのＤＮＡを用いて
検量線を作成し被測定対象のＤＮＡ長を求めればよい。
ＤＮＡの固定には従来ニトロセルロース膜やナイロン誘
導体等がハイブリダイゼーション用として多用されてい
るが、固定したＤＮＡは多点で固定されるため、ＤＮＡ
を引き延ばせず使用できない。ＤＮＡの一端のみを確実
に固定する必要がある。その一例をより具体的に説明す
ると、図８に示す概念図のように、一方の先端に標識物
１０２が結合している、長さ測定対象のＤＮＡ１０１の
他の末端に、直径が０．２μｍないし数μｍ程度の粒子
１０３を結合させる。次に、ＤＮＡ１０１は通過できる
が粒子１０３は通過できないような細孔１０６があいた
担体１０４に粒子１０３の付いたＤＮＡを通過させる。
ＤＮＡ部分は細孔１０６を通過するが粒子１０３部分は
細孔を通過できないので、ＤＮＡの一端を特定の位置に
固定できる。電極１０５ａ、１０５ｂ間に電界をかけ
て、あるいは液流等でＤＮＡを泳動させると、粒子１０
３部分は細孔の入り口に固定され、同時にＤＮＡは伸長
する。標識物の位置を細孔１０６にそって探索してい
き、ＤＮＡの一端の標識物２を固定端である粒子１０３
に対する位置として検出する。
て、本発明では、ＤＮＡの一端あるいはＤＮＡ分子中の
所定の部位に標識物を結合し、他の一端を担体に物理的
または化学的に固定し、ＤＮＡを電界あるいは液流など
により伸長させ、標識物の結合した末端位置を検出する
ことによりＤＮＡ長を測定する。このようにＤＮＡを外
力により伸長させて、両末端間の距離を測定すること
で、ＤＮＡの長さを一分子ごと測定する。ここで、ＤＮ
Ａを必ずしも完全に伸長させて、絶対的な長さを求める
必要はない。特にＤＮＡが長いと熱振動等に起因するゆ
らぎが存在するために、完全に伸長させることは困難に
なる。このような場合は、既知の長さのＤＮＡを用いて
検量線を作成し被測定対象のＤＮＡ長を求めればよい。
ＤＮＡの固定には従来ニトロセルロース膜やナイロン誘
導体等がハイブリダイゼーション用として多用されてい
るが、固定したＤＮＡは多点で固定されるため、ＤＮＡ
を引き延ばせず使用できない。ＤＮＡの一端のみを確実
に固定する必要がある。その一例をより具体的に説明す
ると、図８に示す概念図のように、一方の先端に標識物
１０２が結合している、長さ測定対象のＤＮＡ１０１の
他の末端に、直径が０．２μｍないし数μｍ程度の粒子
１０３を結合させる。次に、ＤＮＡ１０１は通過できる
が粒子１０３は通過できないような細孔１０６があいた
担体１０４に粒子１０３の付いたＤＮＡを通過させる。
ＤＮＡ部分は細孔１０６を通過するが粒子１０３部分は
細孔を通過できないので、ＤＮＡの一端を特定の位置に
固定できる。電極１０５ａ、１０５ｂ間に電界をかけ
て、あるいは液流等でＤＮＡを泳動させると、粒子１０
３部分は細孔の入り口に固定され、同時にＤＮＡは伸長
する。標識物の位置を細孔１０６にそって探索してい
き、ＤＮＡの一端の標識物２を固定端である粒子１０３
に対する位置として検出する。
【０００８】ＤＮＡの固定端に粒子を固定させるには、
周知のカルボジイミド法（後述の実施例１に記載の固定
方法）、グルタルアルデヒド（gultaraldehyde）法、エ
スピーデーピー（ＳＰＤＰ）（エヌ−スクシンイミジィ
ル ３−（２−ピリィジィルジチオ） プロピオネート
（N-succinimidyl 3-(2-pyridylditio) propionate））
法などのような２価性試薬を用いる方法により、アミノ
基を有するプライマーの粒子を結合せしめ、これをライ
ゲーション（ligation)法で目的のＤＮＡに結合させる
とよい。ＤＮＡの固定端に固定する粒子には、例えばラ
テックス粒子、アクリル系粒子が用いられる。ＤＮＡの
一方の末端に蛍光体等の標識物を結合するには、周知の
ライゲーション法を用いるとよい。ＤＮＡの固定端を固
定する、細孔のあいた担体は、シリコンウェーハや石英
ガラス等に、電子線加工、スパッタリング等の半導体加
工方法により、直径が０．１μｍ以上で固定粒子の直径
未満の細孔を形成することにより作られる。細孔の直径
は、加工工程の下限が０．１μｍであるので、０．１μ
ｍとする。ＤＮＡを伸長させるために印加する電界の強
さは、４０〜５０Ｖ／ｃｍでＤＮＡが切断されない範囲
とする。また、標識蛍光体の位置は励起用のレーザ光の
照射位置を移動させて、蛍光の発せられる位置を検出し
て行う。ＤＮＡの他方の末端に結合させる標識物として
酵素を結合して、これを検出するには、例えば次のよう
な方法を用いる。まず、アルカリホスファターゼをＳＰ
ＤＰ法で末端に結合させ、エーエムピーピーデー（ＡＭ
ＰＰＤ）（（3-(2'-spiroadamantane)-4-mettoxy-4-(3"
-phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetane））を基質とし
て化学発光させ、その発光点をシーシーディ（ＣＣＤ）
カメラ、あるいはイメージ増幅器付きカメラ等で検出す
る。
周知のカルボジイミド法（後述の実施例１に記載の固定
方法）、グルタルアルデヒド（gultaraldehyde）法、エ
スピーデーピー（ＳＰＤＰ）（エヌ−スクシンイミジィ
ル ３−（２−ピリィジィルジチオ） プロピオネート
（N-succinimidyl 3-(2-pyridylditio) propionate））
法などのような２価性試薬を用いる方法により、アミノ
基を有するプライマーの粒子を結合せしめ、これをライ
ゲーション（ligation)法で目的のＤＮＡに結合させる
とよい。ＤＮＡの固定端に固定する粒子には、例えばラ
テックス粒子、アクリル系粒子が用いられる。ＤＮＡの
一方の末端に蛍光体等の標識物を結合するには、周知の
ライゲーション法を用いるとよい。ＤＮＡの固定端を固
定する、細孔のあいた担体は、シリコンウェーハや石英
ガラス等に、電子線加工、スパッタリング等の半導体加
工方法により、直径が０．１μｍ以上で固定粒子の直径
未満の細孔を形成することにより作られる。細孔の直径
は、加工工程の下限が０．１μｍであるので、０．１μ
ｍとする。ＤＮＡを伸長させるために印加する電界の強
さは、４０〜５０Ｖ／ｃｍでＤＮＡが切断されない範囲
とする。また、標識蛍光体の位置は励起用のレーザ光の
照射位置を移動させて、蛍光の発せられる位置を検出し
て行う。ＤＮＡの他方の末端に結合させる標識物として
酵素を結合して、これを検出するには、例えば次のよう
な方法を用いる。まず、アルカリホスファターゼをＳＰ
ＤＰ法で末端に結合させ、エーエムピーピーデー（ＡＭ
ＰＰＤ）（（3-(2'-spiroadamantane)-4-mettoxy-4-(3"
-phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetane））を基質とし
て化学発光させ、その発光点をシーシーディ（ＣＣＤ）
カメラ、あるいはイメージ増幅器付きカメラ等で検出す
る。
【０００９】
【作用】一定方向に電場を与える電気泳動では分子サイ
ズの大きな高分子は泳動媒体中では長く伸びた状態とな
り、このように直線状に配向した高分子はバッファー液
中に導かれ、直線状に配向したままの状態で泳動してい
く。生体高分子の両末端に標識された蛍光体は光検出部
で１μｍ以下に絞られたレーザー光により照射され蛍光
を発する。高分子の一方の末端の蛍光標識がレーザー照
射部位を通過してから、高分子の他の末端の蛍光標識が
レーザー照射部位を通過するまでの時間を計測する。泳
動ゲルの濃度がゼロのバッファー液中では生体高分子は
電場強度が一定の場合には分子の長さによらず一定速度
で泳動するので、生体高分子の両末端に標識された蛍光
体がレーザー照射部位を通過するのに要する時間とその
速度から生体高分子の両末端に標識された蛍光体間の距
離が測定できることになる。これにより、ＤＮＡ分子の
長さ、さらにＤＮＡの塩基長を知ることができる。この
方法では１分子（１コピー）のＤＮＡの場合でも分子の
長さが測定でき、分子数が多い分子集団の場合に生じる
拡散の影響がないので高い精度で分子の長さあるいは塩
基長の測定ができる。また、本発明ではＤＮＡの一端を
固定し、ＤＮＡに外力を加え伸長させて、両末端間の距
離を測定する。ＤＮＡの固定端と反対側の末端には、蛍
光体や酵素などの標識物が結合している。固定端の位置
は、粒子を結合したＤＮＡを細孔に固定する場合等は、
細孔の位置が既知のためあらかじめ規定することができ
る。あるいは固定端にも標識体を結合することにより規
定できる。標識体の結合した他の末端は、標識体が蛍光
体であればその螢光を検出することにより、酵素では酵
素活性を測定することで検出できる。例えば、１Ｍ（メ
ガ）塩基からなる二重らせんのＤＮＡは伸長させると約
０．３４ｍｍの長さになる。固定端や標識体の大きさは
１μｍ以下なので、ＤＮＡの固定端と標識物の結合した
他の末端を、容易に分離して認識できる。このように、
ＤＮＡの長さを一分子ごと測定できる。
ズの大きな高分子は泳動媒体中では長く伸びた状態とな
り、このように直線状に配向した高分子はバッファー液
中に導かれ、直線状に配向したままの状態で泳動してい
く。生体高分子の両末端に標識された蛍光体は光検出部
で１μｍ以下に絞られたレーザー光により照射され蛍光
を発する。高分子の一方の末端の蛍光標識がレーザー照
射部位を通過してから、高分子の他の末端の蛍光標識が
レーザー照射部位を通過するまでの時間を計測する。泳
動ゲルの濃度がゼロのバッファー液中では生体高分子は
電場強度が一定の場合には分子の長さによらず一定速度
で泳動するので、生体高分子の両末端に標識された蛍光
体がレーザー照射部位を通過するのに要する時間とその
速度から生体高分子の両末端に標識された蛍光体間の距
離が測定できることになる。これにより、ＤＮＡ分子の
長さ、さらにＤＮＡの塩基長を知ることができる。この
方法では１分子（１コピー）のＤＮＡの場合でも分子の
長さが測定でき、分子数が多い分子集団の場合に生じる
拡散の影響がないので高い精度で分子の長さあるいは塩
基長の測定ができる。また、本発明ではＤＮＡの一端を
固定し、ＤＮＡに外力を加え伸長させて、両末端間の距
離を測定する。ＤＮＡの固定端と反対側の末端には、蛍
光体や酵素などの標識物が結合している。固定端の位置
は、粒子を結合したＤＮＡを細孔に固定する場合等は、
細孔の位置が既知のためあらかじめ規定することができ
る。あるいは固定端にも標識体を結合することにより規
定できる。標識体の結合した他の末端は、標識体が蛍光
体であればその螢光を検出することにより、酵素では酵
素活性を測定することで検出できる。例えば、１Ｍ（メ
ガ）塩基からなる二重らせんのＤＮＡは伸長させると約
０．３４ｍｍの長さになる。固定端や標識体の大きさは
１μｍ以下なので、ＤＮＡの固定端と標識物の結合した
他の末端を、容易に分離して認識できる。このように、
ＤＮＡの長さを一分子ごと測定できる。
【００１０】
【実施例】本発明における、ＤＮＡの両末端に蛍光標識
する場合の実施例の基本的事項について図１および図２
を用いて説明する。図１（ａ）はＤＮＡの酵素による切
断、図１（ｂ）はＤＮＡ断片の末端の蛍光標識、を示
す。本発明による生体高分子の長さの測定の原理を、Ｄ
ＮＡ分子の長さの測定を例にとって概略を説明すると次
のようになる。 ＤＮＡ分子を酵素により切断する（図１(ａ）)。 切断部末端に蛍光標識を結合し、分子の両末端が蛍光
標識されたＤＮＡ断片分子を作成する（図１(ｂ）)。 蛍光標識されたＤＮＡ断片分子をアガロースゲル中で
電気泳動させ、ＤＮＡ断片分子を直線状に配向させる。 アガロースゲルの電気泳動路の直径１μｍ以下の出口
からＤＮＡ断片分子を直線状の配向を保持したままバッ
ファー液中に取り出す。なお、電気泳動路の分子の流出
部の直径の下限は実質的に加工工程の限界で定まる。 電気泳動路の出口のごく近傍（出口から１ｍｍ以内）
の部位で、上記ＤＮＡ断片分子に極めて細く絞ったレー
ザー光を照射する。 上記レーザー光の照射により蛍光標識されたＤＮＡ断
片分子の末端から発した蛍光を受光し光検出器７により
検出する（図２）。蛍光標識されたＤＮＡ断片分子の両
末端の蛍光体が、上記レーザー光照射部位を通過するに
要する時間を計時手段により測定し、ＤＮＡ分子の流速
とからＤＮＡ断片分子の長さを求める。
する場合の実施例の基本的事項について図１および図２
を用いて説明する。図１（ａ）はＤＮＡの酵素による切
断、図１（ｂ）はＤＮＡ断片の末端の蛍光標識、を示
す。本発明による生体高分子の長さの測定の原理を、Ｄ
ＮＡ分子の長さの測定を例にとって概略を説明すると次
のようになる。 ＤＮＡ分子を酵素により切断する（図１(ａ）)。 切断部末端に蛍光標識を結合し、分子の両末端が蛍光
標識されたＤＮＡ断片分子を作成する（図１(ｂ）)。 蛍光標識されたＤＮＡ断片分子をアガロースゲル中で
電気泳動させ、ＤＮＡ断片分子を直線状に配向させる。 アガロースゲルの電気泳動路の直径１μｍ以下の出口
からＤＮＡ断片分子を直線状の配向を保持したままバッ
ファー液中に取り出す。なお、電気泳動路の分子の流出
部の直径の下限は実質的に加工工程の限界で定まる。 電気泳動路の出口のごく近傍（出口から１ｍｍ以内）
の部位で、上記ＤＮＡ断片分子に極めて細く絞ったレー
ザー光を照射する。 上記レーザー光の照射により蛍光標識されたＤＮＡ断
片分子の末端から発した蛍光を受光し光検出器７により
検出する（図２）。蛍光標識されたＤＮＡ断片分子の両
末端の蛍光体が、上記レーザー光照射部位を通過するに
要する時間を計時手段により測定し、ＤＮＡ分子の流速
とからＤＮＡ断片分子の長さを求める。
【００１１】実施例１ 以下、本発明による実施例をより詳細に説明する。 まず分子の長さあるいは塩基長を測定しようとするＤ
ＮＡ分子の試料溶液１０に、制限酵素（例えば NotＩ
等）により各塩基の部所に特徴的な化学反応を起こさせ
て複数のＤＮＡ断片分子に切断する（図１（ａ））。 これら切断されたＤＮＡ断片部末端に酵素（ライゲー
ス（ligase））を用いて蛍光標識１４ａ、１４ｂ付のＤ
ＮＡオリゴマーを結合して標識付ＤＮＡ試料１１を得る
（図１（ｂ））。二本鎖状の蛍光標識されたＤＮＡオリ
ゴマーを制限酵素により切断された切断部末端に結合す
るが、二本のＤＮＡ鎖それぞれに蛍光体を１個あるいは
複数個導入しておく。１つの切断部末端当たり２個ある
いは２個以上の蛍光体分子を結合することができる。蛍
光体としてエフアイテーシー（ＦＩＴＣ）（フルオレッ
セイン イソチオシアネート（fluoresceine isothiocy
anate：発光波長極大５２５ｎｍ）あるいはテキサス
レッド（Texas Red）(発光波長極大６１５ｎｍ）等を用
いることができる。 分子の両末端に蛍光標識されたＤＮＡ断片分子１１
を、図２に示すＤＮＡ等高分子の長さ測定装置の上部バ
ッファー槽１５に試料注入具１２により注入して、細管
２０中のアガロースゲル中で電気泳動すると、両末端が
蛍光標識されたＤＮＡ断片分子１１は泳動媒体中で泳動
方向に伸び、直線状に配向した状態となる。細管の電気
泳動部の直径は従来と同じく５０μｍ〜１００μｍでよ
く、それ以上でもよい。ここではＤＮＡ断片分子を配向
させることが重要な目的であるため、分子配向泳動部１
のアガロースゲルを有する領域の長さは１ｃｍとした
が、一般に泳動距離は１ｃｍ以上あればよい。ＤＮＡ断
片分子を大まかに分離する機能をもたせる場合は５ｃｍ
あるいはそれより長い泳動距離がよい。
ＮＡ分子の試料溶液１０に、制限酵素（例えば NotＩ
等）により各塩基の部所に特徴的な化学反応を起こさせ
て複数のＤＮＡ断片分子に切断する（図１（ａ））。 これら切断されたＤＮＡ断片部末端に酵素（ライゲー
ス（ligase））を用いて蛍光標識１４ａ、１４ｂ付のＤ
ＮＡオリゴマーを結合して標識付ＤＮＡ試料１１を得る
（図１（ｂ））。二本鎖状の蛍光標識されたＤＮＡオリ
ゴマーを制限酵素により切断された切断部末端に結合す
るが、二本のＤＮＡ鎖それぞれに蛍光体を１個あるいは
複数個導入しておく。１つの切断部末端当たり２個ある
いは２個以上の蛍光体分子を結合することができる。蛍
光体としてエフアイテーシー（ＦＩＴＣ）（フルオレッ
セイン イソチオシアネート（fluoresceine isothiocy
anate：発光波長極大５２５ｎｍ）あるいはテキサス
レッド（Texas Red）(発光波長極大６１５ｎｍ）等を用
いることができる。 分子の両末端に蛍光標識されたＤＮＡ断片分子１１
を、図２に示すＤＮＡ等高分子の長さ測定装置の上部バ
ッファー槽１５に試料注入具１２により注入して、細管
２０中のアガロースゲル中で電気泳動すると、両末端が
蛍光標識されたＤＮＡ断片分子１１は泳動媒体中で泳動
方向に伸び、直線状に配向した状態となる。細管の電気
泳動部の直径は従来と同じく５０μｍ〜１００μｍでよ
く、それ以上でもよい。ここではＤＮＡ断片分子を配向
させることが重要な目的であるため、分子配向泳動部１
のアガロースゲルを有する領域の長さは１ｃｍとした
が、一般に泳動距離は１ｃｍ以上あればよい。ＤＮＡ断
片分子を大まかに分離する機能をもたせる場合は５ｃｍ
あるいはそれより長い泳動距離がよい。
【００１２】アガロースゲルの電気泳動路の出口（試
料の溶出部）を、内径が数μｍ以下に絞られた細管状の
形状にして、この出口よりＤＮＡ断片分子をバッファー
液流入口２ａからバッファー液を流入してなるシースフ
ロー用液流２ｂと、上部電極１７と下部電極１８で与え
られる電場によって、直径１μｍ以下の領域内を標識付
ＤＮＡ試料分子１１が直線状の配向を保持したまま通過
するＤＮＡの配向流路３をシースフロー形成管１９内に
形成することができる。なお、アガロースゲルの一端は
上部バッファー槽２１内で上部バッファー液１５と接触
し、試料の泳動力は上部電極１７と下部バッファー液１
６で満たされる下部バッファー槽２２中の下部電極１８
によって与えられる。 電気泳動路の上記出口のごく近傍の部位（上記出口か
ら１ｍｍ以内の距離）に於いて、ＤＮＡの配向流路３に
極めて細く絞ったレーザ光４ａを照射し両末端が蛍光標
識されたＤＮＡ断片分子１１の一方の末端の蛍光体を励
起する。蛍光を励起するためのレーザー光源４にはＡｒ
イオンレーザー（４８８ｎｍ、１０ｍＷ）あるいはＨｅ
−Ｎｅレーザー（５９４ｎｍ、３ｍＷ）がよいが、本実
施例では、蛍光体としてTexas Red を用い、レーザー光
源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを用いる組み合わせを使用
した。Ｈｅ−Ｎｅレーザーをレーザー光絞り込み用レン
ズ５を用いて１μｍ以下に絞り、ＤＮＡの配向流路３を
照射し、レーザー光の入射方向とほぼ直角をなす方向よ
り、蛍光標識されたＤＮＡ断片分子１１から発する蛍光
を検出する。１（μｍ)3の領域にＤＮＡ断片分子の末端
が入ると少なくとも２個の蛍光体が１（μｍ)3の体積中
に含まれることになる。これは約３ｘ１０-9Ｍの濃度に
相当し、背景光(通常３ｘ１０-11Ｍの蛍光体からの光よ
り弱い）より格段に強い光を発する。
料の溶出部）を、内径が数μｍ以下に絞られた細管状の
形状にして、この出口よりＤＮＡ断片分子をバッファー
液流入口２ａからバッファー液を流入してなるシースフ
ロー用液流２ｂと、上部電極１７と下部電極１８で与え
られる電場によって、直径１μｍ以下の領域内を標識付
ＤＮＡ試料分子１１が直線状の配向を保持したまま通過
するＤＮＡの配向流路３をシースフロー形成管１９内に
形成することができる。なお、アガロースゲルの一端は
上部バッファー槽２１内で上部バッファー液１５と接触
し、試料の泳動力は上部電極１７と下部バッファー液１
６で満たされる下部バッファー槽２２中の下部電極１８
によって与えられる。 電気泳動路の上記出口のごく近傍の部位（上記出口か
ら１ｍｍ以内の距離）に於いて、ＤＮＡの配向流路３に
極めて細く絞ったレーザ光４ａを照射し両末端が蛍光標
識されたＤＮＡ断片分子１１の一方の末端の蛍光体を励
起する。蛍光を励起するためのレーザー光源４にはＡｒ
イオンレーザー（４８８ｎｍ、１０ｍＷ）あるいはＨｅ
−Ｎｅレーザー（５９４ｎｍ、３ｍＷ）がよいが、本実
施例では、蛍光体としてTexas Red を用い、レーザー光
源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを用いる組み合わせを使用
した。Ｈｅ−Ｎｅレーザーをレーザー光絞り込み用レン
ズ５を用いて１μｍ以下に絞り、ＤＮＡの配向流路３を
照射し、レーザー光の入射方向とほぼ直角をなす方向よ
り、蛍光標識されたＤＮＡ断片分子１１から発する蛍光
を検出する。１（μｍ)3の領域にＤＮＡ断片分子の末端
が入ると少なくとも２個の蛍光体が１（μｍ)3の体積中
に含まれることになる。これは約３ｘ１０-9Ｍの濃度に
相当し、背景光(通常３ｘ１０-11Ｍの蛍光体からの光よ
り弱い）より格段に強い光を発する。
【００１３】ＤＮＡの配向流路３でのＤＮＡの流速は
液の流速および電場強度による。本実施例のように２５
Ｖ／ｃｍの電場強度を用いた場合、ＤＮＡの流速はＤＮ
Ａの長さによらず約３ｍｍ／秒である（バイオ／テクノ
ロジー（Bio／Technology）第６巻、第８１６頁（１９
８８））。蛍光標識されたＤＮＡ断片分子はレーザー照
射部位を約０．３ｍｓｅｃで通過するがこの間に蛍光体
から放射される蛍光光子数は約６ｘ１０4個である。こ
れら蛍光光子は受光レンズ６、フィルター（図示せず）
を通過して光検出器７で検出される。本実施例では、放
射される蛍光の受光系の受光効率は約５％で光検出器７
の光電交換効率は約５％である。すなわち蛍光分子が検
出部を通過する間に放出される蛍光のうち約１５０ヶが
計数できるので通過時間を明確に検知することができ
る。レーザー照射量を大きくしたり、標識する蛍光体の
数を増やす、あるいは受光効率を上げる等により計測光
子数を１０００程度に増加させることもできる。この場
合、より詳細な通過時間の計測ができる。一方のＤＮＡ
末端が通過してから、他端にある蛍光標識がレーザー照
射部位を通過するまでの時間を計時手段によって計測
し、上記ＤＮＡの流速から蛍光分子の長さを求めること
ができる。必要なデータの演算処理はデータ処理装置８
で実行され、その結果は出力装置９により出力される。
液の流速および電場強度による。本実施例のように２５
Ｖ／ｃｍの電場強度を用いた場合、ＤＮＡの流速はＤＮ
Ａの長さによらず約３ｍｍ／秒である（バイオ／テクノ
ロジー（Bio／Technology）第６巻、第８１６頁（１９
８８））。蛍光標識されたＤＮＡ断片分子はレーザー照
射部位を約０．３ｍｓｅｃで通過するがこの間に蛍光体
から放射される蛍光光子数は約６ｘ１０4個である。こ
れら蛍光光子は受光レンズ６、フィルター（図示せず）
を通過して光検出器７で検出される。本実施例では、放
射される蛍光の受光系の受光効率は約５％で光検出器７
の光電交換効率は約５％である。すなわち蛍光分子が検
出部を通過する間に放出される蛍光のうち約１５０ヶが
計数できるので通過時間を明確に検知することができ
る。レーザー照射量を大きくしたり、標識する蛍光体の
数を増やす、あるいは受光効率を上げる等により計測光
子数を１０００程度に増加させることもできる。この場
合、より詳細な通過時間の計測ができる。一方のＤＮＡ
末端が通過してから、他端にある蛍光標識がレーザー照
射部位を通過するまでの時間を計時手段によって計測
し、上記ＤＮＡの流速から蛍光分子の長さを求めること
ができる。必要なデータの演算処理はデータ処理装置８
で実行され、その結果は出力装置９により出力される。
【００１４】図３は本発明による計測結果の一例を示し
ており、縦軸は分子の両末端が蛍光標識されたＤＮＡ断
片分子１１が発した蛍光光子の計測数で、横軸は２つの
信号の時間間隔、即ち蛍光標識されたＤＮＡ断片分子１
１の両末端の蛍光体の蛍光発生の時間間隔である。本実
施例では、１μｍの長さを移動するのに０．３ｍｓｅｃ
かかるので１ｍｓｅｃはＤＮＡの長さにすると約１０Ｋ
（キロ）塩基に相当する。図３に示した標識付ＤＮＡ試
料１１による信号１３は２００Ｋ（キロ）塩基に相当す
る標識付ＤＮＡ試料によるものである。計測される標識
付ＤＮＡ試料１１の分子数（コピー数）が多いときは、
第１のＤＮＡ分子の後端の蛍光標識からの蛍光発生（第
１のＤＮＡ分子の先端の蛍光標識からの蛍光は既に計測
されている。）と、第２のＤＮＡ分子の先端の蛍光標識
からの蛍光発生の時間間隔も計測されるが、この時間間
隔はランダムであり広く分布する。一方、一つの標識付
ＤＮＡ試料分子１１の先端と後端の蛍光標識による蛍光
信号の出現時間間隔は断片の長さにより一定しているの
で積算するとピークを形成し、ＤＮＡ断片長を知ること
ができる。もちろん一つのＤＮＡ断片分子（１つのコピ
ー）からＤＮＡ断片長を計測することもできる。
ており、縦軸は分子の両末端が蛍光標識されたＤＮＡ断
片分子１１が発した蛍光光子の計測数で、横軸は２つの
信号の時間間隔、即ち蛍光標識されたＤＮＡ断片分子１
１の両末端の蛍光体の蛍光発生の時間間隔である。本実
施例では、１μｍの長さを移動するのに０．３ｍｓｅｃ
かかるので１ｍｓｅｃはＤＮＡの長さにすると約１０Ｋ
（キロ）塩基に相当する。図３に示した標識付ＤＮＡ試
料１１による信号１３は２００Ｋ（キロ）塩基に相当す
る標識付ＤＮＡ試料によるものである。計測される標識
付ＤＮＡ試料１１の分子数（コピー数）が多いときは、
第１のＤＮＡ分子の後端の蛍光標識からの蛍光発生（第
１のＤＮＡ分子の先端の蛍光標識からの蛍光は既に計測
されている。）と、第２のＤＮＡ分子の先端の蛍光標識
からの蛍光発生の時間間隔も計測されるが、この時間間
隔はランダムであり広く分布する。一方、一つの標識付
ＤＮＡ試料分子１１の先端と後端の蛍光標識による蛍光
信号の出現時間間隔は断片の長さにより一定しているの
で積算するとピークを形成し、ＤＮＡ断片長を知ること
ができる。もちろん一つのＤＮＡ断片分子（１つのコピ
ー）からＤＮＡ断片長を計測することもできる。
【００１５】実施例２ 上記実施例では、ＤＮＡ断片分子が直線状の配向を保持
したまま通過するＤＮＡの配向流路３の形成に、アガロ
ースゲル電気泳動とシースフローを用いたが、細管から
電場及びバッファー液流を用いて生体高分子を噴出させ
て直線状に配向させることができる。図４はそのような
装置の一例を示す。上部バッファー液流入口１５ａよ
り、標識付きＤＮＡ試料１１が注入されている、上部バ
ッファー槽２１に、上部バッファー液１５ｂを流入す
る。レーザー光４ａの通過路及び下部バッファー槽２２
には下部バッファー液１６が満たされ、試料に泳動力を
与えるため上部電極１７と下部電極１８に電圧が印加さ
れる。上部バッファー槽２１には試料の噴出用細管２３
ａが設けられ、噴出用細管２３ａの下部は上部径より小
さい径（直径数μｍ以下）の噴出口２３ｂとなってお
り、さらに内径が数μｍ以下の試料通過用細管２５が設
けられている。上部電極１７と下部電極１８で与えられ
る電場、及び噴出用細管２３ａに形成されるバッファー
液の流れにより、噴出口（噴出部）２３ｂより標識付Ｄ
ＮＡ試料１１を直線状に配向させ噴出させ、試料通過用
細管２５により標識付ＤＮＡ試料１１を強制的に配向さ
せることができる。噴出口２３ｂのごく近傍で（噴出口
より約１ｍｍ以内の距離）でレーザー光４ａを入射さ
せ、噴出した標識付ＤＮＡ試料１１から発する蛍光を、
図４の紙面にほぼ垂直な方向、あるいは下部バッファー
槽２２の底部より検出する。蛍光の励起、検出するため
の光学系は図２と同様の方法による。
したまま通過するＤＮＡの配向流路３の形成に、アガロ
ースゲル電気泳動とシースフローを用いたが、細管から
電場及びバッファー液流を用いて生体高分子を噴出させ
て直線状に配向させることができる。図４はそのような
装置の一例を示す。上部バッファー液流入口１５ａよ
り、標識付きＤＮＡ試料１１が注入されている、上部バ
ッファー槽２１に、上部バッファー液１５ｂを流入す
る。レーザー光４ａの通過路及び下部バッファー槽２２
には下部バッファー液１６が満たされ、試料に泳動力を
与えるため上部電極１７と下部電極１８に電圧が印加さ
れる。上部バッファー槽２１には試料の噴出用細管２３
ａが設けられ、噴出用細管２３ａの下部は上部径より小
さい径（直径数μｍ以下）の噴出口２３ｂとなってお
り、さらに内径が数μｍ以下の試料通過用細管２５が設
けられている。上部電極１７と下部電極１８で与えられ
る電場、及び噴出用細管２３ａに形成されるバッファー
液の流れにより、噴出口（噴出部）２３ｂより標識付Ｄ
ＮＡ試料１１を直線状に配向させ噴出させ、試料通過用
細管２５により標識付ＤＮＡ試料１１を強制的に配向さ
せることができる。噴出口２３ｂのごく近傍で（噴出口
より約１ｍｍ以内の距離）でレーザー光４ａを入射さ
せ、噴出した標識付ＤＮＡ試料１１から発する蛍光を、
図４の紙面にほぼ垂直な方向、あるいは下部バッファー
槽２２の底部より検出する。蛍光の励起、検出するため
の光学系は図２と同様の方法による。
【００１６】実施例３ また、図４に示す細管からの試料の噴出と同様に、図５
に示すように細溝から電場およびバッファー液流１５ａ
を用いて生体高分子を噴出させて直線状に配向させるこ
とができ、ＤＮＡ分子の短い径より大きい、シリコン結
晶板、ガラス材等の２枚の板２８で形成される、幅、深
さが１μｍ程度の寸法の細溝２９の群を通して流出さ
せ、ＤＮＡ分子を配向させることもできる。なお、細溝
２９の巾、深さは１μｍ以下でもよい。２枚の板２８で
形成される細溝２９即ち、ＤＮＡの配向流路を先細りの
形状にすることにより、細い所への電界強度は強くなり
ＤＮＡがさらにのびた状態になり、試料を直線状に配向
させた状態で泳動させることができる。このようなＤＮ
Ａの配向流路はシリコン結晶板、ガラス材等の表面に溝
を掘るなど半導体のパターン形成技術、エッチング等の
加工技術を用いて作製することができる。
に示すように細溝から電場およびバッファー液流１５ａ
を用いて生体高分子を噴出させて直線状に配向させるこ
とができ、ＤＮＡ分子の短い径より大きい、シリコン結
晶板、ガラス材等の２枚の板２８で形成される、幅、深
さが１μｍ程度の寸法の細溝２９の群を通して流出さ
せ、ＤＮＡ分子を配向させることもできる。なお、細溝
２９の巾、深さは１μｍ以下でもよい。２枚の板２８で
形成される細溝２９即ち、ＤＮＡの配向流路を先細りの
形状にすることにより、細い所への電界強度は強くなり
ＤＮＡがさらにのびた状態になり、試料を直線状に配向
させた状態で泳動させることができる。このようなＤＮ
Ａの配向流路はシリコン結晶板、ガラス材等の表面に溝
を掘るなど半導体のパターン形成技術、エッチング等の
加工技術を用いて作製することができる。
【００１７】実施例４ 図６に示すように、電場と分子ふるい膜３０を用いてい
る電気泳動によっても、試料を分子ふるい膜３０から噴
出させ同様にＤＮＡ等の長さを計測することができる。
分子ふるい膜３０として、米国フィルトロン社製オメガ
セル（OMEGACell）等が使用できる。図５、図６の実
施例では図４と同様にレーザー光４ａにより、蛍光標識
を励起し紙面と垂直の方向、あるいは下部バッファー槽
２２の底部より励起された蛍光を検出する。以上の実施
例では長波長の発光波長極大を有する蛍光体スルフォロ
ーダミン１０１（Sulforhodamine 101、モレキュラプロ
ーブ社商品名テキサスレッド）、テキサスレッド（Texa
s Red）、とＨｅ−Ｎｅレーザーの組み合わせを用いた
が、２種類以上の制限酵素を用いてＤＮＡ分子を切断し
たり、ＤＮＡ断片分子の両末端をそれぞれ発光波長の異
なる蛍光体で標識し、ＤＮＡ断片分子の両末端を発光波
長によって、両末端を分離識別して計測することもでき
る。この場合、２本鎖ＤＮＡの両端に接合しうる蛍光標
識プライマー（２本鎖状）を用意し、ライゲーション法
を用いた酵素反応で接着する。また、標識物として蛍光
体を吸着、結合保持した微粒子を用いることもでき、こ
れによって生体高分子の両末端を同一の蛍光体、あるい
は異なる蛍光体によって標識してもよい。例えば微粒子
として粒直径が０．１μｍ 程度のクマリン系蛍光色素
を含有し、表面にカルボシキル基を持つポリサイエンス
（Ployscience）社のラテックス粒子などが使用でき
る。
る電気泳動によっても、試料を分子ふるい膜３０から噴
出させ同様にＤＮＡ等の長さを計測することができる。
分子ふるい膜３０として、米国フィルトロン社製オメガ
セル（OMEGACell）等が使用できる。図５、図６の実
施例では図４と同様にレーザー光４ａにより、蛍光標識
を励起し紙面と垂直の方向、あるいは下部バッファー槽
２２の底部より励起された蛍光を検出する。以上の実施
例では長波長の発光波長極大を有する蛍光体スルフォロ
ーダミン１０１（Sulforhodamine 101、モレキュラプロ
ーブ社商品名テキサスレッド）、テキサスレッド（Texa
s Red）、とＨｅ−Ｎｅレーザーの組み合わせを用いた
が、２種類以上の制限酵素を用いてＤＮＡ分子を切断し
たり、ＤＮＡ断片分子の両末端をそれぞれ発光波長の異
なる蛍光体で標識し、ＤＮＡ断片分子の両末端を発光波
長によって、両末端を分離識別して計測することもでき
る。この場合、２本鎖ＤＮＡの両端に接合しうる蛍光標
識プライマー（２本鎖状）を用意し、ライゲーション法
を用いた酵素反応で接着する。また、標識物として蛍光
体を吸着、結合保持した微粒子を用いることもでき、こ
れによって生体高分子の両末端を同一の蛍光体、あるい
は異なる蛍光体によって標識してもよい。例えば微粒子
として粒直径が０．１μｍ 程度のクマリン系蛍光色素
を含有し、表面にカルボシキル基を持つポリサイエンス
（Ployscience）社のラテックス粒子などが使用でき
る。
【００１８】ＤＮＡが二重ラセン構造を取っているとき
の長さは１塩基当り約３．４Åなので３Ｋ（キロ）塩基
で約１μｍの長さとなる。レーザー光は収束条件を最適
化すれば０．５μｍ程度にまで絞れるので１Ｋ（キロ）
〜２Ｋ（キロ）塩基の精度でＤＮＡの長さを計測するこ
とができる。照射するレーザ光の径をファイバー等を用
いてレーザ光の波長以下にすれば更に長さ計測の精度を
高めることができる。以上ではＤＮＡの長さの計測につ
いて説明したが、本方法によって、図７に示すように、
ＤＮＡを１本鎖２７とし、その両末端に異種の蛍光標識
１４ａ、14ｂ、あるいは同種の蛍光標識１４ａ、１４ａ
を行ない、さらに種々の部所に蛍光標識２８ａ、２８
ｂ、２８ｃをもつ、複数個のＤＮＡプローブ２６ａ、２
６ｂ、２６ｃとハイブリッド体を形成して、直線状に配
向させ泳動し、蛍光標識２８ａ、２８ｂ、２８ｃを前記
説明したような装置により、順次検出することによって
詳細なＤＮＡのマップを作成することもできる。
の長さは１塩基当り約３．４Åなので３Ｋ（キロ）塩基
で約１μｍの長さとなる。レーザー光は収束条件を最適
化すれば０．５μｍ程度にまで絞れるので１Ｋ（キロ）
〜２Ｋ（キロ）塩基の精度でＤＮＡの長さを計測するこ
とができる。照射するレーザ光の径をファイバー等を用
いてレーザ光の波長以下にすれば更に長さ計測の精度を
高めることができる。以上ではＤＮＡの長さの計測につ
いて説明したが、本方法によって、図７に示すように、
ＤＮＡを１本鎖２７とし、その両末端に異種の蛍光標識
１４ａ、14ｂ、あるいは同種の蛍光標識１４ａ、１４ａ
を行ない、さらに種々の部所に蛍光標識２８ａ、２８
ｂ、２８ｃをもつ、複数個のＤＮＡプローブ２６ａ、２
６ｂ、２６ｃとハイブリッド体を形成して、直線状に配
向させ泳動し、蛍光標識２８ａ、２８ｂ、２８ｃを前記
説明したような装置により、順次検出することによって
詳細なＤＮＡのマップを作成することもできる。
【００１９】次に、ＤＮＡ１０１の一端に蛍光体などの
標識物１０２を結合し、他の一端を物理的または化学的
に担体１０４に固定し、ＤＮＡを電界あるいは液流など
により伸長させ、標識物の結合した末端位置を検出する
ことによりＤＮＡ長を測定するばあいの実施例について
説明する。ＤＮＡを外力により伸長させて、両末端間の
距離を測定し、ＤＮＡの長さを一分子ごと測定する。こ
こで、ＤＮＡを必ずしも完全に伸長させて、絶対的な長
さを求める必要はない。特にＤＮＡが長いと熱振動等に
起因するゆらぎが存在するために、完全に伸長させるこ
とは困難になる。このような場合は、既知の長さのＤＮ
Ａを用いて検量線を作成し被測定対象のＤＮＡ長を求め
ればよい。なお、一般にＤＮＡは十分に引き延ばすと、
１塩基あたり０．２１ｎｍになることが知られている。
ＤＮＡの固定には従来ニトロセルロース膜やナイロン誘
導体等がハイブリダイゼーション用として多用されてい
るが、固定したＤＮＡは多点で固定されるため、ＤＮＡ
を引き延ばせず使用できない。ＤＮＡの一端のみを確実
に固定する必要がある。まず図８に示すように長さ測定
対象の一端が標識物１０２で標識されたＤＮＡ１０１の
他の末端に直径が０．２μｍないし１μｍ程度の粒子１
０３を結合させる。粒子の大きさはＤＮＡ長に比べ十分
小さい必要があるため１μｍ以下が適当である。粒子を
補足する細孔の形成は０．１μｍ程度が下限であるの
で、粒子の大きさは０．２μｍ以上あればよい。次に、
ＤＮＡ１０１は通過できるが粒子１０３は通過できない
ような細孔１０６があいた担体１０４に粒子１０３の付
いたＤＮＡを通過させる。ＤＮＡ部分は細孔１０６を通
過するが粒子１０３部分は細孔１０６を通過できないの
で、ＤＮＡの一端を特定の位置に固定できる。電極１０
５ａ、１０５ｂ間に電界をかけて、あるいは液流等でＤ
ＮＡを粒子１０３部分で担体１０４に固定し、同時にＤ
ＮＡを伸長させることができる。
標識物１０２を結合し、他の一端を物理的または化学的
に担体１０４に固定し、ＤＮＡを電界あるいは液流など
により伸長させ、標識物の結合した末端位置を検出する
ことによりＤＮＡ長を測定するばあいの実施例について
説明する。ＤＮＡを外力により伸長させて、両末端間の
距離を測定し、ＤＮＡの長さを一分子ごと測定する。こ
こで、ＤＮＡを必ずしも完全に伸長させて、絶対的な長
さを求める必要はない。特にＤＮＡが長いと熱振動等に
起因するゆらぎが存在するために、完全に伸長させるこ
とは困難になる。このような場合は、既知の長さのＤＮ
Ａを用いて検量線を作成し被測定対象のＤＮＡ長を求め
ればよい。なお、一般にＤＮＡは十分に引き延ばすと、
１塩基あたり０．２１ｎｍになることが知られている。
ＤＮＡの固定には従来ニトロセルロース膜やナイロン誘
導体等がハイブリダイゼーション用として多用されてい
るが、固定したＤＮＡは多点で固定されるため、ＤＮＡ
を引き延ばせず使用できない。ＤＮＡの一端のみを確実
に固定する必要がある。まず図８に示すように長さ測定
対象の一端が標識物１０２で標識されたＤＮＡ１０１の
他の末端に直径が０．２μｍないし１μｍ程度の粒子１
０３を結合させる。粒子の大きさはＤＮＡ長に比べ十分
小さい必要があるため１μｍ以下が適当である。粒子を
補足する細孔の形成は０．１μｍ程度が下限であるの
で、粒子の大きさは０．２μｍ以上あればよい。次に、
ＤＮＡ１０１は通過できるが粒子１０３は通過できない
ような細孔１０６があいた担体１０４に粒子１０３の付
いたＤＮＡを通過させる。ＤＮＡ部分は細孔１０６を通
過するが粒子１０３部分は細孔１０６を通過できないの
で、ＤＮＡの一端を特定の位置に固定できる。電極１０
５ａ、１０５ｂ間に電界をかけて、あるいは液流等でＤ
ＮＡを粒子１０３部分で担体１０４に固定し、同時にＤ
ＮＡを伸長させることができる。
【００２０】本方法では、ＤＮＡの一端の標識物１０２
を固定端に対する位置として検出し、ＤＮＡの長さを決
定する。担体１０４として、粒子１０３が通過できない
ような溝あるいは孔を持つ容器を用いれば、粒子１０３
部分は溝あるいは孔の入り口に固定され、ＤＮＡ部分は
一定の方向に掘られた溝あるいは孔の中で伸長する。こ
のため標識物１０２の探索は溝あるいは孔にそって行え
ばよい。もちろん、粒子１０３部分の固定とＤＮＡの伸
長部分に、ゲル担体を用いることも可能である。この場
合は粒子１０３部分はゲル担体の入り口で捕捉される
が、ＤＮＡ部分と標識物１０２はゲル担体内部に伸長す
る。さらに、固定用の粒子１０３をＤＮＡの一端、すな
わち原点を規定する標識物として使用し、他端の標識物
１０２までの距離を測定することも可能である。あるい
は、被測定対象のＤＮＡを固定する方法として会合反応
を用いることも可能で、標的となるＤＮＡの一端に既知
配列のプライマーＤＮＡを結合させ、この基地配列のプ
ライマーに相補的なＤＮＡプライマーを固定した担体に
ハイブリダイゼーションさせ、標識物の結合したＤＮＡ
を固定することができる。この場合でも電界等によりＤ
ＮＡを伸長させ長さを測定することができる。相補的な
ＤＮＡ鎖のかわりに、ビオチンとアビジンの会合反応、
抗原抗体反応などを使用することも可能である。以下、
実施例５、実施例６により本発明を詳細に説明する。 実施例５ 被測定対象物として、ヒト白血球より調製したＤＮＡを
用いる。制限酵素Ｓｆｉ Ｉで切断したＤＮＡ断片にフ
ルオレッセイン系、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−
１、３−ジアゾール系、ローダミン系、フタロシアニン
系、フィコビリタンパク質誘導体等の螢光色素と１μｍ
の粒子を結合して、レーザー共焦点顕微鏡を用いて両末
端間の距離を測定した。これを図９、図１０を用いて説
明する。
を固定端に対する位置として検出し、ＤＮＡの長さを決
定する。担体１０４として、粒子１０３が通過できない
ような溝あるいは孔を持つ容器を用いれば、粒子１０３
部分は溝あるいは孔の入り口に固定され、ＤＮＡ部分は
一定の方向に掘られた溝あるいは孔の中で伸長する。こ
のため標識物１０２の探索は溝あるいは孔にそって行え
ばよい。もちろん、粒子１０３部分の固定とＤＮＡの伸
長部分に、ゲル担体を用いることも可能である。この場
合は粒子１０３部分はゲル担体の入り口で捕捉される
が、ＤＮＡ部分と標識物１０２はゲル担体内部に伸長す
る。さらに、固定用の粒子１０３をＤＮＡの一端、すな
わち原点を規定する標識物として使用し、他端の標識物
１０２までの距離を測定することも可能である。あるい
は、被測定対象のＤＮＡを固定する方法として会合反応
を用いることも可能で、標的となるＤＮＡの一端に既知
配列のプライマーＤＮＡを結合させ、この基地配列のプ
ライマーに相補的なＤＮＡプライマーを固定した担体に
ハイブリダイゼーションさせ、標識物の結合したＤＮＡ
を固定することができる。この場合でも電界等によりＤ
ＮＡを伸長させ長さを測定することができる。相補的な
ＤＮＡ鎖のかわりに、ビオチンとアビジンの会合反応、
抗原抗体反応などを使用することも可能である。以下、
実施例５、実施例６により本発明を詳細に説明する。 実施例５ 被測定対象物として、ヒト白血球より調製したＤＮＡを
用いる。制限酵素Ｓｆｉ Ｉで切断したＤＮＡ断片にフ
ルオレッセイン系、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−
１、３−ジアゾール系、ローダミン系、フタロシアニン
系、フィコビリタンパク質誘導体等の螢光色素と１μｍ
の粒子を結合して、レーザー共焦点顕微鏡を用いて両末
端間の距離を測定した。これを図９、図１０を用いて説
明する。
【００２１】図９を用いて、一端に蛍光体が結合し、他
端に固定用の粒子が結合したＤＮＡ断片の調製法を述べ
る。まず、ヘパリン採血したヒト全血を遠心媒体として
フィコール−ペイクー（Ficoll-Paque）を用いで遠心し
て、白血球を得る。この白血球を７５ｍＭのＮａＣｌ、
２５ｍＭのＥＤＴＡを含む５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で洗浄する。０．５ＭのＥＤＴＡ、１％のＮ−
ラウロリルザルコシン、０．５ｍｇ／ｍｌ（ミリリット
ル）のプロテアーゼＫを加え、５０℃で３時間処理す
る。蛋白質等をクロロホルムとフェノールの１体１の混
合液等で抽出除去する。RNase で処理してＲＮＡを分解
した後、エタノールを加えＤＮＡを分取する。得られた
ＤＮＡを１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのTris・ＨＣ
ｌ緩衝液(ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で透析す
る。このようにして得られたヒトＤＮＡの２μｇにつき
１５ユニットの制限酵素Ｓｆｉ Ｉを含む０．１ｍｇ／
ｍｌ（ミリリットル）の牛血清アルブミン、７ｍＭのメ
ルカプトエタノール、０．０５ＭのＮａＣｌ、８ｍＭの
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０)を加え、５０℃で処理する。Ｓｆｉ Ｉは図９
に示されているように、次に示す（化１）の中の↓の部
位を切断し、切断部を与える。
端に固定用の粒子が結合したＤＮＡ断片の調製法を述べ
る。まず、ヘパリン採血したヒト全血を遠心媒体として
フィコール−ペイクー（Ficoll-Paque）を用いで遠心し
て、白血球を得る。この白血球を７５ｍＭのＮａＣｌ、
２５ｍＭのＥＤＴＡを含む５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で洗浄する。０．５ＭのＥＤＴＡ、１％のＮ−
ラウロリルザルコシン、０．５ｍｇ／ｍｌ（ミリリット
ル）のプロテアーゼＫを加え、５０℃で３時間処理す
る。蛋白質等をクロロホルムとフェノールの１体１の混
合液等で抽出除去する。RNase で処理してＲＮＡを分解
した後、エタノールを加えＤＮＡを分取する。得られた
ＤＮＡを１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのTris・ＨＣ
ｌ緩衝液(ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で透析す
る。このようにして得られたヒトＤＮＡの２μｇにつき
１５ユニットの制限酵素Ｓｆｉ Ｉを含む０．１ｍｇ／
ｍｌ（ミリリットル）の牛血清アルブミン、７ｍＭのメ
ルカプトエタノール、０．０５ＭのＮａＣｌ、８ｍＭの
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０)を加え、５０℃で処理する。Ｓｆｉ Ｉは図９
に示されているように、次に示す（化１）の中の↓の部
位を切断し、切断部を与える。
【００２２】
【化１】 ＧＧＣＣＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4↓Ｎ5ＧＧＣＣ …（化１） （化１）でＮ1〜Ｎ5は４種塩基のいずれも取り得るの
で、得られた二つの断片Ａ、Ｂにおいて、Ａ側断片とＢ
側断片では突出端が異なる配列となる。このため、Ａ側
断片とＢ側断片とに別種のＤＮＡオリゴマーをライゲー
ション反応で導入することができる。また、切断部の配
列に１種だけでなく多くの配列が可能であるため切断部
を区別しながらライゲーション等で標識を入れることが
できる。例えば、図９に示されるＮＮＮ（化１の切断端
部配列、Ｎ2Ｎ3Ｎ4に対応）がＣＣＧの配列をもつ部分
とＣＣＡの配列をもつ部分を保有するＤＮＡの場合を考
える。この二つの部分に挟まれたＤＮＡ断片をＳｆｉ
Ｉを用いた酵素切断で作る。この断片の両側は異なる配
列の突出端をもつので図９に示したように異なる標識物
をもったＤＮＡを結合することができる。このようにし
て得られたＤＮＡ断片１２１は図９に示す構造を有す
る。図９では、Ｎは４種の塩基のいずれも取りうる。こ
のようなＤＮＡ断片１２１に図９中に記載の構造をもつ
螢光標識ＤＮＡ１２２を連結する。蛍光体１０７には、
フルオレセインを含有し表面にカルボキシル基を持つ、
０．０２μｍの粒子を用いる。この粒子１個には約２０
０分子のフルオレセインが含有している。まず、螢光標
識ＤＮＡの調製法を示す。
で、得られた二つの断片Ａ、Ｂにおいて、Ａ側断片とＢ
側断片では突出端が異なる配列となる。このため、Ａ側
断片とＢ側断片とに別種のＤＮＡオリゴマーをライゲー
ション反応で導入することができる。また、切断部の配
列に１種だけでなく多くの配列が可能であるため切断部
を区別しながらライゲーション等で標識を入れることが
できる。例えば、図９に示されるＮＮＮ（化１の切断端
部配列、Ｎ2Ｎ3Ｎ4に対応）がＣＣＧの配列をもつ部分
とＣＣＡの配列をもつ部分を保有するＤＮＡの場合を考
える。この二つの部分に挟まれたＤＮＡ断片をＳｆｉ
Ｉを用いた酵素切断で作る。この断片の両側は異なる配
列の突出端をもつので図９に示したように異なる標識物
をもったＤＮＡを結合することができる。このようにし
て得られたＤＮＡ断片１２１は図９に示す構造を有す
る。図９では、Ｎは４種の塩基のいずれも取りうる。こ
のようなＤＮＡ断片１２１に図９中に記載の構造をもつ
螢光標識ＤＮＡ１２２を連結する。蛍光体１０７には、
フルオレセインを含有し表面にカルボキシル基を持つ、
０．０２μｍの粒子を用いる。この粒子１個には約２０
０分子のフルオレセインが含有している。まず、螢光標
識ＤＮＡの調製法を示す。
【００２３】６０塩基からなる一本鎖ポリヌクレオチド
の合成最終段にアプライド バイオシステムズ社のアミ
ノリンク２を導入して、５′末端にアミノ基を持つポリ
ヌクレオチドを合成する。この合成は、すべて取扱説明
書にそって、アプライド バイオシステムズ社のモデル
３８１型ＤＮＡ合成装置を用いて行なう。次に、水溶性
カルボジイミドを用いて螢光粒子表面のカルボキシル基
と結合させる。弱アルカリ条件下で未反応のカルボキシ
ル基を再生する。最後に５′末端が３塩基短い相補的な
ＤＮＡ鎖をハイブリダイズさせて（化２）のよう螢光粒
子結合ＤＮＡを得る。
の合成最終段にアプライド バイオシステムズ社のアミ
ノリンク２を導入して、５′末端にアミノ基を持つポリ
ヌクレオチドを合成する。この合成は、すべて取扱説明
書にそって、アプライド バイオシステムズ社のモデル
３８１型ＤＮＡ合成装置を用いて行なう。次に、水溶性
カルボジイミドを用いて螢光粒子表面のカルボキシル基
と結合させる。弱アルカリ条件下で未反応のカルボキシ
ル基を再生する。最後に５′末端が３塩基短い相補的な
ＤＮＡ鎖をハイブリダイズさせて（化２）のよう螢光粒
子結合ＤＮＡを得る。
【００２４】
【化２】 螢光粒子−Ｒ−ＣＯＮＨ−ＮＮＮＮ・・・・ＴＧＧＣＣＣＧＣＧＧ−３′ ３′−ＮＮＮＮ・・・・ＡＣＣＧＧＧＣ −５′ （Ｎ：Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかの塩基、・・・・：任意のポリヌクレオチド） …（化２） ＤＮＡフラグメントに螢光粒子標識ＤＮＡを連結する方
法としては、両者をハイブリダイゼーション条件下で会
合させ、リガーゼ反応を用いればよい。以上の操作で、
図９の記載する一端を螢光標識したＤＮＡ１２３を得
る。次に螢光標識したのとは異なる末端に粒子を導入す
る方法を示す。ここでも図９に記載する、あらかじめ粒
子を結合したＤＮＡ２４を、ＤＮＡフラグメントにリガ
ーゼ反応を用いて連結する。粒子としては、表面にカル
ボキシル基を持つ１μｍのポリスチレン粒子を用いる。
粒子を結合したＤＮＡの調製法は、上記螢光粒子標識Ｄ
ＮＡの調製法に準じる。ただし、最後にＬ−リジン（ly
sine）を加え、未反応の残基をブロックする。合成した
１μｍ粒子結合ＤＮＡは、（化３）のような構造をして
いる。
法としては、両者をハイブリダイゼーション条件下で会
合させ、リガーゼ反応を用いればよい。以上の操作で、
図９の記載する一端を螢光標識したＤＮＡ１２３を得
る。次に螢光標識したのとは異なる末端に粒子を導入す
る方法を示す。ここでも図９に記載する、あらかじめ粒
子を結合したＤＮＡ２４を、ＤＮＡフラグメントにリガ
ーゼ反応を用いて連結する。粒子としては、表面にカル
ボキシル基を持つ１μｍのポリスチレン粒子を用いる。
粒子を結合したＤＮＡの調製法は、上記螢光粒子標識Ｄ
ＮＡの調製法に準じる。ただし、最後にＬ−リジン（ly
sine）を加え、未反応の残基をブロックする。合成した
１μｍ粒子結合ＤＮＡは、（化３）のような構造をして
いる。
【００２５】
【化３】 ５′− ＴＧＧＴＧＴＡ・・・・ＮＮＮＮ ３′−ＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴ・・・・ＮＮＮＮ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−粒子 （Ｎ：Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかの塩基、・・・・：任意のポリヌクレオチド） …（化３） 調製した粒子結合ＤＮＡは分散性をよくするために、粒
子表面を牛血清アルブミンや界面活性剤等でコートして
用いる。このようにして調製した粒子結合ＤＮＡに、一
端を螢光標識したＤＮＡフラグメントを加え、ハイブリ
ダイゼーション条件下で両者を会合させ、リガーゼ反応
後、図９に記載の一端に蛍光体が結合し他端に粒子の結
合したＤＮＡフラグメント１２５を得る。この蛍光体と
粒子を結合したＤＮＡフラグメントを、図１０記載の測
定容器を用いて測定した。測定容器は非螢光性の石英ガ
ラスでできており、陰電極槽をかねた試料添加槽１３１
と、正電極槽１３２と、約０．３μｍないし０．８μｍ
の幅の細孔１３３、加圧孔１３４からなる。加圧孔１３
４から加圧して電気浸透を防ぐこともできる。細孔１３
３は、あらかじめ、石英ガラスあるいはシリコンウェハ
ーなどに溝を掘りその上に石英ガラスを張り合わせて作
成する。シリコンウェハーなどの基板に溝を掘る方法と
しては、イオン、プラズマあるいは電子線を用いた半導
体作成技術を用いることができる。通常０．１μｍ程度
までの細さで溝を掘ることができる。容器中に８９ｍＭ
のＴｒｉｓ、８９ｍＭのホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ２ナ
トリウム塩からなるｐＨ８．０の緩衝液を満たした後、
試料添加槽１３１に蛍光体と粒子を結合したＤＮＡフラ
グメント１２５を添加する。電極槽間に４０Ｖの電圧を
かけたところ、ほとんどの粒子（１μｍ径）が細孔の入
り口に集まっていることが、位相差光学顕微鏡で観察さ
れる。次に、レーザー共焦点顕微鏡を用いて蛍光体の位
置を測定する。レーザーは４８８ｎｍのアルゴンレーザ
ーで、約０．５μｍのビームを細孔１３３にそって照射
する。検出は散乱光を除去したのち螢光をフォトンカウ
ンティングして行う。その結果、固定された粒子から６
７μｍの位置に蛍光粒子が４２体検出される。検出され
た蛍光粒子の位置の標準偏差は約１μｍである。ＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素が８塩基認識タイプのため出
現するＤＮＡフラグメントの種類が少なく、さらに蛍光
体の標識と粒子の結合に選択性をもたしている。よっ
て、ヒトの全ＤＮＡ中に蛍光体と粒子を持つＤＮＡの種
類を少なくできるので特定のＤＮＡを検出できる利点が
ある。本実施例ではリガーゼ反応を用いて蛍光体や粒子
を標的ＤＮＡに結合しているが、他の方法、例えば、蛍
光体や粒子の結合した既知の配列のポリヌクレオチドを
標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる方法も可能である。
子表面を牛血清アルブミンや界面活性剤等でコートして
用いる。このようにして調製した粒子結合ＤＮＡに、一
端を螢光標識したＤＮＡフラグメントを加え、ハイブリ
ダイゼーション条件下で両者を会合させ、リガーゼ反応
後、図９に記載の一端に蛍光体が結合し他端に粒子の結
合したＤＮＡフラグメント１２５を得る。この蛍光体と
粒子を結合したＤＮＡフラグメントを、図１０記載の測
定容器を用いて測定した。測定容器は非螢光性の石英ガ
ラスでできており、陰電極槽をかねた試料添加槽１３１
と、正電極槽１３２と、約０．３μｍないし０．８μｍ
の幅の細孔１３３、加圧孔１３４からなる。加圧孔１３
４から加圧して電気浸透を防ぐこともできる。細孔１３
３は、あらかじめ、石英ガラスあるいはシリコンウェハ
ーなどに溝を掘りその上に石英ガラスを張り合わせて作
成する。シリコンウェハーなどの基板に溝を掘る方法と
しては、イオン、プラズマあるいは電子線を用いた半導
体作成技術を用いることができる。通常０．１μｍ程度
までの細さで溝を掘ることができる。容器中に８９ｍＭ
のＴｒｉｓ、８９ｍＭのホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ２ナ
トリウム塩からなるｐＨ８．０の緩衝液を満たした後、
試料添加槽１３１に蛍光体と粒子を結合したＤＮＡフラ
グメント１２５を添加する。電極槽間に４０Ｖの電圧を
かけたところ、ほとんどの粒子（１μｍ径）が細孔の入
り口に集まっていることが、位相差光学顕微鏡で観察さ
れる。次に、レーザー共焦点顕微鏡を用いて蛍光体の位
置を測定する。レーザーは４８８ｎｍのアルゴンレーザ
ーで、約０．５μｍのビームを細孔１３３にそって照射
する。検出は散乱光を除去したのち螢光をフォトンカウ
ンティングして行う。その結果、固定された粒子から６
７μｍの位置に蛍光粒子が４２体検出される。検出され
た蛍光粒子の位置の標準偏差は約１μｍである。ＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素が８塩基認識タイプのため出
現するＤＮＡフラグメントの種類が少なく、さらに蛍光
体の標識と粒子の結合に選択性をもたしている。よっ
て、ヒトの全ＤＮＡ中に蛍光体と粒子を持つＤＮＡの種
類を少なくできるので特定のＤＮＡを検出できる利点が
ある。本実施例ではリガーゼ反応を用いて蛍光体や粒子
を標的ＤＮＡに結合しているが、他の方法、例えば、蛍
光体や粒子の結合した既知の配列のポリヌクレオチドを
標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる方法も可能である。
【００２６】実施例６ 実施例５と同様に被測定対象物としてヒト白血球より調
製したＤＮＡを用いた。制限酵素Ｓｆｉ Ｉで切断した
ＤＮＡ断片に螢光色素を結合し、さらに制限酵素Ｎｏｔ
Ｉで切断した断面にビオチンを結合させる。ビオチン
−アビジン反応を用いてＤＮＡ断片を固定し、レーザー
共焦点顕微鏡を用いて両末端間の距離を測定した。実施
例５に従いヒト白血球からＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｓ
ｆｉ Ｉで切断したＤＮＡ断片に０．０５μｍ のフル
オレセイン系螢光粒子を結合した。続いて１ユニット／
μｌのＮｏｔ Ｉを、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの
ＭｇＣｌ2、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
０．５ｍＭのジチオスレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌ
（ミリリットル）の牛血清アルブミンを含むＴｒｉｓ・
ＨＣｌ(ｐＨ７．５）の緩衝液の条件下で反応させる。
これにより一端が制限酵素Ｎｏｔ Ｉによる切断面を持
つ螢光標識ＤＮＡ断片を得る。このような該ＤＮＡ断片
に表面にアビジンを保有する螢光粒子を結合したＤＮＡ
を連結する。まず、表面にアビジンを有する螢光粒子を
結合した該ＤＮＡ断片の調製法を示す。５′末端にアミ
ノ基を持つオリゴマーＤＮＡを合成しＮ−ヒドロキシス
クシンイミドビオチンを反応させ、さらに相補鎖をハイ
ブリダイズさせた後、過剰量のアビジン化螢光粒子を混
合する。このＤＮＡは、末端がＮｏｔＩ切断面である必
要があるが、他の部分は１０塩基程度の長さがあればい
ろいろな構造の物が使用しうる。
製したＤＮＡを用いた。制限酵素Ｓｆｉ Ｉで切断した
ＤＮＡ断片に螢光色素を結合し、さらに制限酵素Ｎｏｔ
Ｉで切断した断面にビオチンを結合させる。ビオチン
−アビジン反応を用いてＤＮＡ断片を固定し、レーザー
共焦点顕微鏡を用いて両末端間の距離を測定した。実施
例５に従いヒト白血球からＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｓ
ｆｉ Ｉで切断したＤＮＡ断片に０．０５μｍ のフル
オレセイン系螢光粒子を結合した。続いて１ユニット／
μｌのＮｏｔ Ｉを、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの
ＭｇＣｌ2、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
０．５ｍＭのジチオスレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌ
（ミリリットル）の牛血清アルブミンを含むＴｒｉｓ・
ＨＣｌ(ｐＨ７．５）の緩衝液の条件下で反応させる。
これにより一端が制限酵素Ｎｏｔ Ｉによる切断面を持
つ螢光標識ＤＮＡ断片を得る。このような該ＤＮＡ断片
に表面にアビジンを保有する螢光粒子を結合したＤＮＡ
を連結する。まず、表面にアビジンを有する螢光粒子を
結合した該ＤＮＡ断片の調製法を示す。５′末端にアミ
ノ基を持つオリゴマーＤＮＡを合成しＮ−ヒドロキシス
クシンイミドビオチンを反応させ、さらに相補鎖をハイ
ブリダイズさせた後、過剰量のアビジン化螢光粒子を混
合する。このＤＮＡは、末端がＮｏｔＩ切断面である必
要があるが、他の部分は１０塩基程度の長さがあればい
ろいろな構造の物が使用しうる。
【００２７】未反応のビオチン化オリゴマーＤＮＡ等を
洗浄により除去する。この螢光粒子は、測定対象物であ
る該ＤＮＡ断片の他の末端、すなわちここでは制限酵素
Ｓｆｉ Ｉ切断面に結合した螢光粒子と区別できる必要
がある。ここでは、ローダミン系の色素を含有し、表面
にカルボキシル基を持つ０．０２μｍのものを用いた。
カルボジイミド法で粒子にアビジンを固定する。このよ
うにして調製したアビジン化螢光粒子を結合したＤＮＡ
と、該ＤＮＡ断片をハイブリダイズさせた後、リガーゼ
を用いて両者を連結する。このような一端にフルオレセ
イン系の螢光粒子を結合し、他端にローダミン系の螢光
色素を含むアビジン化螢光粒子を結合した該ＤＮＡを、
ビオチン化石英ガラスと反応させ、これを固定する。ビ
オチン化石英ガラスは、石英ガラスにシランカプリング
反応によりアミノ基を導入し、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドビオチンを反応させて調製すればよい。このよう
にして固定した該ＤＮＡに電界をかけて伸長させ、４８
８ｎｍと５１４ｎｍのアルゴンレーザーで走査し、フル
オレセイン系の螢光粒子の位置とローダミン系の螢光粒
子の位置を測定する。その結果、少なくても３２μｍ、
２０μｍ、１７μｍ等の長さのＤＮＡが確認できる。細
孔内に該ＤＮＡを固定すれば、ＤＮＡが伸長する位置を
限定できるので、レーザービームをスキャンする範囲が
少なくてすむ。一端を固定したＤＮＡ断片は、電界をか
けるとただちに伸長するので、本発明では短時間でＤＮ
Ａ断片の長さを測定することができる。以上、実施例で
は制限酵素Ｓｆｉ ＩやＮｏｔ Ｉで切断したＤＮＡを
試料として用いたが、他の方法で調製したＤＮＡでも本
発明の方法で長さを測定できうる。また、該ＤＮＡの伸
長方法は、電界をかける方法の他に、液流を用いる方法
などが使用しうる。
洗浄により除去する。この螢光粒子は、測定対象物であ
る該ＤＮＡ断片の他の末端、すなわちここでは制限酵素
Ｓｆｉ Ｉ切断面に結合した螢光粒子と区別できる必要
がある。ここでは、ローダミン系の色素を含有し、表面
にカルボキシル基を持つ０．０２μｍのものを用いた。
カルボジイミド法で粒子にアビジンを固定する。このよ
うにして調製したアビジン化螢光粒子を結合したＤＮＡ
と、該ＤＮＡ断片をハイブリダイズさせた後、リガーゼ
を用いて両者を連結する。このような一端にフルオレセ
イン系の螢光粒子を結合し、他端にローダミン系の螢光
色素を含むアビジン化螢光粒子を結合した該ＤＮＡを、
ビオチン化石英ガラスと反応させ、これを固定する。ビ
オチン化石英ガラスは、石英ガラスにシランカプリング
反応によりアミノ基を導入し、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドビオチンを反応させて調製すればよい。このよう
にして固定した該ＤＮＡに電界をかけて伸長させ、４８
８ｎｍと５１４ｎｍのアルゴンレーザーで走査し、フル
オレセイン系の螢光粒子の位置とローダミン系の螢光粒
子の位置を測定する。その結果、少なくても３２μｍ、
２０μｍ、１７μｍ等の長さのＤＮＡが確認できる。細
孔内に該ＤＮＡを固定すれば、ＤＮＡが伸長する位置を
限定できるので、レーザービームをスキャンする範囲が
少なくてすむ。一端を固定したＤＮＡ断片は、電界をか
けるとただちに伸長するので、本発明では短時間でＤＮ
Ａ断片の長さを測定することができる。以上、実施例で
は制限酵素Ｓｆｉ ＩやＮｏｔ Ｉで切断したＤＮＡを
試料として用いたが、他の方法で調製したＤＮＡでも本
発明の方法で長さを測定できうる。また、該ＤＮＡの伸
長方法は、電界をかける方法の他に、液流を用いる方法
などが使用しうる。
【００２８】
【発明の効果】以上実施例１から実施例４で説明した、
ＤＮＡ等生体高分子の両末端を蛍光標識してその長さを
測定する本発明によれば、ＤＮＡ分子を引き伸ばした状
態、即ち直線状に配向した状態にして長さを測定するの
で、従来の分子の拡がりの差により長さ分離する手法に
比べて精度が高く、僅かな分子数のＤＮＡを使用して分
子の長さを測定できる利点がある。長さ測定の精度は１
Ｋ（キロ）〜２Ｋ（キロ）塩基であり、数十Ｋ（キロ）
〜数百Ｋ（キロ）塩基あるいはそれ以上の長さのＤＮＡ
計測が可能である。この長さ精度は従来を１桁以上、上
回るものである。更に本発明ではＤＮＡの長さばかりで
なく、ＤＮＡを１本鎖とし、その両末端以外の種々の部
所で蛍光標識ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成し
て直線状に配向させ泳動し検出することにより、詳細な
ＤＮＡのマップ作りをすることもできる。また、以上実
施例５、実施例６で説明した、ＤＮＡの一端を固定して
その長さを測定する本発明では、電気泳動により被測定
ＤＮＡを分離する必要がないので、短時間でＤＮＡ長が
測定できる。また、ＤＮＡの固定や標識に使用する粒子
等は１μｍ以下であるため、数十μｍ以上のＤＮＡを精
度よく測定できる。また、細孔や細溝中にＤＮＡを伸長
させることで、ＤＮＡが伸長する位置を限定できるの
で、標識末端を容易に検索できる利点がある。あるい
は、ＤＮＡの固定用に粒子を使用することで、ＤＮＡを
固定した位置を正確に測定できる利点がある。本発明を
用いれば、ＤＮＡの長さを迅速かつ正確に測定できるの
で、特定のＤＮＡ中におけるＤＮＡの脱落や挿入などの
変異をとらえることができる。上記いずれの本発明にお
いても、測定にもっとも適当なＤＮＡの長さは、５０Ｋ
（キロ）塩基〜６Ｍ（メガ）塩基であるが、この範囲以
外でも測定は可能である。
ＤＮＡ等生体高分子の両末端を蛍光標識してその長さを
測定する本発明によれば、ＤＮＡ分子を引き伸ばした状
態、即ち直線状に配向した状態にして長さを測定するの
で、従来の分子の拡がりの差により長さ分離する手法に
比べて精度が高く、僅かな分子数のＤＮＡを使用して分
子の長さを測定できる利点がある。長さ測定の精度は１
Ｋ（キロ）〜２Ｋ（キロ）塩基であり、数十Ｋ（キロ）
〜数百Ｋ（キロ）塩基あるいはそれ以上の長さのＤＮＡ
計測が可能である。この長さ精度は従来を１桁以上、上
回るものである。更に本発明ではＤＮＡの長さばかりで
なく、ＤＮＡを１本鎖とし、その両末端以外の種々の部
所で蛍光標識ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成し
て直線状に配向させ泳動し検出することにより、詳細な
ＤＮＡのマップ作りをすることもできる。また、以上実
施例５、実施例６で説明した、ＤＮＡの一端を固定して
その長さを測定する本発明では、電気泳動により被測定
ＤＮＡを分離する必要がないので、短時間でＤＮＡ長が
測定できる。また、ＤＮＡの固定や標識に使用する粒子
等は１μｍ以下であるため、数十μｍ以上のＤＮＡを精
度よく測定できる。また、細孔や細溝中にＤＮＡを伸長
させることで、ＤＮＡが伸長する位置を限定できるの
で、標識末端を容易に検索できる利点がある。あるい
は、ＤＮＡの固定用に粒子を使用することで、ＤＮＡを
固定した位置を正確に測定できる利点がある。本発明を
用いれば、ＤＮＡの長さを迅速かつ正確に測定できるの
で、特定のＤＮＡ中におけるＤＮＡの脱落や挿入などの
変異をとらえることができる。上記いずれの本発明にお
いても、測定にもっとも適当なＤＮＡの長さは、５０Ｋ
（キロ）塩基〜６Ｍ（メガ）塩基であるが、この範囲以
外でも測定は可能である。
【図１】本発明のＤＮＡ等生体高分子の長さの測定の第
１の原理を説明する概略図。
１の原理を説明する概略図。
【図２】本発明の一実施例におけるＤＮＡ等生体高分子
の長さの測定装置を示す断面図。
の長さの測定装置を示す断面図。
【図３】本発明の一実施例における測定結果である、蛍
光検出の時間適間隔を示す図。
光検出の時間適間隔を示す図。
【図４】本発明の他の実施例における、細管を用いたＤ
ＮＡ等生体高分子の長さの測定装置を示す断面図。
ＮＡ等生体高分子の長さの測定装置を示す断面図。
【図５】本発明のさらに他の実施例における、細溝を用
いたＤＮＡ等生体高分子の長さの測定装置を示す断面
図。
いたＤＮＡ等生体高分子の長さの測定装置を示す断面
図。
【図６】本発明のさらに別の他の実施例における、分子
ふるい膜を用いたＤＮＡ等生体高分子の長さの測定装置
を示す断面図。
ふるい膜を用いたＤＮＡ等生体高分子の長さの測定装置
を示す断面図。
【図７】両末端を蛍光標識するとともに、他の位置に蛍
光標識をもつＤＮＡプローブをハイブリダイズした１本
鎖のＤＮＡの構造の概念図。
光標識をもつＤＮＡプローブをハイブリダイズした１本
鎖のＤＮＡの構造の概念図。
【図８】本発明のＤＮＡ等生体高分子の長さ測定の第２
の原理を説明する概念図。
の原理を説明する概念図。
【図９】本発明の異なる実施例における、ＤＮＡ断片の
調製法を示す概念図。
調製法を示す概念図。
【図１０】本発明の異なる実施例における、ＤＮＡ等生
体高分子の長さ測定容器を示す概略平面図。
体高分子の長さ測定容器を示す概略平面図。
１…分子配向泳動部、２ａ…バッファー液流入口、２ｂ
…シースフロー用液流、３…ＤＮＡの配向流路、４…レ
ーザー光源、４ａ…レーザー光、５…レーザー光絞り込
み用レンズ、６…受光レンズ、７…光検出器、８…デー
タ処理装置、９…出力装置、１０…ＤＮＡ分子の試料溶
液、１１…標識付ＤＮＡ試料、１２…試料注入具、１３
…標識付ＤＮＡ試料による信号、１４ａ、１４ｂ、２８
ａ、２８ｂ、２８ｃ…蛍光標識、１５、１５ｂ…上部バ
ッファー液、１５ａ…上部バッファー液流入口、１６…
下部バッファー液、１７…上部電極、１８…下部電極、
１９…シースフロー形成管、２０…細管、２１…上部バ
ッファー槽、２２…下部バッファー槽、２３ａ…噴出用
細管、２３ｂ…噴出口、２５…試料通過用細管、２６
ａ、２６ｂ、２６ｃ…蛍光標識プルーブ、２７…１本鎖
ＤＮＡ、２８…シリコン結晶板またはガラス材、２９…
細溝、３０…分子ふるい膜、１０１…測定対象ＤＮＡ断
片、１０２…標識物、１０３…粒子、１０４…ＤＮＡ固
定用担体、１０５ａ、１０５ｂ…電極、１０６…細孔、
１０７…蛍光体、１２１…測定対象ＤＮＡ断片、１２２
…螢光標識ＤＮＡ、１２３…螢光標識付ＤＮＡ断片、１
２４…粒子結合ＤＮＡ、１２５…螢光標識、粒子結合Ｄ
ＮＡ断片、１３１…試料添加兼電極槽、１３２…電極
槽、１３３…細孔、１３４…加圧孔。
…シースフロー用液流、３…ＤＮＡの配向流路、４…レ
ーザー光源、４ａ…レーザー光、５…レーザー光絞り込
み用レンズ、６…受光レンズ、７…光検出器、８…デー
タ処理装置、９…出力装置、１０…ＤＮＡ分子の試料溶
液、１１…標識付ＤＮＡ試料、１２…試料注入具、１３
…標識付ＤＮＡ試料による信号、１４ａ、１４ｂ、２８
ａ、２８ｂ、２８ｃ…蛍光標識、１５、１５ｂ…上部バ
ッファー液、１５ａ…上部バッファー液流入口、１６…
下部バッファー液、１７…上部電極、１８…下部電極、
１９…シースフロー形成管、２０…細管、２１…上部バ
ッファー槽、２２…下部バッファー槽、２３ａ…噴出用
細管、２３ｂ…噴出口、２５…試料通過用細管、２６
ａ、２６ｂ、２６ｃ…蛍光標識プルーブ、２７…１本鎖
ＤＮＡ、２８…シリコン結晶板またはガラス材、２９…
細溝、３０…分子ふるい膜、１０１…測定対象ＤＮＡ断
片、１０２…標識物、１０３…粒子、１０４…ＤＮＡ固
定用担体、１０５ａ、１０５ｂ…電極、１０６…細孔、
１０７…蛍光体、１２１…測定対象ＤＮＡ断片、１２２
…螢光標識ＤＮＡ、１２３…螢光標識付ＤＮＡ断片、１
２４…粒子結合ＤＮＡ、１２５…螢光標識、粒子結合Ｄ
ＮＡ断片、１３１…試料添加兼電極槽、１３２…電極
槽、１３３…細孔、１３４…加圧孔。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 27/447 33/53 Ｍ 8310−2Ｊ (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 西川 哲夫 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内
Claims (18)
- 【請求項１】少なくとも２ケ所が蛍光標識されたＤＮＡ
分子を直線状に配向させ移動させ、２ケ所に標識された
蛍光体が蛍光体を励起する光照射部を通過する時間差を
計測することを特徴とするＤＮＡ分子の長さ計測方法。 - 【請求項２】ＤＮＡ分子の少なくとも２ケ所を蛍光標識
する工程、蛍光標識された該ＤＮＡ分子を泳動させ直線
状に配向させる工程、直線状に配向された該ＤＮＡ分子
をバッファー液中で泳動させる工程、該バッファー液中
の泳動路の所定の位置に励起光を照射する工程、前記バ
ッファー液中の前記泳動路を泳動する前記ＤＮＡ分子の
蛍光標識に前記励起光が照射され、前記蛍光標識から発
せられる蛍光を検出する工程、および前記ＤＮＡ分子中
の一方の部位の前記蛍光標識から発せられた蛍光の検出
時から、前記ＤＮＡ分子中の他方の部位の前記蛍光標識
から発せられた蛍光の検出時までの時間を計測する工
程、を有することを特徴とするＤＮＡ分子の長さ計測方
法。 - 【請求項３】請求項２に記載の、蛍光標識された前記Ｄ
ＮＡ分子を泳動させ直線状に配向させる工程、および直
線状に配向された前記ＤＮＡ分子をバッファー液中で泳
動させる工程における泳動が、電気泳動を含むことを特
徴とするＤＮＡ分子の長さ計測方法。 - 【請求項４】ＤＮＡ分子の一端あるいはＤＮＡ分子中の
所定の部位に標識物を結合し、該ＤＮＡ分子の他の一端
を物理的または化学的に担体に捕捉し、前記ＤＮＡ分子
を電界あるいは液流により伸長せしめ、前記標識物の結
合した末端位置あるいはＤＮＡ分子中の位置を検出する
ことを特徴とするＤＮＡ分子の長さ計測方法。 - 【請求項５】ＤＮＡ分子の一端に微粒子を結合し、該微
粒子より小さい細孔を有する担体に該ＤＮＡ分子を捕捉
することを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡ分子の長
さ計測方法。 - 【請求項６】ＤＮＡ分子の一端において、抗原抗体反
応、既知の長さを有するオリゴマーＤＮＡ分子の相補鎖
結合反応、ビオチンとアビジンの反応のうちいずれかの
会合反応を用いて、前記ＤＮＡ分子を担体に捕捉するこ
とを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡ分子の長さ計測
方法。 - 【請求項７】ＤＮＡ分子の一端あるいは分子中に標識物
を有するＤＮＡ分子の他端に直径が０．２μｍ〜１μｍ
の微粒子を結合することを特徴とする請求項４に記載の
ＤＮＡ分子の長さ計測方法。 - 【請求項８】ＤＮＡ分子の一方の末端あるいは分子中の
所定の部位を蛍光標識する工程、該蛍光標識された該Ｄ
ＮＡ分子の他方の末端を担体に固定する工程、該ＤＮＡ
分子を電界の印加もしくは液流中におくことにより伸長
させる工程、励起光を前記蛍光標識に照射し、前記蛍光
標識から発せられた蛍光を検出する工程、および該蛍光
を検出した位置を測定し、該ＤＮＡ分子の固定されてい
る他端との距離を計測する工程、を有することをＤＮＡ
分子の長さ計測方法。 - 【請求項９】請求項８において、一方の末端あるいは分
子中の所定の部位を蛍光標識されたＤＮＡ分子の他方の
末端を担体に固定する工程が、該ＤＮＡ分子の他方の末
端に粒子を結合し、その粒子の大きさより小さい細孔の
入口に該粒子を固定する工程であることをＤＮＡ分子の
長さ計測方法。 - 【請求項１０】ＤＮＡ分子を直線状に配向して移動させ
る手段、該ＤＮＡ分子の両末端に標識された蛍光体を励
起する光源、励起された蛍光体から発せられた蛍光を検
出する手段、および前記ＤＮＡ分子中の一方の部位から
蛍光が検出されてから他方の部位から蛍光が検出される
までの時間を計測する手段、を有することを特徴とする
ＤＮＡ分子の長さ計測装置。 - 【請求項１１】請求項１０において、ＤＮＡ分子を直線
状に配向して移動させる手段が、細管中の該ＤＮＡ分子
を電気泳動差せる手段であることを特徴とするＤＮＡ分
子の長さ計測装置。 - 【請求項１２】ゲル電気泳動細管の試料溶出部がシース
フロー管内に設けられ、電界印加手段が該ゲル電気泳動
細管の試料注入端とシースフロー管の末端に設けられ、
ＤＮＡ分子を直線状に配向させ泳動させることを特徴と
する請求項１１に記載のＤＮＡの長さ計測装置。 - 【請求項１３】バッファー液で満たされた上部、及び下
部バッファー槽の間に設けられた試料噴出用細管から、
上部、及び下部バッファー槽に設けられた電界印加手段
と、上部バッファー槽から下部バッファー槽に流れるバ
ッファー液流によって、ＤＮＡ分子を噴出させ、該ＤＮ
Ａ分子を直線状に配向させ泳動させることを特徴とする
請求項１１に記載のＤＮＡの長さ計測装置。 - 【請求項１４】上記試料噴出用細管がガラス材等に刻ま
れた細溝によって形成されることを特徴とする請求項１
３に記載のＤＮＡの長さ計測装置。 - 【請求項１５】請求項１０において、ＤＮＡ分子を直線
状に配向して移動させる手段が、バッファー液で満たさ
れた上部、及び下部バッファー槽の間に設けられた分子
ふるい膜から、上部、及び下部バッファー槽に設けられ
た電界印加手段により、ＤＮＡ分子を噴出させる手段で
あることを特徴とするＤＮＡ分子の長さ計測装置。 - 【請求項１６】蛍光体を励起する光の照射部がＤＮＡ分
子の溶出部又は噴出部の１ｍｍ以内の領域に設置される
ことを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡの長さ計測
装置。 - 【請求項１７】前記ＤＮＡ分子の両末端に標識された蛍
光体を励起するための、励起光が１μｍ以下に絞られた
光であることを特徴とする請求項１０に記載のＤＮＡの
長さ計測装置。 - 【請求項１８】ＤＮＡを１本鎖とし、少なくとも片方の
末端を蛍光標識し、両末端以外の部所で複数の蛍光標識
ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成したのち、直線
状に配向させ移動させ前記蛍光標識間の長さを計測する
ことを特徴とするＤＮＡ地図の作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04238033A JP3123249B2 (ja) | 1991-09-10 | 1992-09-07 | Ｄｎａ分子の長さ計測方法および計測装置 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23004591 | 1991-09-10 | ||
| JP3-230045 | 1991-09-10 | ||
| JP3-237757 | 1991-09-18 | ||
| JP23775791 | 1991-09-18 | ||
| JP04238033A JP3123249B2 (ja) | 1991-09-10 | 1992-09-07 | Ｄｎａ分子の長さ計測方法および計測装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05322899A true JPH05322899A (ja) | 1993-12-07 |
| JP3123249B2 JP3123249B2 (ja) | 2001-01-09 |
Family
ID=26529114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04238033A Expired - Fee Related JP3123249B2 (ja) | 1991-09-10 | 1992-09-07 | Ｄｎａ分子の長さ計測方法および計測装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5356776A (ja) |
| JP (1) | JP3123249B2 (ja) |
| DE (1) | DE4230355A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005024431A1 (ja) * | 2003-09-02 | 2005-03-17 | Nec Corporation | 生体分子の解析方法およびこれを用いた生体分子の同定方法 |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5529679A (en) * | 1992-02-28 | 1996-06-25 | Hitachi, Ltd. | DNA detector and DNA detection method |
| CA2170264A1 (en) * | 1993-09-10 | 1995-03-16 | Michael W. Konrad | Optical detection of position of oligonucleotides on large dna molecules |
| US5585069A (en) * | 1994-11-10 | 1996-12-17 | David Sarnoff Research Center, Inc. | Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis |
| US20120160687A1 (en) | 1995-03-17 | 2012-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions |
| US6362002B1 (en) * | 1995-03-17 | 2002-03-26 | President And Fellows Of Harvard College | Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions |
| US7775368B2 (en) * | 1995-04-03 | 2010-08-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Micro-channel long molecule manipulation system |
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