JPH0532703A - 低分子量ヘパリン誘導体の製造法 - Google Patents
低分子量ヘパリン誘導体の製造法Info
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来法によって得られる低分子量ヘパリンに
比べて、抗血栓性がより向上した低分子量ヘパリン誘導
体の製造法を提供する。 【構成】 ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を固相また
は化学的に安定な加熱媒体に分散させて加熱し、ヘパリ
ン分子内のアミノ基に結合している硫酸基を分子内の特
定の水酸基に転移させ、次いで、硫酸基が離脱したアミ
ノ基を再硫酸化したのち、低分子化処理または低分子部
分を分画する低分子量ヘパリン誘導体の製造法である。
比べて、抗血栓性がより向上した低分子量ヘパリン誘導
体の製造法を提供する。 【構成】 ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を固相また
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ン分子内のアミノ基に結合している硫酸基を分子内の特
定の水酸基に転移させ、次いで、硫酸基が離脱したアミ
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分を分画する低分子量ヘパリン誘導体の製造法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な低分子量ヘパリ
ン誘導体の製造方法に関する。さらに詳しくは、天然ヘ
パリンを分画または低分子化処理することにより得られ
る低分子量ヘパリンに比べて、抗血栓剤としての生物学
的活性及び薬動力学的性状に優れた新規な低分子量ヘパ
リン誘導体の製造方法に関する。
ン誘導体の製造方法に関する。さらに詳しくは、天然ヘ
パリンを分画または低分子化処理することにより得られ
る低分子量ヘパリンに比べて、抗血栓剤としての生物学
的活性及び薬動力学的性状に優れた新規な低分子量ヘパ
リン誘導体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヘパリンは血液凝固阻止作用を有し、血
液凝固系に異常のある疾患の治療や、人工透析、人工心
肺などを用いた体外循環血液の凝固性を低下させるため
臨床上広く用いられ、さらには、生体内に導入される医
療器具に抗血栓性を付与するためにも用いられる。
液凝固系に異常のある疾患の治療や、人工透析、人工心
肺などを用いた体外循環血液の凝固性を低下させるため
臨床上広く用いられ、さらには、生体内に導入される医
療器具に抗血栓性を付与するためにも用いられる。
【０００３】ヘパリン系抗血栓剤に関する従来の知識、
技術１９７６年，Anderssonら（L.-O. Andersson et a
l. Thromb. Res., 9(1976)575)，およびHookら、Lamら
はそれぞれ独立して、天然へパリンの３０−５０％の分
子種のみがアンチトロンビンIII（ＡＴIII）と結合し得
るが、残余の分子種は結合しないことを発見した。その
後、ＡＴIII高親和性ヘパリン分子には必ずＡＴIII結合
性オリゴ糖鎖が存在すること、この結合性オリゴ糖自身
は高い抗Ｘａ因子活性を有するが抗トロンビン活性を有
しないこと、さらに抗トロンビン活性発現のためには結
合性オリゴ糖を含む１８−２０種（分子量5000-6000）
以上の糖鎖を必要とすることが判明した（E.Holmer et
al.,Haemostasis,16(Suppl.2)(1986)1）。
技術１９７６年，Anderssonら（L.-O. Andersson et a
l. Thromb. Res., 9(1976)575)，およびHookら、Lamら
はそれぞれ独立して、天然へパリンの３０−５０％の分
子種のみがアンチトロンビンIII（ＡＴIII）と結合し得
るが、残余の分子種は結合しないことを発見した。その
後、ＡＴIII高親和性ヘパリン分子には必ずＡＴIII結合
性オリゴ糖鎖が存在すること、この結合性オリゴ糖自身
は高い抗Ｘａ因子活性を有するが抗トロンビン活性を有
しないこと、さらに抗トロンビン活性発現のためには結
合性オリゴ糖を含む１８−２０種（分子量5000-6000）
以上の糖鎖を必要とすることが判明した（E.Holmer et
al.,Haemostasis,16(Suppl.2)(1986)1）。
【０００４】一般に、ヘパリンの抗血栓作用は血液凝固
遅延活性（ＡＰＴＴ）あるいは抗トロンビン活性の促進
によるとされている。一方でこれらの活性は、ヘパリン
の臨床使用に際しての副作用である出血性の危険度を示
すパラメーターでもある。ヘパリンが併せ持つ抗血栓性
と出血性とのバランスを改善するための努力が長年にわ
たって続けられた。その結果、ヘパリンの抗血栓作用は
ＡＰＴＴ（あるいは抗トロンビン活性）よりも抗Ｘａ因
子活性に依存するとの見解のもとに、いわゆる低分子量
ヘパリン（抗Ｘａ因子活性を保持するが、ＡＰＴＴ効果
はゼロか極めて低い）が抗血栓剤開発の主たる対象とな
ったのである。
遅延活性（ＡＰＴＴ）あるいは抗トロンビン活性の促進
によるとされている。一方でこれらの活性は、ヘパリン
の臨床使用に際しての副作用である出血性の危険度を示
すパラメーターでもある。ヘパリンが併せ持つ抗血栓性
と出血性とのバランスを改善するための努力が長年にわ
たって続けられた。その結果、ヘパリンの抗血栓作用は
ＡＰＴＴ（あるいは抗トロンビン活性）よりも抗Ｘａ因
子活性に依存するとの見解のもとに、いわゆる低分子量
ヘパリン（抗Ｘａ因子活性を保持するが、ＡＰＴＴ効果
はゼロか極めて低い）が抗血栓剤開発の主たる対象とな
ったのである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ヘパリン系抗血栓剤の開発において、本発明が解決しよ
うとする課題 前述のヘパリン系抗血栓剤として期待された低分子量ヘ
パリンは、in vivo およびボランティアによる臨床試験
の結果では、その有効性と安全性は必ずしも天然ヘパリ
ンに比べて優れているとは言い難いとの批判が近年多く
なってきた。すなわち、低分子量ヘパリンに一般に認め
られる好ましい臨床使用上の利点や薬動力学的性状は評
価できるが、前述の抗血栓性に関するテーゼ（高い抗Ｘ
ａ因子活性と低い抗トロンビン活性）自体が現在では見
直されつつある。すなわち、Thomasらはヘパリン製剤が
最大の抗血栓活性を発揮するためには、抗Ｘａ因子活性
と抗トロンビン活性の両者が共に必要であると述べてい
る（Thomas, D.P.,et al.Ann.NY Acad.Sci.(1989)556,
313-321）。また、S.Coccheriは、「低分子量ヘパリン
に関する総説」（S.Coccheri,Haemostasis, (1990) 20
(Suppl.1), 74-80)のなかで、（抗Ｘａ因子／抗トロン
ビン）の高い活性比率は必ずしも強力な抗血栓効果の指
標とはならないと述べている。先に本発明者らはアンチ
トロンビンIIIに対して親和性の強い新規ヘパリン誘導
体（ＳＴヘパリン）を開発した（H.Uchiyama and K.Nag
asawa, Ｊ.Biol. Chem.(1991）266,6756-6760)。ＳＴヘ
パリンを低分子化し、あるいは低分子量ヘパリンをＳＴ
化することにより低分子量ＳＴヘパリンが得られるはず
である。在来の低分子量ヘパリンの抗血栓性について批
判が多い折から、本発明者は、新規抗血栓剤としての低
分子量ＳＴヘパリンの開発を思い立ったのである。
うとする課題 前述のヘパリン系抗血栓剤として期待された低分子量ヘ
パリンは、in vivo およびボランティアによる臨床試験
の結果では、その有効性と安全性は必ずしも天然ヘパリ
ンに比べて優れているとは言い難いとの批判が近年多く
なってきた。すなわち、低分子量ヘパリンに一般に認め
られる好ましい臨床使用上の利点や薬動力学的性状は評
価できるが、前述の抗血栓性に関するテーゼ（高い抗Ｘ
ａ因子活性と低い抗トロンビン活性）自体が現在では見
直されつつある。すなわち、Thomasらはヘパリン製剤が
最大の抗血栓活性を発揮するためには、抗Ｘａ因子活性
と抗トロンビン活性の両者が共に必要であると述べてい
る（Thomas, D.P.,et al.Ann.NY Acad.Sci.(1989)556,
313-321）。また、S.Coccheriは、「低分子量ヘパリン
に関する総説」（S.Coccheri,Haemostasis, (1990) 20
(Suppl.1), 74-80)のなかで、（抗Ｘａ因子／抗トロン
ビン）の高い活性比率は必ずしも強力な抗血栓効果の指
標とはならないと述べている。先に本発明者らはアンチ
トロンビンIIIに対して親和性の強い新規ヘパリン誘導
体（ＳＴヘパリン）を開発した（H.Uchiyama and K.Nag
asawa, Ｊ.Biol. Chem.(1991）266,6756-6760)。ＳＴヘ
パリンを低分子化し、あるいは低分子量ヘパリンをＳＴ
化することにより低分子量ＳＴヘパリンが得られるはず
である。在来の低分子量ヘパリンの抗血栓性について批
判が多い折から、本発明者は、新規抗血栓剤としての低
分子量ＳＴヘパリンの開発を思い立ったのである。
【０００６】本発明の目的は、従来法によって得られる
低分子量ヘパリンに比べて、より向上した抗血栓性が期
待される新規低分子量ヘパリン誘導体の製造法を提供す
ることにある。
低分子量ヘパリンに比べて、より向上した抗血栓性が期
待される新規低分子量ヘパリン誘導体の製造法を提供す
ることにある。
【０００７】上記目的を達成するものは、ヘパリンと芳
香異項環塩基との塩を固相または化学的に安定な加熱媒
体に分散させて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基に結
合している硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移させ、
次いで、硫酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化したの
ち、低分子化処理または低分子部分を分画することによ
る低分子量ヘパリン誘導体の製造法である（第１の製造
法）。
香異項環塩基との塩を固相または化学的に安定な加熱媒
体に分散させて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基に結
合している硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移させ、
次いで、硫酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化したの
ち、低分子化処理または低分子部分を分画することによ
る低分子量ヘパリン誘導体の製造法である（第１の製造
法）。
【０００８】また、上記目的を達成するものは、ヘパリ
ンを低分子化処理または低分子部分を分画することによ
り、低分子量ヘパリンを得て、該低分子量ヘパリンと芳
香異項環塩基との塩を形成させて、該低分子量ヘパリン
と芳香異項環塩基との塩を固相または化学的に安定な加
熱媒体に分散させて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基
に結合している硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移さ
せ、次いで、硫酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化する
ことによる低分子量ヘパリン誘導体の製造法である（第
２の製造法）。
ンを低分子化処理または低分子部分を分画することによ
り、低分子量ヘパリンを得て、該低分子量ヘパリンと芳
香異項環塩基との塩を形成させて、該低分子量ヘパリン
と芳香異項環塩基との塩を固相または化学的に安定な加
熱媒体に分散させて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基
に結合している硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移さ
せ、次いで、硫酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化する
ことによる低分子量ヘパリン誘導体の製造法である（第
２の製造法）。
【０００９】本発明の低分子量ヘパリン誘導体の製造法
について実施例を用いて説明する。本発明の低分子量ヘ
パリン誘導体の第１の製造法は、ヘパリンと芳香異項環
塩基との塩を固相または化学的に安定な加熱媒体に分散
させて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基に結合してい
る硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移させ、次いで、
硫酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化したのち、低分子
化処理または低分子部分を分画するものである。
について実施例を用いて説明する。本発明の低分子量ヘ
パリン誘導体の第１の製造法は、ヘパリンと芳香異項環
塩基との塩を固相または化学的に安定な加熱媒体に分散
させて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基に結合してい
る硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移させ、次いで、
硫酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化したのち、低分子
化処理または低分子部分を分画するものである。
【００１０】本発明の低分子量ヘパリン誘導体の製造法
において使用される原料ヘパリンとしては、ウシ、ブ
タ、クジラ由来等いずれのものを用いてもよい。ヘパリ
ン塩を形成する芳香異項環塩基としては、ピリジンおよ
びそのメチル置換体（ピコリン、ルチジン、コリジ
ン）、キノリン、イソキノリン等が挙げられる。ヘパリ
ンと芳香異項環塩基との塩は常法に従って得られる。例
えば、市販のヘパリン・ナトリウム塩またはカルシウム
塩等を、ピリジニウム型陽イオン交換樹脂等で処理する
ことにより容易にヘパリン・ピリジニウム塩を得ること
ができるが、この方法に限定されるものではない。
において使用される原料ヘパリンとしては、ウシ、ブ
タ、クジラ由来等いずれのものを用いてもよい。ヘパリ
ン塩を形成する芳香異項環塩基としては、ピリジンおよ
びそのメチル置換体（ピコリン、ルチジン、コリジ
ン）、キノリン、イソキノリン等が挙げられる。ヘパリ
ンと芳香異項環塩基との塩は常法に従って得られる。例
えば、市販のヘパリン・ナトリウム塩またはカルシウム
塩等を、ピリジニウム型陽イオン交換樹脂等で処理する
ことにより容易にヘパリン・ピリジニウム塩を得ること
ができるが、この方法に限定されるものではない。
【００１１】得られたヘパリンと芳香異項環塩基との塩
は、固相加熱または化学的に安定な加熱媒体に分散させ
て加熱することにより、分子内Ｎ→Ｏ硫酸基転移反応が
起こる。つまり、ヘパリン分子中のアミノ基に結合して
いた硫酸基が離脱し、分子内の特定の水酸基に転移す
る。この分子内Ｎ→Ｏ硫酸基転移反応に使用する化学的
に安定な加熱媒体としては、例えば、流動パラフィン、
デカリン、シリコンオイルなどがある。加熱温度として
は５０〜１２０℃が、加熱時間としては０．５〜１０時
間が好適である。かくして得られた転移生成物をＮ−再
硫酸化する。Ｎ−再硫酸化は、例えば［A.G.Lloyd,et a
l.(1971),Biochem.Pharmacol.,20,637■648］記載の方
法（前出）に従って実施される。すなわち、転移生成物
をアルカリ性水溶液（ｐＨ９〜１０）として（ＣＨ3）3
Ｎ・ＳＯ3を加え、５５℃で２４時間程度反応させること
により、選択的にアミノ基の硫酸化が進行する。反応終
了後、所望の生成物は常法に従って反応混合物中から採
取される。Ｎ−再硫酸化後、反応溶液のｐＨを９〜９．
５に調整して透析を行い、透析内液を凍結乾燥すること
によって、ヘパリン誘導体（ＳＴヘパリン，注１）が得
られる。 注１） Ｎ→Ｏ硫酸基転移、Ｎ−再硫酸化により得られ
たヘパリン誘導体（sulfate-transferred,N-resulfated
heparin）を“ＳＴヘパリン”と呼ぶ。
は、固相加熱または化学的に安定な加熱媒体に分散させ
て加熱することにより、分子内Ｎ→Ｏ硫酸基転移反応が
起こる。つまり、ヘパリン分子中のアミノ基に結合して
いた硫酸基が離脱し、分子内の特定の水酸基に転移す
る。この分子内Ｎ→Ｏ硫酸基転移反応に使用する化学的
に安定な加熱媒体としては、例えば、流動パラフィン、
デカリン、シリコンオイルなどがある。加熱温度として
は５０〜１２０℃が、加熱時間としては０．５〜１０時
間が好適である。かくして得られた転移生成物をＮ−再
硫酸化する。Ｎ−再硫酸化は、例えば［A.G.Lloyd,et a
l.(1971),Biochem.Pharmacol.,20,637■648］記載の方
法（前出）に従って実施される。すなわち、転移生成物
をアルカリ性水溶液（ｐＨ９〜１０）として（ＣＨ3）3
Ｎ・ＳＯ3を加え、５５℃で２４時間程度反応させること
により、選択的にアミノ基の硫酸化が進行する。反応終
了後、所望の生成物は常法に従って反応混合物中から採
取される。Ｎ−再硫酸化後、反応溶液のｐＨを９〜９．
５に調整して透析を行い、透析内液を凍結乾燥すること
によって、ヘパリン誘導体（ＳＴヘパリン，注１）が得
られる。 注１） Ｎ→Ｏ硫酸基転移、Ｎ−再硫酸化により得られ
たヘパリン誘導体（sulfate-transferred,N-resulfated
heparin）を“ＳＴヘパリン”と呼ぶ。
【００１２】かくして得られたヘパリン誘導体のアンチ
トロンビンIIIに対する親和性は、アンチトロンビンIII
を固定化したセファロースを用いるアフィニティ・クロ
マトグラフィーにより判定される。このＳＴヘパリンを
低分子化するためには、以下の２つの方法がある。 （１）：ＳＴヘパリンを公知の低分子化方法（例えば亜
硝酸の如き化学薬品、あるいは、フラボバクテリウム
ヘパリナムまたはその変異株から得られる酵素ヘパリナ
ーゼの作用）により、所望の分子量範囲にまでＳＴヘパ
リンを低分子化し、本発明の低分子量ヘパリン誘導体
（ＬＭＷ ＳＴヘパリン，注２）を得る方法である。 注２）低分子量ヘパリン誘導体（low molecular weight
ST heparin）を“ＬＭＷ ＳＴヘパリン”と呼ぶ。 （２）：ＳＴヘパリンを公知の分画法（ゲル濾過または
エタノール沈殿法、または濾過膜法など）により分画し
て、所望のＳＴヘパリン低分子量画分を得る方法であ
る。これらの方法を選択使用して、目的とする低分子量
ヘパリン誘導体（ＬＭＷＳＴヘパリン）を得る。
トロンビンIIIに対する親和性は、アンチトロンビンIII
を固定化したセファロースを用いるアフィニティ・クロ
マトグラフィーにより判定される。このＳＴヘパリンを
低分子化するためには、以下の２つの方法がある。 （１）：ＳＴヘパリンを公知の低分子化方法（例えば亜
硝酸の如き化学薬品、あるいは、フラボバクテリウム
ヘパリナムまたはその変異株から得られる酵素ヘパリナ
ーゼの作用）により、所望の分子量範囲にまでＳＴヘパ
リンを低分子化し、本発明の低分子量ヘパリン誘導体
（ＬＭＷ ＳＴヘパリン，注２）を得る方法である。 注２）低分子量ヘパリン誘導体（low molecular weight
ST heparin）を“ＬＭＷ ＳＴヘパリン”と呼ぶ。 （２）：ＳＴヘパリンを公知の分画法（ゲル濾過または
エタノール沈殿法、または濾過膜法など）により分画し
て、所望のＳＴヘパリン低分子量画分を得る方法であ
る。これらの方法を選択使用して、目的とする低分子量
ヘパリン誘導体（ＬＭＷＳＴヘパリン）を得る。
【００１３】次に、本発明の低分子量ヘパリン誘導体の
第２の製造法について説明する。この発明の低分子量ヘ
パリン誘導体の製造方法は、ヘパリンを低分子化処理ま
たは低分子部分を分画することにより、低分子量ヘパリ
ンを得て、ついで低分子量ヘパリンと芳香異項環塩基と
の塩を形成させて、該低分子量ヘパリンと芳香異項環塩
基との塩を固相または化学的に安定な加熱媒体に分散さ
せて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基に結合している
硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移させ、次いで、硫
酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化するものである。
第２の製造法について説明する。この発明の低分子量ヘ
パリン誘導体の製造方法は、ヘパリンを低分子化処理ま
たは低分子部分を分画することにより、低分子量ヘパリ
ンを得て、ついで低分子量ヘパリンと芳香異項環塩基と
の塩を形成させて、該低分子量ヘパリンと芳香異項環塩
基との塩を固相または化学的に安定な加熱媒体に分散さ
せて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基に結合している
硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移させ、次いで、硫
酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化するものである。
【００１４】本発明の低分子量ヘパリン誘導体の製造法
において使用される原料ヘパリンとしては、ウシ、ブ
タ、クジラ由来等いずれのものを用いてもよい。原料ヘ
パリンから低分子量ヘパリンを得るためには二つの方法
が用いられる。即ち、 (１)：公知の低分子化方法（例えば亜硝酸の如き化学薬
品、あるいは、フラボバクテリウム ヘパリナムまたは
その変異株から得られる酵素ヘパリナーゼの作用によ
り、所望の分子量範囲にまで原料ヘパリンを低分子化す
る方法である。 (２)：原料ヘパリンを公知の分画法（ゲル濾過またはエ
タノール沈殿法、または濾過膜法など）により分画し
て、所望のヘパリン低分子量画分を得る方法である。こ
れらの方法を選択使用して、低分子量ヘパリン（ＬＭＷ
ヘパリン）を得る。
において使用される原料ヘパリンとしては、ウシ、ブ
タ、クジラ由来等いずれのものを用いてもよい。原料ヘ
パリンから低分子量ヘパリンを得るためには二つの方法
が用いられる。即ち、 (１)：公知の低分子化方法（例えば亜硝酸の如き化学薬
品、あるいは、フラボバクテリウム ヘパリナムまたは
その変異株から得られる酵素ヘパリナーゼの作用によ
り、所望の分子量範囲にまで原料ヘパリンを低分子化す
る方法である。 (２)：原料ヘパリンを公知の分画法（ゲル濾過またはエ
タノール沈殿法、または濾過膜法など）により分画し
て、所望のヘパリン低分子量画分を得る方法である。こ
れらの方法を選択使用して、低分子量ヘパリン（ＬＭＷ
ヘパリン）を得る。
【００１５】次に、このようにして得た低分子量ヘパリ
ンの芳香異項環塩基との塩を調製する。低分子量ヘパリ
ン塩を形成する芳香異項環塩基としては、ピリジンおよ
びそのメチル置換体（ピコリン、ルチジン、コリジ
ン）、キノリン、イソキノリン等が挙げられる。低分子
量ヘパリンと芳香異項環塩基との塩は常法に従って得ら
れる。例えば、上記の低分子量ヘパリン・ナトリウム塩
またはカルシウム塩を、ピリジニウム型陽イオン交換樹
脂等で処理することにより容易に低分子量ヘパリン・ピ
リジニウム塩を得ることができるが、この方法に限定さ
れるものではない。
ンの芳香異項環塩基との塩を調製する。低分子量ヘパリ
ン塩を形成する芳香異項環塩基としては、ピリジンおよ
びそのメチル置換体（ピコリン、ルチジン、コリジ
ン）、キノリン、イソキノリン等が挙げられる。低分子
量ヘパリンと芳香異項環塩基との塩は常法に従って得ら
れる。例えば、上記の低分子量ヘパリン・ナトリウム塩
またはカルシウム塩を、ピリジニウム型陽イオン交換樹
脂等で処理することにより容易に低分子量ヘパリン・ピ
リジニウム塩を得ることができるが、この方法に限定さ
れるものではない。
【００１６】得られた低分子量ヘパリンと芳香異項環塩
基との塩は、固相加熱または化学的に安定な加熱媒体に
分散させて加熱することにより、ヘパリン分子内のアミ
ノ基に結合していた硫酸基を分子内の特定の水酸基に転
移させる。この分子内Ｎ→Ｏ硫酸基転移反応に使用する
化学的に安定な加熱媒体とは、例えば、流動パラフィ
ン、デカリン、シリコンオイルなどがある。加熱温度と
しては、５０〜１２０℃が、加熱時間としては０.５〜
１０時間が好適である。かくして得られた転移生成物の
Ｎ−再硫酸化を常法に従って実施する（前出）。Ｎ−硫
酸化終了後、透析、凍結乾燥を経て所望のＬＭＷ ＳＴ
ヘパリンが得られる。上記のように第１または第２のい
ずれかの製造方法により、目的とする低分子量ヘパリン
誘導体（ＬＭＷ ＳＴヘパリン）が得られる。
基との塩は、固相加熱または化学的に安定な加熱媒体に
分散させて加熱することにより、ヘパリン分子内のアミ
ノ基に結合していた硫酸基を分子内の特定の水酸基に転
移させる。この分子内Ｎ→Ｏ硫酸基転移反応に使用する
化学的に安定な加熱媒体とは、例えば、流動パラフィ
ン、デカリン、シリコンオイルなどがある。加熱温度と
しては、５０〜１２０℃が、加熱時間としては０.５〜
１０時間が好適である。かくして得られた転移生成物の
Ｎ−再硫酸化を常法に従って実施する（前出）。Ｎ−硫
酸化終了後、透析、凍結乾燥を経て所望のＬＭＷ ＳＴ
ヘパリンが得られる。上記のように第１または第２のい
ずれかの製造方法により、目的とする低分子量ヘパリン
誘導体（ＬＭＷ ＳＴヘパリン）が得られる。
【００１７】
【実施例】次に、実施例および試験例を示して本発明を
さらに具体的に説明する。 ヘパリン・ピリジニウム塩の調製 市販のブタヘパリン・ナトリウム塩（例えばＶＧＦコー
ポレーション製）３１５ｍｇ（１６４ ＵＳＰ ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇ）をピリジニウム型陽イオン交換樹脂（Ｄｏ
ｗｅｘ ５０Ｗ：ダウケミカル社製）にて処理し、得ら
れたヘパリン・ピリジニウム塩水溶液を凍結乾燥して白
色粉末状のピリジニウム塩３０５ｍｇを得た。
さらに具体的に説明する。 ヘパリン・ピリジニウム塩の調製 市販のブタヘパリン・ナトリウム塩（例えばＶＧＦコー
ポレーション製）３１５ｍｇ（１６４ ＵＳＰ ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇ）をピリジニウム型陽イオン交換樹脂（Ｄｏ
ｗｅｘ ５０Ｗ：ダウケミカル社製）にて処理し、得ら
れたヘパリン・ピリジニウム塩水溶液を凍結乾燥して白
色粉末状のピリジニウム塩３０５ｍｇを得た。
【００１８】 ヘパリン・ピリジニウム塩の分析
で得られたヘパリン・ピリジニウム塩の総硫酸含量
（Ｔｏｔａｌ Ｓ）（単位２糖当たりｍｏｌ）を、比濁
法［Dodgson,K.S.&Price,R.G(1962) Biochem.J.,84,106
■110］により測定したところ、２．２５ｍｏｌであっ
た。また、Ｇ１CＮＳ（注３），Ｇ１CＮ６Ｓ（注４）お
よびＩｄｏＡ ２Ｓ（注５）のそれぞれのＳ含量（単位
２糖当たり ｍｏｌ）を、ＮＭＲ法で測定したところ、
０.８３０，０.７７１，０.６５６ ｍｏｌであった。
なお、ＮＭＲ法による測定は、Ｇ１CＮＳに関しては［C
asu,B.,et al.(1983)Arzneim.-Forsch.,33,135■14
2］、Ｇ１CＮ・６Ｓに関しては［Gatti,G.,et al.(197
9) Macromolecules, 12,1001■1107］、ＩｄｏＡ ２Ｓ
に関しては［Ayotte,L.&Perlin,A.S.(1986) Carbohydr.
Res.,145,267■277］記載の原理により行われた。 注３：Ｇ１CＮＳ：Ｎ−スルフォ−Ｄ−グルコサミン残
基； 注４：Ｇ１CＮ６Ｓ：６−０−硫酸化Ｎ−スルフォおよ
びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基。 注５：ＩｄｏＡ ２Ｓ，２−Ｏ−硫酸化Ｌ−イズロン酸
残基。
（Ｔｏｔａｌ Ｓ）（単位２糖当たりｍｏｌ）を、比濁
法［Dodgson,K.S.&Price,R.G(1962) Biochem.J.,84,106
■110］により測定したところ、２．２５ｍｏｌであっ
た。また、Ｇ１CＮＳ（注３），Ｇ１CＮ６Ｓ（注４）お
よびＩｄｏＡ ２Ｓ（注５）のそれぞれのＳ含量（単位
２糖当たり ｍｏｌ）を、ＮＭＲ法で測定したところ、
０.８３０，０.７７１，０.６５６ ｍｏｌであった。
なお、ＮＭＲ法による測定は、Ｇ１CＮＳに関しては［C
asu,B.,et al.(1983)Arzneim.-Forsch.,33,135■14
2］、Ｇ１CＮ・６Ｓに関しては［Gatti,G.,et al.(197
9) Macromolecules, 12,1001■1107］、ＩｄｏＡ ２Ｓ
に関しては［Ayotte,L.&Perlin,A.S.(1986) Carbohydr.
Res.,145,267■277］記載の原理により行われた。 注３：Ｇ１CＮＳ：Ｎ−スルフォ−Ｄ−グルコサミン残
基； 注４：Ｇ１CＮ６Ｓ：６−０−硫酸化Ｎ−スルフォおよ
びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基。 注５：ＩｄｏＡ ２Ｓ，２−Ｏ−硫酸化Ｌ−イズロン酸
残基。
【００１９】ヘパリン・ピリジニウム塩の分子内Ｎ→
Ｏ硫酸基転移およびＮ−再硫酸化 にて得られたヘパリン・ピリジニウム塩３０５ｍｇを
ガラス製容器に入れ、五酸化リン（脱水剤）存在下に容
器内を真空とし、水分を完全に除去した後、固相加熱
（９０℃、９０分）した。反応容器を室温まで冷却した
後、内容物を冷水（２０ｍｌ）に溶解し、Ｌｌｏｙｄら
の方法（前出）に従ってＮ−再硫酸化を行った。すなわ
ち、この水溶液に炭酸ナトリウム（０.８５ｇ）を加え
てアルカリ性としたのち、（ＣＨ3）3Ｎ・ＳＯ3（１.１
ｇ）を３回（反応開始時およびその後、５時間毎）に分
けて添加し、その間ｐＨ９、液温５５℃に保ち、合計２
４時間反応させた。得られた反応溶液を水酸化ナトリウ
ム溶液でｐＨ９に調整したのち透析した。透析内液をろ
過し凍結乾燥してＮ−再硫酸化転移生成物（ＳＴヘパリ
ン）２８５ｍｇを得た。
Ｏ硫酸基転移およびＮ−再硫酸化 にて得られたヘパリン・ピリジニウム塩３０５ｍｇを
ガラス製容器に入れ、五酸化リン（脱水剤）存在下に容
器内を真空とし、水分を完全に除去した後、固相加熱
（９０℃、９０分）した。反応容器を室温まで冷却した
後、内容物を冷水（２０ｍｌ）に溶解し、Ｌｌｏｙｄら
の方法（前出）に従ってＮ−再硫酸化を行った。すなわ
ち、この水溶液に炭酸ナトリウム（０.８５ｇ）を加え
てアルカリ性としたのち、（ＣＨ3）3Ｎ・ＳＯ3（１.１
ｇ）を３回（反応開始時およびその後、５時間毎）に分
けて添加し、その間ｐＨ９、液温５５℃に保ち、合計２
４時間反応させた。得られた反応溶液を水酸化ナトリウ
ム溶液でｐＨ９に調整したのち透析した。透析内液をろ
過し凍結乾燥してＮ−再硫酸化転移生成物（ＳＴヘパリ
ン）２８５ｍｇを得た。
【００２０】 Ｎ−再硫酸化転移生成物の分析
にて得られた転移生成物中の総硫酸含量（Ｔｏｔａｌ
Ｓ） （単位２糖当たりｍｏｌ）を測定したところ、
２.５４ｍｏｌであった。ＧｌCＮＳ，ＧｌCＮ６Ｓおよ
びＩｄｏＡ ２Ｓの含量（単位２糖当たりｍｏｌ）を、
ＮＭＲ法で測定したところ、それぞれ０.８３４，０.７
８０および０.６５９ｍｏｌであり、Ｔｏｔａｌ Ｓ
（２.５４ｍｏｌ）とこれら各残基の合計値（２.２７３
ｍｏｌ）との差、０.２６７ｍｏｌに相当する ＧｌSＮ
６Ｓ，ＩｄｏＡ ２Ｓ以外のＯ−硫酸構造の存在が示唆
された（注６）。 注６：ＧｌCＮ６Ｓ，ＩｄｏＡ ２Ｓ以外のＯ−硫酸構造
は、３−Ｏ−硫酸化ＧｌSＮＳ・６Ｓおよび３−Ｏ−硫酸
化ＩｄｏＡ ２Ｓであり、ヘパリンの分子内Ｎ→Ｏ硫酸
基転移によりこれらの残基がほぼ等モル量（０.１３３
モル）生成したことが本発明者らにより明らかにされ
た。
Ｓ） （単位２糖当たりｍｏｌ）を測定したところ、
２.５４ｍｏｌであった。ＧｌCＮＳ，ＧｌCＮ６Ｓおよ
びＩｄｏＡ ２Ｓの含量（単位２糖当たりｍｏｌ）を、
ＮＭＲ法で測定したところ、それぞれ０.８３４，０.７
８０および０.６５９ｍｏｌであり、Ｔｏｔａｌ Ｓ
（２.５４ｍｏｌ）とこれら各残基の合計値（２.２７３
ｍｏｌ）との差、０.２６７ｍｏｌに相当する ＧｌSＮ
６Ｓ，ＩｄｏＡ ２Ｓ以外のＯ−硫酸構造の存在が示唆
された（注６）。 注６：ＧｌCＮ６Ｓ，ＩｄｏＡ ２Ｓ以外のＯ−硫酸構造
は、３−Ｏ−硫酸化ＧｌSＮＳ・６Ｓおよび３−Ｏ−硫酸
化ＩｄｏＡ ２Ｓであり、ヘパリンの分子内Ｎ→Ｏ硫酸
基転移によりこれらの残基がほぼ等モル量（０.１３３
モル）生成したことが本発明者らにより明らかにされ
た。
【００２１】（実施例１）この実施例は平均分子量約６
０００のＬＭＷ ＳＴヘパリンを製造するために、Ｐｅ
ｒｌｉｎらが報告した亜硝酸によるヘパリンの低分子化
の反応条件（注７）を、本発明者らが改良し、ＳＴヘパ
リンに適用したものである。本実施例の出発物質とし
て、前記のにて得たＳＴヘパリン・ナトリウム塩［平
均分子量１４３００；硫酸含量、２.５４モル ヘパリン
２糖モル；３−０−硫酸化度（注８）、０.２６７モル
ヘパリン２糖モル；抗凝血活性、１７８ ＵＳＰｕｎｉ
ｔ／ｍｇ；ＡＰＴＴ値、１３７ ＵＳＰｕｎｉｔ／ｍ
ｇ；抗Ｘａ因子活性、２８２ ＵＳＰｕｎｉｔ／ｍｇ］
を用いた。
０００のＬＭＷ ＳＴヘパリンを製造するために、Ｐｅ
ｒｌｉｎらが報告した亜硝酸によるヘパリンの低分子化
の反応条件（注７）を、本発明者らが改良し、ＳＴヘパ
リンに適用したものである。本実施例の出発物質とし
て、前記のにて得たＳＴヘパリン・ナトリウム塩［平
均分子量１４３００；硫酸含量、２.５４モル ヘパリン
２糖モル；３−０−硫酸化度（注８）、０.２６７モル
ヘパリン２糖モル；抗凝血活性、１７８ ＵＳＰｕｎｉ
ｔ／ｍｇ；ＡＰＴＴ値、１３７ ＵＳＰｕｎｉｔ／ｍ
ｇ；抗Ｘａ因子活性、２８２ ＵＳＰｕｎｉｔ／ｍｇ］
を用いた。
【００２２】上記のＳＴヘパリン・ナトリウム塩５００
ｍｇを水１０ｍｌに溶解し、これに亜硝酸ナトリウム２
５０ｍｇを加え、氷冷する。この溶液に０．５Ｎ ＨＣ
ｌを加えてｐＨ３．５とし、撹拌しながら４０分間、
４．５℃に保つ。反応後０．１Ｎ ＮａＯＨを加えて中
和し、２倍容量のエタノールを加えて生成物を沈殿させ
る。沈殿を遠心分離し、エタノール・水（２：１）、エ
タノールで順次洗浄し、遠心分離後、乾燥して、ＬＭＷ
ＳＴヘパリン３５０−４００ｍｇを得る。このＬＭＷ
ＳＴヘパリンの性状は、平均分子量が約６０００、抗凝
血活性は、表１に示した平均分子量６０００のＬＭＷ
ＳＴヘパリンの数値とほぼ一致する活性を示した。
ｍｇを水１０ｍｌに溶解し、これに亜硝酸ナトリウム２
５０ｍｇを加え、氷冷する。この溶液に０．５Ｎ ＨＣ
ｌを加えてｐＨ３．５とし、撹拌しながら４０分間、
４．５℃に保つ。反応後０．１Ｎ ＮａＯＨを加えて中
和し、２倍容量のエタノールを加えて生成物を沈殿させ
る。沈殿を遠心分離し、エタノール・水（２：１）、エ
タノールで順次洗浄し、遠心分離後、乾燥して、ＬＭＷ
ＳＴヘパリン３５０−４００ｍｇを得る。このＬＭＷ
ＳＴヘパリンの性状は、平均分子量が約６０００、抗凝
血活性は、表１に示した平均分子量６０００のＬＭＷ
ＳＴヘパリンの数値とほぼ一致する活性を示した。
【００２３】（実施例２）この実施例は平均分子量約６
０００のＬＭＷ ＳＴヘパリンを製造するために、公知
のヘパリン分解酵素ヘパリナーゼによるヘパリンの低分
子化の反応条件（注９）を、本発明者らが、本発明の目
的に沿うよう改良し、ＳＴヘパリンに適用したものであ
る。ＳＴヘパリン・ナトリウム塩として、実施例１と同
じもの５００ｍｇを水１０ｍｌに溶解し、これに酵素ヘ
パリナーゼ（注１０）０.１ｕｎｉｔおよび２０ｍＭ酢
酸ナトリウム・２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７）
１０ｍｌを加え、３７℃で３時間反応させる。反応後溶
液を１分間煮沸し、冷却した後遠心分離（３０００ｒｐ
ｍ，５分間）する。上清液を分取し、２倍容量のエタノ
ールを加えて生成物を沈殿させる。沈殿を遠心分離し、
エタノール・水（２：１）、ついでエタノールで順次洗
浄し、遠心分離後、乾燥して製品３４０−３８０ｍｇを
得た。このＬＭＷ ＳＴヘパリンの性状は、平均分子量
が約６０００、抗凝血活性は、表１に示した平均分子量
６０００のＬＭＷ ＳＴヘパリンの数値よりも全般にや
や高めの活性を示した。
０００のＬＭＷ ＳＴヘパリンを製造するために、公知
のヘパリン分解酵素ヘパリナーゼによるヘパリンの低分
子化の反応条件（注９）を、本発明者らが、本発明の目
的に沿うよう改良し、ＳＴヘパリンに適用したものであ
る。ＳＴヘパリン・ナトリウム塩として、実施例１と同
じもの５００ｍｇを水１０ｍｌに溶解し、これに酵素ヘ
パリナーゼ（注１０）０.１ｕｎｉｔおよび２０ｍＭ酢
酸ナトリウム・２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７）
１０ｍｌを加え、３７℃で３時間反応させる。反応後溶
液を１分間煮沸し、冷却した後遠心分離（３０００ｒｐ
ｍ，５分間）する。上清液を分取し、２倍容量のエタノ
ールを加えて生成物を沈殿させる。沈殿を遠心分離し、
エタノール・水（２：１）、ついでエタノールで順次洗
浄し、遠心分離後、乾燥して製品３４０−３８０ｍｇを
得た。このＬＭＷ ＳＴヘパリンの性状は、平均分子量
が約６０００、抗凝血活性は、表１に示した平均分子量
６０００のＬＭＷ ＳＴヘパリンの数値よりも全般にや
や高めの活性を示した。
【００２４】（実施例３）この実施例はヘパリンを亜硝
酸処理して調製したＬＭＷヘパリン（平均分子量約６０
００）、またはＬＭＷヘパリンをＮａＢＨ4などで糖鎖
末端残基を還元処理して得られる還元型ＬＭＷヘパリン
に、本発明者が発明したＳＴヘパリンの製造技術を適用
してＬＭＷ ＳＴヘパリンを製造するものである。 （i）ＬＭＷヘパリンの調製：原料ヘパリン・ナトリウ
ム塩（平均分子量１４０００；硫酸含量、２.２５モル
ヘパリン２糖モル；抗凝血活性、１６８ ＵＳＰｕｎｉ
ｔ／ｍｇ）５００ｍｇについて、実施例１と同様に亜硝
酸による低分子化処理を行う。ただし、反応時間を２０
分間とする。反応液を、０.１Ｎ ＮａＯＨで中和し（ｐ
Ｈ７）、ＮａＢＨ4 １２０ｍｇを加えて９０分間、２０
℃に保つ。反応液にＨＣｌを加えてｐＨ２とし、ついで
０.５Ｎ ＮａＯＨで中和したのち、２倍容量のエタノー
ルを加えて生成物を沈殿させる。沈殿を遠心分離し、エ
タノール・水（２：１）、ついでエタノールで順次洗浄
し、遠心分離後、乾燥して還元型ＬＭＷヘパリン・ナト
リウム塩（注１１）３５０−４００ｍｇを得た。この還
元型ＬＭＷヘパリン・ナトリウム塩の性状は、平均分子
量が約６０００、抗凝血活性は、表２に示した平均分子
量６０００のＬＭＷヘパリンの数値とほぼ一致する活性
を示した。
酸処理して調製したＬＭＷヘパリン（平均分子量約６０
００）、またはＬＭＷヘパリンをＮａＢＨ4などで糖鎖
末端残基を還元処理して得られる還元型ＬＭＷヘパリン
に、本発明者が発明したＳＴヘパリンの製造技術を適用
してＬＭＷ ＳＴヘパリンを製造するものである。 （i）ＬＭＷヘパリンの調製：原料ヘパリン・ナトリウ
ム塩（平均分子量１４０００；硫酸含量、２.２５モル
ヘパリン２糖モル；抗凝血活性、１６８ ＵＳＰｕｎｉ
ｔ／ｍｇ）５００ｍｇについて、実施例１と同様に亜硝
酸による低分子化処理を行う。ただし、反応時間を２０
分間とする。反応液を、０.１Ｎ ＮａＯＨで中和し（ｐ
Ｈ７）、ＮａＢＨ4 １２０ｍｇを加えて９０分間、２０
℃に保つ。反応液にＨＣｌを加えてｐＨ２とし、ついで
０.５Ｎ ＮａＯＨで中和したのち、２倍容量のエタノー
ルを加えて生成物を沈殿させる。沈殿を遠心分離し、エ
タノール・水（２：１）、ついでエタノールで順次洗浄
し、遠心分離後、乾燥して還元型ＬＭＷヘパリン・ナト
リウム塩（注１１）３５０−４００ｍｇを得た。この還
元型ＬＭＷヘパリン・ナトリウム塩の性状は、平均分子
量が約６０００、抗凝血活性は、表２に示した平均分子
量６０００のＬＭＷヘパリンの数値とほぼ一致する活性
を示した。
【００２５】（ii）ＬＭＷ ＳＴヘパリンの調製：
（i）で得られた還元型ＬＭＷヘパリン・ナトリウム塩
（平均分子量６０００）に、本発明者が発明したＳＴヘ
パリンの製造技術を適用してＬＭＷ ＳＴヘパリンを製
造する。還元型ＬＭＷヘパリン・ナトリウム塩を芳香族
異項環塩基例えばピリジニウム塩に変換する。十分に乾
燥したＬＭＷヘパリン・ピリジニウム塩５００ｍｇを真
空容器内で９０℃で９０分間、均一に固相加熱する。こ
の処理によりＬＭＷヘパリンにＮ→Ｏ硫酸基転移が起こ
る。得られた生成物を水に溶解し、Ｎａ2ＣＯ3溶液を加
えてｐＨ９としたのち、トリメチルアミン・スルホトリ
オキシド（ＣＨ3）3Ｎ・ＳＯ3 １.８ｇを３回に分けて添
加し、５５℃で２０時間反応することにより、Ｎ−再硫
酸化する。反応液に２倍容量のエタノールを加えて生成
物を沈殿させる。沈殿を遠心分離し、エタノール・水
（２：１）、ついでエタノールで順次洗浄し、遠心分離
後、乾燥して、ＬＭＷ ＳＴヘパリン３２０−３５０ｍ
ｇを得た。得られたＬＭＷ ＳＴヘパリンの性状は、平
均分子量が６０００、表１に示した平均分子量６０００
のＬＭＷ ＳＴヘパリンの活性と同じレベルの活性を示
した。
（平均分子量６０００）に、本発明者が発明したＳＴヘ
パリンの製造技術を適用してＬＭＷ ＳＴヘパリンを製
造する。還元型ＬＭＷヘパリン・ナトリウム塩を芳香族
異項環塩基例えばピリジニウム塩に変換する。十分に乾
燥したＬＭＷヘパリン・ピリジニウム塩５００ｍｇを真
空容器内で９０℃で９０分間、均一に固相加熱する。こ
の処理によりＬＭＷヘパリンにＮ→Ｏ硫酸基転移が起こ
る。得られた生成物を水に溶解し、Ｎａ2ＣＯ3溶液を加
えてｐＨ９としたのち、トリメチルアミン・スルホトリ
オキシド（ＣＨ3）3Ｎ・ＳＯ3 １.８ｇを３回に分けて添
加し、５５℃で２０時間反応することにより、Ｎ−再硫
酸化する。反応液に２倍容量のエタノールを加えて生成
物を沈殿させる。沈殿を遠心分離し、エタノール・水
（２：１）、ついでエタノールで順次洗浄し、遠心分離
後、乾燥して、ＬＭＷ ＳＴヘパリン３２０−３５０ｍ
ｇを得た。得られたＬＭＷ ＳＴヘパリンの性状は、平
均分子量が６０００、表１に示した平均分子量６０００
のＬＭＷ ＳＴヘパリンの活性と同じレベルの活性を示
した。
【００２６】（実施例４）この実施例はヘパリンを酵素
ヘパリナーゼで部分的に糖鎖切断してＬＭＷヘパリン
（平均分子量約６０００）を得、ついで、本発明者が発
明したＳＴヘパリンの製造技術を適用してＬＭＷ ＳＴ
ヘパリンを製造したものである。 （i）ＬＭＷヘパリンの調製：原料ヘパリン・ナトリウ
ム塩［実施例３にて用いたものと同じ］５００ｍｇにつ
いて、実施例２のヘパリナーゼによるＳＴヘパリンの低
分子化反応を適用する。ただし、反応時間を１時間とす
る。酵素消化したのちエタノール沈殿法により低分子生
成物を回収し、エタノール・水（２：１）、エタノール
で順次洗浄、乾燥したのち、平均分子量約６０００のＬ
ＭＷヘパリン・ナトリウム塩３５０−４００ｍｇを得
た。
ヘパリナーゼで部分的に糖鎖切断してＬＭＷヘパリン
（平均分子量約６０００）を得、ついで、本発明者が発
明したＳＴヘパリンの製造技術を適用してＬＭＷ ＳＴ
ヘパリンを製造したものである。 （i）ＬＭＷヘパリンの調製：原料ヘパリン・ナトリウ
ム塩［実施例３にて用いたものと同じ］５００ｍｇにつ
いて、実施例２のヘパリナーゼによるＳＴヘパリンの低
分子化反応を適用する。ただし、反応時間を１時間とす
る。酵素消化したのちエタノール沈殿法により低分子生
成物を回収し、エタノール・水（２：１）、エタノール
で順次洗浄、乾燥したのち、平均分子量約６０００のＬ
ＭＷヘパリン・ナトリウム塩３５０−４００ｍｇを得
た。
【００２７】（ii）ＬＭＷ ＳＴヘパリンの調製：
（i）で得られたＬＭＷヘパリン・ナトリウム塩（ヘパ
リナーゼ分解）に、本発明者が発明したＳＴヘパリンの
製造技術を適用してＬＭＷ ＳＴヘパリンを製造する。
上記のＬＭＷヘパリン・ナトリウム塩を芳香族異項環塩
基であるキノリニウム塩に変換したのち、具体的には、
実施例３（ii）と同様の反応条件、処理法を適用するこ
とにより、ＬＭＷ ＳＴヘパリン（平均分子量約６００
０）が収率６５−７５％で得られた。得られたＬＭＷ
ＳＴヘパリンは、表１に示した平均分子量６０００のＬ
ＭＷ ＳＴヘパリンの数値よりやや高めの活性を示し
た。
リナーゼ分解）に、本発明者が発明したＳＴヘパリンの
製造技術を適用してＬＭＷ ＳＴヘパリンを製造する。
上記のＬＭＷヘパリン・ナトリウム塩を芳香族異項環塩
基であるキノリニウム塩に変換したのち、具体的には、
実施例３（ii）と同様の反応条件、処理法を適用するこ
とにより、ＬＭＷ ＳＴヘパリン（平均分子量約６００
０）が収率６５−７５％で得られた。得られたＬＭＷ
ＳＴヘパリンは、表１に示した平均分子量６０００のＬ
ＭＷ ＳＴヘパリンの数値よりやや高めの活性を示し
た。
【００２８】（実施例５）実施例１のＬＭＷ ＳＴヘパ
リン・ナトリウム塩２５０ｍｇを０.２Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3
１０ｍｌに溶解し、０.２Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3で平衡化し
たＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５ゲル（注１２）のカラム
（４.５×２００ｃｍ）上端に重層する。次いで、０.２
Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3溶液をカラムに流下する（流速４００
ｍｌ／ｈ）。カラム流出液の一部についてウロン酸含量
を測定し、図１に示す溶出曲線（実線）を得た。点線
は、実施例１の出発物質であるＳＴヘパリンの溶出曲線
である。図１に示すように分子量マーカー（注１３）の
溶出位置を基準に溶出曲線下の面積を分画する。各分画
はそれぞれ分離され、減圧下に濃縮するかまたは適当な
孔径をもつ濾過膜上にて濃縮される。各濃縮液は、Ｄｏ
ｗｅｘ ５０Ｗ（Ｎａ+）陽イオン交換体などのカラムを
用いてナトリウム塩に変換したのち濾過し、凍結乾燥す
る。
リン・ナトリウム塩２５０ｍｇを０.２Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3
１０ｍｌに溶解し、０.２Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3で平衡化し
たＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５ゲル（注１２）のカラム
（４.５×２００ｃｍ）上端に重層する。次いで、０.２
Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3溶液をカラムに流下する（流速４００
ｍｌ／ｈ）。カラム流出液の一部についてウロン酸含量
を測定し、図１に示す溶出曲線（実線）を得た。点線
は、実施例１の出発物質であるＳＴヘパリンの溶出曲線
である。図１に示すように分子量マーカー（注１３）の
溶出位置を基準に溶出曲線下の面積を分画する。各分画
はそれぞれ分離され、減圧下に濃縮するかまたは適当な
孔径をもつ濾過膜上にて濃縮される。各濃縮液は、Ｄｏ
ｗｅｘ ５０Ｗ（Ｎａ+）陽イオン交換体などのカラムを
用いてナトリウム塩に変換したのち濾過し、凍結乾燥す
る。
【００２９】本実施例のゲル濾過法で分画した各ＬＭＷ
ＳＴヘパリンの分子量分布範囲は狭く、表１に示すよ
うに抗凝血活性値は相互に明確に相違した。表１は、４
画分について、抗Ｘａ因子活性、ＡＰＴＴ、およびそれ
らの活性比を測定した結果である。この実施例の場合、
ＬＭＷ ＳＴヘパリン・サンプルとして分画した平均分
子量１２０００、９３００、６０００、および４３００
の各画分の収率は平均約１５％であり、合計約６０％が
ＬＭＷ ＳＴヘパリンとして回収された。また、分画の
対象としなかった高分子画分（＞１２０００）および低
分子画分（＜４３００）も透析法やゲル濾過脱塩法を適
用することにより回収される。表２は、実施例３（ｉ）
にて得られたＬＭＷヘパリンを、実施例５と同様にゲル
濾過法（Ｓｅｐｈａｄｏｘ Ｇ−７５ゲル ０．２Ｍ
ＮＨ4ＨＣＯ3）で分画し、得られたＬＭＷヘパリンの４
画分について活性を測定した結果である。
ＳＴヘパリンの分子量分布範囲は狭く、表１に示すよ
うに抗凝血活性値は相互に明確に相違した。表１は、４
画分について、抗Ｘａ因子活性、ＡＰＴＴ、およびそれ
らの活性比を測定した結果である。この実施例の場合、
ＬＭＷ ＳＴヘパリン・サンプルとして分画した平均分
子量１２０００、９３００、６０００、および４３００
の各画分の収率は平均約１５％であり、合計約６０％が
ＬＭＷ ＳＴヘパリンとして回収された。また、分画の
対象としなかった高分子画分（＞１２０００）および低
分子画分（＜４３００）も透析法やゲル濾過脱塩法を適
用することにより回収される。表２は、実施例３（ｉ）
にて得られたＬＭＷヘパリンを、実施例５と同様にゲル
濾過法（Ｓｅｐｈａｄｏｘ Ｇ−７５ゲル ０．２Ｍ
ＮＨ4ＨＣＯ3）で分画し、得られたＬＭＷヘパリンの４
画分について活性を測定した結果である。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】注７：文献；A.S.Perlin et al.,Can.J.Ch
en.,50(1972)2437-2441. 注８：ＳＴヘパリンのＧｌSＮＳ．６Ｓ残基とＩｄｏＡ
２Ｓ残基に関する Degree of 3-0-sulfation（３−０−
硫酸化度、ｍｏｌ／ｍｏｌヘパリン２糖）である。文
献：H.Uchiyama and K.Nagasawa,J..Biol.Chem.,266(19
91)6756-6760. 注９：文献；R.J.Linhardt et al.,App.Biochem.Biotec
hnol.,12(1986)135.その他、多数の報告あり。R.S.Lang
er,et al.,U.S.Pat.No.4,396,762(1983)。 注１０：市販品、例えば生化学工業株式会社（東京）、
およびSigma,ChemicalCo.(St.Louis)のヘパリナーゼ
（ＥＣ４・２・２・７）。
en.,50(1972)2437-2441. 注８：ＳＴヘパリンのＧｌSＮＳ．６Ｓ残基とＩｄｏＡ
２Ｓ残基に関する Degree of 3-0-sulfation（３−０−
硫酸化度、ｍｏｌ／ｍｏｌヘパリン２糖）である。文
献：H.Uchiyama and K.Nagasawa,J..Biol.Chem.,266(19
91)6756-6760. 注９：文献；R.J.Linhardt et al.,App.Biochem.Biotec
hnol.,12(1986)135.その他、多数の報告あり。R.S.Lang
er,et al.,U.S.Pat.No.4,396,762(1983)。 注１０：市販品、例えば生化学工業株式会社（東京）、
およびSigma,ChemicalCo.(St.Louis)のヘパリナーゼ
（ＥＣ４・２・２・７）。
【００３３】注１１：亜硝酸分解法で調製したＬＭＷヘ
パリンは糖鎖還元端に反応性アルデヒド基を有する分子
種を多く含む。還元型ＬＭＷヘパリンはこの部位をより
安定なカルビノール基に還元したものである。亜硝酸に
よる低分子化後、還元処理を行わないＬＭＷヘパリンに
ＳＴヘパリンの製造技術を適用した場合、製品は若干の
着色を伴うが、反応性アルデヒド基を保有するＬＭＷ
ＳＴヘパリン分子種を含む製品が得られる。 注１２：Sephadex ケ゛ル(Pharmacia Fine Chemicals,Upps
ala,Sweden）以外にBio-Gel P30(Bio-Rad Laboratorie
s,Richmond）および Ultrogel AcA44 agarose-acrylam
ide(LKB-Produkter AB,Bromma）など市販の分子篩用ゲ
ルを適宜用いることができる。 注１３：それぞれの平均分子量をもったコンドロイチン
硫酸標準品である。文献：H.Uchiyama and K.Nagasawa,
Carbohydr.Res.,140(1985)239-249.
パリンは糖鎖還元端に反応性アルデヒド基を有する分子
種を多く含む。還元型ＬＭＷヘパリンはこの部位をより
安定なカルビノール基に還元したものである。亜硝酸に
よる低分子化後、還元処理を行わないＬＭＷヘパリンに
ＳＴヘパリンの製造技術を適用した場合、製品は若干の
着色を伴うが、反応性アルデヒド基を保有するＬＭＷ
ＳＴヘパリン分子種を含む製品が得られる。 注１２：Sephadex ケ゛ル(Pharmacia Fine Chemicals,Upps
ala,Sweden）以外にBio-Gel P30(Bio-Rad Laboratorie
s,Richmond）および Ultrogel AcA44 agarose-acrylam
ide(LKB-Produkter AB,Bromma）など市販の分子篩用ゲ
ルを適宜用いることができる。 注１３：それぞれの平均分子量をもったコンドロイチン
硫酸標準品である。文献：H.Uchiyama and K.Nagasawa,
Carbohydr.Res.,140(1985)239-249.
【００３４】
【発明の効果】本発明の低分子量ヘパリン誘導体（ＬＭ
Ｗ ＳＴヘパリン）の製造法は、ヘパリンと芳香異項環
塩基との塩を固相または化学的に安定な加熱媒体に分散
させて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基に結合してい
る硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移させ、次いで、
硫酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化したのち、低分子
化処理または低分子部分を分画するものであり、抗凝血
性、抗血栓性などに優れた低分子量ヘパリン誘導体を確
実かつ容易に製造することができる。
Ｗ ＳＴヘパリン）の製造法は、ヘパリンと芳香異項環
塩基との塩を固相または化学的に安定な加熱媒体に分散
させて加熱し、ヘパリン分子内のアミノ基に結合してい
る硫酸基を分子内の特定の水酸基に転移させ、次いで、
硫酸基が離脱したアミノ基を再硫酸化したのち、低分子
化処理または低分子部分を分画するものであり、抗凝血
性、抗血栓性などに優れた低分子量ヘパリン誘導体を確
実かつ容易に製造することができる。
【００３５】また、本発明のＬＭＷ ＳＴヘパリンの製
造法は、ヘパリンを低分子化処理または低分子部分を分
画することにより、低分子量ヘパリンを得て、該低分子
量ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を形成させて、該低
分子量ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を固相または化
学的に安定な加熱媒体に分散させて加熱し、ヘパリン分
子内のアミノ基に結合している硫酸基を分子内の特定の
水酸基に転移させ、次いで、硫酸基が離脱したアミノ基
を再硫酸化するものであり、抗凝血性、抗血栓性などに
優れた低分子量ヘパリン誘導体を確実かつ容易に製造す
ることができる。
造法は、ヘパリンを低分子化処理または低分子部分を分
画することにより、低分子量ヘパリンを得て、該低分子
量ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を形成させて、該低
分子量ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を固相または化
学的に安定な加熱媒体に分散させて加熱し、ヘパリン分
子内のアミノ基に結合している硫酸基を分子内の特定の
水酸基に転移させ、次いで、硫酸基が離脱したアミノ基
を再硫酸化するものであり、抗凝血性、抗血栓性などに
優れた低分子量ヘパリン誘導体を確実かつ容易に製造す
ることができる。
【００３６】そして、本発明の方法によって製造される
ＬＭＷ ＳＴヘパリンの物性および抗凝血活性などの生
物学的、薬動力学的性状を、在来の技術知識により天然
ヘパリンから製造された低分子量ヘパリン（ＬＭＷヘパ
リン）のそれらと比較すると、表１、２に示すごとく両
者の抗Ｘａ活性値およびＡＰＴＴはいずれの平均分子量
レベルにおいてもＬＭＷ ＳＴヘパリンのほうが、ＬＭ
Ｗヘパリンより高く、その差は著しい。ＬＭＷ ＳＴヘ
パリンが抗凝血、抗血栓剤として期待される点は、低分
子量でありながら極めて高い抗Ｘａ因子活性と、ＡＰＴ
Ｔ活性を保持している点にある。
ＬＭＷ ＳＴヘパリンの物性および抗凝血活性などの生
物学的、薬動力学的性状を、在来の技術知識により天然
ヘパリンから製造された低分子量ヘパリン（ＬＭＷヘパ
リン）のそれらと比較すると、表１、２に示すごとく両
者の抗Ｘａ活性値およびＡＰＴＴはいずれの平均分子量
レベルにおいてもＬＭＷ ＳＴヘパリンのほうが、ＬＭ
Ｗヘパリンより高く、その差は著しい。ＬＭＷ ＳＴヘ
パリンが抗凝血、抗血栓剤として期待される点は、低分
子量でありながら極めて高い抗Ｘａ因子活性と、ＡＰＴ
Ｔ活性を保持している点にある。
【００３７】一般に、ＬＭＷヘパリンは通常用いられる
天然ヘパリンに比較して、幾多の臨床上の利点、例え
ば、抗トロンビン作用の向上、天然ヘパリン投与に伴う
副作用（出血）の抑制、皮下注射時の薬物吸収性の向
上、投与量に依存して増大する循環系からの薬物（ヘパ
リン）消失の抑制による血中濃度の維持向上、血小板お
よび脂質分解に対する好ましくない作用の抑制などの効
果を有することが知られている。これらの臨床効果の向
上が主としてヘパリンの低分子量化によることは疑いな
い。しかし、低分子量化により、ヘパリンの生物活性の
力価が大幅に低下する事も免れないことは表１、２に示
されるとおりである。然るに、本発明により製造される
ＬＭＷ ＳＴヘパリンの生物活性力価は、いずれの分子
量レベルにおいてもＬＭＷヘパリンのそれに比べて明ら
かに高く、したがって、より好ましい臨床効果（血中濃
度維持の向上、投与量の減少、出血傾向の抑制、抗血栓
形成能の向上など）を期待することができる。
天然ヘパリンに比較して、幾多の臨床上の利点、例え
ば、抗トロンビン作用の向上、天然ヘパリン投与に伴う
副作用（出血）の抑制、皮下注射時の薬物吸収性の向
上、投与量に依存して増大する循環系からの薬物（ヘパ
リン）消失の抑制による血中濃度の維持向上、血小板お
よび脂質分解に対する好ましくない作用の抑制などの効
果を有することが知られている。これらの臨床効果の向
上が主としてヘパリンの低分子量化によることは疑いな
い。しかし、低分子量化により、ヘパリンの生物活性の
力価が大幅に低下する事も免れないことは表１、２に示
されるとおりである。然るに、本発明により製造される
ＬＭＷ ＳＴヘパリンの生物活性力価は、いずれの分子
量レベルにおいてもＬＭＷヘパリンのそれに比べて明ら
かに高く、したがって、より好ましい臨床効果（血中濃
度維持の向上、投与量の減少、出血傾向の抑制、抗血栓
形成能の向上など）を期待することができる。
【００３８】さらに、本発明により得られるＬＭＷ Ｓ
Ｔヘパリンは、生体の内外に導入される医療器材に抗血
栓性を付与するための、抗血栓性物質としても有用であ
ろう。特に、亜硝酸分解で低分子化したＬＭＷ ＳＴヘ
パリンは、その糖鎖還元末端部に反応性に富むアルデヒ
ド基を有する分子種を多く含むため、医療器材表層にＬ
ＭＷ ＳＴヘパリンを固定する反応行程において極めて
有利である。この場合、低分子量で（従って重量当たり
モル比は大）、なおかつ高い生物活性を保持するＬＭＷ
ＳＴヘパリンはさらに有利であろう。
Ｔヘパリンは、生体の内外に導入される医療器材に抗血
栓性を付与するための、抗血栓性物質としても有用であ
ろう。特に、亜硝酸分解で低分子化したＬＭＷ ＳＴヘ
パリンは、その糖鎖還元末端部に反応性に富むアルデヒ
ド基を有する分子種を多く含むため、医療器材表層にＬ
ＭＷ ＳＴヘパリンを固定する反応行程において極めて
有利である。この場合、低分子量で（従って重量当たり
モル比は大）、なおかつ高い生物活性を保持するＬＭＷ
ＳＴヘパリンはさらに有利であろう。
【図１】図１は、本発明の低分子量ヘパリン誘導体の製
造法の実施例によって得られたＬＭＷ ＳＴヘパリン
（実線）および本発明の低分子量ヘパリン誘導体の製造
法の実施例に使用した出発物質であるＳＴヘパリン（点
線）のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５ゲル・カラムによる溶
出曲線である。Ｖｏはｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅを、それ
ぞれの矢印は標準コンドロイチン硫酸（分子量１２００
０−４３００）の溶出位置を示す。
造法の実施例によって得られたＬＭＷ ＳＴヘパリン
（実線）および本発明の低分子量ヘパリン誘導体の製造
法の実施例に使用した出発物質であるＳＴヘパリン（点
線）のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５ゲル・カラムによる溶
出曲線である。Ｖｏはｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅを、それ
ぞれの矢印は標準コンドロイチン硫酸（分子量１２００
０−４３００）の溶出位置を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を固相
または化学的に安定な加熱媒体に分散させて加熱し、ヘ
パリン分子内のアミノ基に結合している硫酸基を分子内
の特定の水酸基に転移させ、次いで、硫酸基が離脱した
アミノ基を再硫酸化したのち、低分子化処理または低分
子部分を分画することを特徴とする低分子量ヘパリン誘
導体の製造法。 - 【請求項２】 ヘパリンを低分子化処理または低分子部
分を分画することにより、低分子量ヘパリンを得て、該
低分子量ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を形成させ
て、該低分子量ヘパリンと芳香異項環塩基との塩を固相
または化学的に安定な加熱媒体に分散させて加熱し、ヘ
パリン分子内のアミノ基に結合している硫酸基を分子内
の特定の水酸基に転移させ、次いで、硫酸基が離脱した
アミノ基を再硫酸化することを特徴とする低分子量ヘパ
リン誘導体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3210096A JPH0532703A (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 低分子量ヘパリン誘導体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3210096A JPH0532703A (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 低分子量ヘパリン誘導体の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0532703A true JPH0532703A (ja) | 1993-02-09 |
Family
ID=16583752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3210096A Pending JPH0532703A (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 低分子量ヘパリン誘導体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0532703A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5682141A (en) * | 1995-06-05 | 1997-10-28 | Morimoto; Shigeo | Underground object indicating device |
| JP2015500388A (ja) * | 2011-12-19 | 2015-01-05 | ディラホア アクチエボラゲット | 二糖繰り返し単位を含んでいる非抗凝固グリコサミノグリカンおよびそれらの医療用途 |
| JP2015500387A (ja) * | 2011-12-19 | 2015-01-05 | ディラフォレッテ アクチエボラゲット | 低抗凝固剤ヘパリン |
-
1991
- 1991-07-26 JP JP3210096A patent/JPH0532703A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5682141A (en) * | 1995-06-05 | 1997-10-28 | Morimoto; Shigeo | Underground object indicating device |
| JP2015500388A (ja) * | 2011-12-19 | 2015-01-05 | ディラホア アクチエボラゲット | 二糖繰り返し単位を含んでいる非抗凝固グリコサミノグリカンおよびそれらの医療用途 |
| JP2015500387A (ja) * | 2011-12-19 | 2015-01-05 | ディラフォレッテ アクチエボラゲット | 低抗凝固剤ヘパリン |
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