JPH05328971A

JPH05328971A - 修飾リゾチーム

Info

Publication number: JPH05328971A
Application number: JP4157391A
Authority: JP
Inventors: Hisami Kameyama; 久美亀山; Takuji Masunaga; 卓司増永; Katsuyoshi Adachi; 佳津良足立; Toru Yasukochi; 徹安河内; Akinori Suginaka; 昭典杉中
Original assignee: Kose Corp; Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: Kose Corp; NOF Corp
Priority date: 1992-05-26
Filing date: 1992-05-26
Publication date: 1993-12-14
Anticipated expiration: 2015-11-06
Also published as: JP3106265B2

Abstract

(57)【要約】【構成】式（１）で示されるアルケニルエーテルと無
水マレイン酸と他の単量体とのモル比が、５〜60：20〜
90：０〜30である共重合体で修飾されたリゾチーム。【化１】（Ｚは２〜８個の水酸基を持つ化合物の残基、ＡＯは炭
素数２〜18のオキシアルキレン基の１種または２種以上
の混合物で、２種以上のときはブロック状に付加してい
てもランダム状に付加していてもよく、Ｒ¹は炭素数２
〜５のアルケニル基、Ｒ²は炭素数１〜24の炭化水素基
またはアシル基、ａとｂとｃはオキシアルキレン基の平
均付加モル数でそれぞれ０〜600 、ｍは１〜７の整数、
ｎは０〜６の整数、ｍ＋ｎ＝１〜７、ｎ／（１＋ｍ＋
ｎ）≦１／２、かつａ＋ｂｍ＋ｃｎ＝１〜1000であ
る。) 【効果】水系中でも活性を永く持続することができ、
且つ皮膚刺激性が低く適用範囲の広いリゾチームが提供
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高分子の共重合体で修
飾された安定なリゾチームに関し、更に詳しくは、水系
中で長時間活性を持続することができ、適用範囲の広い
修飾リゾチームに関する。

【０００２】

【従来の技術】リゾチームは、細菌細胞壁のムコペプチ
ドなどに存在するＮ−アセチルムラミン酸(MurＮAc) と
Ｎ−アセチルグルコサミン(GlcＮAc) 間のβ１→４結合
を加水分解する溶菌性酵素である。この酵素は動植物界
に広く存在しているが、その中でもニワトリ卵白リゾチ
ームが最もよく研究されている。その分子量は14,300、
129 個のアミノ酸から成る比較的小さなタンパク質であ
り、酵素として初めてＸ線結晶解析が行なわれ、立体構
造も明らかにされている。

【０００３】リゾチームの主な薬理作用としては (1)ウ
イルス性疾患に対する抗ウイルス作用、(2) 細菌、原虫
類感染に対する抗感染作用、(3) 止血作用、(4) 抗腫
瘍、抗炎症作用、(5) 組織修復作用などが知られてい
る。リゾチームの応用については抗ウイルス、抗感染、
組織修復作用などを化粧品として洗顔料、基礎化粧料な
どに利用する試みがあり、また、歯みがきやうがい薬に
用いて歯牙う蝕をもたらす細菌の抑制やウイルス性口内
炎の予防、口腔からの感染防止を目的とする試みがあ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、リゾチ
ームを直接水系中に配合すると酵素活性が低下したり、
皮膚に対して刺激やアレルギーを与えやすい等の問題が
ある。リゾチームの応用にあたっては、使用直前まで乾
燥状態におき、使用時に水溶液と混合して用いる方法
や、リポソーム化、マイクロカプセル化、更には、高分
子化合物による固定化など色々な試みがなされている
が、マイクロカプセル化による方法は、リゾチームと水
溶液等の基剤との接触を使用する直前まで断つことによ
る安定化であり、本質的な問題の解決ではない。また、
多価アルコールや、マルトース、ソルビトール等の糖類
を添加する方法は、プロテアーゼ等の他の酵素の安定化
として有効であるが、リゾチームに対してはほとんど効
果がなく、糖類の添加はかえって安定性を悪くし、その
他の方法でも充分満足のいく安定化の効果が得られてい
ない。

【０００５】本発明は、水系中で長時間活性を持続する
ことができ、適用範囲の広い修飾リゾチームを提供する
ことを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、同一分子
中に酸無水物基とポリオキシアルキレン基を合わせもつ
重合体を化学的に結合させたリゾチームが、水系中でも
長時間活性を持続することを見出し、本発明に到達し
た。すなわち、本発明は式（１）で示されるアルケニル
エーテルと無水マレイン酸と他の単量体とのモル比が５
〜60：20〜90：０〜30である共重合体を化学結合した修
飾リゾチームである。

【０００７】

【化２】

【０００８】（Ｚは２〜８個の水酸基を持つ化合物の残
基、ＡＯは炭素数２〜18のオキシアルキレン基の１種ま
たは２種以上の混合物で、２種以上のときはブロック状
に付加していてもランダム状に付加していてもよく、Ｒ
¹は炭素数２〜５のアルケニル基、Ｒ²は炭素数１〜24
の炭化水素基またはアシル基、ａとｂとｃはオキシアル
キレン基の平均付加モル数でそれぞれ０〜600 、ｍは１
〜７の整数、ｎは０〜６の整数、ｍ＋ｎ＝１〜７、ｎ／
（１＋ｍ＋ｎ）≦１／２、かつａ＋ｂｍ＋ｃｎ＝１〜10
00である)。

【０００９】式（１）において、Ｚを残基とする２〜８
個の水酸基を持つ化合物としては、エチレングリコー
ル、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキ
シレングリコール、スチレングリコール、炭素数８〜18
のアルキレングリコール、ネオペンチルグリコール等の
グリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリ
ン、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、
１，３，５−ペンタントリオール、エリスリトール、ペ
ンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、ソルビ
トール、ソルビタン、ソルバイド、ソルビトールとグリ
セリンの縮合物、アドニトール、アラビトール、キシリ
トール、マンニトール等の多価アルコール、あるいはそ
れらの部分エーテル化物またはエステル化物；キシロー
ス、アラビノース、リボース、ラムノース、グルコー
ス、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボ
ース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、ト
レハロース、シュークロース、ラフィノース、ゲンチア
ノース、メレジトース等の糖、あるいはそれらの部分エ
ーテル化物またはエステル化物；カテコール、レゾルシ
ノール、ヒドロキノン、フロログルシン等のフェノール
類が挙げられる。

【００１０】ＡＯで示されるオキシアルキレン基として
は、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブ
チレン基、オキシテトラメチレン基、オキシスチレン
基、オキシドデシレン基、オキシテトラデシレン基、オ
キシヘキサデシレン基、オキシオクタデシレン基等が挙
げられ、これらは１種だけ付加してもよく、２種以上が
同時に付加していてもよい。また、２種以上が同時に付
加しているときは、ブロック状付加でもランダム状付加
でもよい。

【００１１】オキシアルキレン基は共重合体とリゾチー
ムとの親和性を高めるため、かつ、リゾチームの安定性
を向上させるために必要であるが、あまり多いと、共重
合体中の無水マレイン酸単位の重量割合が低くなって、
リゾチーム中のアミノ基との反応がおこりにくくなるの
で、ａ＋ｂｍ＋ｃｎは1000を超えないことが必要であ
る。

【００１２】Ｒ¹で示される炭素数２〜５のアルケニル
基としてはビニル基、アリル基、メタリル基、１，１−
ジメチル−２−プロペニル基、３−メチル−３−ブテニ
ル基等がある。Ｒ²で示される炭素数１〜24のアルキル
基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプ
ロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペ
ンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘプチル
基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、イソノニル
基、デシル基、ドデシル基、イソトリデシル基、テトラ
デシル基、ヘキサデシル基、イソセチル基、オクタデシ
ル基、イソステアリル基、オレイル基、オクチルドデシ
ル基、ドコシル基、デシルテトラデシル基、ベンジル
基、クレジル基、ブチルフェニル基、ジブチルフェニル
基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ドデシル
フェニル基、ジオクチルフェニル基、ジノニルフェニル
基、スチレン化フェニル基等があり、アシル基として
は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、カプリル
酸、２−エチルヘキサン酸、イソノナン酸、カプリン
酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパ
ルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、アラキ
ン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノ
ール酸、リノレン酸、エルカ酸、安息香酸、ヒドロキシ
安息香酸、桂皮酸、没食子酸等に由来するアシル基があ
る。

【００１３】式（１）のアルケニルエーテルと無水マレ
イン酸との共重合体がリゾチームと充分に結合するため
には、酸無水物構造が必要であり、遊離の水酸基が多い
アルケニルエーテルを用いると重合の際に酸無水物単位
とエステル結合をするために、リゾチームとの反応性が
低下したり、共重合体の溶媒への溶解性が低下したりす
るので、ｎ／（１＋ｍ＋ｎ）≦１／２であることが必要
である。

【００１４】本発明で用いる共重合体は式（１）で示さ
れるアルケニルエーテルと無水マレイン酸とをラジカル
重合触媒を用いて共重合させることによって、容易に得
ることができる。その際、更に他の単量体を加えて共重
合させても良い。他の単量体としては、アクリル酸、メ
タクリル酸、イタコン酸、クロトン酸などの不飽和カル
ボン酸、スチレン、メチルスチレンなどの芳香族ビニル
化合物、塩化ビニル、塩化ビニリデンなどのハロゲン化
ビニル化合物、イソブチレン、ジイソブチレンなどのオ
レフィン、そのほか酢酸ビニル、アクリロニトリル、ア
クリルアミドなどがある。これらは共重合体に粘着性を
持たせるなどの物性改良を行う際に加えることができる
が、その割合があまり多くなると、リゾチームの修飾に
必要なオキシアルキレン基あるいは酸無水物基の含有量
が低下し修飾がうまくできなくなるので、他の単量体の
割合が全単量体中の30モル％以下である必要がある。

【００１５】本発明で用いる共重合体は、重合開始剤の
種類あるいは式（１）のアルケニルエーテルの構造を変
化させることにより、種々の重合度の共重合体を得るこ
とができ、その重量平均分子量は1000〜200 万、好まし
くは3000〜10万である。またオキシアルキレン基のうち
でオキシエチレン基が多く付加したものを用いると親水
性の大きい共重合体を得ることができる。

【００１６】また本発明の修飾リゾチームを得る方法
は、リゾチーム中のアミノ基を利用する方法であり、対
象となるリゾチームとしてはニワトリの卵白に由来する
リゾチームをはじめ、シチメンチョウ、アヒル等の卵白
に由来するもの、また、パパイヤ、イチジク等の植物に
由来するもの、また、バチルス・スブチリス(Bacilluss
ubtilis) などの微生物に由来するものなど種々のもの
が使用できるが、特にこれらに限定されるものではな
い。

【００１７】本発明の修飾リゾチームは、共重合体とリ
ゾチームとを反応させることにより得ることができる。
共重合体とリゾチームとを反応させるときの比率は、リ
ゾチーム中のアミノ基あるいは共重合体中の酸無水物基
の含有量により異なるため一概に特定することはできな
いが、アミノ基の量に比べて共重合体の量が少な過ぎる
と修飾率が低下するために目的とする経時安定性が不充
分となり、共重合体の量が多過ぎると修飾リゾチームの
初期活性が著しく低下するため、好ましい範囲は、リゾ
チーム100 重量部に対して、共重合体50〜400 重量部で
ある。

【００１８】両者の反応は、共重合体が水溶性の場合
は、リゾチームの水溶液に共重合体を直接添加する方法
がよく、共重合体が水に溶解しにくい場合、あるいは水
に不溶の場合は、共重合体を予め水と相溶性のあるアセ
トン等の溶剤に溶解したのち、リゾチーム水溶液に添加
する方法が容易であり、かつ好ましい方法である。ま
た、反応の際のpHは６〜10、好ましくは８〜９である。
これは、pHが酸性側であるとリゾチーム中の遊離アミノ
基の量が少なくなるので修飾率が低下するためである。

【００１９】また反応温度は、高過ぎると修飾工程での
リゾチームの活性低下がおこり、また、酸無水物基の加
水分解反応がリゾチームのアミノ基と酸無水物基との反
応より起こりやすくなって修飾率が低下するため、０〜
10℃が好ましい範囲である。

【００２０】

【発明の効果】本発明はポリオキシアルキレン基をもつ
アルケニルエーテルと無水マレイン酸との共重合体とリ
ゾチームとの反応生成物である新規な修飾リゾチームで
あり、水系中でも活性を永く持続することができ、且つ
皮膚刺激性が低く適用範囲の広いリゾチームが提供でき
る。

【００２１】

【実施例】本発明を製造例および実施例により説明す
る。製造例１下記の化合物を１リットルのトルエンに溶解し、窒素雰
囲気下に80±２℃で７時間の重合反応を行った。

【００２２】 CH₂=CHCH₂0(C₂H₄O)₃₃CH₃ 1524g (１モ
ル）無水マレイン酸 103g (1.05モ
ル) 過酸化ベンゾイル 4.8g (0.02モ
ル) 次いでトルエンおよび未反応の無水マレイン酸を10〜30
mmHgの減圧下に100 ±10℃で留去し、1450g の共重合体
No.1を得た。得られた共重合体No.1は淡黄色のワックス
状の固体で、融点は45℃、ケン化価は68.5であった。

【００２３】製造例２過酸化ラウロイル19.9g(0.05モル) を１リットルのベン
ゼンに溶解し、窒素雰囲気下に攪拌しながら70℃に昇温
したのち、下記組成の混合液を滴下して70±２℃で重合
反応を行った。 CH₂=CHCH₂0(C₂H₄O)₂₀C₄H₉ 497g (0.5 モ
ル）

【００２４】

【化３】

【００２５】無水マレイン酸 103g（1.05モ
ル）ベンゼン 3 リットル全量滴下後、同じ温度で３時間保持したのち、ベンゼン
および未反応の無水マレイン酸を10〜30mmHgの減圧下に
120 ±10℃で留去し、1293g の共重合体No.2を得た。共
重合体No.2は粘稠な液体であり、ケン化価81.5であっ
た。

【００２６】以下同様の方法により共重合体No.3〜No.8
を表１〜２に示す反応のモル比及び反応条件で調製し
た。分析値および溶解性を表３に示した。

【００２７】

【表１】

【００２８】

【表２】

【００２９】注１）BPO ：ベンゾイルペルオキシド、 LPO ：ラウロイルペルオキシド、 tBEH ：ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエ
ート、 AIBN ：アゾビスイソブチロニトリル、

【００３０】

【表３】

【００３１】実施例リゾチームとしてニワトリ卵白リゾチームを用い、表１
の共重合体による修飾を試みた。修飾リゾチームの活性
はマイクロコッカス・リソデイクチクス(Micrococcus l
ysodeikticus) 乾燥菌体を用いた下記の測定方法により
測定した。活性測定法あらかじめ37℃に保温しておいた基質溶液（注１）3.0m
l に試料溶液（注２）0.1ml を加え攪拌したのち光学セ
ル（1ml)に移し、溶菌に伴う波長640nm における吸光度
の減少を日立分光光度計Ｕ−3210で経時的に測定した。
リゾチーム標準品（注３) についても同様に行ない、次
式に従って試料中のリゾチーム量を算出した。

【００３２】（注１）マイクロコッカス・リソデイクチクス(M.lysod
eikticus) の乾燥菌体適量に75mMリン酸ナトリウム（pH
6.2) (注４）を加えて振り混ぜ懸濁したのち、同緩衝液
を対照として波長640nm における吸光度が1.00になるよ
うに乾燥菌体または同緩衝液を加える。

【００３３】（注２）リゾチーム量が約５〜15μg/g 程
度になるように精製水に溶解する。（注３）国立衛生試験所標準品 control No.831 （注４）75mM Na₂HPO₄と75mM NaH₂PO₄を混合し、pH6.2
に調整する。実施例１リゾチーム (力価1.64mg/g）１ｇをpH8.6 の硼酸系緩衝
液（注５）20ｇに溶解させ、系の温度を３℃に保持し
た。これに共重合体No.1の１ｇを微粉末の状態で系に加
えて３±１℃で30分間攪拌したのち、さらに１ｇ加えて
同温度で30分間攪拌を続けた。反応終了後、0.1N−水酸
化ナトリウム水溶液でpHを7.0 に調整した後、逆浸透膜
を用いて無機塩を除去し減圧下35℃で乾燥して修飾リゾ
チーム2.0gを得た。

【００３４】得られた修飾リゾチームの活性を測定した
結果は0.41mg/gであり、リゾチームの修飾による活性残
存率は純分換算で75％であった。（注５）硼酸系緩衝液（pH8.6) 0.2M−水酸化ナトリウム水溶液 12.00ml 0.2M−硼酸・塩化カリウム水溶液 50.00ml 上記水溶液を混合し、精製水を加えて全量を200ml にし
たもの。

【００３５】なお、0.2M−硼酸・塩化カリウム水溶液
は、溶液１リットル中に硼酸12.4g と塩化カリウム14.9
g を含む水溶液である。修飾リゾチームおよび原料のリ
ゾチームの赤外線吸収スペクトル図をそれぞれ図１及び
図２に示す。

【００３６】また、これらのゲルパーミュエーションク
ロマトグラムを、共重合体No.1とともに図３に示すが、
この図から修飾リゾチームの分子量が高分子量化してい
ることがわかる。なお、ゲルパーミュエーションクロマ
トグラフィーの条件は次の通りである。

【００３７】試料濃度：リゾチーム 0.5mg/ml 修飾リゾチーム 1.0mg/ml 試料注入量： 100μl 溶媒：0.1M燐酸系緩衝液(pH7.0) 流速：0.5ml/分検出器：昭和電工（株）ＲＩ示差屈計SE−61 実施例２リゾチーム (力価1.64mg/g) １ｇを pH8.0の燐酸系緩衝
液（注６）20ｇに溶解させ、温度を３℃に保持した。こ
れに共重合体No.3の 0.5g(20％アセトン溶液）を加えて
３±１℃で30分間攪拌し、さらに0.5g（20％アセトン溶
液）を加えて同温度で30分間攪拌した。

【００３８】次に、減圧下に35℃で水分を留去し、修飾
リゾチームを2.1g得た。得られた修飾リゾチームの活性
は0.435mg/g であり、修飾による活性残存率は純分換算
で63％であった。（注６）燐酸系緩衝液（pH8.0) 0.2M−水酸化ナトリウム水溶液 46.85ml 0.2M−燐酸二水素カリウム水溶液 50.00ml 上記水溶液を混合し、精製水を加えて全量を200ml にし
たもの。

【００３９】実施例３〜７および比較例１〜２以下、同様の方法で表４に示す修飾リゾチームを得た。
なお、実施例３、４、５、６は実施例１と同様に逆浸透
膜を用いて無機塩を除去した。これらの修飾リゾチーム
の活性および経時安定性テストの結果を表４に示す。

【００４０】経時安定性テスト修飾リゾチーム0.5gをpH7.0 の燐酸系緩衝液（注７）10
0ml(防腐剤として４−ヒドロキシ安息香酸メチル 0.1％
含有）に溶解し、40℃に所定時間保持し、修飾リゾチー
ムの活性を測定して経時安定性を調べた。比較液とし
て、リゾチーム0.15g をpH7.0 の燐酸系緩衝液100ml(防
腐剤として４−ヒドロキシ安息香酸メチル0.1 ％含有）
に溶解したもの（比較例１）と、これにソルビトールを
30％添加したもの（比較例２）についても経時安定性を
調べた。

【００４１】表４より、本発明の修飾リゾチームが水系
中において優れた経時安定性をもっていることがわか
る。（注７）燐酸系緩衝液（pH7.0) 10mM燐酸水素２ナトリウム水溶液と10mM燐酸水素１ナト
リウム水溶液を混合してpHを7.0 に調整したもの。

【００４２】

【表４】

【００４３】注１）単位：mg／ｇ２）リゾチームの活性（力価 1.64mg／ｇ) に対する修
飾リゾチーム活性率（％）３）修飾リゾチームの初期活性に対する活性率（％）４）リゾチームを燐酸系緩衝液（４−ヒドロキシ安息香
酸メチル含有）に溶解したもの５）リゾチーム水溶液にソルビトールを30％添加したも
の。

【図面の簡単な説明】

【図１】共重合体No.1で修飾されたリゾチームの赤外線
吸収スペクトル図である。

【図２】リゾチームの赤外線吸収スペクトル図である。

【図３】リゾチーム、共重合体No.1および修飾リゾチー
ムのゲルパーミュエーションクロマトグラムである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＹ 8314−4ＣＡＤＺＡＥＢ (72)発明者足立佳津良東京都北区栄町48番18号株式会社コーセー研究所内 (72)発明者安河内徹神奈川県川崎市川崎区藤崎２−３−10− 404 (72)発明者杉中昭典神奈川県茅ヶ崎市室田２−４−10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（１）で示されるアルケニルエーテル
と無水マレイン酸と他の単量体とのモル比が、５〜60：
20〜90：０〜30である共重合体で修飾されたリゾチー
ム。【化１】（Ｚは２〜８個の水酸基を持つ化合物の残基、ＡＯは炭
素数２〜18のオキシアルキレン基の１種または２種以上
の混合物で、２種以上のときはブロック状に付加してい
てもランダム状に付加していてもよく、Ｒ¹は炭素数２
〜５のアルケニル基、Ｒ²は炭素数１〜24の炭化水素基
またはアシル基、ａとｂとｃはオキシアルキレン基の平
均付加モル数でそれぞれ０〜600 、ｍは１〜７の整数、
ｎは０〜６の整数、ｍ＋ｎ＝１〜７、ｎ／（１＋ｍ＋
ｎ）≦１／２、かつａ＋ｂｍ＋ｃｎ＝１〜1000であ
る。)