JPH05328973A - ラットのｄｎａ、ｄｎａプローブ、ベクター及びラットの雌雄判別法 - Google Patents
ラットのｄｎａ、ｄｎａプローブ、ベクター及びラットの雌雄判別法Info
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- JPH05328973A JPH05328973A JP18025692A JP18025692A JPH05328973A JP H05328973 A JPH05328973 A JP H05328973A JP 18025692 A JP18025692 A JP 18025692A JP 18025692 A JP18025692 A JP 18025692A JP H05328973 A JPH05328973 A JP H05328973A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 配列番号１に示されるラットのＤＮＡ、該ラ
ットのＤＮＡの全部またはその一部を標識して得られる
ＤＮＡプローブ、該ラットのＤＮＡの全部またはその一
部を含有するベクター、該ラットのＤＮＡに相補的なＤ
ＮＡ、該ラットのＤＮＡの全部またはその一部とハイブ
リダイズし得るＤＮＡ並びに該ラットのＤＮＡをプロー
ブとして用いるラットの雌雄判別法。 【効果】 高感度にラットの雌雄を判別することができ
る。
ットのＤＮＡの全部またはその一部を標識して得られる
ＤＮＡプローブ、該ラットのＤＮＡの全部またはその一
部を含有するベクター、該ラットのＤＮＡに相補的なＤ
ＮＡ、該ラットのＤＮＡの全部またはその一部とハイブ
リダイズし得るＤＮＡ並びに該ラットのＤＮＡをプロー
ブとして用いるラットの雌雄判別法。 【効果】 高感度にラットの雌雄を判別することができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はラットの雌雄判別法に有
用なＤＮＡ、ＤＮＡプローブ、該ＤＮＡを含むベクター
及びラットの雌雄判別法に関する。
用なＤＮＡ、ＤＮＡプローブ、該ＤＮＡを含むベクター
及びラットの雌雄判別法に関する。
【０００２】
【従来の技術】実験動物は血統や系統が重要視され、さ
らに使用される実験によって雌雄が使い分けられる。そ
のため、実験動物の繁殖学の分野で胚や胎児の性別判
定、つまり雄雌の生みわけが重要視され始めている。遺
伝学的に優良な雄（または雌）のみを選択的に得ること
ができれば、実験動物供給の分野できわめて有用性が高
いと考えられる。
らに使用される実験によって雌雄が使い分けられる。そ
のため、実験動物の繁殖学の分野で胚や胎児の性別判
定、つまり雄雌の生みわけが重要視され始めている。遺
伝学的に優良な雄（または雌）のみを選択的に得ること
ができれば、実験動物供給の分野できわめて有用性が高
いと考えられる。
【０００３】ほ乳類の性別が性染色体によって決定され
ることは良く知られている。発生初期にＹ染色体は未分
化の生殖腺を精巣に分化させるのに重要な役目をしてい
る。従って、Ｙ染色体に特異的な遺伝子を解析すること
によって雌雄の判別ができる。
ることは良く知られている。発生初期にＹ染色体は未分
化の生殖腺を精巣に分化させるのに重要な役目をしてい
る。従って、Ｙ染色体に特異的な遺伝子を解析すること
によって雌雄の判別ができる。
【０００４】最近、Ｙ染色体に特異的な遺伝子やＤＮＡ
を用いた雌雄判別法が報告されている。例えば、シンク
レア（Ｓｉｎｃｌａｉｒ）らは、ヒトのＹ染色体上の未
分化生殖腺を精巣に分化させるＤＮＡの塩基配列の候補
を発表した。さらに、彼らはその塩基配列の一部が哺乳
類で良く保存されている可能性を示唆している（ネイチ
ャー（ＮＡＴＵＲＥ），Ｖｏｌ３４６，１９ ＪＵＬＹ
１９９０）。また、特開昭６３−５００２１４号公報
には雄のウシのＤＮＡとハイブリダイズするウシのＤＮ
Ａプローブが記載されている。
を用いた雌雄判別法が報告されている。例えば、シンク
レア（Ｓｉｎｃｌａｉｒ）らは、ヒトのＹ染色体上の未
分化生殖腺を精巣に分化させるＤＮＡの塩基配列の候補
を発表した。さらに、彼らはその塩基配列の一部が哺乳
類で良く保存されている可能性を示唆している（ネイチ
ャー（ＮＡＴＵＲＥ），Ｖｏｌ３４６，１９ ＪＵＬＹ
１９９０）。また、特開昭６３−５００２１４号公報
には雄のウシのＤＮＡとハイブリダイズするウシのＤＮ
Ａプローブが記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前記のシンクレアらの
ＤＮＡをプローブとして雌雄判別を行うこともできる
が、該ＤＮＡは人由来のものでありその特異性に問題が
残る。また、前記の特開昭６３−５００２１４号公報記
載のプローブはその配列が長すぎる点が問題である。
ＤＮＡをプローブとして雌雄判別を行うこともできる
が、該ＤＮＡは人由来のものでありその特異性に問題が
残る。また、前記の特開昭６３−５００２１４号公報記
載のプローブはその配列が長すぎる点が問題である。
【０００６】本発明は、このような状況に鑑み、より簡
易でかつ高感度にブタの雌雄判別を行うことのできる、
雌雄判別法に有用なラットのＤＮＡ、ＤＮＡプローブ及
び該ＤＮＡを含むベクターの提供並びにラットの雌雄判
別法の提供を目的とする。
易でかつ高感度にブタの雌雄判別を行うことのできる、
雌雄判別法に有用なラットのＤＮＡ、ＤＮＡプローブ及
び該ＤＮＡを含むベクターの提供並びにラットの雌雄判
別法の提供を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、雄ラ
ットのＤＮＡを下記のプライマー ５’−ＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ ＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴ
ＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴ−３’ および ５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＴＡ ＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣ
ＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧ−３’ を用いてＰＣＲ法で増幅して得られることを特徴とする
ラットのＤＮＡに関する。
ットのＤＮＡを下記のプライマー ５’−ＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ ＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴ
ＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴ−３’ および ５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＴＡ ＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣ
ＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧ−３’ を用いてＰＣＲ法で増幅して得られることを特徴とする
ラットのＤＮＡに関する。
【０００８】また本発明は、次式配列（Ｉ）で示される
塩基配列を持つラットのＤＮＡに関する。 配列（Ｉ） ５’−ＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧ
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧ ＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧ
ＡＡＧＣ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＡ ＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ
−３’
塩基配列を持つラットのＤＮＡに関する。 配列（Ｉ） ５’−ＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧ
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧ ＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧ
ＡＡＧＣ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＡ ＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ
−３’
【０００９】さらに本発明は、上記のラットのＤＮＡの
全部またはその一部を含有し、これを標識して得られる
ＤＮＡプローブ、上記のラットのＤＮＡの全部またはそ
の一部を含有するベクター、上記のラットのＤＮＡに相
補的なＤＮＡ及び上記のラットのＤＮＡの全部またはそ
の一部とハイブリダイズし得るＤＮＡに関する。
全部またはその一部を含有し、これを標識して得られる
ＤＮＡプローブ、上記のラットのＤＮＡの全部またはそ
の一部を含有するベクター、上記のラットのＤＮＡに相
補的なＤＮＡ及び上記のラットのＤＮＡの全部またはそ
の一部とハイブリダイズし得るＤＮＡに関する。
【００１０】さらに本発明は、前記ＤＮＡプローブを用
いることを特徴とするラットの雌雄判別法に関する。
いることを特徴とするラットの雌雄判別法に関する。
【００１１】本発明における、プローブとして有用なラ
ットのＤＮＡ断片は、前記プライマーを用いてＰＣＲ
（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ）法で増幅して得ることができるが、その工程は、例
えば以下のようにして行い得る。まず、ラットの新鮮な
またはホルマリン等で固定した白血球、精巣、肝臓、胸
腺などの出発物質に、界面活性剤やプロテイナーゼＫ等
により酵素処理を行ないタンパク質を消化した後、フェ
ノール、クロロホルム、イソプロピルアルコールで抽出
し、エタノール沈澱により精製回収してＤＮＡを抽出す
る。
ットのＤＮＡ断片は、前記プライマーを用いてＰＣＲ
（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ）法で増幅して得ることができるが、その工程は、例
えば以下のようにして行い得る。まず、ラットの新鮮な
またはホルマリン等で固定した白血球、精巣、肝臓、胸
腺などの出発物質に、界面活性剤やプロテイナーゼＫ等
により酵素処理を行ないタンパク質を消化した後、フェ
ノール、クロロホルム、イソプロピルアルコールで抽出
し、エタノール沈澱により精製回収してＤＮＡを抽出す
る。
【００１２】この抽出したＤＮＡをＰＣＲ法により増幅
する。ＰＣＲ法は公知のＤＮＡの増幅法である。このＰ
ＣＲ法に用いるプライマーは以下の通りで、ＤＮＡ合成
機（例えば、ＡＢＩ社製）で合成して用いる。 ５’−ＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ ＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴ
ＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴ−３’ ５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＴＡ ＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣ
ＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧ−３’ ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ量は、テンプレートＤＮＡは１
μｇ程度とし、プライマーＤＮＡは１００ｐｍｏｌ程度
とするのが好ましい。ＰＣＲ法の条件は常法に従うこと
ができる。
する。ＰＣＲ法は公知のＤＮＡの増幅法である。このＰ
ＣＲ法に用いるプライマーは以下の通りで、ＤＮＡ合成
機（例えば、ＡＢＩ社製）で合成して用いる。 ５’−ＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ ＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴ
ＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴ−３’ ５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＴＡ ＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣ
ＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧ−３’ ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ量は、テンプレートＤＮＡは１
μｇ程度とし、プライマーＤＮＡは１００ｐｍｏｌ程度
とするのが好ましい。ＰＣＲ法の条件は常法に従うこと
ができる。
【００１３】このようにして得られたＰＣＲ産物をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、用いたプライマーから推定
される鎖長を有するＤＮＡ断片のみを得る。そして、こ
のＤＮＡ断片を適当なプラスミド等のベクターに挿入す
る（例えば、インビトロージエン社のプラスミドｐＣＲ
１０００など）。続いて、このプラスミドを大腸菌など
の適当な宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体
を適当な抗生物質が入った培地に植えて増殖させる。
ロースゲル電気泳動にかけ、用いたプライマーから推定
される鎖長を有するＤＮＡ断片のみを得る。そして、こ
のＤＮＡ断片を適当なプラスミド等のベクターに挿入す
る（例えば、インビトロージエン社のプラスミドｐＣＲ
１０００など）。続いて、このプラスミドを大腸菌など
の適当な宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体
を適当な抗生物質が入った培地に植えて増殖させる。
【００１４】増殖後、形質転換体の有するプラスミドを
抽出し、陽性クローンを調べる。例えば、プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、挿入ＤＮＡの鎖長を調べ、目
的の長さを持つ挿入ＤＮＡを有するクローンを陽性と判
定することができる。または、精製したＰＣＲ産物を標
識してプローブとし、プラスミドとコロニーハイブリダ
イゼイションを行い陽性を決定することもできる。
抽出し、陽性クローンを調べる。例えば、プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、挿入ＤＮＡの鎖長を調べ、目
的の長さを持つ挿入ＤＮＡを有するクローンを陽性と判
定することができる。または、精製したＰＣＲ産物を標
識してプローブとし、プラスミドとコロニーハイブリダ
イゼイションを行い陽性を決定することもできる。
【００１５】得られた陽性クローンのプラスミドを適当
な制限酵素で消化して、本発明のＤＮＡを得ることがで
きる。得られたＤＮＡの塩基配列はジデオキシ法に従っ
て決定した。その結果、使用したプライマー部分を除
き、以下の配列を持っていた。 配列（Ｉ） ５’−ＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧ
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧＡ
ＡＧＣ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ−
３’（１４６ｂｐ）
な制限酵素で消化して、本発明のＤＮＡを得ることがで
きる。得られたＤＮＡの塩基配列はジデオキシ法に従っ
て決定した。その結果、使用したプライマー部分を除
き、以下の配列を持っていた。 配列（Ｉ） ５’−ＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧ
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧＡ
ＡＧＣ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ−
３’（１４６ｂｐ）
【００１６】本発明のＤＮＡプローブは、前記のラット
のＤＮＡの全部またはＤＮＡプローブとして使用可能な
その一部を標識して得られる。標識化は、３２Ｐ、
３Ｈ、１４Ｃ等のような放射性同位元素による標識、ビ
オチン化等の化学標識など、公知の種々の標識が適用可
能であり、標識する方法も特に制限されない。
のＤＮＡの全部またはＤＮＡプローブとして使用可能な
その一部を標識して得られる。標識化は、３２Ｐ、
３Ｈ、１４Ｃ等のような放射性同位元素による標識、ビ
オチン化等の化学標識など、公知の種々の標識が適用可
能であり、標識する方法も特に制限されない。
【００１７】さらに、前記配列（Ｉ）のＤＮＡに相補的
なＤＮＡおよび前記配列（Ｉ）のＤＮＡにハイブリダイ
ズし得るＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれ、これ
らもまたＤＮＡプローブとして使用することができる。
ここで、該ＤＮＡとハイブリダイズし得るものとして
は、配列（Ｉ）の一部に塩基の置換、欠失、挿入等の変
異のあるものであっても該ＤＮＡとハイブリダイズし得
るもの等を挙げることができる。また、本発明のＤＮＡ
プローブとして、本発明のベクターであるプラスミド等
をニックトランスレーション等により標識してそのまま
用いることもできる。
なＤＮＡおよび前記配列（Ｉ）のＤＮＡにハイブリダイ
ズし得るＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれ、これ
らもまたＤＮＡプローブとして使用することができる。
ここで、該ＤＮＡとハイブリダイズし得るものとして
は、配列（Ｉ）の一部に塩基の置換、欠失、挿入等の変
異のあるものであっても該ＤＮＡとハイブリダイズし得
るもの等を挙げることができる。また、本発明のＤＮＡ
プローブとして、本発明のベクターであるプラスミド等
をニックトランスレーション等により標識してそのまま
用いることもできる。
【００１８】本発明のラットの雌雄判別法は、前述のＤ
ＮＡプローブを用いることを特徴とする。該プローブを
用いて、検体のＤＮＡとハイブリダイゼーションし、ハ
イブリダイズするものを雄性、ハイブリダイズしないも
のを雌性と判別することができる。
ＮＡプローブを用いることを特徴とする。該プローブを
用いて、検体のＤＮＡとハイブリダイゼーションし、ハ
イブリダイズするものを雄性、ハイブリダイズしないも
のを雌性と判別することができる。
【００１９】ハイブリダイゼーションの方法としては、
上記判別が可能なものであれば特に制限はなく、例え
ば、ドットブロットハイブリダイゼーション法、サザン
ブロットハイブリダイゼーション法、ｉｎ ｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
上記判別が可能なものであれば特に制限はなく、例え
ば、ドットブロットハイブリダイゼーション法、サザン
ブロットハイブリダイゼーション法、ｉｎ ｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明はこれにより何ら制限されるものではない。 実施例１ 雌雄のラットの血液より抽出したＤＮＡを試料としてド
ットハイブリダイゼーションを行い雌雄判別を行った。 （１）プローブの製作 ラット（雄）の末梢血５ｍ１を遠心分離し、白血球画分
を得た。得られた白血球画分をプロテイナーゼＫ、ＲＮ
ａｓｅ及びフェノール・クロロホルムで処理し、エタノ
ール沈澱法で回収、精製した。得られたラットゲノムＤ
ＮＡを定量した後、−２０℃で保存した。
発明はこれにより何ら制限されるものではない。 実施例１ 雌雄のラットの血液より抽出したＤＮＡを試料としてド
ットハイブリダイゼーションを行い雌雄判別を行った。 （１）プローブの製作 ラット（雄）の末梢血５ｍ１を遠心分離し、白血球画分
を得た。得られた白血球画分をプロテイナーゼＫ、ＲＮ
ａｓｅ及びフェノール・クロロホルムで処理し、エタノ
ール沈澱法で回収、精製した。得られたラットゲノムＤ
ＮＡを定量した後、−２０℃で保存した。
【００２１】この抽出したＤＮＡをＰＣＲ法により増幅
した。このＰＣＲ法に用いる２種のプライマーは以下の
通りでＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）で合成し用いた。 ５’−ＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ ＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴ
ＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴ−３’ ５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＴＡ ＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣ
ＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧ−３ ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ量は、テンプレートＤＮＡは１
μｇ程度とし、プライマーＤＮＡは１００ｐｍｏｌ程度
とした。これらのＤＮＡをＰＣＲ緩衝液（インニスとゲ
ルファンド（Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ）の
方法（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．３−１
２，１９９０に記載）に従って調製）に最終容量が１０
０μｌになるように加えた。２．５ユニットの耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、シータス社）
を加えた後、プログラム式熱コントローラー（ＭＪリサ
ーチ社）を用いてＰＣＲ操作を行った。具体的には前処
理としてディネーチャー工程を９５℃ １０分行い、次
に１サイクルをアニーリング工程 ５４℃ １分、イク
ステンション工程 ７２℃ ２．５分、ディネーチャー
工程 ９５℃ １分として３０サイクル行った。
した。このＰＣＲ法に用いる２種のプライマーは以下の
通りでＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）で合成し用いた。 ５’−ＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ ＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴ
ＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴ−３’ ５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＴＡ ＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣ
ＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧ−３ ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ量は、テンプレートＤＮＡは１
μｇ程度とし、プライマーＤＮＡは１００ｐｍｏｌ程度
とした。これらのＤＮＡをＰＣＲ緩衝液（インニスとゲ
ルファンド（Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ）の
方法（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．３−１
２，１９９０に記載）に従って調製）に最終容量が１０
０μｌになるように加えた。２．５ユニットの耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、シータス社）
を加えた後、プログラム式熱コントローラー（ＭＪリサ
ーチ社）を用いてＰＣＲ操作を行った。具体的には前処
理としてディネーチャー工程を９５℃ １０分行い、次
に１サイクルをアニーリング工程 ５４℃ １分、イク
ステンション工程 ７２℃ ２．５分、ディネーチャー
工程 ９５℃ １分として３０サイクル行った。
【００２２】このようにして得られたＰＣＲ産物を４％
アガロースゲル（シーケムＭＥ、ＦＭＣ社製）上で電気
泳動にかけて分画し、臭化エチジウム染色を行った（図
１）。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＰＣＲ産
物である。約２５０ｂｐのところにバンディングしてい
るバンドをアガロースゲルより切り出しＤＮＡ断片を抽
出、精製した。
アガロースゲル（シーケムＭＥ、ＦＭＣ社製）上で電気
泳動にかけて分画し、臭化エチジウム染色を行った（図
１）。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＰＣＲ産
物である。約２５０ｂｐのところにバンディングしてい
るバンドをアガロースゲルより切り出しＤＮＡ断片を抽
出、精製した。
【００２３】次に、インビトロージェン社のＴＡクロー
ニングキットを使用して、該キットのプロトコールに従
い、このＤＮＡ断片のクローニングを行った。まず、こ
のＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した（インビトロージ
ェン社のｐＣＲ１０００、図２）。続いて、このプラス
ミドを宿主（大腸菌）に導入した。宿主を抗生物質（カ
ナマイシン）が入った培地に植えて増殖させた。
ニングキットを使用して、該キットのプロトコールに従
い、このＤＮＡ断片のクローニングを行った。まず、こ
のＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した（インビトロージ
ェン社のｐＣＲ１０００、図２）。続いて、このプラス
ミドを宿主（大腸菌）に導入した。宿主を抗生物質（カ
ナマイシン）が入った培地に植えて増殖させた。
【００２４】次に、ＰＣＲ産物より精製したＤＮＡ断片
を、ｒ−３２Ｐ（ＡＴＰ）とＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを使用し、３７℃、６０分反応させ、５′末端を
３２Ｐでラベルし、精製してプローブとした。このプロ
ーブを用いてコロニーハイブリダイゼイション（条件；
プレハイブリダイゼーション５０℃ １時間、ハイブリ
ダイゼーション５０℃ １晩、洗浄５０℃ １時間で２
回）を行い、ＤＮＡ断片が挿入されているかを調べ、Ｄ
ＮＡ断片挿入陽性クローンを決めた。その結果を図３に
示すが、４６コロニー中１５コロニーが陽性であった。
を、ｒ−３２Ｐ（ＡＴＰ）とＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを使用し、３７℃、６０分反応させ、５′末端を
３２Ｐでラベルし、精製してプローブとした。このプロ
ーブを用いてコロニーハイブリダイゼイション（条件；
プレハイブリダイゼーション５０℃ １時間、ハイブリ
ダイゼーション５０℃ １晩、洗浄５０℃ １時間で２
回）を行い、ＤＮＡ断片が挿入されているかを調べ、Ｄ
ＮＡ断片挿入陽性クローンを決めた。その結果を図３に
示すが、４６コロニー中１５コロニーが陽性であった。
【００２５】挿入陽性クローンの有するプラスミドをア
ルカリ分解法で抽出し、制限酵素（ＥｃｏＲｌ、Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ）で切断し、４％アガロースゲルで電気泳動
（条件；ミューピッドを使用し、５０Ｖ、９０分）した
後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射（３０２ｎ
ｍ）下、写真撮影して、切断されたＤＮＡの鎖長を調
べ、目的の長さ（約２５０ｂｐ）を持つ挿入ＤＮＡを有
するクローンを陽性とした。図４にその結果を示すが、
レーン１は分子量マーカ、レーン２〜７はＤＮＡ断片で
ある。図４では、レーン２、３、４、７のコロニーが陽
性である。
ルカリ分解法で抽出し、制限酵素（ＥｃｏＲｌ、Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ）で切断し、４％アガロースゲルで電気泳動
（条件；ミューピッドを使用し、５０Ｖ、９０分）した
後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射（３０２ｎ
ｍ）下、写真撮影して、切断されたＤＮＡの鎖長を調
べ、目的の長さ（約２５０ｂｐ）を持つ挿入ＤＮＡを有
するクローンを陽性とした。図４にその結果を示すが、
レーン１は分子量マーカ、レーン２〜７はＤＮＡ断片で
ある。図４では、レーン２、３、４、７のコロニーが陽
性である。
【００２６】得られたＤＮＡの塩基配列はジデオキシ法
に従って決定した。その結果、使用したプライマー部分
及びプライマーから両末端までの部分を除き以下の配列
を持っていた。 ５’−ＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧ
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧ ＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧ
ＡＡＧＣ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＡ ＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ
−３’（１４６ｂｐ） このサイズは、電気泳動度から推定される値とほぼ同じ
であった。
に従って決定した。その結果、使用したプライマー部分
及びプライマーから両末端までの部分を除き以下の配列
を持っていた。 ５’−ＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧ
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧ ＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧ
ＡＡＧＣ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＡ ＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ
−３’（１４６ｂｐ） このサイズは、電気泳動度から推定される値とほぼ同じ
であった。
【００２７】以上のように配列を決定されたＤＮＡ断片
を有するプラスミドｐＣＲ１０００をニックトランスレ
ーション（条件；〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ使用、１６
℃、１６時間）によって標識し（放射性同位元素：３２
Ｐ）プローブとした。
を有するプラスミドｐＣＲ１０００をニックトランスレ
ーション（条件；〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ使用、１６
℃、１６時間）によって標識し（放射性同位元素：３２
Ｐ）プローブとした。
【００２８】（２）ドットブロットハイブリダイゼイシ
ョン ラット（雌雄一頭ずつ）の末梢血５ｍｌを遠心分離し白
血球画分を得た。得られた白血球画分をプロティナーゼ
Ｋ、ＲＮａｓｅ及びフェノール・クロロホルムで処理
し、ＤＮＡを抽出した。得られたラットゲノムＤＮＡを
定量した後、−２０℃で保存した。
ョン ラット（雌雄一頭ずつ）の末梢血５ｍｌを遠心分離し白
血球画分を得た。得られた白血球画分をプロティナーゼ
Ｋ、ＲＮａｓｅ及びフェノール・クロロホルムで処理
し、ＤＮＡを抽出した。得られたラットゲノムＤＮＡを
定量した後、−２０℃で保存した。
【００２９】ラットゲノムＤＮＡをアルカリ変性、熱変
性処理を行った後、ニトロセルロースフィルターに吸着
させた。同フィルターをプレハイブリダイゼーション液
（５×ＳＳＰＥ（３．６Ｍ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｎ
ａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤ ＴＡを含む、ｐＨ７．
４）、５×デンハルト溶液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム））に７５℃で一時間浸漬するこ
とによって、プレハイブリダイゼーションを行った。続
いて、前述の雄のラットＤＮＡ断片を含むプラスミドを
３２Ｐで標識したプローブと共に一晩ハイブリダイゼー
ションを行った。
性処理を行った後、ニトロセルロースフィルターに吸着
させた。同フィルターをプレハイブリダイゼーション液
（５×ＳＳＰＥ（３．６Ｍ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｎ
ａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤ ＴＡを含む、ｐＨ７．
４）、５×デンハルト溶液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム））に７５℃で一時間浸漬するこ
とによって、プレハイブリダイゼーションを行った。続
いて、前述の雄のラットＤＮＡ断片を含むプラスミドを
３２Ｐで標識したプローブと共に一晩ハイブリダイゼー
ションを行った。
【００３０】次に、同フィルターを６×ＳＳＣ（Ｓｔａ
ｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）液で一時
間洗浄した後、Ｘ線フィルム（コニカ社製）に−８０℃
で一晩露光させた。図５はこのようにして得られたドッ
トブロットハイブリダイゼーションの結果を示してい
る。本発明で提供したプローブは雄のＤＮＡのみと反応
し、雌のＤＮＡとは反応しないことが示され、ブタの雌
雄判別が可能であることを示している。
ｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）液で一時
間洗浄した後、Ｘ線フィルム（コニカ社製）に−８０℃
で一晩露光させた。図５はこのようにして得られたドッ
トブロットハイブリダイゼーションの結果を示してい
る。本発明で提供したプローブは雄のＤＮＡのみと反応
し、雌のＤＮＡとは反応しないことが示され、ブタの雌
雄判別が可能であることを示している。
【００３１】
【発明の効果】本発明のラットのＤＮＡは、雄ラットの
ＤＮＡとのみ反応し、雌ラットのＤＮＡとは反応しない
ので、ラットの雌雄を判別するためのプローブとして有
用である。
ＤＮＡとのみ反応し、雌ラットのＤＮＡとは反応しない
ので、ラットの雌雄を判別するためのプローブとして有
用である。
【００３２】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１４６ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：ラットの末梢血の白血球 配列 ５’−ＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧ
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ５０ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧＡ
ＡＧＣ １００ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ−
３’１４６
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ５０ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧＡ
ＡＧＣ １００ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ−
３’１４６
【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源：核酸モノマー 配列 ＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ ＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴ ＣＡＴ
ＣＧＴＧＴＧＧ Ｔ３１
ＣＧＴＧＴＧＧ Ｔ３１
【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源：核酸モノマー 配列 ＧＡＧＧＴＣＧＡＴＡ ＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣ ＧＧＧ
ＴＡＴＴＴＣＴ ＣＴＣＴＧＴＧ ３７
ＴＡＴＴＴＣＴ ＣＴＣＴＧＴＧ ３７
【００３５】
【図１】図１はＰＣＲ産物の１０％を４％アガロースゲ
ルで電気泳動した後、臭化エチジウムで染色し、紫外線
（３０２ｎｍ）照射下で撮影した結果を示す図である。
レーン１は分子量マーカーであり、レーン２はＰＣＲ産
物である。
ルで電気泳動した後、臭化エチジウムで染色し、紫外線
（３０２ｎｍ）照射下で撮影した結果を示す図である。
レーン１は分子量マーカーであり、レーン２はＰＣＲ産
物である。
【図２】図２はｐＣＲ１０００プラスミドのクローニン
グサイトを示す図である。
グサイトを示す図である。
【図３】図３はコロニーハイブリダイゼイションの結果
を示す図である。
を示す図である。
【図４】図４は抽出したプラスミドを制限酵素で切断し
４％のアガロースゲルで電気泳動した後、臭化エチジウ
ムで染色し、紫外線（３０２ｎｍ）照射下で撮影した結
果を示す図である。レーン１は分子量マーカーであり、
レーン２〜７はＤＮＡ断片である。
４％のアガロースゲルで電気泳動した後、臭化エチジウ
ムで染色し、紫外線（３０２ｎｍ）照射下で撮影した結
果を示す図である。レーン１は分子量マーカーであり、
レーン２〜７はＤＮＡ断片である。
【図５】図５はドットブロットハイブリダイゼーション
分析の結果を示す図である。
分析の結果を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 雄ラットのＤＮＡを下記のプライマー ５’−ＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡ ＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴ
ＣＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴ−３’ および ５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＴＡ ＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣ
ＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧ−３’ を用いてＰＣＲ法で増幅して得られることを特徴とする
ラットのＤＮＡ。 - 【請求項２】 次式配列（Ｉ）で示される塩基配列を持
つラットのＤＮＡ。 配列（Ｉ） ５’−ＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡ ＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧ
ＴＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧ ＣＡＴＧ
ＣＡＧＡＡＴ ＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ ＧＧＧ
ＡＴＡＴＣＡＧ ＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣ ＴＴＡＣＡＧ
ＡＡＧＣ ＴＧＡＡＡＡＡＧＧ ＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣ ＡＧＧＡ
ＧＧＣＧＣＡ ＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧ ＡＣＣＣＴＡ−
３’ - 【請求項３】 請求項１または２記載のラットのＤＮＡ
の全部またはその一部を含有し、これを標識して得られ
るＤＮＡプローブ。 - 【請求項４】 請求項１または２記載のラットのＤＮＡ
の全部またはその一部を含有するベクター。 - 【請求項５】 請求項１または２記載のラットのＤＮＡ
に相補的なＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１または２記載のラットのＤＮＡ
の全部またはその一部とハイブリダイズし得るＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項３記載のＤＮＡプローブを用いる
ことを特徴とするラットの雌雄判別法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18025692A JPH05328973A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | ラットのｄｎａ、ｄｎａプローブ、ベクター及びラットの雌雄判別法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18025692A JPH05328973A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | ラットのｄｎａ、ｄｎａプローブ、ベクター及びラットの雌雄判別法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328973A true JPH05328973A (ja) | 1993-12-14 |
Family
ID=16080083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18025692A Pending JPH05328973A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | ラットのｄｎａ、ｄｎａプローブ、ベクター及びラットの雌雄判別法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05328973A (ja) |
-
1992
- 1992-05-29 JP JP18025692A patent/JPH05328973A/ja active Pending
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