請求の範囲
１ 宿主細胞に好適なベクター中に挿入されて存
在している、プラスミノーゲンアクチベータをコ
ードするcDNAを原核細胞中で発現させることに
よりプラスミノーゲンアクチベータを製造する方
法において、緊縮調節されていて、それ故複製が
宿主細胞の染色体の複製から脱共役しないか又は
一時的に脱共役するに過ぎないベクターを使用
し、かつ緩和調節が起らないかもしくはベクター
のプロモータが、脱共役したプラスミドの
mRNA形成が緊縮調節下のプラスミドの場合よ
りも大きくないように調節される条件下で培養を
実施することを特徴とする、原核細胞中でプラス
ミノーゲンアクチベータを製造する方法。
２ 増幅係数が３より大きくはないベクターを使
用することを特徴とする、請求の範囲第１項記載
の方法。
３ ベクターとして、pRSF1010、pKN402、
pACYC177又はOriを有するそれらから誘導され
るプラスミドを使用することを特徴とする、請求
の範囲第１項又は第２項記載の方法。
４ プラスミノーゲンアクチベータのcDNAを
pKN402中に挿入し、このベクターに好適な原核
宿主細胞中に導入しかつ宿主細胞を温度30℃で培
養することを特徴とする、請求の範囲第３項記載
の方法。
５ 宿主細胞としてE.コリDSM3689を使用する
ことを特徴とする、請求の範囲第３項又は第４項
記載の方法。
６ pRSF1011では宿主細胞としてプソイドモナ
ス・プチダDSM2106を使用することを特徴とす
る、請求の範囲第３項記載の方法。
７ プラスミドpePa、100.1又は／及び
pePa107.8又は及びpePa133又はpePa137を含有
するE.コリDSM3689を培養することを特徴とす
る、請求の範囲第５項記載の方法。
８ プラスミドpePa107.8又はpePa147を単独で
又はプラスミドpePa119と一緒に含有するプソイ
ドモナス・プチダDSM2106を培養することを特
徴とする、請求の範囲第６項記載の方法。
明細書
本発明は、原核細胞中でプラスミノーゲンアク
チベータを製造する方法に関する。
プラスミノーゲンアクチベータは人間及び動物
の組織及び体液中に広く分布している。これはフ
イブリノリシスで中心的な役割を果たし、かつプ
ラスミノーゲンをプラスミンに変化させる。プラ
スミンは血栓溶解作用に重要である。それ故、プ
ラスミノーゲンアクチベータは血栓による血管閉
塞の臨床治療に非常に重要である。
例えば、公知のプラスミノーゲンアクチベータ
はプロウロキナーゼ（ｕ−PA）並びに組織プラ
スミノーゲンアクチベータ（ｔ−PA）である。
プロウロキナーゼは、プラスミンにより活性化
される一本鎖型のセリンプロテアーゼである
〔“Eur.J.Biochem.”、150巻、183〜188頁（1985
年）、ヨーロツパ公開特許第0092181号〕。
ｔ−PAも、種々の変態形で産出するセリンプ
ロテアーゼである〔“動脈硬化
（Arteriosclerosis）”、４巻、579〜585頁（1984
年）〕。
組織又は細胞培養物から単離したｔ−PAは低
い活性（酵素前駆体）の形で一本鎖ｔ−PAとし
てグリコシル化されて存在する（分子量約70000
ダルトン）。プラスミン、トリプシン又はカリク
レインによるこの酵素前駆体に対する制限された
作用により、この前駆体は完全活性状態（二本鎖
ｔ−PA）に変換される。その際に、Arg275と
Ile276との間の結合が切断される。重い鎖（Ａ−
鎖）と軽い鎖（Ｂ−鎖、プロテアーゼドメイン）
が生じる。両方の鎖はジスルフイド架橋により結
合している〔“J.Biol.Chem.”、256巻（7035〜
7041頁（1981年）〕。
更に、ｔ−PAとは僅かに異なる天然誘導体が
公知である。分子の約50％がGly−Ala−Arg−
Ser−Tyr−Gln（Ｌ−鎖）で開始し、ｔ−PAの
他の約50％ではGly−Ala−Argが欠けておりか
つアミン酸配列はGly／Ser−Tyr−Gln（Ｓ−鎖）
で開始する。Ｌ−４位もしくはＳ−１位でGly／
Serの交換が行なわれていることもある〔“FEBS
Letters”、156巻、47〜50頁（1983年）〕。しかし
この僅かな変態はｔ−PAの生物学的作用に対し
て作用しない。
自然界の天然プラスミノーゲンアクチベータは
極く僅かな量（例えば血しよう中でtPA約6nｇ／
ml）でしか産出されないので、臨床的な適用及び
科学的な目的に必要とされる量のこのアクチベー
タを遺伝子工学的に製造すると有利である。例え
ば、ｔ−PAに関しては原核細胞中でのクローニ
ング及び発現の方法〔Pennica及びその他共著、
“ネイチヤー（Nature）”、301巻、214〜221頁
（1983年）〕及び真核細胞中での発現法〔“バイオ
テクノロジー（Bio−technology）”、12月84、
1058〜1062頁〕が記載されている。真核細胞中で
発現されるプラスミノーゲンアクチベータはグリ
コシル化されているが、原核細胞中で発現させる
際にはグリコシル化は行なわれない。
原核細胞中で発現されたプラスミノーゲンアク
チベータは、グリコシル化された天然産生アクチ
ベータと同様に生物学的に作用すると考えられ
る。それというのも例えば炭水化物鎖の分離後
〔“バイオケミストリー（Biochemistry）”、23巻、
6191〜6195頁（1984年）〕又はグリコシル化の阻
害後〔“血栓症及び止血（Thrombosis and Ｈａ¨
emostasis）”、54巻、788〜791頁（1985年）〕の
ｔ−PAでは、そのように製造されたグリコシル
化されていないｔ−PAがグリコシル化された天
然ｔ−PAと同一の特性を有するからである。
従つて、原核生物による問題のない醗酵及び予
測される高い収率故に、プラスミノーゲンアクチ
ベータを原核生物中で発現させるための方法に対
して大きな関心が寄せられている。しかし従来公
知の方法〔例えばｔ−PAに関して“ネイチヤー
（Nature）”、301巻、214〜221頁（1983年）及び
ヨーロツパ特許第0093619号参照〕は、主として
所望の連鎖長を有していない蛋白質が発現される
という欠点を有している。ベクターとしての
pBR322によりE.コリ（coli）中でｔ−PA
cDNAを発現させる際に発現した蛋白質の80％よ
り多くのものが僅か32000〜36000dの分子量を有
し、それ故ｔ−PAの分解生成物より成ることが
認められた。20％より少ない発現蛋白質は一本鎖
ｔ−PAであり、その分子量は57000dである〔前
記の“Nature”中に記載の配列に相当〕。このよ
うに類似の化合物の混合物の精製は不経済で経費
がかかる。
観察されるｔ−PA誘導体の形成は、原核生物
中で組換え蛋白質を発現させる際に長い間公知で
ある現象との類似性を有する。つまり、種々のこ
のような蛋白質に関して、蛋白質が完全に発現さ
れるけれども、蛋白質分解作用を受けるので宿主
細胞中でのその半減期が極めて低いということが
報告されている〔“バイオテクノロジーの方向
（Trends in Biotechnology）”、１巻、109〜113
頁（1983年）〕。この蛋白質の分解を回避するため
に、様々な方法が提案されている。１つの方法
は、分解に関与する蛋白質分解系を有していない
宿主細胞の使用である。例えば、E.コリのlon−
変異株を宿主細胞として使用することができる。
この種の変異株は欠失であるかもしくは野生型で
産生するプロテアーゼの１つである。E.コリには
少なくとも７種の他のプロテアーゼが存在する
〔“J.Bacteriol.”、149巻、1027〜1033頁（1982
年）〕ので、この方法は、発現される蛋白質がこ
れらの他のプロテアーゼにより分解されない場合
にだけ適している。更に、好適な宿主細胞の選択
は非常に限定されている。
蛋白質の分解は、蛋白質中でアミノ酸交換
（cDNAレベル（Ebene）で）によりプロテアー
ゼ切断位置を除去することにより回避することも
できるはずである。しかしそのためにはこの切断
位置を初めにロスの多い方法により決定しなけれ
ばならない。更に、アミノ酸の交換は蛋白質の活
性及び免疫学的特性を激しく変化させ得る。
更に、クローニングベクター中にT4フアージ
のアンチプロテアーゼ遺伝子を組み込むことが公
知である〔“Proc.Natl.Acad.Sci.”、80巻、2059
〜2062頁（1983年）〕。この方法も一定の組換え蛋
白質にだけ好適であり、しかも蛋白質分解を不十
分にしか抑制しない。
更に、発現ベクターのコピー数を高めることに
より、プロテアーゼを莫大な量の組換え蛋白質で
満たしてそのプロテアーゼの作用が比較的僅かな
パーセントの組換え蛋白質でだけ展開されるよう
にして発現を高めることが提案された。しかしこ
の方法の欠点は、僅か１〜２世代で発現を莫大に
高めなければならずかつより長い時間実施するこ
とができないということである〔前記文献“バイ
オテクノロジーの方向（Trends in
Biotechnology）”〕。
蛋白質分解を回避するための他の方法は、組換
え蛋白質を既にcDNAレベルで他の蛋白質との融
合により保護することである。例えば、この方法
はペプチドホルモンのインシユリン及びソマトス
タチンについて記載されており、その際に融合成
分としてβ−ガラクトシダーゼが使われる〔“サ
イエンス（Science）”、198巻、1056〜1063頁
（1977年）〕。しかしこの方法は、保護蛋白質が一
緒に発現しかつ精製する際に初めに分離して除去
しなければならないという欠点を有し、これは付
加的な高い経費を意味する。遺伝子工学的に製造
した蛋白質の分解を回避するために従来提案され
た方法のいずれもが、蛋白質混合物からこうして
製造されるPA（プラスミノーゲンアクチベータ）
の問題を解決するのに好適でないように思われ
る。
それ故、本発明の課題は、原核生物中で完全で
ほぼ均一なプラスミノーゲンアクチベータの発現
を可能にしかつ生成物の分解を回避するための前
記の方法の欠点を有していない方法を開示するこ
とである。
ところで、複製が宿主細胞の染色体の複製から
脱共役（entkoppeln）しないか又は一時的にだ
け脱共役し、それ故mRNAの形成が著しく低減
する発現ベクターを使用する際に、あるいは
mRNA形成が同様に低水準に低下するようにプ
ロモータが調節されるベクターを使用する際に、
原核生物中での発現で一本鎖プラスミノーゲンア
クチベータが高純度で生成するということが判明
し、かつ本発明はこれに基いている。
それ故、宿主細胞に好適であるベクター中に挿
入されて存在している、プラスミノーゲンアクチ
ベータをコードするcDNAを原核細胞中で発現さ
せることによりこのアクチベータを製造する本発
明方法は、緊縮調節（Strikte Kontrolle）され
ていて、それ故複製が宿主細胞の染色体の複製か
ら脱共役しないか又は一時的に脱共役するに過ぎ
ないベクターを使用し、かつ緩和調節
（relaxierte Kontrolle）が起らないかもしくは
ベクターのプロモータが、脱共役したプラスミド
のmRNA形成が緊縮調節下の場合よりも大きく
ないように調節される条件下で培養を実施するこ
とを特徴とする。
本発明は、望ましくない蛋白質混合物の形成
は、種々の組成のmRNA鎖の混合が惹起される
ことに帰因しておりかつ相応して低い転写速度に
調節することにより回避し得るという驚くべき認
識に基いている。
緊縮調節されるベクターは、宿主細胞の成長の
早期にそのコピー数を係数10、殊に係数３よりも
多くは高めない。それは、一般に遺伝子工学で使
用される、緩和調節されたマルチコピープラスミ
ドとは反対に、“ローコピー（low copy）−プラ
スミドと表わされる。
本発明方法に好適なそのようなベクターは、そ
れが活性な蛋白質の生合成あるいはDNA−プロ
テアーゼをその増殖のために必要とするかどう
かを試験して見出すことができる。
“J.Bacteriol.”、110巻、667〜676頁（1972年）
から、クロラムフエニコール又はスペクチノマイ
シンのような蛋白質生合成の阻害物質を添加する
ことにより、緩和調節されているベクター（例え
ばColE型のベクター、pBR322）ではプラスミ
ド複製が染色体の複製から脱共役されかつベクタ
ーのコピー数が100〜1000よりも多く増幅し得る
ことが知られている。主にこの特性が、合成にこ
れらのベクターを優先的に使用する理由である。
しかし本発明による使用に好適な、緊縮調節され
ているベクターはこの方法により係数10倍、殊に
係数３倍よりも多くなく最高約50のコピー数に増
幅することができる。
成長の開始前に、ベクターは１細胞当りコピー
１〜50、殊に２〜20、特に２〜10のコピー数で存
在する。ベクターの開始コピー数が下の範囲（10
又はそれ以下）である場合、増幅係数がその範囲
の上限（10近く）にあるようなベクターが優れて
いる。開始コピー数が既に約20〜50である場合に
は、増幅係数を可能な限り低くすると有利であ
る。増幅係数が３又はそれ以下だと特に好適であ
る。
ベクターとしては特に原核生物のプラスミドベ
クター、フアージベクター及び両方の組合せが好
適である。
緊縮される優れたプラスミドベクターは
pRSF1010、pKN402及びpACYC177並びにこれ
らから誘導される、有利にその特徴的な配列を
Oriとして有するプラスミドである。プラスミド
pKN402及びpACYC177は特に優れている。
pKN402の複製は温度上昇により染色体の複製か
ら脱共役することができる。それ故、コピー数を
簡単な方法で高めることができる。しかしこの際
に一本鎖ではないPaの著しい上昇が認められる。
それ故、脱共役が起らない温度を培養に選択しな
ければならない。表１及び２は、緊縮調節又は緩
和調節されている数種のベクターに関してコピー
数及び一本鎖Paの形成をこれらのベクターによ
り発現される蛋白質の％で示している。
場合により、ｔ−PA染色体のmRNAコピーの
形成を、高いコピー数で存在するベクター（ハイ
コピーベクター：high−copy−Vektoren）を使
用す際に所望通り低くするには、ベクターのプロ
モータを、mRNA形成（転写）が前記の緊縮調
節されるベクターと同じ程度に低いmRNA形成
となるように調節することである。それ故、強力
なプロモータを有するこのようなハイコピーベク
ターを使用する場合に、本発明ではプロモータは
弱く誘発されて、ｔ−PA遺伝子のmRNAへの低
い転写が行なわれるに過ぎない。例えば、このた
めにハイコピーベクターのプロモータを相応して
阻害するリプレツサーを形成する宿主細胞を使用
し、その際に、この阻害は相応して低い量の誘導
物質の添加により抑えることができる。例えばこ
のためには、lac−ペルミアーゼを生成せずかつ
lac−リプレツサーを過剰生産するように形質転
換し得るE.コリ変異株が好適である。それ故、強
力なlac−プロモータを有するハイコピープラス
ミドと一緒に使用する場合、プロモータは強く抑
制されて、mRNAの形成は抑えられる。それ故、
誘導物質の添加により所望の低いmRNA形成が
達成される。このような変異株の代表的な例はE.
コリK12株、DSM2102又はDSM2093である。こ
れをプラスミドpePa119（DSM3691P）で形質転
換する場合には、lac−リプレツサー過剰生産者
が該当する。これは、ｔ−PA遺伝子がlac−プロ
モータのコントロール下に置かれているハイコピ
ープラスミドで、所望のmRNA形成のために、
必要な誘導物質、例えばIPTG（イソプロピル−
β−チオガラクトシド）を相応する少い量で又は
lac−ペルミアーゼ栄養要求変異株ではラクトー
スを添加して使用することができる。後者の場
合、誘導物質ラクトースの少い配量はその極めて
緩慢な細胞への浸透により行なわれる。
tacよりも低い効率のプロモータを使用する場
合、完全に誘導される際には相応して高いベクタ
ーのコピー数が許容される。プロモータ強度はコ
ピー数に反比例して選択し得るか又はプロモータ
の使用は相応して低い誘導により制限しなければ
ならない。
発現ベクターのコピー数を限定することにより
達成される、ｔ−PA断片が産生しないという効
果は次のようにして達成することもできる：
強力なプロモータ（tac）を有するハイコピー
発現ベクターをlac−リプレツサー過剰生産の菌
株（lac Iq）中で使用する場合、誘導物質
（IPTG、ラクトース等）の添加によりｔ−PA合
成が誘導される。これは培地中でIPTG0.5〜５ミ
リモルの量で完全に行なわれる。これに対し、ロ
ーコピーベクターを同じ系（tac−プロモータ、
lac Iq）で使用する場合、同じIPTG量の添加で
屈折体（refractile bodies）の形成が認められる
が、屈折体中へのｔ−PAの断片のとり込みは認
められない。ハイコピーベクターでIPTG添加量
を0.01ミリモルに低下させる際に、完全なIPTG
誘導ではローコピー系と同じ純粋な屈折体が得ら
れる。この効果は、tacより不良のプロモータで
も同様に達成される。ベクターのコピー数は、そ
のプロモータがtac−プロモータよりも低い効率
である分だけ上昇し得る。即ちプロモータの効率
１／１０では可能なプラスミドコピー数の上昇は、使
用されるローコピープラスミドに対して係数10で
ある。
本発明方法の両方の方法ではローコピー系の使
用が優れている。本発明による強力なプロモータ
を有するローコピー系の利点は、醗酵における系
の易取扱い性である。この際に誘導は低い経費で
実施することができる。それというのも誘導物質
の量は調節により強く制御する必要はなく、記載
したように、単槽系（Eintopf−System）が機能
するからである。また、lac系を介するこの誘導
はtrp系を介する制御よりも優先する。それとい
うのもラクトースの使用により細胞の成長が一緒
に制御され得るからであり、これはtrp−欠乏技
術（trp−Verarmungstechnik：Genentech）で
はあまり簡単には可能ではない。
一般に、ベクターの分子量は106〜108ダルトン
である。ベクターはプラスミノーゲンアクチベー
ターcDNA、例えばtPA−cDNA以外に有利には
調節−及び末端配列並びに選択マークを含有して
よい。特に、プロモータとしてはtac−及びtrp−
プロモータが好適であることが明らかになつた。
このベクター中へのcDNAの挿入は任意の配向で
行なうことができる。Claim 1: A method for producing a plasminogen activator by expressing in a prokaryotic cell a cDNA encoding a plasminogen activator, which is inserted into a vector suitable for a host cell. vectors whose replication is uncoupled or only temporarily uncoupled from the replication of the host cell's chromosomes, and where relaxed regulation does not occur or the promoter of the vector is uncoupled. of plasmid
A method for producing a plasminogen activator in prokaryotic cells, characterized in that the cultivation is carried out under conditions in which mRNA formation is regulated such that it is no greater than with plasmids under stringent control. 2. Method according to claim 1, characterized in that a vector with an amplification factor of no greater than 3 is used. 3 As vectors, pRSF1010, pKN402,
3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that pACYC177 or a plasmid derived therefrom having Ori is used. 4 Plasminogen activator cDNA
4. Process according to claim 3, characterized in that it is inserted into pKN402, introduced into a prokaryotic host cell suitable for this vector, and the host cell is cultured at a temperature of 30°C. 5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that E. coli DSM3689 is used as the host cell. 6. The method according to claim 3, wherein pRSF1011 uses Pseudomonas putida DSM2106 as a host cell. 7 Plasmid pePa, 100.1 or/and
6. The method according to claim 5, characterized in that E. coli DSM3689 containing pePa107.8 or pePa133 or pePa137 is cultured. 8. The method according to claim 6, characterized in that Pseudomonas putida DSM2106 containing plasmid pePa107.8 or pePa147 alone or together with plasmid pePa119 is cultivated. Description The present invention relates to a method for producing plasminogen activators in prokaryotic cells. Plasminogen activators are widely distributed in human and animal tissues and body fluids. It plays a central role in fibrinolysis and converts plasminogen to plasmin. Plasmin is important for thrombolytic action. Therefore, plasminogen activators are of great importance in the clinical treatment of thrombotic vascular occlusion. For example, known plasminogen activators are prourokinase (u-PA) as well as tissue plasminogen activator (t-PA). Prourokinase is a single-chain serine protease activated by plasmin [“Eur.J.Biochem.”, Vol. 150 , pp. 183-188 (1985
), European Published Patent No. 0092181]. t-PA is also a serine protease produced in various modified forms [Arteriosclerosis, Vol. 4, pp. 579-585 (1984
Year)〕. t-PA isolated from tissues or cell cultures exists in a low-activity (enzyme progenitor) form glycosylated as single-chain t-PA (molecular weight approximately 70,000
Dalton). Limited action on this proenzyme by plasmin, trypsin or kallikrein converts it to the fully active state (double-chain t-PA). At that time, Arg275 and
The bond between Ile276 and Ile276 is broken. Heavy chain (A-
chain) and light chain (B-chain, protease domain)
occurs. Both chains are connected by a disulfide bridge [“J.Biol.Chem.”, vol. 256 (7035–
7041 pages (1981)]. Furthermore, natural derivatives that differ slightly from t-PA are known. Approximately 50% of the molecules are Gly−Ala−Arg−
The other 50% of t-PA lacks Gly-Ala-Arg and the amino acid sequence is Gly/Ser-Tyr-Gln (S-chain).
Start with. Gly/ in L-4th place or S-1st place
Sometimes Ser is replaced [“FEBS
Letters, Vol. 156, pp. 47-50 (1983)].However, this slight metamorphosis has no effect on the biological effects of t-PA.Natural plasminogen activators in nature are present in extremely small amounts ( For example, approximately 6 ng of tPA/
ml), it would be advantageous to genetically engineer this activator in the quantities required for clinical applications and scientific purposes. For example, for t-PA, methods of cloning and expression in prokaryotic cells [Pennica et al.
"Nature", Vol. 301, pp. 214-221 (1983)] and expression methods in eukaryotic cells ["Bio-technology", December 84,
1058-1062]. Plasminogen activators expressed in eukaryotic cells are glycosylated, but are not glycosylated when expressed in prokaryotic cells. Plasminogen activators expressed in prokaryotic cells are thought to act biologically similar to glycosylated naturally occurring activators. This is because, for example, after separation of carbohydrate chains [Biochemistry, vol. 23,
6191-6195 (1984)] or after inhibition of glycosylation [“Thrombosis and Haemostasis”]
54, pp. 788-791 (1985)], the unglycosylated t-PA so produced has the same properties as the glycosylated natural t-PA. There is therefore great interest in methods for expressing plasminogen activators in prokaryotes because of the problem-free fermentation and expected high yields by prokaryotes. Conventionally known methods (for example, see Nature, Vol. 301, pp. 214-221 (1983) and European Patent No. 0093619 regarding t-PA) mainly involve proteins that do not have the desired chain length. It has the disadvantage that it is expressed as a vector.
t-PA in E. coli by pBR322
It was found that more than 80% of the expressed protein upon expressing the cDNA had a molecular weight of only 32,000-36,000 d and therefore consisted of degradation products of t-PA. Less than 20% of the expressed protein is single-chain t-PA, with a molecular weight of 57,000 d [corresponding to the sequence described in "Nature" above]. Purification of mixtures of similar compounds in this way is uneconomical and expensive. The observed formation of t-PA derivatives has similarities to a phenomenon long known when expressing recombinant proteins in prokaryotes. In other words, it has been reported that for a variety of such proteins, although the protein is fully expressed, its half-life in the host cell is extremely low because it is subject to proteolytic action [``Directions in Biotechnology'']. Trends in Biotechnology)”, Volume 1, 109-113.
Page (1983)]. Various methods have been proposed to avoid this protein degradation. One method is the use of host cells that do not have proteolytic systems involved in degradation. For example, E. coli lon−
Mutant strains can be used as host cells.
This type of mutant is either a deletion or one of the proteases produced in the wild type. At least seven other proteases are present in E. coli [“J. Bacteriol.”, vol. 149, pp. 1027-1033 (1982
), this method is only suitable if the expressed protein is not degraded by these other proteases. Furthermore, the selection of suitable host cells is very limited. Protein degradation could also be avoided by removing protease cleavage sites by amino acid exchanges (at the cDNA level (Ebene)) in the protein. However, in order to do this, the cutting position must first be determined by a lossy method. Furthermore, amino acid exchanges can drastically alter the activity and immunological properties of a protein. Furthermore, it is known to incorporate the T4 phage antiprotease gene into a cloning vector [“Proc. Natl. Acad. Sci.”, Vol. 80, 2059
~2062 pages (1983)]. This method is also suitable only for certain recombinant proteins and only insufficiently inhibits proteolysis. Furthermore, by increasing the copy number of the expression vector, expression can be increased by filling the protease with vast amounts of recombinant protein such that the action of the protease is exerted on only a relatively small percentage of the recombinant protein. was proposed. However, the disadvantage of this method is that the expression has to be increased enormously in only one or two generations and cannot be carried out for longer periods of time [see ref. ``Trends in Biotechnology''.
Another way to avoid proteolysis is to protect the recombinant protein already at the cDNA level by fusion with other proteins. For example, this method has been used for the peptide hormones insulin and somatostatin. In this case, β-galactosidase is used as the fusion component [Science, vol. 198, pp. 1056-1063 (1977)]. and has the disadvantage that it must first be separated and removed during purification, which means additional high costs.Previously proposed to avoid degradation of genetically engineered proteins Both of the methods involve PA (plasminogen activator), which is thus produced from a protein mixture.
seems not suitable for solving the problem. It is therefore an object of the present invention to disclose a method which does not have the disadvantages of the aforementioned methods for allowing complete and almost homogeneous expression of plasminogen activators in prokaryotes and avoiding degradation of the product. It is to be. By the way, when using expression vectors whose replication is not uncoupled or is only temporarily uncoupled from the replication of the chromosomes of the host cell, the formation of mRNA is therefore significantly reduced, or
In using vectors in which the promoter is regulated so that mRNA formation is similarly reduced to low levels,
It has been found, and the present invention is based on, that expression in prokaryotes produces single-chain plasminogen activators in high purity. Therefore, the method of the present invention for producing a plasminogen activator by expressing in a prokaryotic cell a cDNA encoding the plasminogen activator, which is present inserted into a vector suitable for the host cell, comprises Use vectors whose replication is uncoupled or only temporarily uncoupled from the replication of the host cell's chromosomes, and where no relaxing regulation occurs or It is characterized in that the culture is carried out under conditions in which the promoter of the vector is regulated in such a way that the mRNA formation of the uncoupled plasmid is no greater than under stringent control. The present invention is based on the surprising recognition that the formation of undesirable protein mixtures is due to the mixing of mRNA strands of different compositions caused and can be avoided by regulating the transcription rate to a correspondingly low rate. It is based on A stringently regulated vector does not increase its copy number by more than a factor of 10, especially a factor of 3, early in the growth of the host cell. It is referred to as a "low copy-plasmid" as opposed to the mildly regulated multi-copy plasmids commonly used in genetic engineering. Such vectors suitable for the method of the invention are It can be found by testing whether protein biosynthesis or DNA-protease is required for its proliferation. "J. Bacteriol.", Vol. 110, pp. 667-676 (1972)
Therefore, in mildly regulated vectors (e.g. ColE-type vectors, pBR322), plasmid replication can be uncoupled from chromosomal replication by adding inhibitors of protein biosynthesis such as chloramphenicol or spectinomycin. It is known that the vector copy number can be amplified to more than 100-1000. Mainly this property is the reason for the preferential use of these vectors for synthesis.
However, the stringently regulated vectors suitable for use according to the invention can be amplified by this method to a copy number of not more than a factor of 10, in particular not more than a factor of 3, but up to about 50 copies. Before the start of growth, the vector is present in a copy number of 1 to 50, especially 2 to 20, especially 2 to 10 copies per cell. If the starting copy number of the vector is in the lower range (10
or less), vectors with amplification factors at the upper end of that range (near 10) are better. If the starting copy number is already approximately 20-50, it is advantageous to make the amplification factor as low as possible. Particularly preferred is an amplification factor of 3 or less. Particularly suitable vectors are prokaryotic plasmid vectors, phage vectors, and combinations of both. A good plasmid vector that is austere is
pRSF1010, pKN402 and pACYC177 and derived therefrom, advantageously their characteristic sequences.
This is a plasmid possessed as Ori. plasmid
pKN402 and pACYC177 are particularly good.
pKN402 replication can be uncoupled from chromosome replication by increasing temperature. Therefore, the copy number can be increased in a simple way. However, at this time, a significant increase in Pa for non-single strands is observed.
Therefore, a temperature must be chosen for the culture at which no uncoupling occurs. Tables 1 and 2 show the copy number and single-stranded Pa formation as a percentage of the protein expressed by these vectors for several vectors that are either tightly or loosely regulated. Optionally, to reduce the formation of mRNA copies of the t-PA chromosome as desired when using vectors present in high copy numbers (high-copy-Vektoren), the promoter of the vector can be The aim is to control the formation (transcription) so that the mRNA formation is as low as that of the above-mentioned stringently regulated vector. Therefore, when using such a high copy vector with a strong promoter, the promoter is only weakly induced in the present invention, resulting in low transcription of the t-PA gene into mRNA. For this purpose, for example, host cells are used which form repressors which correspondingly inhibit the promoter of the high-copy vector, the inhibition being able to be suppressed by adding correspondingly low amounts of the inducer. For example, for this purpose it is necessary to produce no lac-permease and
E. coli mutant strains that can be transformed to overproduce the lac-repressor are preferred. Therefore, when used with high copy plasmids that have a strong lac-promoter, the promoter is strongly repressed and mRNA formation is suppressed. Therefore,
Addition of inducers achieves the desired low mRNA formation. A typical example of such a mutant strain is E.
coli K12 strain, DSM2102 or DSM2093. When this is transformed with plasmid pePa119 (DSM3691P), it becomes a lac-repressor overproducer. This is a high copy plasmid in which the t-PA gene is placed under the control of the lac-promoter for desired mRNA formation.
The necessary inducer, e.g. IPTG (isopropyl-
β-thiogalactoside) in correspondingly small amounts or
Lac-permease auxotrophic mutants can be used with the addition of lactose. In the latter case, the small dosage of the inducer lactose is achieved due to its extremely slow penetration into the cells. When using a promoter with lower efficiency than tac, a correspondingly higher copy number of the vector is tolerated when fully induced. Promoter strength can be chosen inversely proportional to copy number or the use of the promoter must be limited by a correspondingly low induction. The effect of not producing t-PA fragments, which is achieved by limiting the copy number of the expression vector, can also be achieved as follows: A high copy expression vector with a strong promoter (tac) is transduced into lac- When used in repressor overproducing strains (lac Iq ), t-PA synthesis is induced by the addition of inducers (IPTG, lactose, etc.). This is accomplished completely with amounts of 0.5-5 mmol of IPTG in the culture medium. In contrast, low-copy vectors with the same system (tac-promoter,
lac I q ), the formation of refractile bodies is observed with the addition of the same amount of IPTG, but no incorporation of t-PA fragments into the refractile bodies is observed. When lowering the IPTG loading to 0.01 mmol in high copy vectors, complete IPTG
In guiding, a pure refractor similar to the low-copy system is obtained. This effect is achieved with promoters worse than tac as well. The copy number of the vector can be increased to the extent that its promoter is less efficient than the tac-promoter. Thus, with a promoter efficiency of 1/10, the possible increase in plasmid copy number is a factor of 10 for the low copy plasmid used. The use of low copy systems is advantageous in both methods of the invention. An advantage of the low copy system with a strong promoter according to the invention is the ease of handling the system in fermentation. In this case, induction can be carried out at low cost. This is because the amount of inducing substance does not have to be strongly controlled by regulation, and the single bath system works as described. Moreover, this induction via the lac system takes precedence over regulation via the trp system. This is because by using lactose the growth of the cells can be controlled together, which is not so easily possible with the TRP-depletion technique (TRP-Verarmungstechnik: Genentech). Generally, the molecular weight of the vector is between 10 6 and 10 8 Daltons. The vector may advantageously contain regulatory and terminal sequences as well as selection marks in addition to the plasminogen activator cDNA, eg tPA-cDNA. In particular, the promoters tac- and trp-
It has been found that promoters are suitable.
Insertion of cDNA into this vector can be performed in any orientation.
【表】【table】
【表】
宿主細胞としては原核細胞が好適である。E.コ
リ、クレープジエラ・プノイモニエ（Klebsiella
pneumoniae）、プソイドモナス・エルギノーサ
（Pseudomonas aeruginosa）、プソイドモナス・
プチダ（Pseudomonas putida）及びバチルス・
スブチリス（Bacillus subtilis）が有利であるこ
とが明らかになつた。E.コリの例えば菌株
DSM3689並びにプソイドモナス・プチダの菌株
DSM2106が特に優れている。
宿主細胞は、使用されるベクターに相応して、
ベクターが宿主中で良好に複写されるように選択
すると有利である。好適なベクター／宿主の組合
せは当業者に公知である。その都度使用するプロ
モータに好適な調節体（リプレツサー）、例えば
lac−又はtac−プロモータに対してlac−リプレ
ツサーを含有する宿主を使用すると有利である。
本発明の範囲でプラスミノーゲンアクチベータ
としては、プラスミノーゲンを活性化する作用を
前記の意味で有するすべての蛋白質、殊にｔ−
PA及びプロウロキナーゼ並びにそれらの誘導体
である。
誘導体では、例えば１個又はそれ以上のドメイ
ンが部分的にもしくは全部欠損している天然誘導
体並びに人工的に製造された誘導体が挙げられ
る。この方法は、１個又は数個のアミノ酸が交換
されている誘導体にも好適である。
この方法は、天然ｔ−PA並びに公知の天然ｔ
−PA分子から誘導されている（第１図参照）が、
アミノ酸43〜72の１つで開始しかつアミノ酸179
〜113の１つで終結している完全ｔ−PA分子の連
鎖の断片が欠損しているｔ−PA誘導体を発現す
るのに特に好適である。例えばそれは西ドイツ国
特許出願第p3643158.3号に記載されている。この
命名法はPennica（前記文献）により記載された
命名法と同じである。
プラスミノーゲンアクチベータをコードする
cDNAのベクター中への挿入はここで詳説する必
要のない当業者に常用の方法により行なう。例え
ばtPA誘導体を製造する際に、完全tPA分子に比
べて該誘導体に欠けているアミノ酸配列をコード
する断片をｔ−PA−DNAから、相応する制限エ
ンドヌクレアーゼにより切断し、所望のtPA誘導
体をコードする断片を結合させ、このようにして
得られたtPA誘導体−cDNAを本発明により好適
なベクターを介して原核生物中に導入しかつそこ
で発現させて行なう。この場合、制限エンドヌク
レアーゼとしては特にcDNA配列の範囲bp315〜
bp726〔Pennica著、“Nature”、301巻、214〜221
頁（1983年）参照〕において切断するような酵素
が好適である。
制限エンドヌクレアーゼの組合せDraとMae
はアミノ酸45〜179の除去に、又はDdeと
Mnlはアミノ酸45〜171の除去に並ひにDde
はアミノ酸45〜174及びFnu4Hはアミノ酸52〜
168の除去に及びRsaはアミノ酸67〜162の除去
に特に好適である。
ベクター中での再結合に当つて、殊にリンカー
の使用下に公知方法を適用する。
引続いて、このベクターを原核生物中に公知方
法により導入しかつ例えばtPA誘導体のようなプ
ラスミノーゲンアクチベータを発現させる。
調製ベクターの製造に当つても、イントロンを
含有する完全DNAから出発することができる。
このためにDNA，例えばtPA−DNAをマニアチ
ス・ゲンバンク（Maniatis−Genbank）から単
離し、選択したベクター中に挿入する。
更に、PA産生細胞系（Pennica著、前記文献）
からmRNAを単離しかつ多量分別
（GroBenfraktionierung）により分離することが
できる。それからcDNA製造しかつ生成クローン
を試験することにより、PAのコード領域を含有
するクローンを見出すことができる。そのため
に、相応して構成されているオリゴヌクレオチド
で雑種形成するクローンを選択する。
本発明により、アミノ酸45〜179が欠損してい
るtPA誘導体を製造すると特に優れている。例え
ば、これはcDNAレベルで、制限エンドヌクレア
ーゼDra及びMaeで切断しかつ突出している
一本鎖末端をヌクレアーゼSlで消化することによ
り製造することができる。引続いて、リガーゼで
連結する。その後、本発明によるベクター系で原
核生物中で発現させる。真核生物中で発現させる
際にこのように生成したtPA誘導体は分子量約
43000Dを有する。
本発明により、実質的に純粋なプラスミノーゲ
ンアクチベータが主として不溶性不活性形（屈折
体）で得られ、これは分離後に可溶性の活性形に
変換することができる。
参考例１ （本発明で使用する発現プレスミドあ
るいは発現ベクターの調整について詳説する）
tPA用発現プラスミドの調製：
ａ pBR322Oriを有するプラスミドの使用下に
発現プラスミドの調製：
出発プラスミドとしてプラスミドpBT95
（DSM3611P、西ドイツ国特許第3545126号）を
使い、このプラスミドからプラスミドpePa98.1
を次のように製造した：このプラスミドを酵素
Bglで切断しかつヌクレアーゼS1で後処理す
る。更に酵素Scaで切断することにより、フラ
グメントａが調製的に得られ、これは約760個の
塩基対を有しかつtPAをコードするヌクレオチド
配列192〜952（Pennica著、前記文献）を含有す
る。フラグメントｂも同様にpBT95からSca及
びHindで切断することにより得られる；これ
によりtPAヌクレオチド配列953〜2165を含有す
る約1200の塩基対のフラグメントが得られる。パ
ートナーｃはリンカーとして合成されかつ次の配
列を含有する：
5′GAATTCTTATGTC3′
3′ GAATACAG5′
構成中のパートナーｄとしてはプラスミド
pKK223−３（DSM3694P）を酵素EcoR及び
Hindによりポリリンカーで切断する。パート
ナーａ〜ｄを連結する。連結反応バツチを常法に
よりT4−リガーゼで処理し、引続いてE.コリ細
胞（DSM 3689）中で形質転換させる。形質転換
細胞を培地上で50μｇ／ml−アンピシリンの添加
下に培養する。得られたクローンから、プラスミ
ドpePa98.1を担持するクローンを選択する。こ
のpePa98.1は出発プラスミドpBT95及びpKK223
−３とは、プラスミドpKK223−３のポリリンカ
ーにおいてEcoRとHind−切断部位との間に
tPAヌクレオチド配列192〜2165を正しい配列で
含有することにより異なつている。
ｂ 温度感受性複製調節性を有するtPA用発現プ
ラスミドの調製：
1a）で製造したプラスミドpePa98.1から、
Xhoで切断することにより約1.85kbのフラグメ
ントが得られ、これはtPAをコードしかつtacプ
ロモータを含有する。このフラグメント中には
tPAをコードするヌクレオチド配列192〜1809が
変化せずに含有されている。デソキシヌクレオシ
ドトリホスフエート４個全部の存在においてクレ
ノウ酵素で処理することにより、Xho切断部位
の5′−突出（u¨berha¨ngend）末端が満たされる。
複製と、それ故コピー数が温度調節により作用さ
れる受容プラスミドpREM2334（DSM3690P）を
酵素Claにより線状にしかつ5′−突出
（u¨berstehend）末端はデソキシヌクレオシドト
リホスフエート４個全部の存在においてクレノウ
酵素により満たされる。このように準備したパー
トナー分子を連結反応バツチ中で合する。E.コリ
細胞（DSM3689）中での形質転換後、細胞をク
ロラムフエニコール25μｇ／mlを含有する培地上
で培養する。温度は僅か30℃である。このように
して得られたクローンのうち、プラスミド
pePa100.1を含有するものを選択する。このプラ
スミドは出発プラスミドpREM2334とは、tPAを
コードするXhoフラグメントを含有する点で異
なつている。このことは、このクローンのプラス
ミドを単離しかつBam HIで切断することにより
検査する。その際にpePa100.1分子は約6.85及び
2.15kbである２つのフラグメントに切断される。
ｃ E.コリ中でもプソイドモナス・プチダ中でも
使用することのできるtPA用発現ベクターの調
製：
クレノウ酵素で処理した例1b）に記載のXho
フラグメントを再度使用する。受容プラスミドと
しては、Hpaで線状になるプラスミド
pREM3061（DSM3692P）を使う。両方のパート
ナー分子を一緒に連結反応バツチ中でT4−リガ
ーゼで処理する。E.コリ細胞（DSM3689）中で
形質転換しかつ良好に形質転換された細胞をカナ
マイシン25μｇ／mlを含有する培地で培養するこ
とによりクローンが得られた。これらのクローン
からプラスミドpePa107.8を含有する細胞を選択
する。このプラスミドは出発ベクターpREM3061
とは、記載のXhoフラグメントを含有するので
異なつている。プラスミドを細胞から取得しかつ
酵素BstEにより分析的に切断する。その際に
10.8及び1.3kbのおおよその大きさの２つのフラ
グメントが得られる。このプラスミドは菌株プソ
イドモナス・ブチダの細胞中で形質転換すること
により導入することができる。
そのために、菌株プソイドモナス・プチド
（DSM2106）の細胞を初めにプラスミドpePa119
（DSM3691P）で形質転換しかつカナマイシン
25μｇ／mlを含有する培地上で選択する。いまや
このプソイドモナス・プチダ細胞はlac−リプレ
ツサーを多量に産生する状態のプラスミドを含有
する。
pePa119を含有するプソイドモナス・プチダ細
胞をプラスミドpePa107.8で形質転換する。この
形質転換体をストレプトマイシン50μｇ／mlを含
有する培地上で選択し、その後プラスミド
pePa119並びにpePa107.8を含有する。プラスミ
ドpePa119の存在はlac−リプレツサー蛋白質の
生成により細胞中でのtPAの生成を抑制する。こ
の蛋白質はtac−プロモータからの転写をプソイ
ドモナス・プチダ中でも抑制し得る。
ｄ PACYC177Oriを含有するtPA用発現プラス
ミドの調製
クレノウ酵素で処理した約1.85kbのXhoフラ
グメントを使用する（例1b）から）。これをフラ
グメントａと表わす。フラグメントｂはpKK223
−３から調製し、つまりBam Ｈで切断しかつ
S1ヌクレアーゼで処理する。引続いて酵素Pvu
で後切断し、このようにして約1.05kbのフラグメ
ントが得られ、これは転写読み終り暗号
（Transkriptionsterminator）及びβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子の5′−ポーシヨン（Portion）を含有
する。フラグメントｃはプラスミドpACYC177
（DSM3693P）をBam Ｈで切断しかつ引続い
てS1ヌクレアーゼ消化により得られる。このバ
ツチを部分的にPvuで後切断する。調製的に約
2.9kbのフラグメントが得られる。フラグメント
ａ，ｂ及びｃを連結反応バツチ中で合する。T4
−リガーゼで処理した後で、この連結反応バツチ
をE.コリ（DSM3689）の細胞中で形質転換する。
引続いてこの細胞をカナマイシン25μｇ／ml及び
アンピシリン50μｇ／mlを含有する培地上に塗布
する。生成クローンから、プラスミドpePaを担
持するものを選択する。これは出発プラスミド
PACYC177とは、tPAをコードする192〜1809の
配列を変らずに含有しかつ付加的にプラスミド
pKK223−３からの転写読み終り暗号を含有する
点で異なつている。プラスミドを単離しかつ酵素
Bst Ｅで分析的に切断する。大きさ約3.9及び
1.9kbの２つのフラグメントが得られる。
例 ２
原核細胞中でのtPA蛋白質の発現
ａ 1a），ｂ），ｃ）及びｄ）で製造したプラス
ミドをlacq−プラスミドを含有するE.コリ
（DSM3689）中で形質転換する。形質転換体
を、1a），ｃ）及びｄ）からのプラスミドに関
してはアンピシリン50μｇ／mlを含有しあるい
は1b）からのプラスミドに関してはクロラム
フエニコール25μｇ／mlを含有する培地で選択
する。プラスミドpePa98.1、pePa100.1、
pePa107.8又はpePa133を含有する細胞を培養
ブイヨン中でOD550on＝0.4まで通気下に培養
し、かつその後IPTG100ミリモルの添加下に
誘導する。恒温保持はプラスミドpePa98.1、
pePa107.8及びpePa133では37℃で及びプラス
ミドpePa100.1では30℃で行なう。IPDGの存
在において通気下に４時間恒温保持した後で、
細胞を採取しかつ砕解する。そのために15分間
氷上でリゾチーム0.5μｇ／mlで処理する（細胞
濃度OD10／ml）。トリス緩衝液PH8.6を使用す
る（EDTA100mmモル／及びNaCl100ミリモ
ル／を含有するトリス−HCl0.1モル／）。
その後、細胞を超音波処理により砕解する。こ
のようにして得られた懸濁液を10分間20000ｇ
で遠心しかつ上澄みを廃棄する。沈積物はtPA
を不活性形で含有する。これは西ドイツ国特許
3537708号に記載の方法により溶解しかつ回復
させることができる。しかしまたペレツトを
SDS1％及びメルカプトエタノール100ミリモ
ル／を添加することにより溶解しかつSDS−
ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分
離することもできる。この電気泳動の後で蛋白
質をクマシーブルー（Coomassieblue）により
着色することにより蛋白質バンドを可視化する
ことができる。主に、プラスミドpePa100.1、
pePa107.8又はpePa133を有する細胞からの抽
出液はグリコシル化されていないtPA−蛋白質
の大きさに相当する約57000ダルトンの分子量
の蛋白質１種を含有する。プラスミド
pePa98.1を有する細胞からの抽出液は主に大
きさ32000〜34000ダルトンの物質と僅少量の
57000ダルトンを含有する。同定した蛋白質バ
ンドは、ウエスタン・ブロート法（Western−
blot−Verfahren）によりヤギからの抗tPA−
PAK−接合体で等価的に免疫学的に検出する
ことができる。
ｂ 例1c）によりプラスミドpePa119及び
pePa107.8で形質転換したプソイドモナス・プチ
ダ細胞（DSM2106）を30℃で培養ブイヨン中で
OD550on＝0.4まで通気下に培養し、その後
IPTG10ミリモルの添加下に誘導する。IPTGの
存在において30℃で通気下に４時間恒温保持した
後で細胞を採取しかつ砕解する。更に例2a）に
記載したように行なう。細胞抽出液のゲル電気泳
動及びクマシーブルーによる蛋白質の染色後に、
主に抽出液中に分子量約57000ダルトンの蛋白質
が認められる。この蛋白質はウエスタン・ブロー
ト法によりヤギからの抗−tPA−PAK−接合体
でtPA−蛋白質として免疫学的に検出可能であ
る。57000ダルトンより小さい蛋白質は一般に免
疫学的に記載の方法でtPAとして検出することは
できない。
例 ３
高いコピー数及び低いコピー数を有するベクタ
ープラスミドのtPA発現の比較
プラスミドpePa100.1を含有するE.コリ菌株
（DSM3689）を使用する。この細胞を培養ブイヨ
ン中OD550on＝0.4まで通気下に30℃で培養する。
IPTG10ミリモルの添加により誘導する。このバ
ツチを３個の同一容量部に分ける。それぞれ1/3
ずつを30℃、37℃又は42℃で４時間IPTGの存在
において更に恒温保持する。引続いて、細胞を採
取しかつ例２に記載したように砕解する。抽出液
のSDS−ゲル電気泳動後、tPA−蛋白質バンドを
クマシー・ブルーで可視化することができる。30
℃バツチからの抽出液は主に分子量57000ダルト
ンの蛋白質を含有する。37℃及び42℃のバツチか
らの抽出液は大きさ57000ダルトンの蛋白質を僅
少割合で含有するだけであり、大部分は32000〜
34000ダルトンである。これらの蛋白質バンドは
ウエスタン・ブロート法によりヤギからの抗−
tPA−PAK−接合体で等価であることを免疫学
的に証明することができる。
プラスミドpePa100.1は高い温度で強く複製さ
れ、これは細胞中でのプラスミドのより高いコピ
ー数に案内する。この高いコピー数は、大きさ
57000ダルトンの不活性tPA−蛋白質を取得する
際に不利に作用する。
例 ４
原核生物からtPA−蛋白質の復元
例２及び３により得られたtPA−蛋白質を含有
する細胞フラクシヨンを西ドイツ国特許第
3537708号に記載の方法により溶解しかつ回復さ
せることができる。その際に、30℃で培養させた
pePa107.8、pePa133又はpePa100.1を含有する細
胞の抽出液から、37℃又は42℃で培養させた
pePa98.1あるいはpePa100.1を含有する細胞より
も約10倍活性のtPAが得られる。得られた活性
tPAはそれぞれフイブリンにより刺激性である。
一般に、その刺激性は10倍より大きい。
例 ５
tPAの半減期を決定するドメインの欠失
（Deletion）
ａ tPA−突然変異蛋白質−遺伝子の調製
出発物質としてプラスミドpePa98.1を使用す
る。このプラスミドから、Xho切断を介して
tac−プロモータを有するtPA−コードのフラグ
メントが得られる。このフラグメントは約1.85kb
の大きさでありかつ突出末端で、デソキシヌクレ
オシドトリホスフエート４個すべての存在におい
てクレノウ酵素で処理することにより完全に満た
される。工程Ａでは、このフラグメントを酵素
Draで切断しかつ突出末端をヌクレアーゼS1で
消化させる。ゲル電気泳動により塩基対約370の
大きさのフラグメントが得られる。工程Ｂでは同
じXho出発フラグメントを酵素Maeで切断し
かつ同じようにS1で後消化させる。引続いて付
加的にこのバツチを酵素Sacで処理する。ゲル
電気泳動によりこのバツチから塩基対約700の大
きさのフラグメントが単離する。バツチＣではベ
クタープラスミドpePa98.1を酵素Bam Ｈで切
断しかつ突出末端をデソキシヌクレオシドトリホ
スフエート４個全部の存在においてクレノウ酵素
により満たしかつ酵素Sacで後切断する。引続
いて、ゲル電気泳動により最大フラグメントがこ
のバツチから得られる。連結反応バツチ中でバツ
チＡ，Ｂ及びＣから得られたフラグメントを一緒
にしかつDNA−リガーゼの添加下に連結させる。
連結混合物をlacq−プラスミドを含有するE.
コリDSM3689中で形質転換させかつ生成した形
質転換体をアンピシリン50μｇ／mlを含有する培
地上で選択する。このようにして得られたクロー
ンから、所望のプラスミドpePa129を含有するも
のを選択し、このプラスミドはtPA cDNA−配
列301〜726の間のDNA配列をもはや含有してい
ない点で出発プラスミドpePa98.1と異なつてい
る。第１図はこのようにして得られた突然変異蛋
白質遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
ｂ E.コリ中で発現させるための突然変異蛋白質
用の発現ベクターの調製
ａ）により製造したプラスミドpePa129から、
制限酵素Bam Ｈ及びPvuによる消化でtPA
をコードするフラグメントが得られる。プラスミ
ドpACYC177（DSM3693P）も同様にBam Ｈ
及びPvuで切断する。両方のフラグメントを連結
させかつlacq−プラスミドを含有するE.コリ−
DSM3689中で形質転換する。カナマイシン及び
アンピシリンをそれぞれ25μｇ／mlもしくは50μ
ｇ／ml含有する培地で選択することにより形質転
換体が得られ、そのうちのプラスミドpePa137を
含有するものを選択する。これは、pePa129から
の突然変異蛋白質遺伝子フラグメントとプラスミ
ドpACYC177の配列とをそれぞれ完全に含有す
るという点で出発ベクターとは異なつている。第
２図はプラスミド137の制限切断部位地図を示す。
ｃ プソイドモナス・プチド中で発現させるため
の突然変異蛋白質用の発現ベクターの調製
プソイドモナス・プチダのベクターとしては、
付加的にpACYC177からのカナマイシン耐性遺
伝子を含有するプラスミドpRSF1010の誘導体を
使用する。このベクターはpREM3061
（DSM3692P）と表わされる。このプラスミドは
制限酵素Hpaを使うことにより線状化されてい
る。
ａ）により製造したベクターpePa129からXho
切断により約1.45kbのフラグメントが得られ、
これはtac−プロモータ及び完全な突然変異蛋白
質遺伝子配列を含有する。デオキシヌクレオシド
トリホスフエート４個全部の存在においてクレノ
ウ・フラグメントで処理することによりXho−
切断部位は完全に満たされる。このように処理し
たフラグメントを線状ベクターpREM3061と連結
しかつE.コリ細胞（DSM3689）中で形質転換さ
せる。この形質転換体をカナマイシン25μｇ／ml
を含有する培地上で選択する。プラスミド
pePa143を含有する形質転換体を選択する。この
プラスミド143は、tac−プロモータを有する完全
突然変異蛋白質遺伝子配列を含有する点で出発ベ
クターpREM3061とは異なつている。このプラス
ミドを単離しかつ形質転換により菌株プソイドモ
ナス・プチダDSM2106の細胞中に挿入する。形
質転換体をカナマイシン25μｇ／mlを含有する培
地上で選択し、引続いて分析する。これはプラス
ミド143を含有する。付加的に、この形質転換体
細胞中に同様に形質転換により、pePa143と適合
性でありかつlacq−遺伝子を含有するプラスミ
ドpePa119（DSM3691P）を導入する。このプラ
スミドはプラスミドRP4の誘導体である。このプ
ラスミドの存在は、lac−リプレツサー蛋白質の
産生により該細胞中での突然変異蛋白質の産生を
抑制する。これは、tac−プロモータからの転写
を抑制することができる。
例 ６
無傷のtPAを大腸菌中で強力なプロモータを有
するハイコピーベクターにより発現
突然変異をlac−遺伝子中に有しかつlac−ペル
ミアーゼを産生することのできないE.コリＫ−12
の誘導体を使用する。菌株はED8654（DSM2102）
又はC600（DSM2093）である。この菌株から変
異株を製造することができ、この変異株はそれを
pePa119（DSM3691P）で形質転換することによ
りlac−リプレツサーを過剰生産する（1a参照）。
このようにして得られた細菌中でプラスミド
pePa98.1を形質転換すると（1a参照）、lac−リプ
レツサーを過剰生産しかつtPAを合成する細菌が
得られる。
この細菌を2aに記載されているように培養ブ
イヨン中、37℃で通気下に培養する。
ａ OD550＝0.4でラクトース0.2％を培地に添加
しかつ恒温保持を４時間継続する。lac−ペル
ミアーゼが欠損することによりラクトースは細
胞中に緩慢に吸収されるに過ぎない。引続い
て、例2aに記載されているように、細胞を採
取し、砕解し、tPA−フラクシヨンを取得しか
つSDS−ポリアクリルアミドゲル中で分析す
る。
定性的かつ定量的に、例２の完全誘導されたロ
ウコピーベクターからの抽出液と同じ結果がtPA
生産に関して得られる。
ｂ 同じように、この時点で僅少量のIPTGの添
加によりtPA発現に関して相応して低い誘導速
度が達成される。IPTG0.05〜５ミリモル及び
それ以上の量で完全な誘導が達成され、0.002
〜0.01ミリモルの量で相応して低い誘導が達成
される。この低い誘導は、例２からのロウコピ
ーベクターの完全誘導と定性的かつ定量的に同
じ結果をもたらす。tacとしてより低い効率の
プロモータを使用する際に、完全誘導ではベク
ターの相応して高いコピー数が可能である。プ
ロモータの強さはコピー数に反比例して選択す
るか又はプロモータの使用を相応して低い誘導
により制限すべきである。
tPA切片が産生されないという発現ベクターの
コピー数の制限による作用効果は、次のようにし
て達成することもできる：
強力なプロモータ（tac）を有するハイコピー
発現ベクターをlac−リプレツサー過剰生産（lac
q）する菌株中で使用する際に、誘導物質
（IPTG、ラクトース等）の添加によりtPA合成
を誘導しなければならない。これは培地中の
IPTG0.5〜５ミリモルの量で完全に達成される。
これに対してロウコピーベクターを同じ系（tac
−プロモータ、lacIq）中で使用する場合、屈折
体の形成が認められるが、同じIPTG添加量で
tPA切片の屈折体中へのとり込みは認められな
い。IPTG添加量をハイコピーベクターで0.01ミ
リモルに低める場合、完全IPTG誘導でロウコピ
ー系と同じ純粋な屈折体が得られる。この効果
は、tacよりも不良なプロモータを用いても達成
される。ベクターのコピー数は、プロモータが
tac−プロモータよりも低い効率の分だけ高める
ことができる。即ち1/10のプロモータ効率で可能
なプラスミドコピー数の上昇は使用したロウコピ
ープラスミドに対して係数10である。
本発明による強力なプロモータを有するロウコ
ピー系の利点は醗酵における系の取扱いの容易さ
にある。この際に、誘導を実施するのに経費が少
ない。それというのも誘導物質の量を調節により
厳しく制御する必要はなく、記載したように単槽
系が機能するからである。lac系を介するこの誘
導はtyp系を介する制御よりも好ましい。それと
いうのもラクトースの使用により細胞の成長を一
緒に制御することができるからであるり、これは
typ−欠乏技術（Verarmungs−technik：
Genentech）ではあまり簡単ではない。[Table] Prokaryotic cells are preferred as host cells. E. coli, Klebsiella
pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas putida and Bacillus putida
Bacillus subtilis has proven advantageous. For example, strains of E. coli
DSM3689 and Pseudomonas putida strains
DSM2106 is particularly good. Depending on the vector used, the host cell is
It is advantageous if the vector is selected for good replication in the host. Suitable vector/host combinations are known to those skilled in the art. Regulators (repressors) suitable for the respective promoters, e.g.
It is advantageous to use a host containing a lac-repressor for the lac- or tac-promoter. Within the scope of the present invention, plasminogen activators include all proteins, in particular t-
PA and prourokinase and their derivatives. Derivatives include, for example, natural derivatives in which one or more domains are partially or completely deleted, as well as artificially produced derivatives. This method is also suitable for derivatives in which one or several amino acids have been replaced. This method uses natural t-PA as well as known natural t-PA.
- derived from PA molecules (see Figure 1),
Starts with one of amino acids 43-72 and starts with amino acid 179
It is particularly suitable for expressing t-PA derivatives lacking a linkage fragment of a complete t-PA molecule terminating in one of ~113. For example, it is described in West German patent application no. p3643158.3. This nomenclature is the same as that described by Pennica (cited above). encodes a plasminogen activator
Insertion of cDNA into a vector is carried out by methods commonly used by those skilled in the art, which do not need to be detailed here. For example, when producing a tPA derivative, a fragment encoding an amino acid sequence lacking in the derivative compared to the complete tPA molecule is cleaved from the t-PA-DNA by the corresponding restriction endonuclease, encoding the desired tPA derivative. The tPA derivative-cDNA thus obtained is introduced into prokaryotes via a suitable vector according to the invention and expressed therein. In this case, the restriction endonuclease is particularly suitable for cDNA sequences in the range bp315 to
bp726 [Pennica, “Nature”, vol. 301, 214-221
(1983)] are suitable. Restriction endonuclease combination Dra and Mae
for the removal of amino acids 45-179 or with Dde
Mnl removes amino acids 45-171 as well as Dde
is amino acid 45-174 and Fnu4H is amino acid 52-
168 and Rsa is particularly suitable for removing amino acids 67-162. For recombination in the vector, known methods are applied, in particular using linkers. Subsequently, this vector is introduced into prokaryotes by known methods and a plasminogen activator, such as a tPA derivative, is expressed. In the production of preparative vectors, it is also possible to start from complete DNA containing introns.
For this purpose, DNA, for example tPA-DNA, is isolated from Maniatis-Genbank and inserted into the chosen vector. Additionally, PA-producing cell lines (Pennica, supra)
mRNA can be isolated from and separated by mass fractionation. Clones containing the coding region of PA can then be found by producing cDNA and testing the resulting clones. To this end, clones are selected that hybridize with correspondingly configured oligonucleotides. It is particularly advantageous to produce tPA derivatives lacking amino acids 45 to 179 according to the invention. For example, it can be produced at the cDNA level by cutting with the restriction endonucleases Dra and Mae and digesting the overhanging single-stranded ends with the nuclease Sl. Subsequently, ligation is performed using ligase. It is then expressed in prokaryotes with the vector system according to the invention. When expressed in eukaryotes, the tPA derivatives thus produced have molecular weights of approx.
Has 43000D. According to the invention, a substantially pure plasminogen activator is obtained primarily in an insoluble inactive form (refractor), which can be converted into a soluble active form after separation. Reference Example 1 (Details on the preparation of the expression plesmid or expression vector used in the present invention) Preparation of an expression plasmid for tPA: a Preparation of an expression plasmid using a plasmid having pBR322Ori: Plasmid pBT95 as a starting plasmid
(DSM3611P, West German Patent No. 3545126) from this plasmid to plasmid pePa98.1.
was produced as follows: This plasmid was
Cut with Bgl and work up with nuclease S1. Further cleavage with the enzyme Sca preparatively yields fragment a, which has approximately 760 base pairs and contains the nucleotide sequence 192-952 encoding tPA (Pennica, supra). Fragment b is similarly obtained from pBT95 by cutting with Sca and Hind; this yields a fragment of about 1200 base pairs containing the tPA nucleotide sequence 953-2165. Partner c is synthesized as a linker and contains the following sequence: 5'GAATTCTTATGTC3'3'GAATACAG5' As partner d in the construction, the plasmid
pKK223-3 (DSM3694P) with enzyme EcoR and
Cleave at the polylinker with Hind. Connect partners a to d. The ligation batches are treated with T4-ligase in a conventional manner and subsequently transformed into E. coli cells (DSM 3689). The transformed cells are cultured on medium with the addition of 50 μg/ml ampicillin. From the obtained clones, select one carrying plasmid pePa98.1. This pePa98.1 is the starting plasmid pBT95 and pKK223
-3 is between EcoR and Hind-cleavage site in the polylinker of plasmid pKK223-3.
It differs by containing the tPA nucleotide sequence 192-2165 in the correct sequence. b. Preparation of an expression plasmid for tPA with temperature-sensitive replication control: From the plasmid pePa98.1 produced in 1a),
Cutting with Xho yields a fragment of approximately 1.85 kb, which encodes tPA and contains the tac promoter. In this fragment
The nucleotide sequence 192-1809 encoding tPA is contained unchanged. Treatment with Klenow enzyme in the presence of all four desoxynucleoside triphosphates fills in the 5'-end of the Xho cleavage site.
The recipient plasmid pREM2334 (DSM3690P), in which replication and therefore copy number is affected by temperature regulation, is linearized with the enzyme Cla and the 5'-overhanging (u¨berstehend) ends are affected by the presence of all four desoxynucleoside triphosphates. filled with Klenow enzyme. The partner molecules thus prepared are combined in a ligation reaction batch. After transformation in E. coli cells (DSM3689), the cells are cultured on medium containing 25 μg/ml chloramphenicol. The temperature is only 30℃. Among the clones obtained in this way, plasmid
Select one containing pePa100.1. This plasmid differs from the starting plasmid pREM2334 in that it contains an Xho fragment encoding tPA. This is tested by isolating the plasmid of this clone and cutting with Bam HI. At that time, the pePa100.1 molecule is approximately 6.85 and
It is cut into two fragments of 2.15kb. c Preparation of an expression vector for tPA that can be used both in E. coli and in Pseudomonas putida: Xho as described in Example 1b) treated with Klenow enzyme
Reuse the fragment. As a recipient plasmid, a plasmid that becomes linear in Hpa
Use pREM3061 (DSM3692P). Both partner molecules are treated together with T4-ligase in a ligation batch. Clones were obtained by transformation in E. coli cells (DSM3689) and culturing the successfully transformed cells in medium containing 25 μg/ml of kanamycin. Select cells containing plasmid pePa107.8 from these clones. This plasmid is the starting vector pREM3061
It is different from the above because it contains the described Xho fragment. The plasmid is obtained from the cells and cut analytically with the enzyme BstE. At that time
Two fragments with approximate sizes of 10.8 and 1.3 kb are obtained. This plasmid can be introduced by transformation in cells of the strain Pseudomonas butida. To this end, cells of the bacterial strain Pseudomonas putido (DSM2106) were first incubated with the plasmid pePa119.
(DSM3691P) and kanamycin
Select on medium containing 25 μg/ml. This Pseudomonas putida cell now contains a plasmid capable of producing large quantities of the lac-repressor. Pseudomonas putida cells containing pePa119 are transformed with plasmid pePa107.8. The transformants were selected on medium containing 50 μg/ml streptomycin and then the plasmid
Contains pePa119 and pePa107.8. The presence of plasmid pePa119 suppresses the production of tPA in cells through the production of lac-repressor protein. This protein can also repress transcription from the tac-promoter in Pseudomonas putida. d Preparation of an expression plasmid for tPA containing PACYC177Ori An approximately 1.85 kb Xho fragment treated with Klenow enzyme is used (from Example 1b)). This is denoted as fragment a. Fragment b is pKK223
-3, cleaved with Bam H and
Treat with S1 nuclease. Subsequently enzyme Pvu
A fragment of about 1.05 kb was thus obtained, which contains the transcription terminator and the 5'-portion of the β-lactamase gene. Fragment c is plasmid pACYC177
(DSM3693P) is obtained by cutting with Bam H and subsequent digestion with S1 nuclease. This batch is partially post-cut with Pvu. Preparatively approx.
A 2.9kb fragment is obtained. Fragments a, b and c are combined in a ligation batch. T4
- After treatment with ligase, the ligation batch is transformed in E. coli (DSM3689) cells.
The cells are subsequently plated on a medium containing 25 μg/ml kanamycin and 50 μg/ml ampicillin. From the resulting clones, select one carrying plasmid pePa. This is the starting plasmid
PACYC177 is a plasmid that contains the sequence 192-1809 encoding tPA unchanged and additionally
It differs in that it contains the transcription end code from pKK223-3. Isolate the plasmid and enzymatically
Analytically cut with Bst E. Size: approx. 3.9 and
Two fragments of 1.9kb are obtained. Example 2 Expression of tPA protein in prokaryotic cells a The plasmids prepared in 1a), b), c) and d) are transformed into E. coli (DSM3689) containing the lac q -plasmid. Transformants are selected on medium containing 50 μg/ml ampicillin for the plasmids from 1a), c) and d) or 25 μg/ml chloramphenicol for the plasmid from 1b). Plasmid pePa98.1, pePa100.1,
Cells containing pePa107.8 or pePa133 are cultured in culture broth under aeration until OD 550on =0.4 and then induced with the addition of 100 mmol of IPTG. For constant temperature maintenance, use plasmid pePa98.1,
For pePa107.8 and pePa133 it is carried out at 37°C and for plasmid pePa100.1 at 30°C. After incubation for 4 hours under ventilation in the presence of IPDG,
Harvest and disrupt cells. For this purpose, the cells are treated with 0.5 μg/ml of lysozyme for 15 minutes on ice (cell concentration OD10/ml). A Tris buffer PH 8.6 is used (0.1 mol/Tris-HCl containing 100 mmol/EDTA/100 mmol/NaCl).
Thereafter, the cells are disrupted by ultrasonication. 20,000 g of the suspension thus obtained for 10 minutes.
Centrifuge and discard the supernatant. The deposit is tPA
Contains in inactive form. This is a West German patent
It can be dissolved and recovered by the method described in No. 3537708. But also pellets
Dissolve and SDS- by adding 1% SDS and 100 mmol/mercaptoethanol.
Separation can also be performed by electrophoresis in polyacrylamide gels. After this electrophoresis, protein bands can be visualized by staining the proteins with Coomassie blue. Mainly, plasmid pePa100.1,
Extracts from cells containing pePa107.8 or pePa133 contain one protein with a molecular weight of approximately 57,000 daltons, which corresponds to the size of unglycosylated tPA-protein. plasmid
Extracts from cells with pePa98.1 mainly contain substances with a size of 32,000 to 34,000 Daltons and a small amount of
Contains 57,000 Daltons. The identified protein bands were analyzed by Western blotting.
anti-tPA− from goats by blot−Verfahren).
It can be equivalently detected immunologically with PAK-conjugates. b According to example 1c) plasmid pePa119 and
Pseudomonas putida cells (DSM2106) transformed with pePa107.8 were grown in culture broth at 30°C.
Cultivate under aeration until OD 550on = 0.4, then
Induced upon addition of 10 mmol of IPTG. Cells are harvested and disrupted after incubation for 4 hours under aeration at 30° C. in the presence of IPTG. Proceed further as described in Example 2a). After gel electrophoresis of cell extracts and protein staining with Coomassie blue,
Proteins with a molecular weight of approximately 57,000 daltons are mainly observed in the extract. This protein can be immunologically detected as tPA-protein in anti-tPA-PAK-conjugates from goats by Western blotting. Proteins smaller than 57,000 daltons generally cannot be detected as tPA by immunological methods described. Example 3 Comparison of tPA expression of vector plasmids with high and low copy numbers An E. coli strain (DSM3689) containing plasmid pePa100.1 is used. The cells are cultured in culture broth at 30° C. with ventilation until OD 550on =0.4.
Induction by addition of 10 mmol of IPTG. Divide this batch into three equal volume parts. 1/3 each
The aliquots are further incubated at 30°C, 37°C or 42°C for 4 hours in the presence of IPTG. Subsequently, the cells are harvested and disrupted as described in Example 2. After SDS-gel electrophoresis of the extract, tPA-protein bands can be visualized with Coomassie blue. 30
The extract from the °C batch mainly contains proteins with a molecular weight of 57,000 Daltons. The extracts from the batches at 37°C and 42°C contain only a small proportion of proteins with a size of 57,000 Daltons, with the majority being between 32,000 and 32,000 Daltons.
It is 34,000 Daltons. These protein bands were detected by Western blotting using goat anti-
Equivalence can be demonstrated immunologically in the tPA-PAK-conjugate. Plasmid pePa100.1 replicates strongly at high temperatures, which leads to a higher copy number of the plasmid in the cell. This high copy number is due to the size
This has a disadvantageous effect on obtaining an inactive tPA-protein of 57,000 Daltons. Example 4 Restoration of tPA-protein from prokaryotes The cell fraction containing tPA-protein obtained in Examples 2 and 3 was
It can be dissolved and recovered by the method described in No. 3537708. At that time, it was cultured at 30°C.
Cultured at 37°C or 42°C from extracts of cells containing pePa107.8, pePa133 or pePa100.1
Approximately 10 times more active tPA is obtained than cells containing pePa98.1 or pePa100.1. Activity obtained
tPA is more irritating to fibrin, respectively.
Generally, its irritating properties are 10 times greater. Example 5 Deletion of the domain determining the half-life of tPA a Preparation of the tPA-mutant protein-gene Plasmid pePa98.1 is used as starting material. From this plasmid, via Xho cleavage
A fragment of the tPA-code with the tac-promoter is obtained. This fragment is approximately 1.85kb
of size and with overhanging ends, it is completely filled by treatment with Klenow enzyme in the presence of all four desoxynucleoside triphosphates. In step A, this fragment is enzymatically
Cut with Dra and digest the overhanging ends with nuclease S1. Gel electrophoresis yields a fragment approximately 370 base pairs in size. In step B, the same Xho starting fragment is cut with the enzyme Mae and post-digested with S1 in the same way. Subsequently, the batch is additionally treated with the enzyme Sac. A fragment approximately 700 base pairs in size is isolated from this batch by gel electrophoresis. In batch C, the vector plasmid pePa98.1 is cut with the enzyme Bam H and the overhanging ends are filled with the Klenow enzyme in the presence of all four desoxynucleoside triphosphates and post-cleaved with the enzyme Sac. Subsequently, the largest fragment is obtained from this batch by gel electrophoresis. The fragments obtained from batches A, B and C are combined in a ligation batch and ligated with the addition of DNA-ligase. The ligation mixture was transferred to E. coli containing the lac q -plasmid.
E. coli DSM3689 and the resulting transformants are selected on medium containing 50 μg/ml ampicillin. From the clones obtained in this way, we selected the one containing the desired plasmid pePa129 and the starting plasmid pePa98.1 in that this plasmid no longer contained the DNA sequence between tPA cDNA-sequences 301 and 726. It's different. FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the mutant protein gene thus obtained. b Preparation of an expression vector for the mutated protein for expression in E. coli From the plasmid pePa129 produced according to a),
tPA by digestion with restriction enzymes Bam H and Pvu.
You will get a fragment that codes. Plasmid pACYC177 (DSM3693P) is also Bam H
and cut with Pvu. E. coli with both fragments ligated and containing the lac q -plasmid.
Transform in DSM3689. Kanamycin and ampicillin at 25μg/ml or 50μ, respectively.
Transformants are obtained by selection on a medium containing g/ml, and those containing plasmid pePa137 are selected. It differs from the starting vector in that it completely contains the mutant protein gene fragment from pePa129 and the sequences of plasmid pACYC177, respectively. Figure 2 shows the restriction cleavage site map of plasmid 137. c. Preparation of expression vectors for mutated proteins for expression in Pseudomonas putida Vectors for Pseudomonas putida include:
A derivative of plasmid pRSF1010 is used which additionally contains the kanamycin resistance gene from pACYC177. This vector is pREM3061
(DSM3692P). This plasmid has been linearized using the restriction enzyme Hpa. Xho from vector pePa129 produced by a)
The cleavage yielded a fragment of approximately 1.45 kb,
It contains the tac-promoter and the complete mutant protein gene sequence. Xho-
The cutting site is completely filled. The fragment thus treated is ligated with the linear vector pREM3061 and transformed into E. coli cells (DSM3689). This transformant was treated with kanamycin at 25 μg/ml.
Select on medium containing. plasmid
Select transformants containing pePa143. This plasmid 143 differs from the starting vector pREM3061 in that it contains the complete mutant protein gene sequence with the tac-promoter. This plasmid is isolated and inserted into cells of the strain Pseudomonas putida DSM2106 by transformation. Transformants are selected on medium containing 25 μg/ml kanamycin and subsequently analyzed. This contains plasmid 143. Additionally, the plasmid pePa119 (DSM3691P), which is compatible with pePa143 and contains the lac q -gene, is also introduced into the transformant cells by transformation. This plasmid is a derivative of plasmid RP4. The presence of this plasmid suppresses the production of the mutant protein in the cell through the production of lac-repressor protein. This can repress transcription from the tac-promoter. Example 6 Expression of intact tPA by a high copy vector with a strong promoter in E. coli K-12 with a mutation in the lac- gene and unable to produce lac-permease
using a derivative of The strain is ED8654 (DSM2102)
Or C600 (DSM2093). A mutant strain can be produced from this strain, and this mutant strain
Overproduce the lac-repressor by transforming with pePa119 (DSM3691P) (see 1a).
In the bacteria thus obtained, the plasmid
Transformation of pePa98.1 (see 1a) results in bacteria that overproduce the lac-repressor and synthesize tPA. The bacteria are cultured in culture broth as described in 2a at 37°C with ventilation. a Lactose 0.2% is added to the medium at OD 550 =0.4 and incubation is continued for 4 hours. Due to the lack of lac-permease, lactose is only slowly absorbed into the cells. Subsequently, the cells are harvested, disrupted, the tPA fraction is obtained and analyzed in an SDS-polyacrylamide gel as described in Example 2a. Qualitatively and quantitatively, the same results as the extract from the fully induced low copy vector of Example 2 were obtained with tPA
obtained regarding production. b Similarly, at this point a correspondingly low rate of induction of tPA expression is achieved by addition of a small amount of IPTG. Complete induction was achieved at doses of IPTG 0.05-5 mmol and higher;
A correspondingly low induction is achieved with amounts of ~0.01 mmol. This low induction gives qualitatively and quantitatively the same results as the full induction of the low copy vector from Example 2. When using a lower efficiency promoter as tac, full induction allows correspondingly higher copy numbers of the vector. The strength of the promoter should be chosen inversely proportional to the copy number or the use of the promoter should be limited by a correspondingly low induction. The effect of limiting the copy number of an expression vector such that no tPA fragments are produced can also be achieved as follows: A high copy expression vector with a strong promoter (tac) is used as a lac-repressor overproducing (lac)
q ) When used in a bacterial strain, tPA synthesis must be induced by the addition of an inducer (IPTG, lactose, etc.). This is in the medium
It is fully achieved with amounts of 0.5-5 mmol IPTG.
In contrast, the row copy vector is the same system (tac
- Promoter, lacI q ), formation of refractor was observed, but with the same amount of IPTG added.
No incorporation of the tPA section into the refractor was observed. If the amount of IPTG added is lowered to 0.01 mmol with high copy vectors, a pure refractor similar to the low copy system is obtained with complete IPTG induction. This effect is also achieved using promoters worse than tac. The number of copies of the vector depends on the promoter
It can be increased by a lower efficiency than the tac-promoter. That is, the increase in plasmid copy number possible with a promoter efficiency of 1/10 is a factor of 10 for the low copy plasmid used. The advantage of the wax copy system with a strong promoter according to the invention lies in the ease of handling the system in fermentation. In this case, it costs less to carry out the guidance. This is because the amount of inducer does not need to be tightly controlled by regulation and the single-vessel system functions as described. This induction via the lac system is preferred over regulation via the typ system. This is because the use of lactose can jointly control cell growth;
typ-deficit technology (Verarmungs-technik:
Genentech) is not so easy.