JPH05331185A - 核酸ｒｎａの３′末端標識 - Google Patents
核酸ｒｎａの３′末端標識Info
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- JPH05331185A JPH05331185A JP4161695A JP16169592A JPH05331185A JP H05331185 A JPH05331185 A JP H05331185A JP 4161695 A JP4161695 A JP 4161695A JP 16169592 A JP16169592 A JP 16169592A JP H05331185 A JPH05331185 A JP H05331185A
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- Japan
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- rna
- biotin
- nucleic acid
- labeling
- mmol
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ＲＮＡの３′末端ＯＨをビオチン誘導体で標
識する。 【構成】 〔ｎ；２〜１８の整数、Ａｄ；アデニン−９−イル、Ｃ
y ；シトニン−１−イル、Ｘ；ＯまたはＮＨ、Ｙ1 、Ｙ
2 、Ｙ3 ；Ｈ、アルカリ金属、アンモニウムイオン、低
級アルキル置換アンモニウムイオン〕で表されるＤ−ビ
オチン誘導体からなる標識化合物およびこれを用いるＲ
ＮＡの３′末端ＯＨの標識方法。 【効果】 アルカリホスファターゼを結合したアビジン
はビオチン構造を取り込んだＲＮＡと結合するため、そ
の塩基配列決定のために選択的に切断されたフラグメン
トは発光基質と反応し、その際の放射光によりフィルム
を感光し得る。このため、従来の放射性物質による標識
方法に付随する危険性を完全に回避し得る。
識する。 【構成】 〔ｎ；２〜１８の整数、Ａｄ；アデニン−９−イル、Ｃ
y ；シトニン−１−イル、Ｘ；ＯまたはＮＨ、Ｙ1 、Ｙ
2 、Ｙ3 ；Ｈ、アルカリ金属、アンモニウムイオン、低
級アルキル置換アンモニウムイオン〕で表されるＤ−ビ
オチン誘導体からなる標識化合物およびこれを用いるＲ
ＮＡの３′末端ＯＨの標識方法。 【効果】 アルカリホスファターゼを結合したアビジン
はビオチン構造を取り込んだＲＮＡと結合するため、そ
の塩基配列決定のために選択的に切断されたフラグメン
トは発光基質と反応し、その際の放射光によりフィルム
を感光し得る。このため、従来の放射性物質による標識
方法に付随する危険性を完全に回避し得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸ＲＮＡの塩基配列
決定のための３′末端ＯＨの標識に関し、特にビオチン
誘導体をもって標識化することに関する。
決定のための３′末端ＯＨの標識に関し、特にビオチン
誘導体をもって標識化することに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸ＲＮＡの末端標識は塩基配列決定の
ためには必要不可欠な操作であり、これまで主に放射性
同位体32Ｐを用いる標識方法が採用されオートラジオグ
ラフィーで検出する方式が広まってきた。すなわち、Ｒ
ＮＡの３′末端ＯＨにたいしＴ４ＲＮＡリガーゼの存在
下、適当な放射性標識ヌクレオチド例えば、［５′−32
Ｐ］シチジン３′，５′−二リン酸（以下、32ｐＣｐと
略記）を結合せしめ、ｔＲＮＡやウィルスＲＮＡのよう
な高分子ＲＮＡの３′末端を32ｐＣｐとする。以下、標
識したＲＮＡを酵素または化学的方法を用いて選択的に
切断し切断分解物の混合物をゲル電気泳動法により分離
展開し、多数の切断分解物の分離展開パターンを得る。
この分離展開パターンをＸ線フィルム上に可視化してそ
のオートラジオグラフを得、得られたオートラジオグラ
フと各々の塩基特異的切断手段とから、放射性元素が結
合された鎖状分子の端部から一定の位置関係にある塩基
を順次決定し、これにより対象物全ての塩基配列が決定
されてきた。
ためには必要不可欠な操作であり、これまで主に放射性
同位体32Ｐを用いる標識方法が採用されオートラジオグ
ラフィーで検出する方式が広まってきた。すなわち、Ｒ
ＮＡの３′末端ＯＨにたいしＴ４ＲＮＡリガーゼの存在
下、適当な放射性標識ヌクレオチド例えば、［５′−32
Ｐ］シチジン３′，５′−二リン酸（以下、32ｐＣｐと
略記）を結合せしめ、ｔＲＮＡやウィルスＲＮＡのよう
な高分子ＲＮＡの３′末端を32ｐＣｐとする。以下、標
識したＲＮＡを酵素または化学的方法を用いて選択的に
切断し切断分解物の混合物をゲル電気泳動法により分離
展開し、多数の切断分解物の分離展開パターンを得る。
この分離展開パターンをＸ線フィルム上に可視化してそ
のオートラジオグラフを得、得られたオートラジオグラ
フと各々の塩基特異的切断手段とから、放射性元素が結
合された鎖状分子の端部から一定の位置関係にある塩基
を順次決定し、これにより対象物全ての塩基配列が決定
されてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、放射性物質は
きわめて有害であるため、核酸末端の標識の一連の操作
は専用施設のもとでなされねばならない。その施設管理
は当事者の大きな負担になっており、この負担を軽減す
るために、放射性同位体を用いない核酸の末端標識化合
物の開発が望まれてきた。このような課題に対して Ric
hardson と Gumportはビオチンや蛍光物質の誘導体を合
成し、ＲＮＡの３′末端ＯＨと反応せしめる方法を Nuc
leic Acid Res.,１１（１８）、６１６７−８４（１９
８３）に報告している。これらの方法は放射性同位元素
を用いることがないので通常の実験研究設備下に、核酸
の塩基配列を決定し得る特長を有している。
きわめて有害であるため、核酸末端の標識の一連の操作
は専用施設のもとでなされねばならない。その施設管理
は当事者の大きな負担になっており、この負担を軽減す
るために、放射性同位体を用いない核酸の末端標識化合
物の開発が望まれてきた。このような課題に対して Ric
hardson と Gumportはビオチンや蛍光物質の誘導体を合
成し、ＲＮＡの３′末端ＯＨと反応せしめる方法を Nuc
leic Acid Res.,１１（１８）、６１６７−８４（１９
８３）に報告している。これらの方法は放射性同位元素
を用いることがないので通常の実験研究設備下に、核酸
の塩基配列を決定し得る特長を有している。
【０００４】しかしながら、上記文献記載のアデノシン
（５′）ジホスホ−６−ビオチニルアミノヘキサノール
（以下、Ａ5 ′ｐｐ−ＨＡ−Biotinと略記）を用いたＧ
ｐＡｐＣ（Ｇ、Ａ、Ｃはそれぞれグアノシン、アデノシ
ン、シチジンを表し、ｐはリン酸結合を表す。）なるＲ
ＮＡ３量体の３′−ＯＨ末端へのライゲーション（生成
物をＧｐＡｐＣｐ−ＨＡ−Biotinと略記する）を検討し
たところ、反応速度は満足行くものではなかった。
（５′）ジホスホ−６−ビオチニルアミノヘキサノール
（以下、Ａ5 ′ｐｐ−ＨＡ−Biotinと略記）を用いたＧ
ｐＡｐＣ（Ｇ、Ａ、Ｃはそれぞれグアノシン、アデノシ
ン、シチジンを表し、ｐはリン酸結合を表す。）なるＲ
ＮＡ３量体の３′−ＯＨ末端へのライゲーション（生成
物をＧｐＡｐＣｐ−ＨＡ−Biotinと略記する）を検討し
たところ、反応速度は満足行くものではなかった。
【０００５】即ち、容量０．６ ml のエッペンドルフチ
ューブにＲＮＡ３量体ＧｐＡｐＣ０．０５μmol 、２倍
等量の標識試薬Ａ5 ′ｐｐ−ＨＡ−Biotin、緩衝液
（０．５Ｍ Tris−ＨＣl （ｐＨ８．０）、０．１Ｍ
ＭｇＣl2）２０μl 、０．１Ｍジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ、別称スレオ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブ
タンジオール）２０μl を加え、滅菌水で全量を２００
μl にし、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを加えて、４℃で反応さ
せた。反応終了後、１００℃で３０秒処理し、ＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフ）で分析した。リガーゼの添
加量が１３０ unit ／０．２ ml の場合２４時間反応後
のライゲーション収率は２９％であった。溶媒中にジメ
チルスルホキシドを１０容量％添加した場合は、５４％
であった。更に、リガーゼの添加量を５倍にしたとこ
ろ、はじめて９９％の収率が得られた。反応速度は不十
分である。
ューブにＲＮＡ３量体ＧｐＡｐＣ０．０５μmol 、２倍
等量の標識試薬Ａ5 ′ｐｐ−ＨＡ−Biotin、緩衝液
（０．５Ｍ Tris−ＨＣl （ｐＨ８．０）、０．１Ｍ
ＭｇＣl2）２０μl 、０．１Ｍジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ、別称スレオ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブ
タンジオール）２０μl を加え、滅菌水で全量を２００
μl にし、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを加えて、４℃で反応さ
せた。反応終了後、１００℃で３０秒処理し、ＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフ）で分析した。リガーゼの添
加量が１３０ unit ／０．２ ml の場合２４時間反応後
のライゲーション収率は２９％であった。溶媒中にジメ
チルスルホキシドを１０容量％添加した場合は、５４％
であった。更に、リガーゼの添加量を５倍にしたとこ
ろ、はじめて９９％の収率が得られた。反応速度は不十
分である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】核酸の塩基配列決定のた
めの末端標識においては、反応速度が早く定量的である
ほどこれに続く処理が容易になるので、より好適な３′
末端標識化合物を鋭意探索した。その結果、式（Ｉ）で
示したビオチン誘導体は、ＲＮＡの３′末端ＯＨと速や
かに反応することを見いだし本発明を完成するに至っ
た。
めの末端標識においては、反応速度が早く定量的である
ほどこれに続く処理が容易になるので、より好適な３′
末端標識化合物を鋭意探索した。その結果、式（Ｉ）で
示したビオチン誘導体は、ＲＮＡの３′末端ＯＨと速や
かに反応することを見いだし本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】
【化２】
【０００８】（ここに、ｎは２から１８までの整数を、
Ａｄはアデニン−９−イルを、Ｃy はシトシン−１−イ
ルを、ＸはＯまたはＮＨを、Ｙ1 、Ｙ2 、Ｙ3 はＨまた
はアルカリ金属、アンモニウムイオンおよび低級アルキ
ル置換アンモニウムイオンを表す）
Ａｄはアデニン−９−イルを、Ｃy はシトシン−１−イ
ルを、ＸはＯまたはＮＨを、Ｙ1 、Ｙ2 、Ｙ3 はＨまた
はアルカリ金属、アンモニウムイオンおよび低級アルキ
ル置換アンモニウムイオンを表す）
【０００９】本願発明になる式（Ｉ）で表される標識化
合物の合成ルートの例を図１〜３に示す。即ち、ビオチ
ンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの活性エステル
をω−アミノ置換一級アルコールと反応させアミドを
得、ついでデオキシシチジン−Ｓ−フェニルチオホスフ
ェートと反応させリン酸エステルを得る。酸で保護基
ジメトキシトリチルをはずして得られたにシクロヘキ
シルアンモニウムＳ，Ｓ−ジフェニルホスホロジチオエ
ート（ＰＳＳ）を反応せしめジチオホスフェート誘導体
、チオホスフェート誘導体を経て最後にアデノシン
５′−一燐酸（５′−ＡＭＰ）と反応させ、ビオチン構
造、リン酸ジエステルおよびジリン酸エステルを有する
標識化合物（式（Ｉ）で表される標識化合物の一例）
を得ることができる。
合物の合成ルートの例を図１〜３に示す。即ち、ビオチ
ンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの活性エステル
をω−アミノ置換一級アルコールと反応させアミドを
得、ついでデオキシシチジン−Ｓ−フェニルチオホスフ
ェートと反応させリン酸エステルを得る。酸で保護基
ジメトキシトリチルをはずして得られたにシクロヘキ
シルアンモニウムＳ，Ｓ−ジフェニルホスホロジチオエ
ート（ＰＳＳ）を反応せしめジチオホスフェート誘導体
、チオホスフェート誘導体を経て最後にアデノシン
５′−一燐酸（５′−ＡＭＰ）と反応させ、ビオチン構
造、リン酸ジエステルおよびジリン酸エステルを有する
標識化合物（式（Ｉ）で表される標識化合物の一例）
を得ることができる。
【００１０】式（Ｉ）のビオチン誘導体を用いた標識化
反応にあたっては、必要に応じ常圧下にＴ４ＲＮＡリガ
ーゼ、リガーゼの活性を保持するためのほぼ中性領域の
緩衝液の共存下対象サンプルのＲＮＡと式（Ｉ）で示し
た標識化合物を−５℃〜２０℃程度の常温条件下で数時
間ないし数１０時間撹拌することによりなされるが、反
応速度を高めるためには０℃以上が好ましい。
反応にあたっては、必要に応じ常圧下にＴ４ＲＮＡリガ
ーゼ、リガーゼの活性を保持するためのほぼ中性領域の
緩衝液の共存下対象サンプルのＲＮＡと式（Ｉ）で示し
た標識化合物を−５℃〜２０℃程度の常温条件下で数時
間ないし数１０時間撹拌することによりなされるが、反
応速度を高めるためには０℃以上が好ましい。
【００１１】比較のため前記ＧｐＡｐＣなるＲＮＡ３量
体への標識化合物（Ｉ）のライゲーションを文献記載の
アデノシン（５′）ジホスホ−６−ビオチニルアミノヘ
キサノールのライゲーションと同一条件で検討した。即
ち、容量０．６ ml のエッペンドルフチューブにＲＮＡ
３量体ＧｐＡｐＣ０．０５μmol 、２倍等量の標識試薬
Ａ5 ′ｐｐｄＣｐ−ＨＡ−Biotin（ｄＣは２′デオキシ
シチジンを表す（図４参照））、緩衝液（０．５Ｍ Tr
is−ＨＣl（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ ＭｇＣl2）２０
μl 、０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）２０μl
を加え、滅菌水で全量を２００μl にし、Ｔ４ＲＮＡリ
ガーゼを加えて、４℃で反応させた。反応終了後、１０
０℃で３０秒処理し、ＨＰＬＣで分析した。リガーゼの
添加量が１３０ unit ／０．２ ml の場合１２時間反応
後のライゲーション収率は９０％以上で２４時間反応後
のライゲーション収率は９９％であった。この結果は本
願発明になる式（Ｉ）の標識化合物の反応性の高いこと
を示すものである。
体への標識化合物（Ｉ）のライゲーションを文献記載の
アデノシン（５′）ジホスホ−６−ビオチニルアミノヘ
キサノールのライゲーションと同一条件で検討した。即
ち、容量０．６ ml のエッペンドルフチューブにＲＮＡ
３量体ＧｐＡｐＣ０．０５μmol 、２倍等量の標識試薬
Ａ5 ′ｐｐｄＣｐ−ＨＡ−Biotin（ｄＣは２′デオキシ
シチジンを表す（図４参照））、緩衝液（０．５Ｍ Tr
is−ＨＣl（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ ＭｇＣl2）２０
μl 、０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）２０μl
を加え、滅菌水で全量を２００μl にし、Ｔ４ＲＮＡリ
ガーゼを加えて、４℃で反応させた。反応終了後、１０
０℃で３０秒処理し、ＨＰＬＣで分析した。リガーゼの
添加量が１３０ unit ／０．２ ml の場合１２時間反応
後のライゲーション収率は９０％以上で２４時間反応後
のライゲーション収率は９９％であった。この結果は本
願発明になる式（Ｉ）の標識化合物の反応性の高いこと
を示すものである。
【００１２】以上の反応によりビオチン構造がＲＮＡに
取り込まれるため、この標識化されたＲＮＡをさらに、
アルカリホスファターゼが共有結合で連結したアビジン
と混合させると、ビオチン−アビジンの特異的複合体の
形成によりアルカリホスファターゼがＲＮＡと間接的に
結合できることになる。したがって、このアルカリホス
ファターゼが結合したＲＮＡ、あるいはこれを酵素法や
化学的方法によって選択的に切断したビオチン−アビジ
ン結合を有する分解物に、このアルカリホスファターゼ
によって初めて活性化され光を放つことのできる基質
（例えば、ルミジェンTMＰＰＤなど）を反応させると、
放出光が増幅され感度よくＸ線フィルムで微量のＲＮＡ
が検出できることになる。このケミルミネッセンス法の
原理を用いて核酸の塩基配列を容易に決定することがで
きる。以下に本発明を実施例をもってさらに詳しく説明
するが、これによって本発明が限定されるものではな
い。
取り込まれるため、この標識化されたＲＮＡをさらに、
アルカリホスファターゼが共有結合で連結したアビジン
と混合させると、ビオチン−アビジンの特異的複合体の
形成によりアルカリホスファターゼがＲＮＡと間接的に
結合できることになる。したがって、このアルカリホス
ファターゼが結合したＲＮＡ、あるいはこれを酵素法や
化学的方法によって選択的に切断したビオチン−アビジ
ン結合を有する分解物に、このアルカリホスファターゼ
によって初めて活性化され光を放つことのできる基質
（例えば、ルミジェンTMＰＰＤなど）を反応させると、
放出光が増幅され感度よくＸ線フィルムで微量のＲＮＡ
が検出できることになる。このケミルミネッセンス法の
原理を用いて核酸の塩基配列を容易に決定することがで
きる。以下に本発明を実施例をもってさらに詳しく説明
するが、これによって本発明が限定されるものではな
い。
【００１３】
実施例１ 標識化合物の合成ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（化合物１）の合成 Ｄ−ビオチン（５．３０６ｇ、２１．７２ mmol ）およ
びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．４９９ｇ、２
１．７０ mmol ）を減圧下ピリジン（２０ ml ）で４回
共沸脱水したのちジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（６
０ ml ）に溶解した。ここにジシクロヘキシルカルボジ
イミド（４．４８１ｇ、２１．７２ mmol）を加え７０
℃で２時間撹拌した。沈殿物を濾過し、ＤＭＦ（５ ml
）で３回洗浄した。濾液をエバポレーターで濃縮し、
ＤＭＦ溶液から再結晶した。結晶を濾過し、エーテル
（２０ ml ）で３回洗浄したのちデシケーター中で減圧
乾燥し、目的物（６．１７５ｇ、１８．０９ mmol ）を
収率８３％で得た。ＮＭＲ測定結果は次の通り：1 Ｈ−
ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 ） δ １．３
８−１．７６（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ）、２．６１（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，ＣＨ2 Ｓ）、２．７０（２Ｈ，
ｔ，Ｊ＝７．２６Ｈｚ，ＣＨ2 ＣＯ）、２．８４（４
Ｈ，ｓ）、２．８４−２．９２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ2
Ｓ）、３．１０−３．１７（１Ｈ，ｍ，ＣＨＳ）、４．
１７（１Ｈ，ｍ，ＣＨＮＨ）、４．３３（１Ｈ，ｍ，Ｃ
ＨＮＨ）、６．４２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ｎ
ＨＣＯＮＨ）。
（化合物１）の合成 Ｄ−ビオチン（５．３０６ｇ、２１．７２ mmol ）およ
びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．４９９ｇ、２
１．７０ mmol ）を減圧下ピリジン（２０ ml ）で４回
共沸脱水したのちジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（６
０ ml ）に溶解した。ここにジシクロヘキシルカルボジ
イミド（４．４８１ｇ、２１．７２ mmol）を加え７０
℃で２時間撹拌した。沈殿物を濾過し、ＤＭＦ（５ ml
）で３回洗浄した。濾液をエバポレーターで濃縮し、
ＤＭＦ溶液から再結晶した。結晶を濾過し、エーテル
（２０ ml ）で３回洗浄したのちデシケーター中で減圧
乾燥し、目的物（６．１７５ｇ、１８．０９ mmol ）を
収率８３％で得た。ＮＭＲ測定結果は次の通り：1 Ｈ−
ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 ） δ １．３
８−１．７６（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ）、２．６１（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，ＣＨ2 Ｓ）、２．７０（２Ｈ，
ｔ，Ｊ＝７．２６Ｈｚ，ＣＨ2 ＣＯ）、２．８４（４
Ｈ，ｓ）、２．８４−２．９２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ2
Ｓ）、３．１０−３．１７（１Ｈ，ｍ，ＣＨＳ）、４．
１７（１Ｈ，ｍ，ＣＨＮＨ）、４．３３（１Ｈ，ｍ，Ｃ
ＨＮＨ）、６．４２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ｎ
ＨＣＯＮＨ）。
【００１４】６−（Ｎ−ビオチニル）アミノ−１−ヘキ
サノール（化合物２）の合成 化合物１（５．５４１ｇ、１６．２３ mmol ）をＤＭＦ
（６０ ml ）に溶かし、６−アミノ−１−ヘキサノール
（１．９０２ｇ、１６．２３ mmol ）を加え、室温で１
時間撹拌した。ＤＭＦを減圧留去し、エタノールから再
結晶した。結晶を濾過しエーテル（２０ ml ）で３回洗
浄したのち、デシケーター中で減圧乾燥し、目的物
（４．６５３ｇ、１３．５５ mmol ）を収率８３％で得
た。ＮＭＲ測定結果は次の通り：1 Ｈ−ＮＭＲ（２７０
ＭＨｚ，ＣＤ3 ＯＤ） δ １．２８−１．８１（１４
Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ）、２．１９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２６
Ｈｚ，ＣＨ2 ＣＯ）、２．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．
９Ｈｚ，ＣＨ2 Ｓ）、２．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．
９５，１２．９Ｈｚ，ＣＨ2 Ｓ）、３．１６−３．２４
（３Ｈ，ｍ，contains ＣＨ2 ＮＨ triplet at ３．１
７，Ｊ＝６．９３Ｈｚ）、３．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝
６．６０Ｈｚ，ＣＨ2 ＯＨ）、４．３０（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝４．６２、７．９２Ｈｚ，ＣＨＮＨ）、４．４９
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．９５，７．９２Ｈｚ，ＣＨＮ
Ｈ）。
サノール（化合物２）の合成 化合物１（５．５４１ｇ、１６．２３ mmol ）をＤＭＦ
（６０ ml ）に溶かし、６−アミノ−１−ヘキサノール
（１．９０２ｇ、１６．２３ mmol ）を加え、室温で１
時間撹拌した。ＤＭＦを減圧留去し、エタノールから再
結晶した。結晶を濾過しエーテル（２０ ml ）で３回洗
浄したのち、デシケーター中で減圧乾燥し、目的物
（４．６５３ｇ、１３．５５ mmol ）を収率８３％で得
た。ＮＭＲ測定結果は次の通り：1 Ｈ−ＮＭＲ（２７０
ＭＨｚ，ＣＤ3 ＯＤ） δ １．２８−１．８１（１４
Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ）、２．１９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２６
Ｈｚ，ＣＨ2 ＣＯ）、２．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．
９Ｈｚ，ＣＨ2 Ｓ）、２．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．
９５，１２．９Ｈｚ，ＣＨ2 Ｓ）、３．１６−３．２４
（３Ｈ，ｍ，contains ＣＨ2 ＮＨ triplet at ３．１
７，Ｊ＝６．９３Ｈｚ）、３．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝
６．６０Ｈｚ，ＣＨ2 ＯＨ）、４．３０（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝４．６２、７．９２Ｈｚ，ＣＨＮＨ）、４．４９
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．９５，７．９２Ｈｚ，ＣＨＮ
Ｈ）。
【００１５】５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−（４−Ｎ
−ベンゾイル）デオキシシチジン（３′）−Ｓ−フェニ
ルチオホスホ−６−ビオチニルアミノヘキサノール（化
合物３）の合成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−（４−Ｎ−ベンゾイ
ル）デオキシシチジン（３′）−Ｓ−フェニルチオホス
フェート（０．２８５ｇ、０．３１４ mmol ）および化
合物２（０．１２９ｇ、０．３７６ mmol ）、３−ニト
ロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（０．０７３ｇ、
０．６２７ mmol ）を減圧下ピリジン（５ml）で４回共
沸脱水したのちピリジン（３ ml ）に溶解した。ここに
イソデュレンジスルホニルクロリド（ＤＤＳ）（０．３
１２ｇ、０．９４１ mmol ）を加え、室温下１０分間撹
拌した。溶媒を減圧留去しクロロホルム（５０ ml ）に
溶かしたのち炭酸水素ナトリウム水溶液（５％、５０ m
l ）で３回洗浄した。水層をクロロホルム（５０ ml ）
で抽出し有機層に加えた。有機層を無水硫酸ナトリウム
（２０ｇ）で乾燥し濾別したのち溶媒を減圧留去し、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル（Wako
gel Ｃ−２００）１６ｇ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （０〜５％）＋
ＣＨ3 ＯＨ（０．５％）＋Ｃ5 Ｈ5 Ｎ（９４．５〜９
９．５％））で精製した。溶媒を減圧留去して目的物
（０．２５７ｇ、０．２２７ mmol ）を収率７２％で得
た。ＮＭＲ測定結果は次の通り：1 Ｈ−ＮＭＲ（９０Ｍ
Ｈｚ，ＣＤＣｌ3 ） δ １．２１−１．９６（１４
Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ）、２．０８−２．２５（２Ｈ，ｍ，Ｃ
Ｈ2 ＣＯ）、２．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，
ＣＨ2 Ｓ）、２．６９−３．３０（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2
Ｓ，ＣＨＳ，ＣＨ2 ＮＨ and ２′−Ｈ）、３．３３−
３．５２（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、３．７８（６Ｈ，
ｓ，ＯＣＨ3 ）、３．９４−４．５２（５Ｈ，ｍ，ＣＨ
ＮＨ，ＣＨ2 Ｏ and ４′−Ｈ）、４．９３−５．３８
（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、５．８５−６．３３（１Ｈ，
ｍ，１′−Ｈ）、６．７４−８．２４（２５Ｈ，ｍ）。
−ベンゾイル）デオキシシチジン（３′）−Ｓ−フェニ
ルチオホスホ−６−ビオチニルアミノヘキサノール（化
合物３）の合成 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−（４−Ｎ−ベンゾイ
ル）デオキシシチジン（３′）−Ｓ−フェニルチオホス
フェート（０．２８５ｇ、０．３１４ mmol ）および化
合物２（０．１２９ｇ、０．３７６ mmol ）、３−ニト
ロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（０．０７３ｇ、
０．６２７ mmol ）を減圧下ピリジン（５ml）で４回共
沸脱水したのちピリジン（３ ml ）に溶解した。ここに
イソデュレンジスルホニルクロリド（ＤＤＳ）（０．３
１２ｇ、０．９４１ mmol ）を加え、室温下１０分間撹
拌した。溶媒を減圧留去しクロロホルム（５０ ml ）に
溶かしたのち炭酸水素ナトリウム水溶液（５％、５０ m
l ）で３回洗浄した。水層をクロロホルム（５０ ml ）
で抽出し有機層に加えた。有機層を無水硫酸ナトリウム
（２０ｇ）で乾燥し濾別したのち溶媒を減圧留去し、シ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル（Wako
gel Ｃ−２００）１６ｇ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （０〜５％）＋
ＣＨ3 ＯＨ（０．５％）＋Ｃ5 Ｈ5 Ｎ（９４．５〜９
９．５％））で精製した。溶媒を減圧留去して目的物
（０．２５７ｇ、０．２２７ mmol ）を収率７２％で得
た。ＮＭＲ測定結果は次の通り：1 Ｈ−ＮＭＲ（９０Ｍ
Ｈｚ，ＣＤＣｌ3 ） δ １．２１−１．９６（１４
Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ）、２．０８−２．２５（２Ｈ，ｍ，Ｃ
Ｈ2 ＣＯ）、２．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，
ＣＨ2 Ｓ）、２．６９−３．３０（６Ｈ，ｍ，ＣＨ2
Ｓ，ＣＨＳ，ＣＨ2 ＮＨ and ２′−Ｈ）、３．３３−
３．５２（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、３．７８（６Ｈ，
ｓ，ＯＣＨ3 ）、３．９４−４．５２（５Ｈ，ｍ，ＣＨ
ＮＨ，ＣＨ2 Ｏ and ４′−Ｈ）、４．９３−５．３８
（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、５．８５−６．３３（１Ｈ，
ｍ，１′−Ｈ）、６．７４−８．２４（２５Ｈ，ｍ）。
【００１６】Ｎ−４−ベンゾイルデオキシシチジン
（３′）−Ｓ−フェニルチオホスホ−６−ビオチニルア
ミノヘキサノール（化合物４）の合成 化合物３（０．２５１ｇ、０．２２２ mmol ）をジクロ
ロメタン（８ ml ）に溶かし、氷浴で０℃に冷やした。
ここにトリフルオロ酢酸（０．０８ ml ）を加え、０℃
で１時間撹拌した。反応終了後クロロホルム（５０ ml
）を加え、炭酸水素ナトリウム水溶液（５％、５０ ml
）で３回洗浄した。水層をクロロホルム（２０ ml ）
で抽出し、有機層に加えた。有機層を無水硫酸ナトリウ
ム（２０ｇ）で乾燥し濾別したのち溶媒を減圧留去し、
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル（Wa
kogel Ｃ−２００）５ｇ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （０〜４％）＋
ＣＨ3 ＯＨ（１００〜９６％））で精製した。溶媒を減
圧留去して目的物（０．１７８ｇ、０．２１５ mmol ）
を収率９７％で得た。ＮＭＲ測定結果は次の通り：1 Ｈ
−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 −ＣＤ3 ＯＤ） δ
１．１３−１．８８（１４Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ）、２．０
５−２．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ＣＯ）、２．５６−
３．４４（ｍ，ＣＨ2 Ｓ，ＣＨＳ，ＣＨ2 ＮＨ and
２′−Ｈ）、３．７６（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．０
０−４．６０（５Ｈ，ｍ，ＣＨＮＨ，ＣＨ2 Ｏ and
４′−Ｈ）、５．１４（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、６．２
１（１Ｈ，ｍ，１′−Ｈ）、７．１６−７．６０（９
Ｈ，ｍ）、７．９３（２Ｈ，ｍ）、８．３６（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６−Ｈ）。
（３′）−Ｓ−フェニルチオホスホ−６−ビオチニルア
ミノヘキサノール（化合物４）の合成 化合物３（０．２５１ｇ、０．２２２ mmol ）をジクロ
ロメタン（８ ml ）に溶かし、氷浴で０℃に冷やした。
ここにトリフルオロ酢酸（０．０８ ml ）を加え、０℃
で１時間撹拌した。反応終了後クロロホルム（５０ ml
）を加え、炭酸水素ナトリウム水溶液（５％、５０ ml
）で３回洗浄した。水層をクロロホルム（２０ ml ）
で抽出し、有機層に加えた。有機層を無水硫酸ナトリウ
ム（２０ｇ）で乾燥し濾別したのち溶媒を減圧留去し、
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル（Wa
kogel Ｃ−２００）５ｇ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （０〜４％）＋
ＣＨ3 ＯＨ（１００〜９６％））で精製した。溶媒を減
圧留去して目的物（０．１７８ｇ、０．２１５ mmol ）
を収率９７％で得た。ＮＭＲ測定結果は次の通り：1 Ｈ
−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 −ＣＤ3 ＯＤ） δ
１．１３−１．８８（１４Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ）、２．０
５−２．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ＣＯ）、２．５６−
３．４４（ｍ，ＣＨ2 Ｓ，ＣＨＳ，ＣＨ2 ＮＨ and
２′−Ｈ）、３．７６（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．０
０−４．６０（５Ｈ，ｍ，ＣＨＮＨ，ＣＨ2 Ｏ and
４′−Ｈ）、５．１４（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、６．２
１（１Ｈ，ｍ，１′−Ｈ）、７．１６−７．６０（９
Ｈ，ｍ）、７．９３（２Ｈ，ｍ）、８．３６（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６−Ｈ）。
【００１７】５′−（Ｓ，Ｓ′−ジフェニルジチオホス
ホ）−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン（３′）−Ｓ
−フェニルチオホスホ−６−ビオチニルアミノヘキサノ
ール（化合物５）の合成 化合物４（０．１７３ｇ、０．２０９ mmol ）およびシ
クロヘキシルアンモニウムＳ，Ｓ−ジフェニルホスホロ
ジチオエート（ＰＳＳ）（０．０９６ｇ、０．２５１ m
mol ）、１Ｈ−テトラゾール（０．０５９ｇ、０．８３
６ mmol ）を減圧下ピリジン（５ ml ）で４回共沸脱水
したのちピリジン（４ ml ）に溶解した。ここにイソデ
ュレンジスルホニルクロリド（ＤＤＳ）（０．２０７
ｇ、０．６２７ mmol ）を加え、室温で３０分間撹拌し
た。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラ
フィー（シリカゲル（Wakogel Ｃ−２００）１２ｇ、Ｃ
Ｈ2Ｃｌ2 （０〜４％）＋ＣＨ3 ＯＨ（９６〜１００
％））で精製した。溶媒を減圧留去して目的物（０．１
５７ｇ、０．１４３ mmol ）を収率６９％で得た。ＮＭ
Ｒ測定結果は次の通り：1 Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ，Ｃ
ＤＣｌ3 ） δ １．１０−２．４３（１６Ｈ，ｍ，Ｃ
Ｈ2 ）、２．６８−３．３２（５Ｈ，ｍ，ＣＨ2 Ｓ，Ｃ
ＨＳ、２′ and５′−Ｈ）、３．９６−４．６１（６
Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ＮＨ，ＣＨＮＨ，ＣＨ2Ｏ and ４′−
Ｈ）、５．０１（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、５．８６−
６．９６（４Ｈ，ｍ）、７．１５−７．７０（１９Ｈ，
ｍ）、７．８１−８．０１（３Ｈ，ｍ）。
ホ）−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン（３′）−Ｓ
−フェニルチオホスホ−６−ビオチニルアミノヘキサノ
ール（化合物５）の合成 化合物４（０．１７３ｇ、０．２０９ mmol ）およびシ
クロヘキシルアンモニウムＳ，Ｓ−ジフェニルホスホロ
ジチオエート（ＰＳＳ）（０．０９６ｇ、０．２５１ m
mol ）、１Ｈ−テトラゾール（０．０５９ｇ、０．８３
６ mmol ）を減圧下ピリジン（５ ml ）で４回共沸脱水
したのちピリジン（４ ml ）に溶解した。ここにイソデ
ュレンジスルホニルクロリド（ＤＤＳ）（０．２０７
ｇ、０．６２７ mmol ）を加え、室温で３０分間撹拌し
た。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラ
フィー（シリカゲル（Wakogel Ｃ−２００）１２ｇ、Ｃ
Ｈ2Ｃｌ2 （０〜４％）＋ＣＨ3 ＯＨ（９６〜１００
％））で精製した。溶媒を減圧留去して目的物（０．１
５７ｇ、０．１４３ mmol ）を収率６９％で得た。ＮＭ
Ｒ測定結果は次の通り：1 Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ，Ｃ
ＤＣｌ3 ） δ １．１０−２．４３（１６Ｈ，ｍ，Ｃ
Ｈ2 ）、２．６８−３．３２（５Ｈ，ｍ，ＣＨ2 Ｓ，Ｃ
ＨＳ、２′ and５′−Ｈ）、３．９６−４．６１（６
Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ＮＨ，ＣＨＮＨ，ＣＨ2Ｏ and ４′−
Ｈ）、５．０１（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ）、５．８６−
６．９６（４Ｈ，ｍ）、７．１５−７．７０（１９Ｈ，
ｍ）、７．８１−８．０１（３Ｈ，ｍ）。
【００１８】アデノシン（５′）ジホスホ（５′）デオ
キシシチジン（３′）ホスホ−６−ビオチニルアミノヘ
キサノール（化合物７）の合成（式（Ｉ）の一例） 化合物５（０．１５０ｇ、０．１３７ mmol ）をピリジ
ン（４ ml ）に溶かし、ビストリブチル錫オキシド
（０．７０ ml 、１．４ mmol ）を加え、室温で２０分
間撹拌した。反応終了後トリメチルシリルクロリド
（０．３５ ml 、２．７mmol ）を加えて室温で５分間
撹拌した。溶媒を減圧留去し、水−ピリジン（容積比
２：１）（５ ml ）に溶かし、ヘキサン（５ ml ）で３
回抽出した。水層の溶媒を減圧留去し、ピリジン（１３
ml ）に溶かし、濃アンモニア水（２６ ml）を加えて
室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、イオン交換
樹脂カラム（Dowex ５０Ｗ−Ｘ８、２ ml ）に通し、溶
媒を減圧留去した。残留物と５′−ＡＭＰ（０．１３７
mmol ）を減圧下ピリジン（５ ml ）で４回共沸脱水
し、ＤＭＦ（６ ml ）に溶かした。ここにピリジン（１
ml ）に溶かした硝酸銀（０．４４２ｇ、２．７４ mmo
l ）を加え、室温で１時間撹拌した。十分な量の硫化水
素を吹き込んで銀イオンを沈澱させ、減圧して硫化水素
を除いてから沈澱を遠心分離して除いた。上澄みを減圧
濃縮し、逆相クロマトグラフィー（Ｃ18ゲル２０ｇ、
０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（０〜１５％）＋ＣＨ
3 ＯＨ（８５〜１００％））で精製した。溶媒を減圧留
去し、水に溶かし、凍結乾燥で水および酢酸アンモニウ
ムを除き、目的物（６３６Ａ260 unit 、０．０３３０
mmol ）を収率２５％で得た。ＮＭＲ測定結果は次の通
り：1 Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ−ＤＭＳＯ−
ｄ6 ） δ １．２０−１．７５（１４Ｈ，ｍ，ＣＨ
2 ）、２．１０−２．２３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ＣＯ）、
２．３３−２．４８（２Ｈ，ｍ，ｄＣ ２′−Ｈ）、
２．７５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2 Ｏ）、２．８７（２Ｈ，
ｍ，ＣＨ2 Ｓ）、３．０９（２Ｈ，ｍ，ｄＣ ５′−
Ｈ）、３．１９（１Ｈ，ｍ，ＣＨＳ）、３．７８（２
Ｈ，ｍ，Ａｄ ５′−Ｈ）、４．１２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ
2 ＮＨ）、４．２５−４．３４（２Ｈ，ｍ，Ａｄ＆ ｄ
Ｃ ４′−Ｈ）、４．４０（１Ｈ，ｍ，ＣＨＮＨ）、
４．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，７．９Ｈｚ，ＣＨ
ＮＨ）、４．５８−４．９５（３Ｈ，ｍ，Ａｄ ２′，
３′−Ｈ ＆ ｄＣ ３′−Ｈ）、５．９７（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ｄＣ ５−Ｈ）、６．０３（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ａｄ １′−Ｈ）、６．２４
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６，７．９Ｈｚ，ｄＣ １′−
Ｈ）、７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ｄＣ ６
−Ｈ）、８．２２（１Ｈ，ｓ，Ａｄ２−Ｈ）、８．５１
（１Ｈ，ｓ，Ａｄ ８−Ｈ）。
キシシチジン（３′）ホスホ−６−ビオチニルアミノヘ
キサノール（化合物７）の合成（式（Ｉ）の一例） 化合物５（０．１５０ｇ、０．１３７ mmol ）をピリジ
ン（４ ml ）に溶かし、ビストリブチル錫オキシド
（０．７０ ml 、１．４ mmol ）を加え、室温で２０分
間撹拌した。反応終了後トリメチルシリルクロリド
（０．３５ ml 、２．７mmol ）を加えて室温で５分間
撹拌した。溶媒を減圧留去し、水−ピリジン（容積比
２：１）（５ ml ）に溶かし、ヘキサン（５ ml ）で３
回抽出した。水層の溶媒を減圧留去し、ピリジン（１３
ml ）に溶かし、濃アンモニア水（２６ ml）を加えて
室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、イオン交換
樹脂カラム（Dowex ５０Ｗ−Ｘ８、２ ml ）に通し、溶
媒を減圧留去した。残留物と５′−ＡＭＰ（０．１３７
mmol ）を減圧下ピリジン（５ ml ）で４回共沸脱水
し、ＤＭＦ（６ ml ）に溶かした。ここにピリジン（１
ml ）に溶かした硝酸銀（０．４４２ｇ、２．７４ mmo
l ）を加え、室温で１時間撹拌した。十分な量の硫化水
素を吹き込んで銀イオンを沈澱させ、減圧して硫化水素
を除いてから沈澱を遠心分離して除いた。上澄みを減圧
濃縮し、逆相クロマトグラフィー（Ｃ18ゲル２０ｇ、
０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（０〜１５％）＋ＣＨ
3 ＯＨ（８５〜１００％））で精製した。溶媒を減圧留
去し、水に溶かし、凍結乾燥で水および酢酸アンモニウ
ムを除き、目的物（６３６Ａ260 unit 、０．０３３０
mmol ）を収率２５％で得た。ＮＭＲ測定結果は次の通
り：1 Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ−ＤＭＳＯ−
ｄ6 ） δ １．２０−１．７５（１４Ｈ，ｍ，ＣＨ
2 ）、２．１０−２．２３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2 ＣＯ）、
２．３３−２．４８（２Ｈ，ｍ，ｄＣ ２′−Ｈ）、
２．７５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2 Ｏ）、２．８７（２Ｈ，
ｍ，ＣＨ2 Ｓ）、３．０９（２Ｈ，ｍ，ｄＣ ５′−
Ｈ）、３．１９（１Ｈ，ｍ，ＣＨＳ）、３．７８（２
Ｈ，ｍ，Ａｄ ５′−Ｈ）、４．１２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ
2 ＮＨ）、４．２５−４．３４（２Ｈ，ｍ，Ａｄ＆ ｄ
Ｃ ４′−Ｈ）、４．４０（１Ｈ，ｍ，ＣＨＮＨ）、
４．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，７．９Ｈｚ，ＣＨ
ＮＨ）、４．５８−４．９５（３Ｈ，ｍ，Ａｄ ２′，
３′−Ｈ ＆ ｄＣ ３′−Ｈ）、５．９７（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ｄＣ ５−Ｈ）、６．０３（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ａｄ １′−Ｈ）、６．２４
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６，７．９Ｈｚ，ｄＣ １′−
Ｈ）、７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ｄＣ ６
−Ｈ）、８．２２（１Ｈ，ｓ，Ａｄ２−Ｈ）、８．５１
（１Ｈ，ｓ，Ａｄ ８−Ｈ）。
【００１９】実施例２ 標識反応 容量０．６ ml のエッペンドルフチューブにＮ−ホルミ
ルメチオニンｔＲＮＡ（ｔＲＮＡfMet）（１Ａ260 uni
t、１０μl ）、緩衝液（０．５Ｍ Tris−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ＝８．０）、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ：２．０μl ）、
０．１Ｍ ＤＴＴ（２．０μl ）、滅菌水（１．７μl
）、化合物７（１０ nmol 、３．３μl ）、Ｔ４ＲＮ
Ａリガーゼ（５０ unit 、１μl ）を加え、タッチミキ
サーで撹拌した後、かるく遠心分離機にかけ、４℃で２
４時間反応させた。反応終了後、１００℃で３０秒処理
して酵素を失活させた。ここに１０μｇ／μl のキャリ
ア−ｔＲＮＡ（２０μl ）および１Ｍ酢酸ナトリウム
（２０μl ）、冷エタノール（１８０μl ）を加え、か
るく撹拌・遠心分離した後、−７８℃で１０分間静置し
た。これを３０分間遠心分離し、上澄みを除き、１０分
間乾燥し目的物であるビオチン化ｔＲＮＡfMetを収率８
０％で得た。
ルメチオニンｔＲＮＡ（ｔＲＮＡfMet）（１Ａ260 uni
t、１０μl ）、緩衝液（０．５Ｍ Tris−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ＝８．０）、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ：２．０μl ）、
０．１Ｍ ＤＴＴ（２．０μl ）、滅菌水（１．７μl
）、化合物７（１０ nmol 、３．３μl ）、Ｔ４ＲＮ
Ａリガーゼ（５０ unit 、１μl ）を加え、タッチミキ
サーで撹拌した後、かるく遠心分離機にかけ、４℃で２
４時間反応させた。反応終了後、１００℃で３０秒処理
して酵素を失活させた。ここに１０μｇ／μl のキャリ
ア−ｔＲＮＡ（２０μl ）および１Ｍ酢酸ナトリウム
（２０μl ）、冷エタノール（１８０μl ）を加え、か
るく撹拌・遠心分離した後、−７８℃で１０分間静置し
た。これを３０分間遠心分離し、上澄みを除き、１０分
間乾燥し目的物であるビオチン化ｔＲＮＡfMetを収率８
０％で得た。
【００２０】
【発明の効果】上記の説明及び実施例からも明らかなよ
うに、放射性物質を用いない本願発明になる標識化合物
と、これを用いた核酸の末端標識方法は通常の化学や生
化学の実験研究機器および設備のもとに容易に合成さ
れ、標識化が実行され得る。すなわち、アビジンに特異
的に結合するビオチン構造を有する標識化合物の提供
と、これを用いたＲＮＡの３′末端ＯＨを標識する方法
の提案は、従来必要とされていた放射性物質取扱のため
の専用設備を要しない、安全な核酸解析の手段を提供す
るものである。すなわち、以下例えば、Donis −Keller
法により塩基配列の決定が可能となる。また、本願発明
になるビオチン誘導体である標識化合物は、比較的に合
成工程が短く、各段の合成収率が高く、精製が容易であ
る。さらに反応条件が穏和ながら反応速度が速いため合
成が短時間になされ効率的である。その上、標識反応そ
のものが定量的に且迅速に進行するため、試料となる核
酸の所要量は少なくて済み未反応物や副生成物の混入量
が少ないため、解析の効率は大いに高まる。
うに、放射性物質を用いない本願発明になる標識化合物
と、これを用いた核酸の末端標識方法は通常の化学や生
化学の実験研究機器および設備のもとに容易に合成さ
れ、標識化が実行され得る。すなわち、アビジンに特異
的に結合するビオチン構造を有する標識化合物の提供
と、これを用いたＲＮＡの３′末端ＯＨを標識する方法
の提案は、従来必要とされていた放射性物質取扱のため
の専用設備を要しない、安全な核酸解析の手段を提供す
るものである。すなわち、以下例えば、Donis −Keller
法により塩基配列の決定が可能となる。また、本願発明
になるビオチン誘導体である標識化合物は、比較的に合
成工程が短く、各段の合成収率が高く、精製が容易であ
る。さらに反応条件が穏和ながら反応速度が速いため合
成が短時間になされ効率的である。その上、標識反応そ
のものが定量的に且迅速に進行するため、試料となる核
酸の所要量は少なくて済み未反応物や副生成物の混入量
が少ないため、解析の効率は大いに高まる。
【図１】標識化合物合成ルートを示した説明図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】標識化反応を示した説明図である。
ｎ ２〜１８の整数 Ｃy Bz Ｎ−ベンゾイルシトシン−１−イル ＤＭＴｒ ジメトキシフェニルフェニルメチル ＰＳＳ シクロヘキシルアンモニウムＳ，Ｓ′−ジフ
ェニルホスホロジチオエート ＤＤＳ イソデュレンジスルフォニルクロリド Ｂｕ ブチル Ｍｅ メチル 5'-AMP アデノシン５′−一リン酸 Ａｄ アデニン−９−イル Ｃy シトシン−１−イル Ｂ Ａｄ、Ｃｙ、グアニン−９−イル、チミン−
１−イル、ウラシル−１−イル
ェニルホスホロジチオエート ＤＤＳ イソデュレンジスルフォニルクロリド Ｂｕ ブチル Ｍｅ メチル 5'-AMP アデノシン５′−一リン酸 Ａｄ アデニン−９−イル Ｃy シトシン−１−イル Ｂ Ａｄ、Ｃｙ、グアニン−９−イル、チミン−
１−イル、ウラシル−１−イル
Claims (2)
- 【請求項１】 下記式（Ｉ）で示されるＤ−ビオチン誘
導体 【化１】 （ここに、ｎは２から１８までの整数を、Ａｄはアデニ
ン−９−イルを、Ｃy はシトシン−１−イルを、ＸはＯ
またはＮＨを、Ｙ1 、Ｙ2 、Ｙ3 はＨ、アルカリ金属、
アンモニウムイオンおよび低級アルキル置換アンモニウ
ムイオンを表す）。 - 【請求項２】 ほぼ中性領域の緩衝液中において、Ｔ４
ＲＮＡリガーゼの存在下、０℃〜２０℃、常圧下で、式
（Ｉ）で表されるＤ−ビオチン誘導体と核酸ＲＮＡの
３′末端ＯＨを反応させることによる核酸ＲＮＡの３’
末端標識方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4161695A JPH05331185A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 核酸ｒｎａの３′末端標識 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4161695A JPH05331185A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 核酸ｒｎａの３′末端標識 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05331185A true JPH05331185A (ja) | 1993-12-14 |
Family
ID=15740110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4161695A Withdrawn JPH05331185A (ja) | 1992-05-29 | 1992-05-29 | 核酸ｒｎａの３′末端標識 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05331185A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142202A1 (ja) | 2006-06-06 | 2007-12-13 | Panasonic Corporation | ヌクレオチド鎖修飾方法 |
| EP1540007A4 (en) * | 2002-07-12 | 2008-05-28 | Affymetrix Inc | NUCLEIC ACID MARKING METHODS |
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1992
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