JPH0534353A - ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの免疫学的定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの免疫学的定量法
の提供。 【構成】ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼに対し、特異的に
結合する２種類のモノクローナル抵抗を、固相担体に結
合させる抗体、あるいは標識物を付与する抗体として用
いて、サンドイッチ法により免疫学的に測定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、医学的生理学的分野に用いられ
るヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの免疫学的定量法に関す
る。

【０００２】さらに詳しく言えば、本発明は、ヒト９２
ｋＤａゼラチナーゼの特定のアミノ酸配列に対し、特異
的に結合するモノクローナル抗体を用いてヒト９２ｋＤ
ａゼラチナーゼを免疫学的に定量する法に関する。

【０００３】

【背景技術】細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロ
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラ
ミニンなどの粘着性糖蛋白質から構成されている。これ
らマトリックス成分の分解には、マトリックスメタロプ
ロテアーゼ（ＭＭＰ）が重要な役割を果たしているが、
ＭＭＰ−９と称される９２ｋＤａ（キロダルトン）ゼラ
チナーゼは、ｗｉｌｈｅｌｍら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２９，１９８９，１７２１３−１７２２１）により
ＳＶ４０形質転換ヒト胎児肺線維芽細胞、ヒト肺マクロ
ファージ、外形核白血球、単球性白血病Ｕ９３７細胞、
線維肉腫ＨＴ１０８０細胞およびケラチノサイトなどに
より産生され、ゼラチンやＩＶ型コラーゲンを分解する
活性を有していることが報告されている。

【０００４】このように、ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼ
（以下、ヒトＭＭＰ−９と記す）は、ゼラチンやＩＶ型
コラーゲンを分解する酵素（ＩＶ型コラゲナーゼ）であ
るが、Ｂｅｒｇｍａｎｎらは、ヒト多形核白血球からヒ
トＭＭＰ−９を調製し、そのヒトＭＭＰ−９に対するウ
サギポリクローナル抗体を用いて、競合反応あるいはサ
ンドイッチ法により、ヒトＭＭＰ−９を定量している
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２７，１９８９，３５１−３５９）。この方法で
は、固相担体にＩＶ型コラゲナーゼの基質（ゼラチン）
を吸着させ、検体中の抗原と反応させ、さらにポリクロ
ーナル抗体を反応させる方法が用いられている。

【０００５】しかしながら、この方法ではポリクローナ
ル抗体を使用しているために、定量法としては反応時間
が長く、精度が低いことなどの欠点が存在する。

【０００６】

【発明の目的】本発明の目的は、ヒトＭＭＰ−９に対
し、特異的に結合するモノクローナル抗体を用いて、被
検試料中のヒトＭＭＰ−９を精度良く、簡便かつ迅速に
定量する方法を提供することにある。

【０００７】

【発明の開示】本発明は、ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼ
に対し、特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体
を、固相担体に結合させる抗体、あるいは標識物を付与
する抗体として用いて、サンドイッチ法により免疫学的
に測定を行うことを特徴とするヒト９２ｋＤａゼラチナ
ーゼの定量法を提供するものである。

【０００８】本発明の方法は、固相担体に結合させる抗
体あるいは標識物を付与する抗体として、ヒトＭＭＰ−
９の異なる抗原決定基に対し特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体をそれぞれ、使用することを特徴とするもの
である。

【０００９】本発明の方法において、抗原抗体反応を行
わしめるにあたり、その反応液中に適量のポリオキシエ
チレンラウリルアルコールエーテルを加えることによ
り、非特異結合や抗原抗体反応の血清タンパク質による
干渉を減少させることができるので、これにより、検体
中のヒトＭＭＰ−９量をより正確に測定することができ
る。このポリオキシエチレンラウリルアルコールエーテ
ルの使用量は、好ましくは、濃度範囲で、通常０．０２
〜０．１％（ｗ／ｖ）である。

【００１０】本発明の定量方法においては、免疫学的測
定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体
等タンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカー
ボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製の
ボール、マイクロプレート、スティック、微粒子あるい
は試験管等の種々の材料および形態を任意に選択し、使
用することができる。一方、標識物を付与する抗体とし
ては、抗体含有物を硫安分画した後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｃｅｌの如き、陰イオン交換ゲルおよびＩｇＧ画
分、さらにはペプシン消化後還元して得られる特異的結
合部Ｆａｂ′を用いることができる。これらの場合の標
識物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
等）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素等が
ある。

【００１１】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
るが、本発明は、これら実施例により限定されるもので
はない。

【００１２】実施例１ 抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗体の作製 （ａ） ヒトＭＭＰ−９ポリペプチドの調製 ヒトＭＭＰ−９ポリペプチドは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６４，１９８９，１７２１３−１７２２１に記
載のｗｉｌｈｅｌｍらのアミノ酸配列を用いた。表１に
示したヒトＭＭＰ−９ポリペプチド（Ｐ−１〜Ｐ−３）
を各々ペプチドシンセサイザー９６００（ミリジェン／
バイオサーチ）で合成した。なお、各ペプチドＣ末端に
システインを導入した。合成ペプチドの純度が約７０％
以下のものは、μＢｏｎｄａｓｈｅｒｅ（５μ、Ｃ１８
−１００Å、ウォーターズ）カラムを用いて高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製した。

【００１３】（ｂ） 各ポリペプチドと牛血清アルブミ
ンまたは各ポリペプチドとキーホールリンペットヘモシ
アニンの複合体の調製 ２ｍｇ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｌの０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したもの、あるいは
２ｍｇキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を
１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し
たものと１．８５ｍｇＮ−（ε−マレイミドカプロイル
オキシ）コハク酸イミドを２００μｌのジメチルホルム
アミドに溶解したものとを混合し、３０℃、３０分間イ
ンキュベーションした。次に上記の混合液を０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラ
ム（セファデックスＧ−２５Ｍ、ファルマシア）に供
し、マレイミドが結合されたＢＳＡまたはマレイミドが
結合されたＫＬＨを分取し、１．５ｍｌ以下に濃縮し
た。マレイミドが結合されたＢＳＡまたはマレイミドが
結合されたＫＬＨに対し５０倍モル量の前記（ａ）で合
成した各ヒトＭＭＰ−９ポリペプチドを１ｍｌの０．１
Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ７．０）に溶解したものと混合
した。４℃、２０時間インキュベーションし、ＭＭＰ−
９ポリペプチド−ＢＳＡおよびＭＭＰ−９ポリペプチド
−ＫＬＨ複合体を各々調製した。

【００１４】（ｃ） 抗体産生細胞の調製 前記（ｂ）の方法により調製した各複合体２５０μｇを
完全フロイントアジュバントと共に８週令Ｂａｌｂ／ｃ
雌マウスにそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。１５
日後に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した
各複合体２００μｇを初回免疫したそれぞれのマウスに
腹腔内投与し追加免疫した。さらに、３８日後に追加免
疫時と同様に各複合体７０μｇを静脈内および１３０μ
ｇを腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後に脾臓
を摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。

【００１５】（ｄ） 細胞融合 （１） 以下の材料および方法を用いた。 ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を
加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東
洋メンブレンフィルターで除菌濾過した。

【００１６】ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ １６４０培
地に除菌濾過した仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加
えた。

【００１７】ＰＥＧ ４，０００溶液：ＲＰＭＩ １６
４０培地にポリエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ
４，０００、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／
ｗ）になるように加え、無血清溶液を調製した。

【００１８】８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ
２（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔ
ｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ ａ
ｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ
ｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、３５１−３
７２に記載のｏｉらの方法を若干改変して行った。

【００１９】（２） 前記（ｃ）で調製した有核脾臓細
胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１
００％）とを５：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエ
ローマ細胞とを別に前記のＲＰＭＩ １６４０培地で洗
浄し、次に同じ培地に懸濁し、融合させるため上記の割
合で混合した。容量２５０ｍｌのポリプロピレン製遠沈
管（岩城硝子）を用い、４０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０
培地中４００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を完全に
吸出した。沈殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ４，０００溶液
６．０ｍｌを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さ
らに１分間撹拌し細胞を再懸濁、分散させた。次に３７
℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地６．０ｍｌを１分間で滴
下した。この操作をさらに１回繰り返した後、同培地４
２．０ｍｌを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し細胞
を分散させた。これを４００×ｇ、１０分間遠心分離
し、上清を完全に吸引除去した。次にこの沈殿細胞に３
７℃加温ＮＳ−１培地６０ｍｌを速やかに加え、細胞の
大きい塊を１０ｍｌのピペットを用いて注意深くピペッ
ティングして分散した。さらに同培地１２０ｍｌを加え
て希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウエル（岩城
硝子）にウエル当り６．０×１０^５個／０．１ｍｌの細
胞を加えた。細胞を加えた上記のマイクロウエルを７％
炭酸ガス／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下
に培養に付した。

【００２０】（ｅ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 （１） 使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ培地：前記（ｄ）で述べたＮＳ−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）アミノプテリン（０．４
μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。

【００２１】ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外
は上記ＨＡＴ培地と同一組成のものである。

【００２２】（２） 前記（ｄ）の培養開始後翌日（１
日目）、細胞にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴
（約０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８、１１日目
に培地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き
換え、１４日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換
えた。以降３〜４日毎に培地の半分を新しいＨＴ培地で
置き換えた。通常約２週間で充分なハイブリドーマの生
育が観察される。ハイブリドーマ生育全ウエルについて
次項（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳ
Ａ）により陽性ウエルをチェックした。次にフィーダー
として１０^７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌ
をポリスチレン製２４穴セルウエル（岩城硝子）に加え
たものを用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマ
の全内容物を移した。これを前記（ｄ）におけると同様
に７％炭酸ガス存在下、３７℃で約１週間培養に付し
た。その間１〜２回各ウエルの上清０．５ｍｌを新しい
ＨＴ培地０．５ｍｌと交換した。ハイブリドーマの充分
生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性を再確認し、そ
れぞれについて次項（ｇ）記載の限界希釈法によるクロ
ーニングを行った。なお、クローニングに使用後の残液
をポリスチレン製２５ｃｍ^２組織培養フラスコ（岩城硝
子）に移し、凍結保存用試料を調製した。

【００２３】（ｆ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＭＭＰ
−９抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４
（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改
変した方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体
の検出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプ
レート（ＦｌｏｗＬａｂ．）を１００ｎｇの各ヒトＭＭ
Ｐ−９ポリペプチドでコートし、次に、未コート部分を
１％ＢＳＡでブロックした。これに前記（ｅ）で得られ
たハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温
で約１時間インキュベートした。２次抗体として西洋わ
さびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を加え、さらに室温で約１
時間インキュベートした。次に基質である過酸化水素と
ｏ−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の程度をマ
イクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋ソーダ）
を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定し判定した。

【００２４】（ｇ） クローニング 前記（ｅ）の操作後、各ウエル中には、２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０^７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエルにウエル当り５個、１
個および０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目、
１２日目に全ウエルに各約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を
追加した。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハ
イブリドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウエ
ルが５０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行っ
た。テストした全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウ
エル中のコロニー数を確認し、ウエル中に１コロニーが
確認されたウエルを４〜６個選び再クローニングする。
最終的に表２に示したようにヒトＭＭＰ−９ポリペプチ
ドに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得
た。

【００２５】（ｈ） モノクローナル抗体の生体外増殖
および生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ
マウス）にマウス１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．）を腹腔内投与し
た。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０^７個を
同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後に生体内
で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を
含む腹水を得ることができた。

【００２６】（ｉ） モノクローナル抗体の重鎖および
軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトＭＭＰ−９ポリペ
プチドをコートしたミクロタイトレーションプレート
に、前記（ｇ）で得られた各モノクローンの培養上清を
加えた。次にＰＢＳにより洗浄した後、アイソタイプ特
異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）
を加えた。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、
基質として過酸化水素および２，２′−アジノ−ジ（３
−エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用いてそれぞれの重
鎖および軽鎖を判定した。その結果をまとめて表２に示
した。

【００２７】（ｊ） モノクローナル抗体の精製 前記（ｈ）で得られた各腹水を４０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画した後、ＩｇＧ１クラスの抗体について０．
５Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ８．９）で平衡化したプロテインＡアフィゲ
ル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムに吸着させ、上記洗浄液で
洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出
することにより精製した。

【００２８】実施例２ ヒトＭＭＰ−９の調製 （ａ） 細胞培養 ヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０（アメリカンタイプカルチ
ャーコレクションから購入）をＮＳ−１培地で、３７
℃、５％炭酸ガス存在下、３〜４日間培養した。培養上
清を捨て、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと記す）を適量加
えゆるやかに振とう洗浄した。次に、０．１２５％トリ
プシンおよび０．０１％エチレンジアミン四酢酸ナトリ
ウム（以下ＥＤＴＡと記す）を含むＰＢＳを加え、軽く
ゆすって細胞を培養フラスコからはがした（１分以内）
後、ＮＳ−１培地を適量加えた。遠心後、上清を捨て、
ＮＳ−１培地を適量加え、細胞を懸濁した後、新しい培
養フラスコに約２×１０^５個／ｍｌの細胞を添加し、３
７℃、５％炭酸ガス存在下、３〜４日間培養した。

【００２９】（ｂ） 細胞刺激 培養細胞に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ一α）を作用させるこ
とにより行う。前項（ａ）で培養した培養液を捨て、約
１００ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を加え、最終濃度
０．２％および１００Ｕ／ｍｌになるようにラクトアル
ブミン水解物（Ｇｉｂｃｏ）およびＴＮＦ−α（Ｇｅｎ
ｚｙｍｅ）を各々加える。３７℃、５％炭酸ガス存在
下、７〜１０日間静置し、その培養上清に最終濃度１０
ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加え、ヒトＭＭＰ−９調製
用材料とした。

【００３０】（ｃ） ヒトＭＭＰ−９の調製 前項（ｂ）で調製した培養上清に最終濃度８０％飽和に
なるように硫酸アンモニウムを加え、遠心後の沈殿に適
量のＰＢＳを加え、溶解し、ＰＢＳに対し透析した。Ｍ
ＭＰ−２を除くため、透析後の溶液を、抗（ＭＭＰ−
２）抗体（クローンＮｏ．４３−３Ｆ９）結合カラムに
供し、その素通り画分を採取した。さらに、抗（ＭＭＰ
−９）抗体（クローンＮｏ．５７−１３Ｄ８）結合カラ
ムに供し、その吸着蛋白質を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）、続いて０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）
で溶出した。ｐＨ６で溶出された画分には、ＭＭＰ−９
が含まれており、ＳＤＳ電気泳動上、ほぼ単一にまで精
製された。一方、ｐＨ４で溶出された画分には、ＳＤＳ
電気泳動上、ＭＭＰ−９とＴｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ
（以下ＴＩＭＰと記す）が存在しており、ＭＭＰ−９と
ＴＩＭＰの複合体が得られたと考えられる。後述する酵
素免疫学的定量（以下ＥＩＡと記す）には、ｐＨ６で溶
出されたＭＭＰ−９を標準抗原として使用した。

【００３１】実施例３ 酵素標識抗体の調製 （ａ） ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体の調製 １） ＳＨ基標識ＩｇＧの調製 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４，２０９〜３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に従って、マ
ウス抗ヒトＭＭＰ−９ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を調製し
た。ヒトＭＭＰ−９に対し、反応性が認められたモノク
ローナル抗体（ＩｇＧ；クローンＮｏｓ．５６−２Ａ４
および５７−１３Ｄ８）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）に対し透析し、その溶液に含有するＩｇＧに対
して１００倍モルのＳ−アセチルメルカプト無水コハク
酸をジメチルホルムアミド溶液として加え、３０℃、３
０分間インキュベーションした。次に、０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、０．１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ溶液（ｐＨ６．０）１０μｌ、１Ｍヒドロキシル
アミン溶液（ｐＨ７．０）１００μｌを加え、３０℃、
５分間静置後、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−２５でゲル濾過し、ＳＨ基標識マウス抗ヒトＭＭＰ−
９ＩｇＧを得た。

【００３２】２） マレイミド標識ペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）の調製 ＰＯＤを１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、そのＰＯＤ量に対
して２５倍モル量のＮ−（ε−マレイミドカプロイルオ
キシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ）をジメチルホルムア
ミド溶液として加え、３０℃、３０分間反応させた。こ
の反応液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で，平
衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムでゲル濾過
し、マレイミド標識ＰＯＤ画分を分取した。

【００３３】３） ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体の調製 上記１）で調製したＳＨ基標識ＩｇＧ １モルに、上記
２）で得られたマレイミド標識ＰＯＤ約５モルを加え、
４℃、２０時間静置した。この混合液を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ
ＡｃＡ ４４カラムでゲル濾過し，マウス抗ヒトＭＭＰ
−９ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体画分を分取した。ＢＳＡお
よびチメロサールを各々０．１％および０．００５％に
なるように添加し、４℃で保存した。

【００３４】（ｂ） Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体の調製 １） Ｆａｂ′の調製 マウス抗ヒトＭＭＰ−９ ＩｇＧ（クローンＮｏ．５６
−２Ａ４）を、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）
に透析し、そのＩｇＧ量に対し、１％（ｗ／ｗ）ペプシ
ンを加え、３７℃、１８時間消化した。その消化液に２
Ｍトリス溶液を加えてｐＨを７．０に調整することによ
り、消化反応を停止させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ５４カ
ラムでゲル濾過することにより、Ｆ（ａｂ′）_２画分を
分取した。次にＦ（ａｂ）_２画分を５ｍＭ ＥＤＴＡ含
有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に透析し、それ
に終濃度１０μＭとなるようにアミノエタンチオール
（ＭＥＡ）を加え、３７℃、１．５時間還元した。その
後、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ５４カ
ラムでゲル濾過し、Ｆａｂ′画分を分取した。

【００３５】２） Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体の調製 上記１）で調製したＦａｂ′に対して、前記（ａ）−
２）項記載の方法に従って調製したマレイミド標識ＰＯ
Ｄを等モル加え、更に、Ｆａｂ′およびマレイミド標識
ＰＯＤの終濃度が１００μＭとなるように５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し
た。この混合液を４℃、２０時間静置後、Ｆａｂ′に対
して１０倍モル量のＮ−エチルマレイミドで未反応チオ
ール基をブロックした。これを、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ
５４カラムでゲル濾過し、Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体画
分を分取後、ＢＳＡおよびチメロサールを各々０．１％
および０．００５％になるように添加し、４℃で保存し
た。

【００３６】実施例４ ヒトＭＭＰ−９の定量法 （ａ） モノクローナル抗体結合担体の調製法 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４，２０９〜３２７（１
９８３）に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に従って、
マウス抗ヒトＭＭＰ−９ ＩｇＧ（クローンＮｏｓ．５
６−６Ｄ１、５６−２Ａ４および５７−１３Ｄ８）を各
々０．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解し、１００μｇ／ｍｌ（Ａ_２８０
＝０．１５）の濃度に調製した。そのモノクローナル抗
体溶液を９６穴マイクロプレートにウエル当り１００μ
ｌずつ加え、あるいは、その抗体溶液にポリスチレンボ
ール（φ６．５ｍｍ、イチコ）を浸漬し、４℃、２４時
間静置した。次にモノクローナル抗体溶液を除去し、各
々生理食塩液で２回洗浄後、１％ＢＳＡ−０．１Ｍ塩化
ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
浸漬し、４℃で保存した。

【００３７】（ｂ） １ステップサンドイッチＥＩＡ法 １％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ
ＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以
下緩衝液Ａと記す）で希釈した精製ヒトＭＭＰ−９ある
いはヒトＭＭＰ−９を含む検体を９６穴ビニルプレート
（Ｆａｌｃｏｎ）あるいは、プラスチックチューブ（１
２×７５ｍｍ）に各々１０μｌあるいは２０μｌ加え
た。次に実施例３−（ａ）あるいは、同（ｂ）項で調製
したＩｇＧ（クローンＮｏ．５６−２Ａ４）−ＰＯＤあ
るいは、Ｆａｂ′（クローンＮｏ．５６−２Ａ４）−Ｐ
ＯＤ複合体を３０００ｎｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａ
で希釈し、上記ビニルプレートあるいは、プラスチック
チューブに各々１００μｌあるいは、３００μｌずつ加
え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製した抗体
結合プレートに１００μｌあるいは、この混合液中に抗
体結合ボールを加え、室温で１時間反応させ、生理食塩
液あるいは、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下緩衝液Ｂと記す）で３
回洗浄した。次に、０．０２％過酸化水素含有０．１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶解した４ｍ
ｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミンをウエル当り１００
μｌあるいは、チューブ当り３００μｌ加え、室温で３
０分間反応後、２Ｎ硫酸１００μｌあるいは、１ｍｌを
添加し、反応を停止させた。この反応混液のＡ_４９２を
マイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４東洋ソーダ）
あるいは、マイクロフロースペクトロフォトメーターＵ
Ｖ７３０（島津製作所）を用いて測定し、検量線より検
体中のヒトＭＭＰ−９量を求めた。

【００３８】以上の操作法を表３に示した。表３記載の
プレート法により、クローンＮｏ．５６−２Ａ４からの
ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体および前記（ａ）項で調製した３
種の抗体結合担体を用い、検量線が描けるか調べた（表
４）。固相抗体にクローンＮｏ．５６−２Ａ４からのＩ
ｇＧを使用した場合、酵素標識抗体と同一部位を認識す
るため、標準抗原の高濃度側でも、吸光度の上昇は認め
られなかった（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）。
クローンＮｏ．５６−６Ｄ１の場合、クローンＮｏ．５
６−２Ａ４と免疫原が同一のため、ほぼ抗原中の同一部
位を認識していると思われる。クローンＮｏ．５７−１
３Ｄ８からのＩｇＧを使用した場合、標準抗原の濃度に
依存した吸光度が得られた。検量線において、標準抗原
３７ｎｇ／ｍｌの濃度まで直線性が認められた。従っ
て、本発明では固相および酵素標識複合体用モノクロー
ナル抗体として、クローンＮｏｓ．５７−１３Ｄ８およ
び５６−２Ａ４からの抗体を以下の免疫学的定量法に使
用した。しかし、本発明はこれに限定されるものではな
い。

【００３９】（ｃ） ２ステップサンドイッチＥＩＡ法 緩衝液Ａあるいは１％ＢＳＡ、０．１２５Ｍ塩化ナトリ
ウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ブリッジ−
３５含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、
緩衝液Ｃと記す）で希釈した精製ヒトＭＭＰ−９あるい
は検体をビニルプレートあるいはチューブに各々２０μ
ｌ加え、次に緩衝液ＡあるいはＣを各々１００μｌある
いは３００μｌ加え、混合した。この混合液１００μｌ
を前記（ａ）項で調製した抗体結合プレートに、あるい
は、この混合液中に抗体結合ボールを加え、室温で１時
間反応させた。反応後、生理食塩液あるいは緩衝液Ｂで
洗浄し、実施例３−（ａ）あるいは同（ｂ）項で調製し
たＩｇＧ（クローンＮｏ．５６−２Ａ４）−ＰＯＤある
いはＦａｂ′（クローンＮｏ．５６−２Ａ４）−ＰＯＤ
複合体を１５００ｎｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａで希
釈し、各々１００μｌあるいは３００μｌずつ加えた。
室温で１時間反応させた後、以下の操作は、前記（ｂ）
項と同様に行った。以上の操作法を表５に示した。

【００４０】（ｄ） サンドイッチアッセイ法による血
清中ヒトＭＭＰ−９の測定 前記（ｂ）および（ｃ）項で記載したプレート１ステッ
プ法およびプレート２ステップ法により、精製ヒトＭＭ
Ｐ−９（標準抗原）および検体として健常人血清を各々
測定した（表６−１，６−２）。ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体
使用時、標準抗原においては、１ステップ法の方が吸光
度が高く、検量線の直線性は標準抗原３１−１０００ｎ
ｇ／ｍｌの範囲内で認められたが、血清中の抗原をほと
んど検出できなかった。２ステップ法では、吸光度は低
いが、検量線の直線性は標準抗原１６−１０００ｎｇ／
ｍｌの範囲内で認められ、血清中の抗原も検出すること
ができた。Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体を使用した時、Ｉｇ
Ｇ−ＰＯＤ複合体使用時に比べ、吸光度は低く、１ステ
ップ法では標準抗原３１−１０００ｎｇ／ｍｌの範囲内
で、２ステップ法では、標準抗原１６−１０００ｎｇ／
ｍｌの範囲内で検量線に直線性が認められた。

【００４１】１ステップ法では、血清中の抗原を検出で
きなかったため、ボール法では２ステップ法のみ行った
（表６−３）。ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を使用した場合、
標準抗原９４−３０００ｎｇ／ｍｌの範囲内で検量線の
直線性が認められたが、Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体を使用
した場合、標準抗原３０００ｎｇ／ｍｌでも吸光度は低
かった。

【００４２】標準抗原において、プレート法の方が吸光
度が高く、検量線における直線性最少下限濃度もプレー
ト法の方が低かった。また、血清中の抗原においても検
出効率が高いと考えられた。プレート２ステップ法にお
いて、標準抗原０ｎｇ／ｍｌの吸光度を６回測定し、そ
の平均値（ｘ）と標準偏差（ＳＤ）を算出し、ｘ＋２Ｓ
Ｄに相当する標準抗原濃度を感度とするとき、その感度
は、約１５ｎｇ／ｍｌであった。

【００４３】実施例５ ポリオキシエチレンラウリルア
ルコールエーテル添加効果 抗体結合担体と標準抗原液あるいは検体（健常人血清）
中抗原の反応の際、その反応液として０．０５％ポリオ
キシエチレンラウリルアルコールエーテル（ブリッジ−
３５）を含む緩衝液Ｃを用い、血清タンパク質の干渉に
対する効果を調べた。対照として緩衝液Ａを用いた。血
清の中に既知量の標準抗原を加え、２ステップサンドイ
ッチＥＩＡ法により測定し、その加えた標準抗原の回収
率を調べた（表７）。緩衝液Ａを用いた場合、標準抗原
の平均回収率は８４％であり、緩衝液Ｃを用いた場合、
ブリッジ−３５による吸光度の低下は認められるが、加
えた標準抗原量のほぼ１００％回収された。従って、緩
衝液Ｃを用いた場合、血清２０μｌ中の抗原量を正確な
値として読みとれることが認められた。

【００４４】実施例６ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃａｐｔ
ｕｒｅイムノアッセイ法 （ａ） ゼラチン結合担体の調製法 ゼラチン（豚皮膚由来、仔牛皮膚由来、牛骨由来等）を
１ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で溶解し、９６穴マイクロプレートにウエル当
り１００μｌずつ加え、４℃に２４時間静置した。次
に、ゼラチン溶液を除去し、生理食塩液で２回洗浄後、
１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有３０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μｌを加え、４℃で保存
した。

【００４５】（ｂ） Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃａｐｔｕ
ｒｅイムノアッセイ法 １） １ステップアッセイ法 実施例４−（ｂ）項記載の操作法と同様に行った。緩衝
液Ａで希釈した標準抗原あるいは検体を９６穴ビニルプ
レートに１０μｌあるいは２０μｌ加えた。次に実施例
３−（ａ）項で調製したＩｇＧ（クローンＮｏｓ．５６
−２Ａ４または５７−１３Ｄ８）−ＰＯＤ複合体を各々
５００ｎｇ／ｍｌあるいは３０００ｎｇ／ｍｌになるよ
うに緩衝液Ａで希釈し、上記ビニルプレートに１００μ
ｌずつ加え、混合した。この混合液を前記（ａ）項で調
製したゼラチン結合プレートに各々１００μｌずつ加
え、室温で１時間反応させ、生理食塩液あるいは緩衝液
Ｂで３回洗浄した。次に、０．０２％過酸化水素含有
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶解
した４ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミンをウエル当
り１００μｌを加え、室温で３０分間反応後、２Ｎ硫酸
１００μｌを添加し、反応を停止させた。この反応混合
液のＡ_４９２値を測定した。

【００４６】２） ２ステップアッセイ法 実施例４−（ｃ）項に記載の方法に従い、標準抗原ある
いは検体をビニルプレートに１０μｌあるいは２０μｌ
加え、次に緩衝液Ａを１００μｌ加え混合した。この混
合液１００μｌを前記（ａ）項で調製したゼラチン結合
プレートに加え、室温で１時間反応させた。反応後、ウ
エルを洗浄し、実施例３−（ａ）項で調製したＩｇＧ
（クローンＮｏｓ．５６−２Ａ４または５７−１３Ｄ
８）−ＰＯＤ複合体を各々５００ｎｇ／ｍｌあるいは３
０００ｎｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａで希釈し、ウエ
ルに１００μｌずつ加え、室温で１時間反応させた。以
下の操作は前記（ｂ）項と同様に行った。

【００４７】（ｄ） Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃａｐｔｕ
ｒｅイムノアッセイ法による血清中ヒトＭＭＰ−９の測
定 ヒトＭＭＰ−９のＣ末端あるいはＮ末端のアミノ酸配列
を認識するＩｇＧ（各々クローンＮｏｓ．５６−２Ａ４
あるいは５７−１３Ｄ８）−ＰＯＤ複合体を使用し、前
記（ｂ）項記載の方法に従い、１ステップアッセイ法あ
るいは２ステップアッセイ法により、検体（健常人血
清）を測定した。その結果を表８−１，８−２に示し
た。１ステップ法では、標準抗原における吸光度は高い
が、血清中の抗原を検出することができなかった。一
方、２ステップ法では、標準抗原における吸光度は低い
が、血清中の抗原を定量することができた。１ステップ
法では、クローンＮｏｓ．５６−２Ａ４あるいは５７−
１３Ｄ８からのＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を使用した時、標
準抗原３１−１０００ｎｇ／ｍｌの範囲内で両方の場合
とも検量線の直線性が認められ、２ステップ法では、ク
ローンＮｏ．５６−２Ａ４からのＩｇＧ−ＰＯＤ複合体
を使用した場合、標準抗原６３−２０００ｎｇ／ｍｌの
範囲内で、一方、クローンＮｏ．５７−１３Ｄ８からの
ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を使用した場合、標準抗原１２５
−２０００ｎｇ／ｍｌの範囲内で検量線に直線性が認め
られた。

【００４８】なお、使用する固相抗体濃度、標準抗体濃
度等により、感度あるいは検量線の直線性の範囲を随時
変更することができる。

【００４９】

【表１】

【００５０】

【表２】

【００５１】

【表３】

【００５２】

【表４】

【００５３】

【表５】

【００５４】

【表６】

【００５５】

【表７】

【００５６】

【表８】

【００５７】

【表９】

【００５８】

【表１０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 新谷 孝 富山県高岡市野村1297番地14号 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市五十里東町190番地

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト９２ｋＤａゼラチナーゼに対し、特
   異的に結合する２種類のモノクローナル抗体を、固相担
   体に結合させる抗体、あるいは標識物を付与する抗体と
   して用いて、サンドイッチ法により免疫学的に測定を行
   うことを特徴とするヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの定量
   法。
2. 【請求項２】 固相担体に結合させたモノクローナル抗
   体と検体中のヒト９２ｋＤａゼラチナーゼとの抗原抗体
   反応を行わしめるにあたり、その反応液中に適量のポリ
   オキシエチレンラウリルアルコールエーテルを加えるこ
   とにより、検体中のヒト９２ｋＤａゼラチナーゼを測定
   することを特徴とする請求項１に記載のヒト９２ｋＤａ
   ゼラチナーゼの定量法。
3. 【請求項３】 固相担体にゼラチンを結合させ、ヒト９
   ２ｋＤａゼラチナーゼに対し特異的に結合するモノクロ
   ーナル抗体に標識物を付与し、ゼラチンと標識物を付与
   したモノクローナル抗体の両者を使用することを特徴と
   する請求項１に記載のヒト９２ｋＤａゼラチナーゼの定
   量法。