JPH053797A

JPH053797A - ピルビン酸測定方法

Info

Publication number: JPH053797A
Application number: JP15681291A
Authority: JP
Inventors: Akio Karigome; 昭夫刈米; Yukie Inoue; 幸枝井上; Ryuzo Hayashi; 隆造林
Original assignee: Kanzaki Paper Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Kanzaki Paper Manufacturing Co Ltd
Priority date: 1991-06-27
Filing date: 1991-06-27
Publication date: 1993-01-14

Abstract

(57)【要約】【目的】ピルビン酸の測定において、安定かつ簡便かつ
精度よく安価に測定できる方法を提供する。【構成】金属イオンとフラビンモノヌクレオチドと無機
リン酸、さらにチアミンピロリン酸を含む緩衝液を連続
的に送液し、その緩衝液に試料を注入し、さらに固定化
したピルビン酸オキシダーゼに導き、生成する過酸化水
素もしくは減少する酸素の量を過酸化水素電極もしくは
酸素電極で、電気化学的に定量することによりピルビン
酸を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、固定化酵素を用いた測
定法に関し、特に血液、培養液、発酵液等に含まれるピ
ルビン酸を酵素法によって、安定で簡便かつ精度よく測
定できる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ピルビン酸は、生体内の代謝系において
解糖系、クエン酸回路、脂肪酸代謝経路の中間代謝物
で、さまざまな酵素の基質もしくは生成物となる。その
ためピルビン酸濃度を測定することにより、生体液中の
酵素活性の測定を行うことができ、代謝異常や疾患の診
断に利用されている。例えば、心筋、肝臓、骨格筋、腎
臓に含まれるグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナ
ーゼもしくは肝臓、腎臓に含まれるグルタミン酸ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ等の酵素活性を測定することは
肝炎、肝硬変等の肝疾患、心筋硬塞、感染性疾患の診断
に有用である。これらの酵素は、単独、または他の酵素
と組み合せることによりピルビン酸を生成する。

【０００３】また発酵工程管理においてもピルビン酸の
測定は不可欠である。例えば日本酒の製造工程管理にお
いてピルビン酸量を測定し、発酵工程の停止時期を調整
することにより、清酒の異臭発生を防げることが知られ
ている。従来、乳酸脱水素酵素を用いピルビン酸の還元
の際にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型
（ＮＡＤＨ）から生じるニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤ）を測定する方法がある。しかしこの
方法では操作が煩雑で高価な補酵素を大量に消費すると
いう欠点がある。また、ピルビン酸を含む試料にピルビ
ン酸オキシダーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅ
ＥＣ．１．２．３．３．）を作用させ、生成した過酸
化水素の量を発色剤を用いて比色法により定量するとい
う方法があった（特公昭５９−１５６３７号）。しかし
この方法では、測定操作が煩雑であること、また試料が
着色している場合には分光光度計を用いた測定は困難で
あること、酵素を使い捨てにするため測定コストがかか
ること、ピルビン酸オキシダーゼ自身が溶液中では不安
定なため測定の再現性が悪いこと、ピルビン酸自体によ
り発色反応が阻害される可能性がある、等の問題があっ
た。

【０００４】そこでこれらの問題点を解決するために、
ピルビン酸オキシダーゼを固定化し、過酸化水素電極ま
たは酸素電極と組み合せて電気化学的に測定する方法が
研究されている（特公平２−４８０５９号）。ピルビン
酸オキシダーゼはピルビン酸、リン酸および酸素からア
セチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生成する
反応を触媒する酵素であり、ペディオコッカス、ストレ
プトコッカスおよびアエロコッカス等の微生物の菌体内
に見られる酵素である。この酵素はマグネシウムイオ
ン、カルシウムイオン、マンガンイオンおよびコバルト
イオン等の金属イオンにより活性化され、エチレンジア
ミン四酢酸によりこれらの金属イオンをキレートすると
阻害される性質がある。またこの反応においては、基質
として無機リン酸が必要であり、またコファクターとし
てチアミンピロリン酸（以下ＴＰＰと略す）、フラビン
アデニンジヌクレオチド（以下ＦＡＤと略す）が必要で
あることは知られている（特公昭５９−１５６３７
号）。そのためピルビン酸オキシダーゼを固定化し、過
酸化水素電極または酸素電極と組み合せて電気化学的に
測定する方法では、酵素反応を安定に行うために、これ
らの成分を含んだ緩衝液を用いなければならない。

【０００５】上記の文献では、緩衝液中にこれらの補酵
素を加えている。そして、ピルビン酸オキシダーゼの固
定化法としては、コラーゲン、アセチルセルロース、ポ
リカーボネート等の多孔性の高分子膜に固定化し、この
膜を酸素電極、もしくは過酸化水素電極上に装着してい
る。この方法では、緩衝液中の補酵素は分子量が大きい
ため膜内へ浸透しにくく、酵素と補酵素が接触しにくい
ため酵素反応を安定に行うことが難しい。そのため緩衝
液中の補酵素の濃度を高くする必要があるが、ＦＡＤは
非常に高価であるため、測定コストが非常に高価になる
という欠点があった。

【０００６】また、電極上の固定化酵素膜がリアクター
であるため、固定化できる酵素の量が非常に少なく、検
出に必要な充分な感度を得ることが難しい等の問題があ
った。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
を解決し、簡便に安定で精度良く、かつ安価にピルビン
酸を測定する方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、金属イオン、
フラビンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮと略す）、無機
リン酸、およびＴＰＰを含む緩衝液を連続的に送液し、
その緩衝液に試料を注入して、固定化したピルビン酸オ
キシダーゼに導き、生成する過酸化水素もしくは減少す
る酸素の量を、それぞれ過酸化水素電極もしくは酸素電
極で電気化学的に定量することによるピルビン酸測定方
法である。またこの測定法において緩衝液の金属イオン
はマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイ
オンおよびコバルトイオンより選ばれる少なくとも１種
であることが望ましい。さらに、緩衝液の金属イオンが
マグネシウムイオンで、かつ濃度が０．０１〜１０ｍＭ
であり、無機リン酸の濃度が０．１〜２０ｍＭであるこ
とが望ましい。またピルビン酸オキシダーゼは粒状担体
に固定化されていて、その粒状担体がカラム中に充填さ
れており、前記カラムの下流側に過酸化水素電極もしく
は酸素電極が配置されていることが望ましい。

【０００９】

【作用】ピルビン酸オキシダーゼを作用させる際、補酵
素ＦＡＤと、ＴＰＰが必要である。ところが本発明者ら
は、緩衝液の組成について検討した結果、ＦＡＤにかわ
るコファクターとしてＦＭＮが有効であることを見いだ
した。本発明ではＦＭＮを補酵素として用いるが、ＦＭ
Ｎは分子量が４５６であり、ＦＡＤの分子量が７８６で
あるのに比べて小さく、結果的に拡散性に優れており安
定した測定を行えるという点でＦＭＮはＦＡＤに比べて
優れている。

【００１０】また、ＦＡＤは非常に高価なため、緩衝液
に高濃度加えて使い捨てにしていたのでは、コストが高
くて実用には向かない。コスト面においてもＦＭＮはＦ
ＡＤに比べて非常に安価であることから実用に向いてい
る。また、緩衝液としてはリン酸緩衝液、クエン酸リン
酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が使用される。また本発
明者等は緩衝液中のリン酸濃度が高すぎても、マグネシ
ウム等の金属イオン濃度が高すぎても、可逆的阻害を受
けピルビン酸オキシダーゼが失活することを見いだし
た。緩衝液中での望ましい濃度はリン酸では０．１〜２
０ｍＭ程度、金属イオンはマグネシウムの場合、０．０
１〜５０ｍＭ程度である。補酵素のＦＭＮおよびＴＰＰ
の濃度については特に限定するものではないが、例えば
ＦＭＮでは０．１〜５０μＭ程度、ＴＰＰでは０．０５
〜１ｍＭ程度加えられていれば充分である。またｐＨは
用いるピルビン酸オキシダーゼの最適ｐＨ付近で用いる
ことが望ましい。

【００１１】ピルビン酸オキシダーゼの固定化法は主に
２通り考えられる。第１の方法は、過酸化水素電極もし
くは酸素電極の表面にピルビン酸オキシダーゼを固定化
する方法で、例えば多孔性の高分子膜上にピルビン酸オ
キシダーゼを固定化して前記の電極上に固定する方法で
ある。第２の方法は、過酸化水素電極もしくは酸素電極
とは別にピルビン酸オキシダーゼ固定化リアクターを設
けて反応させる方法で、さまざまな固定化法を用いるこ
とができる。第１の方法では電極上にのみ固定化される
のに対して、第２の方法では担体に粒状物質を用いた場
合はその担体量や粒度を変化させることにより固定化す
るピルビン酸オキシダーゼの量を調節することができ、
さまざまな活性のものが得られる利点がある。特に第２
の方法ではピルビン酸オキシダーゼのように酵素活性が
低い場合でも、実用に適する酵素活性にまで活性を高め
ることができ、また、補酵素との接触のしやすさの点か
らも適している。

【００１２】この粒状固定化担体には、ケイソウ土、シ
リカゲル、ガラスビーズ、アルミナ、セラミック、カー
ボン、活性炭、モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セ
ルロース、アガロース、アミノ酸系ポリマー等が例示で
き、固定化法には共有結合法、吸着法等が考えられる。
生成した過酸化水素を測定する過酸化水素電極は、アノ
ード側では、Ｈ₂Ｏ₂→Ｏ₂＋２Ｈ⁺＋２ｅ^- カソード側では、２ＡｇＣｌ＋２ｅ^-→２Ａｇ＋２Ｃｌ^- の反応が起こり電流が生じる。電極の基体としては、ア
ノード側では炭素、白金、ニッケル、パラジウム等を用
いることができる。過電圧が低く高感度が得られる、電
位窓が広いという理由から白金を用いることが望まし
い。そして電極表面にポリシロキサン、アクリル樹脂、
蛋白膜、アセチルセルロース膜等の選択透過膜を有して
もよい。カソード側では一般に銀または銀／塩化銀電極
を用いる。

【００１３】減少した酸素を測定する酸素電極は、カソ
ード側ではＯ₂＋４ｅ^-＋２Ｈ₂Ｏ→４ＯＨ^- アノード側では、４Ａｇ＋４Ｃｌ^-→４ＡｇＣｌ＋４ｅ^- の反応が起こり電流が生じる。電極の基体としては、ア
ノード側では炭素、金、白金、鉛等を用いることがで
き、内部液として塩化カリウム等の電解質を有する。そ
して電極表面にテフロン、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン等の選択透過膜を有してもよい。カソード側では一般
に銀または銀／塩化銀電極を用いる。

【００１４】これらは２電極の過酸化水素電極、酸素電
極についてであるが、安定性、精度の点から３電極のも
のがより望ましい。尚、本発明でピルビン酸測定とは、
ピルビン酸およびその塩の測定を意味する。

【００１５】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。

【００１６】実施例１「ピルビン酸オキシダーゼ固定化カラムの製造方法」耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをよく乾
燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの
無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、よくトルエンで
洗浄し、乾燥する。こうしてアミノシラン化処理した担
体を５％グルタルアルデヒドに１時間浸漬した後、よく
蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１０ｍＭのリン酸
ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ
除いておく。このホルミル化した耐火レンガに１０μＭ
ＦＡＤを含むｐＨ７．０Ｈ、１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液にペディオコッカス属のピルビン酸オキシダーゼ
１００ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌ
を接触させ、０〜４°Ｃで１日放置し固定化する。この
酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラ
ムに充填しピルビン酸オキシダーゼ固定化カラムとす
る。

【００１７】「過酸化水素電極の製造方法」直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）２０ｍｇを蒸留
水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを０．
２％になるように加える。この混合液を手早く先に用意
した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化
する。これを過酸化水素電極とする。また参照電極とし
てはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の
配管を用いた。

【００１８】「ピルビン酸測定装置」本発明に従う測定には、図１に示されるフロー型測定装
置を使用した。まず緩衝液槽（１）より緩衝液が送液ポ
ンプ（２）により連続的に送液されサンプラ（３）より
注入されたピルビン酸を含む試料は、恒温槽（６）に送
られる。恒温槽内のピルビン酸オキシダーゼ固定化カラ
ム（４）中に詰められた粒状担体に固定化されたピルビ
ン酸オキシダーゼにより試料中のピルビン酸より酸素が
消費され過酸化水素が生成する。この増減を過酸化水素
電極を有する測定部（５）で感知し電流値の変化が、検
出器（７）によって検知され、信号がシングルボードコ
ンピュータ（８）に送られピルビン酸濃度に換算され
る。なお、図１の（９）はＲＳ２３２Ｃコードを、（１
０）はパーソナルコンピュータ、（１１）はサンプラ制
御信号、（１２）はポンプ制御信号、（１３）は廃液を
示している。

【００１９】「測定方法」上記のピルビン酸測定装置を用いて、５μｌの試料を注
入し、カラムの温度を２５℃として反応させた。緩衝液
は、リン酸１０ｍＭ、ＴＰＰ０．２ｍＭ、塩化マグネシ
ウム１０ｍＭおよびＦＭＮ１０μＭを含むｐＨが７．０
の緩衝液を用いた。試料としてはピルビン酸標準液（１
０ｍＭのピルビン酸リチウム）を用い、２０回測定して
安定性について実験した。

【００２０】第１回目測定の電流密度を１００とし測定
値よりピルビン酸オキシダーゼの相対活性を求めた。２
０回の測定において相対活性はほぼ１００％であり、安
定に測定を行うことができた。結果を表１に示す。

【００２１】比較例１実施例１と同様のピルビン酸測定装置を用いて、５μｌ
の試料を注入し、同様に２５℃で反応させた。緩衝液と
してはＦＭＮを含まず、リン酸１０ｍＭ、ＴＰＰ０．２
ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭを含みｐＨが７．０の
緩衝液を送液し、ピルビン酸標準液の測定を行い、２０
回測定の安定性について実験した。

【００２２】第１回目測定の電流密度を１００とし測定
値よりピルビン酸オキシダーゼの相対活性を求めた。２
０回の測定で相対活性が７０％程度に低下しＦＭＮを加
えない緩衝液中での測定では、固定化ピルビン酸オキシ
ダーゼの活性が不安定であるため正確に行うことができ
ないことが確認された。

【００２３】

【表１】

【００２４】実施例２実施例１のピルビン酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
方法と同様に固定化したピルビン酸オキシダーゼ固定化
担体を、実施例１と同様の緩衝液に接触させ０〜４℃で
３日間保存した。この固定化ピルビン酸オキシダーゼ担
体をカラムに充填し、実施例１と同様のピルビン酸測定
装置に配置し、ピルビン酸標準液の測定を行い、初期活
性と３日後の活性について調べた。

【００２５】初期活性を１００とすると３日後の活性は
９８でありこの固定化ピルビン酸オキシダーゼは、ＦＭ
Ｎを含む緩衝液中で安定に保存できることが確認でき
た。表２に結果を示す。

【００２６】比較例２実施例１のピルビン酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
方法と同様に固定化したピルビン酸オキシダーゼ固定化
担体を、比較例１と同様の緩衝液に接触させ０〜４℃で
３日間保存した。この固定化ピルビン酸オキシダーゼ担
体をカラムに充填し、実施例１と同様のピルビン酸測定
装置に配置し、ピルビン酸標準液の測定を行い、初期活
性と３日後の活性について調べた。

【００２７】初期活性を１００とすると３日後の活性は
２０でありこの固定化ピルビン酸オキシダーゼは、ＦＭ
Ｎを含まない緩衝液中では不安定であることが確認でき
た。

【００２８】

【表２】

【００２９】

【発明の効果】本発明によりピルビン酸濃度の測定が安
定かつ簡便かつ精度よく安価に行うことが可能となっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１において用いた本発明のピルビ
ン酸測定方法で用いる装置の一例である。

【符号の説明】

１・・・緩衝液槽２・・・送液ポンプ３・・・サンプラ４・・・ピルビン酸オキシダーゼ固定化カラム５・・・過酸化水素電極を有する測定部６・・・恒温槽７・・・検出器８・・・シングルボードコンピュータ９・・・ＲＳ２３２Ｃコード１０・・・パーソナルコンピュータ１１・・・サンプラ制御信号１２・・・ポンプ制御信号１３・・・廃液

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】金属イオン、フラビンモノヌクレオチ
ド、無機リン酸、およびチアミンピロリン酸を含む緩衝
液を連続的に送液し、その緩衝液に試料を注入して、固
定化したピルビン酸オキシダーゼに導き、生成する過酸
化水素もしくは減少する酸素の量を、過酸化水素電極も
しくは酸素電極で電気化学的に定量することによるピル
ビン酸測定方法。
【請求項２】緩衝液の金属イオンがマグネシウムイオ
ン、カルシウムイオン、マンガンイオンおよびコバルト
イオンより選ばれる少なくとも１種である請求項１記載
のピルビン酸測定方法。
【請求項３】緩衝液の金属イオンがマグネシウムイオ
ンで、かつ濃度が０．０１〜５０ｍＭであり、無機リン
酸の濃度が０．１〜２０ｍＭである請求項２記載のピル
ビン酸測定方法。
【請求項４】ピルビン酸オキシダーゼが粒状担体に固
定化されていて、その粒状担体がカラム中に充填されて
おり、前記カラムの下流側に過酸化水素電極もしくは酸
素電極が配置されている請求項１記載のピルビン酸測定
方法。