JPH05399B2 - - Google Patents
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- JPH05399B2 JPH05399B2 JP19651987A JP19651987A JPH05399B2 JP H05399 B2 JPH05399 B2 JP H05399B2 JP 19651987 A JP19651987 A JP 19651987A JP 19651987 A JP19651987 A JP 19651987A JP H05399 B2 JPH05399 B2 JP H05399B2
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- JP
- Japan
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- chloroform
- methanol
- daunorubicin
- crude product
- mixture
- Prior art date
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は液体抽出とカラムクロマトグラフイー
とを組合わせて利用することによつて発酵液から
ダウノルビシン塩酸塩を回収するための改善され
た方法に関する。
とを組合わせて利用することによつて発酵液から
ダウノルビシン塩酸塩を回収するための改善され
た方法に関する。
ダウノルビシンは癌に対して有効な構成物質で
あつて、これは臨床において用いられたアンスラ
サイクリン型の構成物質の最初のものである。こ
のものはストレプトマイセスの類のバクテリアに
よつて形成される。この構成物質はイタリア、フ
ランス及びソビエト連邦の研究者によつてそれぞ
れ独立に1960年代の半ばに分離された〔ベルギー
特許第639897号及び同第632391号公報並びに雑誌
“Antibiotiki”11，763（1966）参照〕。
あつて、これは臨床において用いられたアンスラ
サイクリン型の構成物質の最初のものである。こ
のものはストレプトマイセスの類のバクテリアに
よつて形成される。この構成物質はイタリア、フ
ランス及びソビエト連邦の研究者によつてそれぞ
れ独立に1960年代の半ばに分離された〔ベルギー
特許第639897号及び同第632391号公報並びに雑誌
“Antibiotiki”11，763（1966）参照〕。
ダウノルビシンを生産する各株はその発酵の間
に、化学的にダウノルビシンと近似した多数の化
合物を作り出す。従つて今日までダウノルビシン
の分離と生成とのための公知となつている種々の
方法は極めて複雑であつた高経費である。純粋物
質は一般に種々異なつた有機溶剤を用いて行なわ
れる多段階の抽出によるか、又は抽出法と吸着法
との組合わせによつて得られる（1984年にニユー
ヨークのMarcel Dekkerから出版されたvan
Damme E.J.編集の刊行本“Biotechnology of
Industrial Antibiotics”第569−594頁及び1984
年にニユーヨークのAlan R.Liss.Inc.から出版さ
れたA.Mizurahi−Al van Wezel編集の刊行本
“Advances in Biotechnological Processes”第
３巻141−161頁参照）。
に、化学的にダウノルビシンと近似した多数の化
合物を作り出す。従つて今日までダウノルビシン
の分離と生成とのための公知となつている種々の
方法は極めて複雑であつた高経費である。純粋物
質は一般に種々異なつた有機溶剤を用いて行なわ
れる多段階の抽出によるか、又は抽出法と吸着法
との組合わせによつて得られる（1984年にニユー
ヨークのMarcel Dekkerから出版されたvan
Damme E.J.編集の刊行本“Biotechnology of
Industrial Antibiotics”第569−594頁及び1984
年にニユーヨークのAlan R.Liss.Inc.から出版さ
れたA.Mizurahi−Al van Wezel編集の刊行本
“Advances in Biotechnological Processes”第
３巻141−161頁参照）。
ベルギー特許第639897号公報によれば発酵液は
濾過助剤の存在のもとに濾過される。なお相当に
不純物の含まれた生成物であるその粗製のダウノ
ルビシンはその濾過助剤と混合された菌糸及び濾
過された発酵液からｎ−ブタノール又はクロロホ
ルムを用いる多段階抽出によつて別々に分離され
る。この粗生成物の精製のためにｎ−ブタノール
と燐酸塩緩衝液との中での向流抽出が行なわれ
る。この方法の収率は発酵液の作用物質含有量に
ついて21％である。
濾過助剤の存在のもとに濾過される。なお相当に
不純物の含まれた生成物であるその粗製のダウノ
ルビシンはその濾過助剤と混合された菌糸及び濾
過された発酵液からｎ−ブタノール又はクロロホ
ルムを用いる多段階抽出によつて別々に分離され
る。この粗生成物の精製のためにｎ−ブタノール
と燐酸塩緩衝液との中での向流抽出が行なわれ
る。この方法の収率は発酵液の作用物質含有量に
ついて21％である。
次に開発されたもう一つの抽出法〔雑誌
“Process Biochem.”14，６−11（1979）によれ
ば発酵液を先ずｎ−ブタノールと混合した後、濾
過する。濾液の各相を互いに分離し、そのブタノ
ール相を蒸発濃縮する。残渣をｎ−ヘキサンと混
合した後、酸性にした水で抽出する。ダウノルビ
シンを含有する水性相をアセトンとトルオールと
の混合物によつて洗浄し、次いでｎ−ブタノール
の添加によつて粗製のダウノルビシン塩酸塩が析
出する。この粗生成物をメタノール／エタノー
ル／クロロホルムの混合物から再結晶する。
“Process Biochem.”14，６−11（1979）によれ
ば発酵液を先ずｎ−ブタノールと混合した後、濾
過する。濾液の各相を互いに分離し、そのブタノ
ール相を蒸発濃縮する。残渣をｎ−ヘキサンと混
合した後、酸性にした水で抽出する。ダウノルビ
シンを含有する水性相をアセトンとトルオールと
の混合物によつて洗浄し、次いでｎ−ブタノール
の添加によつて粗製のダウノルビシン塩酸塩が析
出する。この粗生成物をメタノール／エタノー
ル／クロロホルムの混合物から再結晶する。
吸着法と組合わせた抽出法の場合には、吸着材
として、弱酸性のカチオン交換樹脂であるアンバ
ーライトIRC−50（フランス特許第1551195号公
報）、カチオン交換樹脂と酸化アルミニウム（ベ
ルギー特許第632391号公報）或はカチオン交換樹
脂とシリカゲル〔雑誌“Folia Microbiol.”22，
275−285（1977）が用いられた。
として、弱酸性のカチオン交換樹脂であるアンバ
ーライトIRC−50（フランス特許第1551195号公
報）、カチオン交換樹脂と酸化アルミニウム（ベ
ルギー特許第632391号公報）或はカチオン交換樹
脂とシリカゲル〔雑誌“Folia Microbiol.”22，
275−285（1977）が用いられた。
上記の公知の方法はいずれも、種々の異なつた
有機溶剤を著しい量で使用しなければならないこ
と、及びその収率が極めて低いという共通の欠点
を有している。各種の有機溶剤を用いる作業はそ
れらの方法は極めて高経費のものにするばかりで
なく、健康保護、環境保護、等の面における一連
の対応策を必要とし、それによつてそれらの方法
は更に高経費のものとなる。
有機溶剤を著しい量で使用しなければならないこ
と、及びその収率が極めて低いという共通の欠点
を有している。各種の有機溶剤を用いる作業はそ
れらの方法は極めて高経費のものにするばかりで
なく、健康保護、環境保護、等の面における一連
の対応策を必要とし、それによつてそれらの方法
は更に高経費のものとなる。
ダウノルビシン自身は発癌性を有し且つ心臓毒
性を示し、従つて根本的な作業保護対策が必要で
あることが知られている。これはその方法が複雑
であればあるほど、また多くの段階を要すれば要
するほど実現が困難になる。
性を示し、従つて根本的な作業保護対策が必要で
あることが知られている。これはその方法が複雑
であればあるほど、また多くの段階を要すれば要
するほど実現が困難になる。
本発明の目的はダウノルビシンを簡単で経済的
な態様において発酵液から回収し且つ更に精製す
ることができるような方法を開発することであつ
た。
な態様において発酵液から回収し且つ更に精製す
ることができるような方法を開発することであつ
た。
本発明者等は、その分離法の中にカラムクロマ
トグラフイー的な段階を組み入れ、その際吸着材
として適当な粒度のシリカゲルを、そして溶離剤
として蟻酸含有のクロロホルム／メタノール混合
物を用いた場合にその精製段階の数を著しく少な
くすることができることを見出した。
トグラフイー的な段階を組み入れ、その際吸着材
として適当な粒度のシリカゲルを、そして溶離剤
として蟻酸含有のクロロホルム／メタノール混合
物を用いた場合にその精製段階の数を著しく少な
くすることができることを見出した。
本発明に従う方法を次に詳細に説明する。
場合により予め濾過した培養液を弱アルカリ性
の条件のもとでｎ−ブタノールにより抽出する。
その抽出液を真空中で蒸発濃縮し、そしてその得
られた残渣から塩酸塩の形で作用物質を沈殿させ
る。そのようにして得られた粗生成物はダウノル
ビシンに加えてなお多数の特定されていないアン
スラサイクリングリコシド及びアグルコン類を含
んでいる。簡単な唯一回のカラムクロマトグラフ
イーによつて、その著しく不純物を含んだ粗生成
物から純粋なダウノルビシン塩酸塩が得られる。
この目的のためには粗生成物をできるだけ少ない
量のメタノールの中に溶解し、そしてその溶液を
好ましくは0.063−0.2mmの粒度のシリカゲルが充
填されたカラムにチヤージする。分離の鋭敏度を
高めるためにはシリカゲルをクロロホルムで予め
調整された懸濁液の形でそのカラムの中に導入す
るのが有利である。このために用いられるクロロ
ホルムはメタノールもその他の溶剤も含んではな
らない。溶離剤としてはクロロホルムとメタノー
ルとの混合物中に蟻酸の含まれた液体が用いら
れ、例えばクロロホルム：メタノール：蟻酸の
82：18：１の比率の混合物が用いられる。溶離液
は各フラクシヨン毎に捕集してそれらのフラクシ
ヨンを薄層クロマトグラフにより検査する。ダウ
ノルビシン塩酸塩を含んだ各フラクシヨンはその
他のフラクシヨンと鮮鋭にわかれている。目的生
成物を含んだ各フラクシヨンは蒸発濃縮させる。
蒸発濃縮された残渣は１回だけ再結晶し、その際
析出したダウノルビシン塩酸塩は薬理学的な諸目
的に対して充分に純粋である。発酵液の抗生物質
含有量についての収率は60−62％である。このよ
うな収率は公知の方法では決して得られないもの
である。
の条件のもとでｎ−ブタノールにより抽出する。
その抽出液を真空中で蒸発濃縮し、そしてその得
られた残渣から塩酸塩の形で作用物質を沈殿させ
る。そのようにして得られた粗生成物はダウノル
ビシンに加えてなお多数の特定されていないアン
スラサイクリングリコシド及びアグルコン類を含
んでいる。簡単な唯一回のカラムクロマトグラフ
イーによつて、その著しく不純物を含んだ粗生成
物から純粋なダウノルビシン塩酸塩が得られる。
この目的のためには粗生成物をできるだけ少ない
量のメタノールの中に溶解し、そしてその溶液を
好ましくは0.063−0.2mmの粒度のシリカゲルが充
填されたカラムにチヤージする。分離の鋭敏度を
高めるためにはシリカゲルをクロロホルムで予め
調整された懸濁液の形でそのカラムの中に導入す
るのが有利である。このために用いられるクロロ
ホルムはメタノールもその他の溶剤も含んではな
らない。溶離剤としてはクロロホルムとメタノー
ルとの混合物中に蟻酸の含まれた液体が用いら
れ、例えばクロロホルム：メタノール：蟻酸の
82：18：１の比率の混合物が用いられる。溶離液
は各フラクシヨン毎に捕集してそれらのフラクシ
ヨンを薄層クロマトグラフにより検査する。ダウ
ノルビシン塩酸塩を含んだ各フラクシヨンはその
他のフラクシヨンと鮮鋭にわかれている。目的生
成物を含んだ各フラクシヨンは蒸発濃縮させる。
蒸発濃縮された残渣は１回だけ再結晶し、その際
析出したダウノルビシン塩酸塩は薬理学的な諸目
的に対して充分に純粋である。発酵液の抗生物質
含有量についての収率は60−62％である。このよ
うな収率は公知の方法では決して得られないもの
である。
以下、本発明を幾つかの例によつて更に詳細に
説明するが、これらは本発明になんらの縮限を加
えるものでないことを明記する。
説明するが、これらは本発明になんらの縮限を加
えるものでないことを明記する。
例 １
発酵液（作用物質含有量＝40γ／ml）500を
２％濃度の蓚酸10に室温において加える。この
発酵液を45分間攪拌した後、１％の濾過用パーラ
イトを加えて更に30分間攪拌する。次にその菌糸
を濾過分離する。この菌糸から抗生物質を回収す
るためにこのものを２％濃度の蓚酸100で30分
間攪拌のもとに洗い出し、次いで濾過する。
２％濃度の蓚酸10に室温において加える。この
発酵液を45分間攪拌した後、１％の濾過用パーラ
イトを加えて更に30分間攪拌する。次にその菌糸
を濾過分離する。この菌糸から抗生物質を回収す
るためにこのものを２％濃度の蓚酸100で30分
間攪拌のもとに洗い出し、次いで濾過する。
合一した濾液（530）を40％濃度の苛性ソー
ダで8.0−8.4のpH値に調節し、ついで各200の
ｎ−ブタノールを用いて２回抽出する。そのｎ−
ブタノール相を脱イオン水100で洗浄し、1Nの
塩酸でpH5.1−5.5に調節し、そして真空中で45℃
において蒸発濃縮する。この蒸発濃縮した濃縮液
（4.5）に脱イオン水90mlを加える。ついでその
pH値を6Nのエタノール性塩酸を用いて1.2−1.4
に調節する。この混合物を45℃においてその容積
の3/4まで蒸発濃縮した後、結晶化を５℃におい
て24時間行なわせる。粗製のダウノルビシン塩酸
塩（21g、作用物質含有量＝60％）を濾過し、ｎ
−ブタノールで洗浄し、そして25℃において真空
中で乾燥させる。母液を改めてその容積の3/4ま
で蒸発濃縮し、そしてもう一度５℃において結晶
化を行なわせる。24時間の後に更に7gの生成物
（作用物質含有量＝58％）が分離され、そしてこ
れを上述したと同じ方法で洗浄し、乾燥させる。
ダで8.0−8.4のpH値に調節し、ついで各200の
ｎ−ブタノールを用いて２回抽出する。そのｎ−
ブタノール相を脱イオン水100で洗浄し、1Nの
塩酸でpH5.1−5.5に調節し、そして真空中で45℃
において蒸発濃縮する。この蒸発濃縮した濃縮液
（4.5）に脱イオン水90mlを加える。ついでその
pH値を6Nのエタノール性塩酸を用いて1.2−1.4
に調節する。この混合物を45℃においてその容積
の3/4まで蒸発濃縮した後、結晶化を５℃におい
て24時間行なわせる。粗製のダウノルビシン塩酸
塩（21g、作用物質含有量＝60％）を濾過し、ｎ
−ブタノールで洗浄し、そして25℃において真空
中で乾燥させる。母液を改めてその容積の3/4ま
で蒸発濃縮し、そしてもう一度５℃において結晶
化を行なわせる。24時間の後に更に7gの生成物
（作用物質含有量＝58％）が分離され、そしてこ
れを上述したと同じ方法で洗浄し、乾燥させる。
合一した粗生成物のフラクシヨン（28g）をカ
ラムクロマトグラフイーによつて精製する。この
ために0.063−0.2mmの粒度のシリカゲル５をク
ロロホルム中に懸濁させてカラム（直径：高さ＝
１：20）の中に充填する。前記の粗生成物を124
mlのメタノール中に溶解してこのカラムにチヤー
ジする。次に溶離液体として82：18：１の比率で
調整されたクロロホルム、メタノール及び蟻酸の
混合物を上記のカラムに導く（流量800ml／hr）。
各800mlづつのフラクシヨンを捕集して薄相クロ
マトグラフイーによりテストする。ダウノルビシ
ンを含んでいて唯一の班紋を与えるフラクシヨン
を合一し（12）、そして真空中で35℃において
その容積の1/100まで蒸発濃縮する。この濃縮物
を５℃において24時間放置する。次にダウノルビ
シン塩酸塩の結晶を濾過し、クロロホルムで洗浄
して真空中で25℃において乾燥させる。12.5gの
生成物が得られ、これは発酵液の全作用物質含有
量について62％の収率である。
ラムクロマトグラフイーによつて精製する。この
ために0.063−0.2mmの粒度のシリカゲル５をク
ロロホルム中に懸濁させてカラム（直径：高さ＝
１：20）の中に充填する。前記の粗生成物を124
mlのメタノール中に溶解してこのカラムにチヤー
ジする。次に溶離液体として82：18：１の比率で
調整されたクロロホルム、メタノール及び蟻酸の
混合物を上記のカラムに導く（流量800ml／hr）。
各800mlづつのフラクシヨンを捕集して薄相クロ
マトグラフイーによりテストする。ダウノルビシ
ンを含んでいて唯一の班紋を与えるフラクシヨン
を合一し（12）、そして真空中で35℃において
その容積の1/100まで蒸発濃縮する。この濃縮物
を５℃において24時間放置する。次にダウノルビ
シン塩酸塩の結晶を濾過し、クロロホルムで洗浄
して真空中で25℃において乾燥させる。12.5gの
生成物が得られ、これは発酵液の全作用物質含有
量について62％の収率である。
元素分析：C27H29NO10HCl（Ｍ＝563.5）
計算値（％）：C57.50 H5.32 N2.48 Cl6.30
実測値（％）：C57.10 H5.40 N2.51 Cl6.36
融点：188−189℃（分解）
薄層クロマトグラフイー：
１％濃度の蓚酸が含浸されているMerckの
珪酸ゲル60の上で溶離剤としてｎ−ブタノー
ル、酢酸及び水の４：１：５の比率の混合物
を用いる。Rf＝0.4 UV−スペクトル Ｅ１％ １cm（メタノールに溶
解） 233nm 620 250nm 440 286nm 138 476nm 201 494nm 199 532nm 115 例 ２ 500の発酵液を予め菌糸の濾過除去を行なわ
ずに、pH8−8.4において（40％濃度の苛性ソー
ダ溶液で調節）400のｎ−ブタノールで抽出す
る。各相を互いに分離し、そしてその有機相を半
分の容積の脱イオン水で洗浄する。その洗浄され
た有機相を例１に記述したと同じ方法で処理す
る。生成物の収率及び各パラメータは例１におけ
ると同じである。
珪酸ゲル60の上で溶離剤としてｎ−ブタノー
ル、酢酸及び水の４：１：５の比率の混合物
を用いる。Rf＝0.4 UV−スペクトル Ｅ１％ １cm（メタノールに溶
解） 233nm 620 250nm 440 286nm 138 476nm 201 494nm 199 532nm 115 例 ２ 500の発酵液を予め菌糸の濾過除去を行なわ
ずに、pH8−8.4において（40％濃度の苛性ソー
ダ溶液で調節）400のｎ−ブタノールで抽出す
る。各相を互いに分離し、そしてその有機相を半
分の容積の脱イオン水で洗浄する。その洗浄され
た有機相を例１に記述したと同じ方法で処理す
る。生成物の収率及び各パラメータは例１におけ
ると同じである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水と溶解しない溶剤による抽出、抽出液の蒸
発濃縮、粗生成物の沈殿、及びこの粗生成物のク
ロマトグラフ的方法による精製によつてダウノル
ビシン塩酸塩を発酵液から回収する方法におい
て、 上記クロマトグラフ的精製を、蟻酸の含まれた
クロロホルムとメタノールとの混合物よりなる溶
離剤を用い、そして吸着材としてシリカゲルが含
まれたカラムで行ない、ダウノルビシン塩酸塩の
含まれたフラクシヨンを蒸発濃縮し、そして生成
物を場合により再結晶すること を特徴とする、改良方法。 ２ 溶離剤が0.2−2.0容積％の蟻酸を含有し、そ
して80：20ないし90：10の比率のクロロホルムと
メタノールとからなる、特許請求の範囲第１項に
従う方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19651987A JPS6442498A (en) | 1987-08-07 | 1987-08-07 | Improvement for collecting daunorubicin hydrochloride from fermentation liquid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19651987A JPS6442498A (en) | 1987-08-07 | 1987-08-07 | Improvement for collecting daunorubicin hydrochloride from fermentation liquid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6442498A JPS6442498A (en) | 1989-02-14 |
| JPH05399B2 true JPH05399B2 (ja) | 1993-01-05 |
Family
ID=16359088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19651987A Granted JPS6442498A (en) | 1987-08-07 | 1987-08-07 | Improvement for collecting daunorubicin hydrochloride from fermentation liquid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6442498A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029708A1 (fr) * | 1997-12-05 | 1999-06-17 | Mercian Corporation | Anthracycline cristalline antibiotique et son procede de production |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL2301943T3 (pl) * | 2009-09-08 | 2014-06-30 | Heraeus Precious Metals Gmbh | Krystalizacja epidaunorubicyny x HCI |
| CN101798328B (zh) * | 2010-03-20 | 2012-05-23 | 山东新时代药业有限公司 | 一种柔红霉素发酵液提取纯化工艺改进方法 |
-
1987
- 1987-08-07 JP JP19651987A patent/JPS6442498A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029708A1 (fr) * | 1997-12-05 | 1999-06-17 | Mercian Corporation | Anthracycline cristalline antibiotique et son procede de production |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6442498A (en) | 1989-02-14 |
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