JPH0541977A

JPH0541977A - 細胞培養試験用基材およびその製造方法

Info

Publication number: JPH0541977A
Application number: JP3203008A
Authority: JP
Inventors: Manabu Yamazaki; 学山崎; Michiko Tsuchida; 路子土田; Yuichi Mori; 森　　有一
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1991-08-13
Filing date: 1991-08-13
Publication date: 1993-02-23

Abstract

(57)【要約】【目的】細胞の接着、増殖性、剥離性を簡単に判定する
ことができる細胞培養用試験基材およびその製造方法を
提供する。【構成】ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物と細
胞接着性物質からなる細胞培養試験用基材において；前
記細胞培養試験用基材中の細胞接着性物質が、架橋され
ている部分と架橋されていない部分を海島構造状、海海
構造状または層状構造状に有しており、かつ、前記架橋
されている部分の架橋の程度が異なる複数の部分からな
ることを特徴とする細胞培養試験用基材、およびその製
造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞の接着、増殖性、
剥離性を簡単に判定することができる細胞培養用試験基
材に関する。本発明の細胞培養試験用基材を用いれば、
培養液の温度を変化させることによって培養した細胞を
基材から剥離させ回収することができる。また、本発明
はかかる細胞培養試験用基材の製造方法にも関する。

【０００２】

【従来の技術】今日の細胞培養技術は、１）細胞産生物
の生産、２）生体の病変部や欠損部への補綴材、３）薬
剤の毒性および薬理活性評価用のシュミレーターなどに
利用されている。

【０００３】以下に上記の応用分野を中心として従来技
術について概観する。

【０００４】今日、細胞培養に使用されている動物細胞
は２種類に分類される。即ち、接着非依存性細胞（anch
orage independent cells）と接着依存性細胞（anchora
gedependentcells）である。前者の接着非依存性細胞
は、生存、増殖、物質産生能などの細胞機能が細胞の足
場である基質が存在しなくても正常に発現される細胞で
ある。典型的な例としてミエローマ細胞、リンホーマ細
胞などから形成されるハイブリドーマがあげられる。

【０００５】一方、後者の接着依存性細胞は、生存、増
殖、物質産生能などの細胞機能が細胞の足場である基質
が存在しなくては正常に発現されない細胞である。初代
培養細胞をはじめとした正常二倍体細胞の大部分は接着
依存性である。さらに無限に増殖可能な樹立細胞系に
も、接着依存性を示すものが数多く知られている。例え
ば、インターフェロン、インターロイキンなどのサイト
カイン類、エリスロポエチン、コロニー・ステュミレイ
ティング・ファクター、トロンボボエチンなどの各種分
化成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチべータ
ー、ワクチンなどの有用な細胞産生物を生産する樹立細
胞系にも接着依存性を示すものが多く知られている。従
って、これら有用な細胞産生物の生産のためにも接着依
存性細胞の培養技術の確立は非常に重要である。

【０００６】一般に細胞を物質生産のために利用する場
合、細胞を高機能を維持した状態で大量にかつ高密度に
培養することが重要である。ところが、動物細胞は微生
物細胞と比較して老廃物の蓄積および酸素をはじめとし
た栄養物の供給不足の影響を受け易く、高密度で大量に
培養する時にその機能を維持することが極めて困難であ
る。

【０００７】接着非依存性細胞の場合には、浮遊培養法
が最も適当であると考えられている。撹拌下に浮遊培養
法を行えば、細胞老廃物の速やかな除去および栄養物の
効率的な供給が可能であり、大量かつ高密度化を目的と
した装置のスケール・アップが容易だからである。しか
し、接着依存性細胞の場合には、細胞の足場としての基
質が必要なために浮遊培養法を適用することができな
い。そこで従来、種々の接着依存性細胞の培養器が開発
されてきた。例えば実験室的に少量の細胞を培養する場
合には、一般的にはデイッシュ型、フラスコ型、プレー
ト型などの細胞培養器が広く使用されている。しかし、
これらの容器は細胞を大量に効率良く培養したい場合に
は不適当である。このため、細胞が接着する基質面積を
全体の容積に対して大きくすることによって大量培養を
可能にするために、以下のような工夫が行われてきた。

【０００８】細胞培養用のガラスビンを回転させ壁
面全体に細胞を増殖させるローラーびん法：細胞接着用の板を培養溶液中に平行に並べその間に
培養液を循環させるマルチトレー法：プラスチックフィルムを渦巻状にしたものを円筒内
に挿入し横に回転させながら細胞を接着させた後にフィ
ルム間に培養液を循環させるコイル培養法：半透過性を有する中空糸膜を用いて中空糸の外面に
細胞を接着させ内側に培養液を循環させることにより、
中空糸膜から栄養物を補給し、老廃物を除去する中空糸
培養法：充填したガラスビーズに細胞を接着させその間隙に
培養液を循環させる充填ガラスビーズ法：マイクロビーズを培養液中に浮遊させマイクロビー
ズ表面に細胞を接着させて撹拌下に培養を行う疑似浮遊
培養法（マイクロビーズ培養法）である。

【０００９】以上のように、細胞を高密度で大量培養す
ることにより有用な細胞産生物を効率良く大量に生産さ
せるために、培養装置および培養基材の形状に重点をお
いた開発が従来進められてきた。しかし近年、接着依存
性細胞の活性あるいは機能維持および発現には培養基材
の性質が著しく関連していることがわかってきて、上述
したように培養基材の形状により酸素をはじめとした栄
養素の効率的供給あるいは細胞老廃物の効率的除去のみ
では細胞を長期間にわたり、その活性および特異的な機
能を維持した状態で培養することがほとんど不可能であ
るということがわかってきた。そこで培養基材の性質を
種々変えることにより細胞の活性、機能維持を向上させ
る試みが近年活発に行われはじめた。現在、細胞培養容
器の材質として光学的透明性、無毒性、良好な機械的物
性および成型性、低コストなどの点からポリスチレンが
広く使用されている。しかしポリスチレン表面は疎水性
が強く、細胞活性維持のために細胞の接着が著しく阻害
されるという重大な欠点を有している。そこでポリスチ
レン表面をコロナ放電処理することにより表面にのみ陰
イオン基を導入し親水性を付与することにより細胞の接
着、増殖性を改善した細胞培養基材が開発され広く使用
されている。しかしこの程度の改善では細胞の特異的な
機能を発現させそれを維持することが困難であることが
わかってきて最近では培養細胞の環境を細胞が生体内に
存在する状態に出来るだけ近づけることにより細胞の接
着、増殖、分化、物質産生能などの機能を向上させる研
究が行われてきた。即ち、細胞外マトリックスを細胞基
材に組合せる方法である。

【００１０】ところで、生体内での細胞外マトリックス
の機能についての研究が近年急速に進み、従来から知ら
れていた細胞を支持、固定化するという単純な受動的な
役割だけではなく、細胞機能を能動的に制御する機能も
有していることが分かってきた。

【００１１】例えば、細胞外マトリックスの主成分であ
るコラーゲンには１０種以上あることが発見されてお
り、それぞれのコラーゲンは決まった細胞によって合成
され、一定の組織に局在し、そして異なる細胞機能を制
御する役割を有していることが解明されつつある。ま
た、同一タイプのコラーゲンでも、高次構造の変性ある
いは種々の官能基を導入するなどの改質によっても細胞
機能に影響があることがわかってきた。

【００１２】また、細胞外マトリックスの第２成分であ
る、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プ
ロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどは、コラー
ゲンおよび細胞膜に対して特異的な結合部位を有し、細
胞の基質への接着に重要な役割を果たしている。なお、
接着性タンパク質はそれぞれ一定種の細胞、コラーゲン
に特異的に結合する。例えば、フィブロネクチンは主と
して繊維芽細胞およびI型、II型のコラーゲンに、ラミ
ニンは上皮、内皮細胞およびIV型コラーゲンにそれぞれ
特有の結合部位を有している。更に上記の細胞外マトリ
ックス以外にも細胞機能に大きな影響を与えるものとし
てコラーゲンの熱変性物であるゼラチン、細胞膜上の糖
鎖に特異的に結合するレクチン、フィブロネクチンなど
の結合部位である接着性オリゴペプチド、イガイから得
られた細胞接着蛋白等が知られている。上記の細胞の接
着、増殖を制御する因子を培養基材に組合せた例として
は、コラーゲンをコーティングした培養基材（K.Yoshiz
ato.et al..Annals ofPlastic Surgery.13.9.1984）、
またフィブロネクチンをコーティングした基材（F.Grin
nell.Expl.Cell Res.102.51.1976）、またイガイから得
られた細胞接着蛋白をコーティングした基材（P.T.Picc
iano.et all..In Vitro Cellular andDevelopmental Bi
ology 22(3).24A.1986）などが開発され、細胞接着およ
び増殖効果の改善が認められている。さらには生体由来
の細胞外基質のかわりにガラクトース末端を側鎖に有す
るポリスチレンをコーティングした基材（赤池敏宏ら、
人工臓器、17.227.1988）が開発され特に肝細胞の接着
性の向上および生存性の維持が認められている。従来、
培養条件が厳しく接着が非常に困難であった細胞も上記
したような方法で表面を処理した培養基材を用いること
によって培養が可能になってきた。以上述べたように、
栄養素への効率的な補給および老廃物の効率的な除去が
可能な細胞培養法の開発、細胞の特異的な機能を維持す
ることを目的として細胞接着・増殖因子をくみこんだ培
養基材の開発が進んできたにも拘らず、現在の技術には
下記のような重大な問題点が残されていた。

【００１３】接着依存性細胞の重要な特徴は、細胞が培
養基材に接着し、増殖し、基材表面を完全に覆ってしま
うとコンタクト・インヒビションという機能が働きそれ
以上の細胞増殖が停止してしまうという性質である。し
たがって細胞を更に増殖させるためには細胞を新しい培
養基材に植え替える継代操作が必要となる。

【００１４】従来、基材表面に接着し、増殖した細胞を
脱離させる継代操作にはトリプシン、コラゲナーゼ、な
どの蛋白分解酵素、カルシウムイオンの錯体化合物であ
るＥＤＴＡなどが一般的に用いられてきたがこれらの細
胞脱離剤は下記のように細胞機能および細胞培養工程に
重大な障害をもたらす。

【００１５】１）従来の細胞脱離剤は培養基材と細胞の
間の結合を破壊するのみならず細胞と細胞の間のあらゆ
る結合を破壊してしまう。細胞間の結合にはタイトジャ
ンクション、ギャップジャンクション、デスモゾームと
呼ばれる３種類の結合様式があることがわかっていて、
細胞同士が集合してタイトジャンクションが形成される
と細胞集合体としての物質透過に対してのバリヤーとし
ての働き生体内部の特異的環境が維持される。またギャ
ップジャンクションが形成されるとその結合を通じて隣
り合う細胞間の情報および物質の交換が行われる。一
方、デスモゾームはタイトジャンクション、ギャップジ
ャンクションの結合が維持されるように細胞集合体を機
械的に保持する。したがって細胞はそれ自身単独では活
性、機能の発現は困難であり上述した細胞間結合によっ
て社会を形成してはじめて機能が発現するものと考えら
れている（B.Alberts.et al.゛Molecular Bioloby of t
heCell″.3rd edn.Garland Publishing.Inc..NewYork&L
ondon P.673.1983）。したがって従来の細胞脱離剤は高
度に機能が維持された状態で培養された細胞に対しても
継代時に致命的な障害を与えてしまう。

【００１６】２）細胞膜上にはホルモン、神経伝達物質
などの種々の信号物質に対するリセプターが存在し、細
胞はこれらの信号物質とリセプターの特異的反応により
遠隔制御を受けかつ行っている。蛋白分解酵素などの従
来の細胞脱離剤はこれらの細胞膜リセプターを破壊して
しまうことがわかっている（C.Sung.et al..BiochemPha
rmocol.38.696.1989）。したがって従来の技術によって
継代された細胞を特異的生理活性を有する信号物質によ
りその機能をコントロールすることはほとんど不可能で
ある。

【００１７】３）一般的に細胞培養液中には栄養素とし
て血清が添加されていて血清中には強力なトリプシン阻
害物質が存在する。このため、トリプシン処理の継代時
には、あらかじめ緩衝液で充分細胞を洗浄しトリプシン
阻害物質を除去しておくことが必要である。この洗浄工
程は操作を煩雑にするばかりでなく細胞培養にとって致
命的な汚染の重大な原因にもなる。すでに述べたように
細胞外マトリックスなどの細胞の接着、増殖、分化など
の機能の発現を促進させる因子を用いた培養基材の進展
にもかかわらず、細胞を回収、継代する際に従来の細胞
脱離剤を用いれば上述（１）、（２）の理由によりせっ
かく維持された細胞の高機能性が著しく損なわれること
になる。この問題が高機能性を維持した細胞を培養する
技術の大きな障害になっている。

【００１８】一方、従来の細胞脱離操作は大量培養技術
にも致命的な欠点をもたらす。即ち接着依存性細胞は培
養液中の初期細胞濃度が低すぎると細胞は基質に接着し
ても増殖および物質産生機能を十分に発揮することがで
きないといわれている。特に採取が困難な初代培養細胞
あるいは正常二倍体細胞などの場合は、初めから大容量
の培養液中で培養することは細胞濃度が低くなりすぎる
ので、小容量の培養装置を用いて段階的に細胞継代を繰
り返しながら大容量化しなければならない。即ち通常、
大量培養時には数回の細胞回収、継代の操作が必要にな
る。したがって（３）の理由により従来の細胞脱離法は
特に大量培養時の致命的欠隔である操作装置の煩雑化お
よび汚染の大きな危険性にもつながることになる。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】従来の細胞培養技術が
有していた上記の問題点に対処するために、本発明者ら
は温度感応性高分子化合物を用いた細胞培養技術を開発
してきた。しかし、その後の本発明者らによる検討によ
り、細胞の接着性および増殖性が非常に良好でかつ増殖
した細胞を効率よく回収するのに適した基材の条件は、
細胞の種類によって微妙に異なることが明らかになっ
た。このため本発明者らは、異なる条件を備えた複数の
部分からなる細胞培養試験用基材を開発し、さまざまな
細胞の接着、増殖、剥離性を簡単に判定できるようにし
た。しかしながら、その後の検討によりかかる基材を用
いても、接着、増殖、剥離性を正確に判定できないこと
が明らかになった。本発明は、このような剥離性の悪い
細胞を含む広範な細胞の接着、増殖、剥離性を簡単に判
断することができる細胞培養試験用基材を提供すること
を目的とする。

【００２０】

【課題を解決するための手段】上記の目的は、ＬＣＳＴ
を有する温度感応性高分子化合物と細胞接着性物質から
なる細胞培養試験用基材において；前記細胞培養試験用
基材中の細胞接着性物質が架橋されている部分と架橋さ
れていない部分を海島構造状、海海構造状または層状構
造状に有しており、かつ、前記架橋されている部分の架
橋の程度が異なる複数の部分からなることを特徴とする
細胞培養試験用基材を提供する本発明により達成され
た。

【００２１】本発明の細胞培養試験用基材に使用する細
胞接着性物質は、試料として与えられた細胞を変性する
ことなく接着する物質を１以上含み、コラーゲンを５０
％以上含有するものを意味する。細胞を変性することな
く接着する物質としては、コラーゲン、フィブロネクチ
ン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、グ
リコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス成分や、
コラーゲンの熱変性物であるゼラチンやその他のコラー
ゲン誘導体、細胞膜上の糖鎖に親和力を有するコンカナ
バリンＡ（Con A）などのレクチン、イガイ由来の接着
タンパク質、フィブロネクチンと細胞との接着部位に対
応する接着性オリゴペプチドなどが挙げられる。一方、
細胞接着性物質に含有させることができるコラーゲンの
種類は、特に限定されない。したがって、各種タイプの
コラーゲン単体やそれらの混合物を広く用いることがで
きる。

【００２２】本発明の細胞培養試験用基材に使用するＬ
ＣＳＴを有する温度感応性高分子とは、水に対する溶解
度温度係数が負を示す高分子化合物であり、低温にて生
成する高分子化合物と水分子との水素結合に依存する水
和物（オキソニウムヒドロキシド）が、高温で分解し脱
水和することにより、高分子化合物同士が凝集し沈殿す
る特徴を有する。ＬＣＳＴ（Lower Critical Solution
Temperature）とは、このような温度感応性高分子化合
物の水和と脱水和の転移温度をいう（例えば、ハスキン
ズ（M. Haskins）らの J. Macromol, Sci.-Chem., A2
(8), 1441(1968) 参照)。したがって、温度感応性高分
子化合物は、ＬＣＳＴより高い温度では非水溶性で固体
状態であり、温度をＬＣＳＴより低くすることによって
可逆的に水溶性になる。

【００２３】本発明では、培養温度より低いＬＣＳＴを
有する温度感応性高分子化合物を使用する。このような
高分子化合物であれば、その構造を問わず広く使用する
ことができる。該温度感応性高分子化合物は、細胞培養
温度では水に不溶性の固体状態あるため、細胞接着性物
質と温度感応性高分子化合物とからなる層を足場として
細胞が接着、増殖することができる。また、温度をＬＣ
ＳＴ以下にすることによって高分子化合物は水に可溶性
になるため増殖した細胞は足場を失い、細胞間の結合を
損なわずしかも細胞膜表面のタンパク質を損傷すること
なく増殖細胞を回収することができる。したがって、細
胞接着性物質と温度感応性高分子化合物とからなる本発
明の基材を用いれば、トリプシンやＥＤＴＡといった剥
離剤を使用せずに、機能を損なうことなく細胞を簡単に
剥離して回収することができる。

【００２４】本発明で使用することができる温度感応性
高分子化合物としては、ポリＮ置換アクリルアミド誘導
体、ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体およびこれら
の共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレン
オキサイド、エーテル化メチルセルロース、ポリビニル
アルコール部分酢化物などが挙げられる。特に好ましい
のは、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ置換メ
タアクリルアミド誘導体またはこれらの共重合体、ポリ
ビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化
物である。

【００２５】好ましい高分子化合物を以下にＬＣＳＴが
低い順に列挙する。

【００２６】ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン；ポリーＮ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリーＮ−イソプロピルアクリルアミド；ポリーＮ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド；ポリーＮ−イソプロピルメタアクリルアミド；ポリーＮ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリーＮ−アクリロイルピロリジン；ポリーＮ,Ｎ−エチルメチルアクリルアミド；ポリーＮ−シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリーＮ−エチルアクリルアミド上記の高分子は、単一の単量体を重合したものであって
も、他の単量体と共重合したものであってもよい。共重
合する単量体は、親水性単量体、疎水性単量体のいずれ
であってもよい。一般的には、親水性単量体と共重合す
るとＬＣＳＴは上昇し、疎水性単量体と共重合するとＬ
ＣＳＴは下降する。したがって、これらを適宜選択する
ことによって所望のＬＣＳＴを有する高分子化合物を得
ることもできる。

【００２７】親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリ
ドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリル
アミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチル
メタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒ
ドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルア
クリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル
酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスルホ
ン酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチルスル
ホン酸など、並びに塩基性を有するＮ,Ｎ−ジメチルア
ミノエチルメタクリレート、Ｎ,Ｎ−ジエチルアミノエ
チルメタクリレート、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロピル
アクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。

【００２８】一方、疎水性単量体としては、エチルアク
リレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリ
レートなどのアクリレート誘導体およびメタクリレート
誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ置
換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、ア
クリロニトリル、スチレン、酢酸ビニルなどが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。

【００２９】本発明で使用する温度感応性高分子化合物
は、分子量が１.０ｘ１０⁵以上であるのが好ましい。さ
らに好ましくは１.０ｘ１０⁶以上である。分子量が小さ
いと、細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物とを含
有する層が細胞を播種したときにその一部が剥離してし
まうため、十分に細胞を脱離することができない。な
お、ここでいう分子量とは、粘度から求めた平均分子量
をさす。例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドの平均分子量と極限粘度との関係は、下記の式で表さ
れる。

【００３０】

【００３１】本発明の細胞培養試験用基材の特徴は、該
基材中の細胞接着性物質が、架橋されている部分と架橋
されていない部分を海島構造状、海海構造状または層状
構造状に有しており、かつ、該基材が、細胞接着性物質
の架橋されている部分の架橋の程度が異なる複数の部分
を有しているところにある。

【００３２】細胞接着性物質の代表例であるコラーゲン
は一般に培養状態において線維を形成し、生体内と同様
の構造をとることが知られている。そして、このように
線維を形成したコラーゲンは、培養液に溶解することは
ほとんどない。しかし、温度感応性高分子化合物とコラ
ーゲンが共存する系においては、コラーゲンが本来有す
る線維形成能を十分に発揮することができないため、細
胞が基材に接着する前に基材中のコラーゲンの一部が培
養液に溶出してしまう。その結果、細胞の接着性や増殖
性が悪くなって系の利用性を損なう場合もある。かかる
事態に対処するために、本発明者らは先にコラーゲンに
部分的に架橋が導入されている細胞培養用基材を開発し
た。架橋を導入することによって、コラーゲンは培養液
に対して不溶性になるため、細胞を基材に十分に接着さ
せることができるのである。

【００３３】一方、細胞は細胞膜表面にモザイク状に存
在する結合サイトにより細胞培養用基材に接着して増殖
する。この接着様式は多点接着であるため、接着点の数
が多ければ多いほど細胞の接着強度は強くなって剥離し
にくくなる。従って、細胞培養用基材からの剥離性が悪
い細胞を培養する際は、このような接着点をある程度少
なくする方が有利である。このため、細胞接着性物質に
架橋が導入されている部分とされていない部分が、海島
構造状、海海構造状または層状構造に形成されている細
胞培養用基材を用いれば、接着点の数を制御して剥離性
をコントロールしやすくなる。しかし、細胞培養の容易
性は、このような構造のみならず、架橋が導入されてい
る部分の架橋の程度によっても左右される。一般的な傾
向として、架橋の程度を大きくすると細胞の接着、増殖
性は増し、剥離性は低下することが明らかになってい
る。逆に、架橋の程度を小さくすると、細胞の接着、増
殖性は悪くなるが、剥離性は良くなる。しかし、最適な
架橋の程度を正確に予測することは極めて困難であるた
め、何らかの試験用基材を用いてあらかじめ最適条件を
決定しておくことが不可欠である。本発明の細胞培養試
験用基材は、架橋の程度が異なる複数の部分からなるた
め、架橋の最適条件を定める試験に極めて有効である。

【００３４】本発明の細胞培養試験用基材は、海島構造
状、海海構造状または層状構造状のいずれか１つの構造
の規則性が異なる複数の部分からなっていてもよいし、
２種または３種の構造の規則性がそれぞれ異なる複数の
部分からなっていてもよい。また、海島構造状、海海構
造状および層状構造状の部分を１つずつ有する基材も本
発明の細胞培養試験用基材の中に含まれる。また、複数
の部分相互の規則性の違いは特に制限されないため、島
と島の間の距離、島のサイズ、周期の大きさが異なる場
合だけでなく、島と海の関係が逆転している場合も本発
明の範囲に含まれる。このような構造または規則性が異
なる複数の部分は同一平面上に存在させるのが一般的で
ある。また、構造または規則性が異なる部分は２以上あ
ればよく、その数の上限は制限されない。通常は２〜１
０程度とし、４〜８にするのが典型的である。

【００３５】本発明の細胞培養試験用基材中で海島構造
状をとる場合は、架橋が導入されている部分が海と島の
いずれであってもよい。架橋が導入されている部分が島
であっても海であっても、島のサイズおよび島と島の間
の距離は培養する細胞のサイズ以下であるのが望まし
い。これらのサイズの平均は両方とも、５０μm以下で
あるのが好ましく、２０μm以下であればより好まし
い。また、下限は通常０.１μmである。

【００３６】海海構造状または層状構造状をとる部分
は、その周期が培養する細胞のサイズの２倍以下である
のが好ましい。ここで、周期とは細胞培養用基材をある
一線で切ったときに、隣あう２つの部分（架橋されてい
る部分とされていない部分）の距離の平均値をいう。周
期は１００μm以下であるのが好ましく、４０μm以下で
あればより好ましい。

【００３７】本発明の細胞培養試験用基材中に含有させ
る細胞接着性物質のうち架橋されているものの総面積
は、細胞の増殖面積の５０％以下あるのが望ましい。ま
た、３０％以下であればより望ましい。

【００３８】細胞接着性物質へ架橋を導入する方法は、
特に限定されるものではなく、一般的に用いられる方法
であればいかなる方法であってもよい。例えば、グルタ
ールアルデヒドなどを用いた化学的処理法、オゾン処理
法、紫外線処理法、電子線処理法、プラズマ処理法など
を用いることができる。架橋されている部分とされてい
ない部分とを本発明のように海島構造状、海海構造状ま
たは層状構造状にするには、紫外線処理法、電子線処理
法、プラズマ処理法が適していると考えられる。また、
架橋の程度が異なる部分をつくる方法としても、紫外線
処理法、電子線処理法、プラズマ処理法が適していると
思われる。

【００３９】本発明の細胞培養試験用基材に含有させる
細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物との重量比
は、１：９から１：４９の範囲内にすれば細胞の接着、
増殖、剥離性が良好であるため好ましい。より好ましい
範囲は、１：９から１：３９である。また、本発明の細
胞培養試験用基材においては、細胞接着性物質と温度感
応性高分子化合物の構造は、特に制限されるものではな
く、どのような構造をとっていてもよい。

【００４０】本発明の細胞培養試験用基材は、上記の細
胞接着性物質と温度感応性高分子化合物からなるコーテ
ィング層と支持体から形成されているのが一般的であ
る。しかし、支持体上にコーティングされていない基材
も本発明の範囲に含まれる。乾燥後のコーティング層の
厚みは０.５μm以上であるのが好ましく、１.０μm以上
であればより好ましい。コーティング層の厚みは、基材
を形成する物質の密度を１.０と考えて、混合物溶液の
濃度と乾燥前のコーティング層の厚みから計算して求め
る。コーティング層の厚みが０.５μm以下であると、細
胞の脱離性が悪くなったり、脱離までの時間が非常に長
くなったりして、性能が不安定になる。細胞接着性物質
と温度感応性高分子化合物からなる層のコーティング
は、支持体の全表面にわたってもよいし、一部であって
もよい。

【００４１】本発明において、コーティングされる支持
体は、透明または半透明であるのが好ましい。とくに、
細胞を顕微鏡下で観察するのに十分な透明性を有してい
ることが好ましい。材料は、ガラス、ポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミ
ド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリメチル
メタクリレート、アクリル系樹脂などの透明または半透
明の材料を広く用いることができる。また、物質透過性
を有する膜を使用するのも好ましい。そのような膜の例
として、再生セルロース、セルロースアセテート、コラ
ーゲン、キトサンなどの半透膜や、ポリプロピレン、セ
ルロースアセテート、テフロン^TM、ポリフッ化ビニリデ
ンなどの多孔質膜などを挙げることができるが、これら
に限定されるものではない。支持体の形状は、ディッシ
ュ、プレート、ボトル、チューブ、フラスコ、フィルム
などが一般的であるがこれらに限定されるものではな
い。本発明の細胞培養用基材は、通常用いられている当
業者に自明な方法で製造することができ、その方法は特
に制限されない。例えば、溶媒キャスティング法やディ
ップ法を用いれば簡便に製造することができる。

【００４２】上記の細胞培養用基材は、（ａ）細胞接着性物質と温度感応性高分子化合物とを含
有する層を形成する工程（ｂ）（イ）紫外線を透過する部分と、透過しない部分
の構造が、海島構造状、海海構造状または層状構造状に
形成された紫外線透過マスクと（ロ）紫外線透過量が場
所によって異なる紫外線透過マスクの２種類のマスクを
重ねて用いて紫外線を照射する工程からなる本発明の方
法で製造すれば、安定した性能を有する細胞培養試験用
基材を極めて効率よく製造することができる。

【００４３】工程（ａ）においては、キャスト法やディ
ップ法など層を形成させることができる方法を広く用い
ることができる。したがって、細胞接着性物質と温度感
応性高分子化合物の層を別々に形成させるような方法を
採ることもできる。

【００４４】工程（ｂ）で使用する紫外線透過マスク
（イ）は、紫外線の透過する部分としない部分の構造が
海島構造状、海海構造状または層状構造状であり、本発
明の目的を有効に達成することができるものであればそ
の種類や材質は特に制限されない。したがって、市販の
メッシュや多孔質膜を代用してもよいし、また、材質は
石英ガラスであってもよい。

【００４５】工程（ｂ）で用いるマスク（ロ）は、図１
に示すようにある部分のみ紫外線が透過し他の部分は紫
外線がまったく透過しないものであってもよいし、図２
に示すように紫外線透過量が異なる複数の部分からなる
ものであってもよい。前者のマスクを使用する場合はマ
スクの位置を変えたりマスクそのものを換えたりして紫
外線照射を複数回行う必要がある。複数回の照射とは２
回以上の照射を意味するが、通常は２〜１０回であり、
典型的には４〜８回とする。後者のマスクを使用する場
合は紫外線照射は１回で済ませることもできる。もちろ
ん後者のマスクを紫外線強度を変えながら複数回使用し
て製造することもできる。さらに、複数の部分からなる
マスクを２種類以上用いて紫外線照射することによって
製造することもできる。これらの態様はいずれも本発明
の方法の中に含まれる。

【００４６】いずれのマスクを用いる場合でも、マスク
（イ）とマスク（ロ）は重ねて用いる。本明細書におい
て「重ねて用いる」とは、２種類の別個のマスクを重ね
て用いる場合のみならず、マスク（イ）とマスク（ロ）
がはじめから一体となっている１つのマスクを用いる場
合も含まれる。即ち、マスク（イ）とマスク（ロ）の２
つの機能を合わせ持つ１つのマスクを用いる場合も本発
明の方法に含まれる。

【００４７】紫外線の照射量（照射強度ｘ時間：２５４
nm）は、１００〜１０,０００Ｊ/m²とするのが好まし
く、５００〜８,０００Ｊ/m²とすればより好ましい。１
００Ｊ/m²以下では紫外線照射の効果がほとんどなく、
また、１０,０００Ｊ/m²以上では細胞がほとんど剥離し
ない。なお、２５４nm以外の波長の紫外線を使用する場
合は、２５４nmの紫外線を上記の範囲で照射したときと
同程度の架橋を生じる量を照射する。

【００４８】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明するが本発明の範囲は特許請求の範囲の記載によ
り定まるものであり、以下の実施例により制限を受ける
ものではない。

【００４９】（実施例１および比較例１）０.５％（w/
v）牛真皮ペプシン可溶化タイプIコラーゲン溶液（ｐＨ
３）（KOKEN CELLGEN I-PC, (株)高研製）と、０.５％
（w/v）ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（平均
分子量３.５×１０⁶、以下 PNIPAAm）水溶液（塩酸でｐ
Ｈ３に調整、この溶液はオートクレーブ処理後再溶解し
たもの）を、コラーゲンとPNIPAAmの混合比が１対９に
なるように混合し、キャスティング溶液を調製した。こ
のキャスティング溶液の２.４mlを市販のφ９０mmディ
ッシュ(Falcon#3003、日本ベクトン製）に分注し、すば
やく均一にのばしてコーティングした。その後１０℃の
インキュベーター内で約１０時間乾燥させた。乾燥後の
コーティング層の厚みは、約２μmである。このディッ
シュの裏面には、面積が均等に６分割されるような線を
あらかじめ引いておいた。

【００５０】次に、６分割した中の１つの場所だけが紫
外線を透過できる窓を有するマスク（図１参照）をつく
り、この窓の部分に表１に示すサイズのメッシュ（５０
０メッシュ、線幅１８μm、開口幅３２μm、開口率４１
％）をはり、これをディッシュに乗せて紫外線照射装置
（ＸＸ−１００、波長２５４nm、フナコシ製）で紫外線
を照射した。このときのマスクの窓の位置を移動させ、
照射時間を変えながら５回照射した。このときの紫外線
照射エネルギーは表１に示すとおりとした。コーティン
グおよび紫外線の照射は、無菌的な環境下で行った。こ
のコーティングしたディッシュを用いて培養評価を行っ
た。

【００５１】また、比較例としてメッシュを入れないで
同様に紫外線照射したものも同時に培養評価した。

【００５２】以下には培養評価実験の内容を示す。ヒト
真皮由来の線維芽細胞をダルベッコ改変イーグル培地
（以下Ｄ−ＭＥＭ、１０％牛胎児血清含有、ＧＩＢＣＯ
社製）を用いて、最終細胞濃度が約２ｘ１０⁵細胞／ml
になるように細胞懸濁液を作製し、３７℃に保温した。
またディッシュは、あらかじめ３７℃に保温しておいた
プレート（マイクロウォームプレート、北里サプライ
製）の上に乗せて保温し、細胞懸濁液を１２ml注入し
た。これを素早く３７℃の炭酸ガスインキュベーター
（５％炭酸ガス）内に移し３日間培養した。

【００５３】細胞の接着、増殖性と剥離性については、
位相差顕微鏡下で観察し、以下の式に従って、接着、増
殖率と剥離率を計算した。なお、接着、増殖性の観察は
３７℃で行い、剥離性の観察はディッシュを氷上に移し
約３分間放置したのち室温にて行った。

【００５４】

【００５５】結果を表１に示す。メッシュを使用した系
では、メッシュを用いない系に比較して、細胞の接着、
増殖性はやや悪くなるものの、剥離性が大幅に改善され
ていることが明らかである。さらに、メッシュを使用し
ない系では細胞の剥離に約３〜５分もかかるのに比べ、
メッシュを使用した系では約１分で細胞が剥離し、剥離
スピードもかなり改善されていることが確認された。表
１の各データを比較することによって、この系では紫外
線照射エネルギー４,０００Ｊ／m²のときが最適条件と
なることが明らかになった。このときの細胞の接着、増
殖性は比較例よりもさらに良くなっており、剥離しにく
い細胞の最適条件を決めるためには本発明の基材が非常
に有効であることが明らかになった。

【００５６】

【００５７】（実施例２および比較例２）実施例１およ
び比較例１に示した方法と同様にコーティングおよび細
胞評価を行った。ただし、メッシュの代わりに、石英ガ
ラスに線幅６μm、周期１０μmの層状のパターンが刻ま
れているマスク（イ）と、図２に示したような紫外線の
透過量が場所によって異なるマスク（ロ）を重ねて用い
た。紫外線の照射エネルギーは表２に示した通りであ
る。このメッシュを用いて架橋を導入すると、架橋され
たところの総面積は４０％となる。また、コラーゲンと
ＰＮＩＰＡＡｍの混合比は１対１９とした。細胞は、ヒ
ト絨毛膜由来の線維芽細胞を用い、培地としてイーグル
培地を用いた。

【００５８】比較例では、マスク（ロ）のみを使用して
紫外線照射を行った。

【００５９】結果を表２に示す。実施例１と同様に、マ
スク（イ）を使用した系では、使用しない系に比較し
て、細胞の接着、増殖性は若干悪くなる傾向がみられた
ものの、剥離性は大幅に改善され、さらに、剥離スピー
ドの改善も確認された。表２の各データを比較すること
によって、この系では紫外線照射エネルギー８,０００
Ｊ／m²のとき、最適条件となることがわかった。このと
きの細胞の接着、増殖性および剥離性は比較例よりもさ
らに一段と良くなっており、剥離しにくい細胞の最適条
件を決めるためには本発明の基材が非常に有効であるこ
とが明らかになった。

【００６０】

【００６１】（実施例３および比較例３）実施例１およ
び比較例１に示した方法と同様にコーティングおよび細
胞評価を行った。ただし、コラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍ
の混合比を１：３９にし、図１に示したマスクと石英ガ
ラスに周期１０μmの海海構造のパターンが刻まれてい
るマスクを重ねて紫外線を照射した。紫外線の照射エネ
ルギーは表３に示すとおりである。このマスクを用いて
架橋を導入すると、架橋されたところの総面積は３０％
となる。比較例では、図１に示したマスクのみを用いて
紫外線照射した。

【００６２】細胞はＩＭＲ−９０（ヒト胎児肺由来の線
維芽細胞株）を用い、培地としてＤ−ＭＥＭを用いた。

【００６３】結果を表３に示す。実施例１および２と同
様にパターンが刻まれているマスクを使用した系では、
マスクを使用しない系に比較して、細胞の接着、増殖性
が若干悪くなる傾向が見られたものの、剥離性は大幅に
改善され、さらに、剥離性スピードの改善も確認され
た。表３の各データを比較することによって、この系で
は紫外線照射エネルギー８,０００Ｊ／m²のとき、最適
条件になることが明らかになった。このときの細胞の接
着、増殖性と剥離性は比較例よりもさらに一段と良くな
ることが明らかになり、剥離しにくい細胞の最適条件を
決めるためには本発明の基材が非常に有効であることが
明らかになった。

【００６４】

【００６５】

【発明の効果】本発明の細胞培養試験用基材を用いれ
ば、従来法では接着、増殖性および剥離性を判定するこ
とが難しかった細胞でも、接着、増殖性および剥離性を
簡単にかつ再現性よく判定することが可能になった。

【００６６】また、本発明の製造方法を用いれば、性能
が安定した細胞培養試験用基材を簡便な方法で製造する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】紫外線透過マスク（ロ）を示したものであり、
図中１は紫外線透過部分、２は紫外線不透過部分を示
す。

【図２】紫外線透過マスク（ロ）を示したものであり、
図中３は紫外線不透過部分、４は紫外線透過率１００％
の部分、５は紫外線透過率５０％の部分、６は紫外線透
過率２５％の部分、７は紫外線透過率１２.５％の部
分、８は紫外線透過率６.２５％の部分、９は紫外線透
過率３.１２５％の部分を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者土田路子神奈川県厚木市戸室671−１ＳＡＴＩＩＩＡＴＳＵＧＩ 306 (72)発明者森有一神奈川県横浜市金沢区釜利谷町1642−212 Ｂ−４

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物
と細胞接着性物質からなる細胞培養試験用基材におい
て、前記細胞培養試験用基材中の細胞接着性物質が、架橋さ
れている部分と架橋されていない部分を海島構造状、海
海構造状または層状構造状に有しており、かつ前記架橋
されている部分の架橋の程度が異なる複数の部分からな
ることを特徴とする細胞培養試験用基材。
【請求項２】（ａ）細胞接着性物質と温度感応性高分子
化合物とを含有する層を形成する工程（ｂ）（イ）紫外線を透過する部分と、透過しない部分
の構造が、海島構造状、海海構造状または層状構造状に
形成された紫外線透過マスクと（ロ）紫外線透過量が場
所によって異なる紫外線透過マスクの２種類のマスクを
重ねて用いて紫外線を照射する工程からなる請求項１の
細胞培養試験用基材の製造方法。