JPH0542263B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、嫌気的、非無菌的条件下で新規な、
中温性、メタン生産性の混合微生物集団を用いる
ことによる、補酵素B₁₂および他のコリノイド
（例えば、フアクター）を生成する発酵ブロス
の調製方法、および公知の前駆物質および一部分
に公知の栄養素を含有する新規なブロスに関す
る。 本発明に係る方法において、ブロスの前駆物質
および所定の成分は公知であるけれども、補酵素
B₁₂生産に必要な栄養素の量および栄養素の数お
よび割合は、通常用いられる方法の場合より本質
的に少ない。従つて、本発明に係る方法において
用いられるブロスは新規なものである。 本発明に係る発酵ブロスは、乾燥処理もしくは
熱処理の後、動物飼料または飼料添加物（プレミ
ツクス）の製造に、所望ならば、人間または家畜
の治療に用いるB₁₂（シアノコバラミン）の製造
に、用いることができる。 ビタミンB₁₂発酵に用いられる微生物細胞中
に、ビタミンB₁₂の代わりに、他のコリノイド
（補酵素B₁₂）が蓄積され、そのコリノイド骨格
の中心のコバルト原子に、シアニド基の代わりに
デオキシアデノシル基が結合しているということ
が知られている。 本願明細書において活性成分は、活性コリノイ
ド補酵素B₁₂およびフアクターの混合物を意味
するものである〔Biol.Chem.235、480（1960
年）〕。 文献によれば、接種材料は、「新規な無菌培養
物の製造に用いられる植物性の器官、組織もしく
は細胞、またはウイルス溶液、または微生物もし
くは細胞の懸濁液」である（ストローブ、エフ．
ビー．（Straub、F.B.）：Biological
Enzyelopedia、p.287、Akade′miai Kiado′、
ブタペスト（1978年））。本発明に係る接種材料
は、嫌気性、非無菌性、中温性、メタン生産性の
混合微生物集団を含有する。 この明細書において用いる前駆物質なる語は、
一連の生物学的反応によつて所望の最終産物を製
造するための出発化合物（前掲、437、例えば、
５，６−ジメチルベンゾイミダゾール、塩化コバ
ルト等である）。 ブロスは、微生物の発酵増殖に用いるために調
製した培養媒体である。ブロスは、資化可能な形
で発酵の間微生物によつて要求されるすべつの栄
養素（前掲、249、例えばメタノール、炭酸水
素アンモニウム、塩化マグネシウム等）を含有し
ている。本明細書中で用いる「ブロス」なる語
は、栄養素および前駆物質の組合わせを含有する
培養媒体を意味する。 栄養素は、微生物集団の生命維持に必要な化学
物質、例えば、炭素源および窒素源である。本発
明に係る方法においては、メタノールは２つの機
能を有する。すなわち、メタノールは、生合成に
おける炭素源となり、同時に混合微生物集団の形
成に必要なエネルギーを提供する。 半連続発酵は、中温性、メタン生産性の混合微
生物集団の形成が連続的であるが、発酵ブロスの
取り出しおよび栄養素の添加を定期的に、好まし
くは１日に１回または２回実行することを意味し
ている。 本発明に係る方法に用い半連続「維持」発酵の
目的は、比較的少量の活性成分量で、より長期
間、本発明に係る、新規な、中温性、メタン生産
性と混合微生物集団の組成の保存（維持）するこ
とである。この発酵工程によつて、出発の発酵ブ
ロスを、定期的に、好ましくは１日に１回または
２回、回分式「生産」発酵（ここでは、活性成分
濃度が高い）用に提供する。 従来の技術 補酵素B₁₂の生産に対しては、多数の当業者に
公知の発酵方法および技術がある。これらの発酵
の大部分は、好気的で無菌的な方法である。これ
らの方法の有利な点は、特に補酵素B₁₂をより多
く生産することであるが、このような条件下で
は、生産コストが高く、より複雑な設備が必要と
なり、そして汚染の危険性がある。 好気的、無菌的発酵と比較して、好気的、非無
菌的発酵は、特定の補酵素B₁₂がより少ないが、
かなりより単純でありかつより安価である。発酵
の間、副産物として形成されるバイオガスは、高
い発熱量を有する、有効なエネルギー源である。 補酵素B₁₂の生合成は、ヴエイ・フローラント
（J.Florent）およびエル．ニネツト（L.Ninet）
によつて要約されている（エイチ．ジエイ．ペプ
ラー（H.J.Peppler）およびデイ．ペルマン（D.
Perlman）：Microbial Technology、第２版、
Vol.、497〜519頁）。 知られているように、約20年前、補酵素B₁₂
は、スラツジ中に存在する微生物を用いて、下水
スラツジの栄養素からの発酵によつて生産され
た。場合により、下水スラツジに、種々の別の栄
養素がさらに補充された。この方法は、非無菌的
条件下で発酵を実施できるという利点を有する
が、各発酵に対して多量の下水スラツジを発酵プ
ラントまで輸送しなければならず、スラツジの組
成および細菌集団が変動し、さらにいわゆる「野
生株」が下水スラツジにはり込むことがあり、そ
の存在が安定した微生物集団の形成を不可能にし
た。 ハンガリー特許第153740号明細書に開示の新規
な方法に従い、必要な栄養素を含有するブロスに
下水スラツジが１回だけ添加され、そして少なく
とも５回の経代接種の後、混合微生物集団が富化
し、その際、この混合微生物集団が、接種材料と
して機能することが可能で、約６〜6.2mg／発酵
ブロス１の量で補発酵B₁₂が生産される、方法
によつて、嫌気的、無菌的条件下で補酵素B₁₂が
生産させる。この、いわゆる「下水スラツジ不
含」方法は、下水スラツジ由来の微生物を順応さ
せ、補酵素B₁₂を生産させるために、少なくとも
５回の接種工程を要し、このことは方法を煩雑に
した。さらに、補酵素B₁₂の生産性が低く、多数
の異なる栄養素が必要であつたために、生産コス
トはむしろ高いものであつた。 混合微生物集団を用いた、好気的、非無菌的発
酵による補酵素B₁₂の生産に対して、および補酵
素B₁₂の収量の増加に対して、当業者に公知の多
数の別法があり（例えば、米国特許第3954971号
および第3979159号明細書を参照されたい）、それ
らは前記「下水スラツジ不含」方法の強化に関す
る。 中温性メタン生産性の混合微生物集団が、ハン
ガリー特許第167658号明細書に記載された。この
混合微生物集団は、No.00076、No.00077、No.00078
およびNo.00079の番号で、Hungarian National
Collection of Medical Bacteria（OKI）Nation
Institute of Hygieneに寄託された菌株、コリネ
バクテリウム（Corynebacterium）sp.（24A1）、
コリネバクテリウム（Corynebacterium）sp.
（62B9）、ラクトバシラス（Lactobacillus）sp.
（244B／C1）およびプロピオニバクテリウム
（Propionibacterium）sp.（239A1/6）を含んでい
た。 しかしながら、この嫌気性、中温性、メタン生
産性の混合微生物集団は、一般的でない栄養素を
含有するブロスに順応させることが難しく、６〜
７回の経代接種が必要であつた。１回の経代接種
サイクルが約７日間を要するとして、大量生産の
ための前記微生物集団に基づく発酵の適用は約40
〜50日間続き、これは極めて長期間であり、結果
として高い生産コストとなる。 嫌気性、中温性、メタン生産性の微生物を用い
ることによる、従来公知の補酵素B₁₂の生産方法
は、すべて、多数（約18〜20）の異なる栄養素を
高い総濃度で用いることに特徴がある。栄養素の
一部は、天然性のものであり、例えば、糖蜜、ビ
ール酵母加水分解物、工業用肝臓抽出物、コーン
ステイープリカーおよび亜硫酸塩粉末亜硫酸パル
プ蒸解時に副産物として生じた亜硫酸塩廃液を真
空蒸発して得た粉末状乾燥物質）等である。これ
らの栄養素の組成は、その性質に依存して変化す
る。この事実のため、B₁₂収量は必然的に変動す
る。他の栄養素、例えば、グリシンおよび琥珀酸
は高価である。 発明が解決しようとする問題点 前記の不利益を取り除くために、本発明の目的
は、 Γ栄養素の数および特定量を減じること、 Γ可能な限り、天然栄養素を取り除くこと、およ
び Γ同時に、活性成分生産を同じレベルに保つか、
またはその生産を増大させること にある。 問題点を解決するための手段 本発明者は、新規な、嫌気性、中温性、メタン
生産性の微生物集団を含有する新規な接種材料
（その調製に関しては、実施例１、工程(a)を参照
されたい）を用い、そして同時に２つの発酵、す
なわち、半連続式維持発酵および回分式生産発酵
を実施することによつて、実験的に下記のことを
見い出した。 Γ栄養素の数は、通常の数の約半数まで減じるこ
とができる。 Γ大部分の栄養素に対して要求される栄養素の特
定量は、特定の栄養素に依存して約10〜30％ま
で減じることができる。 Γ活性成分生産の特定の材料費は、約20〜25％ま
で減じることができる。 Γ通常用いられる５種の天然性の栄養素のうち、
４種は取り除くことができる。 Γ高価なグリシンおよび琥珀酸は取り除くことが
できる。 Γコーンステイープリカーの代わりに、その熱処
理（加水分解）溶液（実施例１、工程(a)）を、
またはコーンスターチから出発する蒸留酒製造
の間に形成される廃棄物である「コーンスロツ
プ」を、またはそのコーンスロツプの加水分解
物（実施例４）を、用いることができ、そして
活性成分生産を20〜30％まで増大させることが
できる。 本発明に係る方法は、公知の方法と下記の点で
相違している。 Γ新規な、嫌気性、中温性、メタン生産性の混合
微生物集団を含有する接種材料を用いて発酵を
行なう。 Γ半連続式生産に適した新規な回分式接種材料発
酵の操作の転換が14〜15日間で完了される。そ
の際、この方法は公知方法とは異なつており、
公知工程では40〜50日を要した。 Γ栄養素の数が通常の数の約半分まで減じられ、
かつその栄養素の量（メタノールおよびｏ−キ
シリジンを除く）が特定の栄養素に依存して約
10〜30％まで減じられる、新規なブロスが用い
られる（第１表を参照されたい）。 コーンステイープリカーの代わりに、その加水
分解溶液またはいわゆるコーンスロツプ（実施例
４）またはその加水分解物を好都合に用いること
ができる。

【表】 本発明は、メタノール、前駆物質および一部分
に公知な栄養成分を含有する新規なブロスを用い
て、嫌気的、非無菌的条件下に、新規な中温性メ
タン生産性混合微生物集団によつて、補酵素B₁₂
を生産する、新規な発酵ブロスの製造方法に関す
る。前記製造方法における改良は、 嫌気性、中温性且つメタン生産性の混合微生物
集団及び補酵素B₁₂を含有する発酵ブロスの製造
方法であつて、 (a) 嫌気性、中温性且つメタン生産性の混合微生
物集団を含有する発酵ブロスを用意し、 (b) 前記発酵ブロスの５〜15容量％を除去し、そ
してそれと同容量の、次の成分：メタノール、
熱処理により加水分解されていてもよいコーン
ステイープリカー溶液及び／又は熱処理により
加水分解されたコーンスロツプ、炭素水素アン
モニウム、塩化マグネシウム、塩化コバルト、
５，６−ジメチルベンジミダゾール、並びに亜
硫酸水素ナトリウム、を含有する栄養培地
（）を加え、 (c) メタノール資化速度が0.2〜0.3ｇメタノー
ル／発酵ブロス１／時間に達するまで前記(b)
の操作を反復し、 (d) 前記(c)のメタノール資化速度に達した後の発
酵ブロスの５〜15容量％を除去し、そしてそれ
と同容量の、前記栄養培地（）の前記成分に
硫酸アンモニウム及びＯ−キシリジンを加えた
培地（）を加え、 (e) メタノール資化速度が0.2〜0.3ｇメタノー
ル／発酵ブロス１／時間に達するまで前記(d)
の操作を反復し、 (f) 前記(e)のメタノール資化速度に達した後の発
酵ブロスの５〜15容量％を取り出し、そしてそ
れと同容量の前記培地（）を加え、 (g) 所望により、(f)により得られた培地の５〜15
％を取り出し、そして同容量の前記培地を加
え、 (h) 前記(f)又は(g)において取り出した発酵ブロス
に、１日目に前記培地（）に係る栄養素を添
加し、そして所望により第２日目に、メタノー
ル、熱処理により加水分解されていてもよいコ
ーンステイープリカー及び／又は熱処理により
加水分解されたコーンスロツプ、並びに炭素水
素アンモニウムを添加して培養して目的とする
発酵ブロスを得ることを特徴とする。 前述の如く、本発明に係る方法においては、５
〜15容量％、好ましくは10容量％の接種材料用発
酵ブロス（実施例１、工程(a)）を取り出し、そし
て好ましくはさらにそれを処理すると、その補酵
素B₁₂の低濃度にもかかわらず、その濃度はやが
て増加する。本発明の好ましい態様に従つて、残
りの接種材料用発酵ブロスに、30〜35℃の水中に
溶かしたブロスまたはメタノールを加える。この
ブロスは下記の栄養素を含むものである。 Γメタノール、 Γコーンステイープリカーの加水分解溶液、 Γ炭酸水素アンモニウム、 Γ塩化マグネシウム、 Γ塩化コバルト、 Γ５，６−ジメチル−ベンゾイミダゾール、 および Γ亜硫酸水素ナトリウム。 コーンステイープリカー加水分解物の代わり
に、コーンステイプリカーまたはコースロツプま
たはその加水分解物またはそれらの混合物を用い
てもよい。 ５〜15容量％、好ましくは10容量％の発酵ブロ
スを取り出しおよび同容量のプロスの添加を６〜
８日間にわたり継続すると、その間に、発酵ブロ
スの活性成分濃度の測定およびメタノール資化
（以下、メタノリシスという）速度の測定によつ
てモニターできるように、混合微生物集団の補酵
素B₁₂生産能力が次第に改善される。メタノリシ
ス速度が0.2ｇのメタノール／発酵ブロス１／
時間になつたときに、前記栄養素のほかに、 Γ硫酸アンモニウムおよび Γｏ−キシリジン をブロスに加え、メタノリシス速度が0.3ｇのメ
タノール／発酵ブロス１／時間になるまで（約
７〜10日間）、半連続式発酵を継続する。これは、
半連続式発酵の平衡状態に相当する。 この方法で、半連続的に働く「維持」発酵ブロ
スが得られる。このブロスは、約15〜16mg／の
活性成分を含有している。毎日約10％の発酵ブロ
スを取り出し、そしてその代わりに、硫酸アンモ
ニウムおよびｏ−キシリジンで補充された、前記
規定の同容量のブロスを加えることによつて、こ
の半連続式維持発酵を続ける（続けてもよ）。 半連続的状態が達成され次第、取り出した、約
10容量％の維持発酵ブロスを引き続きの処理にそ
れ以上付すことをやめ、その代わりに、それを数
日間、回分式に後発酵させる（生産性発酵）。 半連続式維持発酵ブロスに、塩化マグネシウム
および亜硫酸水素ナトリウムのほかは同じ栄養素
を、場合により異なる濃度で含有する新しいブロ
スを加えることによつて、回分式生産発酵を行な
う。所望ならば、回分式生産発酵の２日目に、 Γメタノール、 Γコーンステイープリカー（または前記の同等の
生成物）および Γ炭酸水素アンモニウム のみを発酵ブロスに加える。 回分式生産発酵を２日間のうちに完了する。得
られる発酵ブロスは、半連続式発酵の出発状態お
よび栄養素の質および量に依存して、約26〜32
mg／の活性成分を含有している。 本発明に係る方法の主要な有利さは下記の如く
である。 Γ新規な回分式接種材料用発酵から半連続式維持
発酵への転換に要する時間が短い。 Γ天然性の栄養素の使用の本質的減少によつて、
発酵（半連続式維持発酵および回分式生産発
酵）の活性成分生産が、実際に変動を示さな
い。 Γ他の栄養素の数および量の減少が、方法の経済
性を改善する。 Γより少ない栄養素をより低濃度で含有するブロ
スを使用するにもかかわらず、単位時間当りに
生産される活性成分濃度が約20〜30％まで増加
する。 Γ栄養素の数の減少により、そして主として天然
性の栄養素を除いたことにより、発酵ブロスか
らの活性成分の生産効率が改善される。 実施例 本発明に係る方法を、以下の限定的でない実施
例によつて詳細に説明する。 実施例 １ (a) 接種材料の調製 10の実働容積を有する、実験室規模のガラ
ス製発酵槽中に、30〜32℃にあらかじめ加温し
た6000mlの水道水を加え、次いで下記の栄養素
を添加した。 35mlのメタノール、 50ｇのコーンステイープリカーから得られた
100mlの加水分解物、 30ｇの炭酸水素アンモニウム、 1.0ｇの塩化マグネシウム、 0.05ｇの塩化コバルト、 0.03ｇの５，６−ジメチルベンジルイミダゾ
ールおよび 0.30ｇの亜硫酸水素ナトリウム。 次いで、この培養ブロスを完全に均質化し、
30〜32℃の水道水を用いて8000mlにした。この
培養ブロスに、公共下水プラントから新たに得
られた、2000mlの消化後の下水スラツジを加え
た。この混合物を混合し、ガラス製発酵槽をゴ
ム板でおおい、32〜34℃の恒温器に入れた。 続く発酵期間中、毎日、50mlの試料を（均質
化の後）採取し、35mlのメタノールを発酵槽に
加え、その後さらに200mlの試料を採取し、発
酵槽をゴム板でおおい、嫌気的発酵を同温でさ
らに７日間続けた。 最初の７日間の後に得られた発酵ブロスを第
１代ブロスと称する。 メタノールの添加前に採取した試料から、発
酵ブロスのPHおよびメタノール濃度を測定し
た。メタノールの添加後に採取した200mlの発
酵ブロスをガスメーターに入れ、バイオガス発
生速度を測定した。ガス計量器から試料を取り
出し、これを次のメタノール部分の添加と平行
して発酵槽に再び加えた。 発酵の７日目に、５倍のスケールアツプを行
なつた。50の実働容積を有する発酵槽に、30
〜32℃の水道水30を加え、次いで下記の栄養
素を加えた。 175mlのメタノール、 250ｇのコーンステイープリカーから得られ
た500mlの加水分解物、 150ｇの炭酸水素アンモニウム、 ５ｇの塩化マグネシウム、 0.25ｇの塩化コバルト、 0.15ｇの５，６−ジメチルベンゾイミダゾー
ル、 1.5ｇの亜硫酸水素ナトリウム。 栄養素の添加を終えた後、30〜32℃の水道水
を加えて培養ブロスを40にした。 その後、７日目の発酵ブロス（第１代ブロ
ス）の全量（10）を新たに調製した培養ブロ
スに加え（接種）、強い均質化の後、発酵槽を
シールし、嫌気的発酵を32〜34℃においてさら
に７日間続けた。 第２の７日間の間、毎日、50mlの試料を採取
し、175mlのメタノールを発酵槽に加え、次い
で200mlの試料を採取した。発酵槽をシールし、
32〜34℃で発酵を続けた。メタノールの添加の
前後に、採取した試料について、おのおの、
PH、メタノール濃度およびバイオガス発生速度
を測定した。 第２の７日間の後に得られた発酵ブロスを、
第２代ブロスと称する。10％（5.0）の均質
化された第２代ブロスを取り出し、下記の組成
を有する同容量の培養ブロスを加えた。 5000mlの30〜32℃の水道水、 175mlのメタノール、 25ｇのコーンステイープリカーから得られた
50mlの加水分解物、 15ｇの炭酸水素アンモニウム、 0.5ｇの塩化マグネシウム、 0.25ｇの塩化コバルト、 0.15ｇの５，６−ジメチルベンゾイミダゾー
ルおよび 0.1ｇの亜硫酸水素ナトリウム。 この培養ブロスの添加後、発酵ブロスを完全
混合し、発酵槽をシールし、さらに１日間32〜
34℃で発酵を続けた。 前記の手順の間に、新規な、嫌気性、中温
性、メタン生産性の混合微生物集団が形成され
た。前記微生物集団は、No.00076、No.00079およ
びNo.00272の番号で、Hungarian National
Collection in Medical Bacteria（OKI）
Nation Institute of Hygieneに寄託された菌
株を含んでいた（寄託番号の順に、コリネバク
テリウム（Corynebacterium）sp.（24A1）、プ
ロピオニバクテリウム（Propionibacterium）
sp.（239A1/6）およびメタ／コツカス
（Methanococcus）sp.（MC−017）である）。
この接種材料は、5.4〜5.8のPHおよび0.5〜0.8
のバイオガス／日／発酵ブロス１のバイオ
ガス発生によつて特徴付けられる。 得られた接種材料は、補酵素B₁₂の生産に適
していた。 ハンガリー特許第167658号明細書に開示の方
法によつて半連続式操作の第１日目に採取した
試料から測定された発酵ブロスの活性成分濃度
は、7.3mg／に達した。 栄養成分を下記のようなコーンステイープリ
カーの熱処理を行なつて調製した。約45％の乾
物量を有するコーンステイープリカーを、同容
量の水道水を用いて稀釈し、この混合物を煮沸
に到らせ、15分間煮沸した。次いで、この溶液
を冷却し、そして水道水を用いて初めの容量に
した。得られた新たな溶液は、いわゆる熱処理
したコーンステイープリカー（加水分解物）で
ある。 活性成分生産のための接種材料の調製に使用
されるコーンステイープリカーの適合性を、以
下の微生物学的方法によつて、その使用前に決
定した。10の実働容積を有する実験室規模の
ガラス製発酵槽中に、30〜32℃の水道水９
を、次いで下記の栄養素を加えた。 50mlのメタノール、 試験される、45％の乾物を含有する、50ｇの
未処理（未加水分解）のコーンステイープリカ
ー、 30ｇの炭酸水素アンモニウム、 １ｇの塩化マグネシウム、 0.05ｇの塩化コバルト、 0.03ｇの５，６−ジメチルベンゾイミダゾー
ルおよび 0.20ｇの亜硫酸水素ナトリウム。 均質化の後、補酵素B₁₂発酵槽からの300ml
の発酵ブロスを、前記ブロスに加え、次いで、
そこに30〜32℃の水道水を加えて10にした。
発酵槽を、ゴム板でおおい、32〜34℃の恒温器
に入れた。毎日、この混合物に50mlのメタノー
ルを加え、均質にした後200mlの発酵ブロスを
取り出してバイオガス発生速度を測定し、発酵
槽におおいをして32〜34℃にて発酵を続けた。
発酵の４日目に、バイオガス発生が0.3〜0.6
／発酵ブロス１／日であつた場合に、コー
ンステイープリカーは、前記の熱処理後は、接
種材料の調製に適合するものである。 ５，６−ジメチルイミダゾールは、規定量の
メタノール中に溶解の後、前記ブロスに加え
た。 他の栄養素は、直接に前記ブロスに加え、そ
の中で溶解させた。 (b) 半連続式維持発酵 50の実働容積を有する発酵槽中に調製した
接種材料の約10％を毎日取り出し、その代わり
に、以下の如く調製した同量の維持ブロスを加
えた。 下記の栄養素を、30〜35℃の水5.0中に溶
かした。 300mlのメタノール、 25ｇのコーンステイープリカーの50mlの加水
分解溶液、 17.5ｇの炭酸水素アンモニウム、 0.5ｇの塩化マグネシウム、 0.05ｇの塩化コバルト、 予め10mlのメタノール中に溶解されている、 0.03ｇの５，６−ジメチル−ベンゾイミダゾ
ール、および 0.15ｇの亜硫酸水素ナトリウム。 均質化の後、前記ブロスを、50の実働容積
を有し、発酵ブロスを含有する発酵槽中に注い
だ。この混合物を完全混合し、発酵槽をシール
して、嫌気的条件下に32〜34℃で発酵を行なつ
た。 毎日取り出した５の発酵ブロスから試料を
採取し、工程(a)に記載のように、活性成分（補
酵素B₁₂およびフアクター（）量およびメタ
ノール量並びにPHを測定した。 発酵の６日目および８日目に、メタノリシス
速度がメタノール0.2ｇ／発酵ブロス１／時
間になつた場合には、さらに、 ５ｇの硫酸アンモニウムおよび 0.2ｇのｏ−キシリジン を前記発酵ブロスに加えた。ｏ−キシリジン
は、15mlのメタノール中に溶解した。 10％の発酵ブロスの取り出しおよび維持発酵
ブロス（硫酸アンモニウムおよびｏ−キシリジ
ン含有）の添加を毎日繰り返した。この方法
で、接種材料発酵を、17.5mg／の活性成分量
を有する維持発酵に迅速に転換した。 (c) 回分式生産発酵 活性成分濃度を増加させるために、半連続式
維持発酵の間、毎日取り出した５の発酵ブロ
スを、以下の回分式後発酵に付した。 発酵ブロスを、５の実働容積のガラス製発
酵槽中に充填し、その後下記の成分を加えた。 45mlのメタノール、 3.5ｇのコーンステイープリカー（乾物量45
％）、 2.5ｇの炭酸水素アンモニウム、 1.5ｇの硫酸アンモニウム、 0.005ｇの塩化コバルト、 0.01ｇの５，６−ジメチル−ベンゾイミダゾ
ールおよび 0.01ｇのｏ−キシリジン^(*) (*) ５，６−ジメチル−ベンゾイミダゾールお
よびｏ−キシリジンは、５mlのメタノールに中
溶かして発酵ブロスに加えたので、メタノール
の全量は50mlであつた。 栄養素の添加を終えた後、発酵槽をゴム板でお
おい、32〜34℃で放置した。翌日（第２日目）
に、さらに下記の栄養素を加えた。 20mlのメタノール、 1.5ｇのコーンステイープリカー（乾物量45％）
および 1.5ｇの炭酸水素アンモニウム。 栄養素の添加の完了後、発酵ブロスを再び完全
混合し、発酵槽をゴム板でおおい、一夜間32〜34
℃で放置した。第２日目の後、発酵ブロスの活性
成分濃度は、26mg／に達していた。 実施例 ２ 実施例１、工程(b)に記載の如く、半連続式維持
発酵を行なつた。発酵ブロスの活性成分濃度は、
17.5mg／であつた。 周期的な毎日の、発酵ブロスの取り出しおよび
新しいブロスの添加を、下記の方法で、４日間、
中断した。発酵の所定の日に、発酵ブロスを１
だけ取り出し、その４日目に、さらに発酵ブロス
を取り出すことなく、450mlのメタノールおよび
下記の栄養素： 50ｇのコーンステイープリカー（加水分解溶
液）、 30ｇの炭酸水素アンモニウム、 10ｇの硫酸アンモニウム、 0.5ｇの塩化マグネシウム、 0.15ｇの塩化コバルト、 0.10ｇの５，６−ジメチル−ベンゾイミダゾー
ル、 0.10ｇのｏ−キシリジンおよび 0.10ｇの亜硫酸ナトリウム を含有する、30〜35℃の水道水250mlを加えた。
半連続式操作の５日目から通常の方法で発酵を続
けた。すなわち、毎日５の発酵ブロスを取り出
し、そしてその代わりに500mlのメタノールおよ
び下記の栄養素： 50ｇのコーンステイープリカー（加水分解溶
液）、 17.5ｇの炭酸水素アンモニウム、 ５ｇの硫酸アンモニウム、 0.5ｇの塩化マグネシウム、 0.05ｇの塩化コバルト、 0.03ｇの５，６−ジメチル−ベンゾイミダゾー
ル、 0.2ｇのｏ−キシリジンおよび 0.15ｇの亜硫酸ナトリウム を含有する、30〜35℃の同量のブロスを加えた。 次いで、発酵液の取り出しおよびブロスの添加
を、前記の如く毎日繰り返した。得られた発酵ブ
ロスの活性成分濃度は、24.6mg／に達した。 次いで、活性成分濃度を増加させるために、維
持発酵槽から毎日取り出した５の発酵液を回分
式で後発酵させた（実施例１、工程(c)を参照され
たい）。この工程は、回分式生産発酵である。24
時間の後発酵の後、発酵ブロスは32mg／の活性
成分を含んでいた。 実施例 ３ 本例は、熱処理した（加水分解した）コーンス
テイープリカーの使用が未処理のコーンステイー
プリカーの使用より有効であることを示すもので
ある。 本質的に実施例１、工程(b)に従つたが、45％の
乾物量を有する25ｇのコーンステイープリカーか
ら調製した50mlの加水分解コーンステイープリカ
ーの代わりに、50ｇの未処理のコーンステイープ
リカー（乾物量：45％）を、５のブロスに加え
た。 維持発酵ブロスは、17.0mg／の活性成分を含
んでおり、この発酵ブロスは、48時間の後発酵の
後（実施例１、工程(c)を参照されたい）、250mg／
の活性成分を得た。半連続式維持発酵ブロスお
よび回分式生産発酵ブロスの双方の活性成分濃度
は、実際には、本例で用いた２倍量のコーンステ
イープリカーにもかかわらず、実施例１の工程(b)
および(c)で調製した対応する発酵ブロスの活性成
分濃度と同一であることがわかつた。 実施例 ４ 50mlのコーンステイープリカー加水分解溶液
（25ｇのコーンステイープリカーから調製）の代
わりに、75ｇのコーンスロツプ（乾物量：30％）
の加水分解によつて調製した150mlの溶液を、50
の半連続式生産発酵槽の毎日のブロス中に加え
た以外は、本質的に実施例１、工程(b)に記載の手
順に従つた。コーンスロツプの熱処理（加水分
解）を、コーンステイープリカーの加水分解に関
して記載した（実験例１の）如くに実施した。 実施例１の工程(c)に係る後発酵の間、45％の乾
物量を含有し、おのおの第１日目および第２日目
に加えられた。3.5ｇおよび1.5ｇのコーンステイ
ープリカーに代わりに、5.25ｇおよび2.25ｇの熱
処理したコーンスロツプを加えた。２日間の後発
酵の後に得られた、発酵ブロスの活性成分濃度
は、25.2mg／に達した。 本例で説明したように、コーンステイプリカー
およびその加水分解物を、熱処理したコーンスロ
ツプと置きかえることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 嫌気性、中温性且つメタン生産性の混合微生
   物集団及び補酵素B₁₂を含有する発酵ブロスの製
   造方法であつて、 (a) 嫌気性、中温性且つメタン生産性の混合微生
   物集団を含有する発酵ブロスを用意し、 (b) 前記発酵ブロスの５〜15容量％を除去し、そ
   してそれと同容量の、次の成分：メタノール、
   熱処理により加水分解されていてもよいコーン
   ステイープリカー溶液及び／又は熱処理により
   加水分解されたコーンスロツプ、炭酸水素アン
   モニウム、塩化マグネシウム、塩化コバルト、
   ５，６−ジメチルベンジミダゾール、並びに亜
   硫酸水素ナトリウム、を含有する栄養培地
   （）を加え、 (c) メタノール資化速度が0.2〜0.3ｇメタノー
   ル／発酵ブロス１／時間に達するまで前記(b)
   の操作を反復し、 (d) 前記(c)のメタノール資化速度に達した後の発
   酵ブロスの５〜15容量％を除去し、そしてそれ
   と同容量の、前記栄養培地（）の前記成分に
   硫酸アンモニウム及びＯ−キシリジンを加えた
   培地（）を加え、 (e) メタノール資化速度が0.2〜0.3ｇメタノー
   ル／発酵ブロス１／時間に達するまで前記(d)
   の操作を反復し、 (f) 前記(e)のメタノール資化速度に達した後の発
   酵ブロスの５〜15容量％を取り出し、そしてそ
   れと同容量の前記培地（）を加え、 (g) 所望により、(f)により得られた培地の５〜15
   ％を取り出し、そして同容量の前記培地を加
   え、 (h) 前記(f)又は(g)において取り出した発酵ブロス
   に、１日目に前記培地（）に係る栄養素を添
   加し、そして所望により第２日目に、メタノー
   ル、熱処理により加水分解されていてもよいコ
   ーンステイープリカー及び／又は熱処理により
   加水分解されたコーンスロツプ、並びに炭酸水
   素アンモニウムを添加して培養して目的とする
   発酵ブロスを得ることを特徴とする方法。