JPH0543353B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は、枯草菌等の宿主細胞中でスタフイロ
キナーゼ遺伝子（以下sak遺伝子）を形質発現さ
せることのできる新規な組換えプラスミド
pHSAK565に関するものであり、更に詳しくは
エシエリシア・コリ（以下大腸菌）に適用可能な
プラスミドベクターpACYC177とストレプトコ
ツカス・フエカリス（Streptococcus faecalis）
由来のプラスミドpAMα1を出発物質とする複合
プラスミドpHY460（該複合プラスミドによる形
質転換体としての大腸菌（pHY460）及び枯草菌
（pHY460）は、それぞれ、微工研条寄第438号及
び微工研条寄第439号として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託済み。）と、スタフイロコツ
カス アウレウス（Staphylococcus aureus）の
溶原フアージSφ−Ｃと大腸菌に適用可能なプラ
スミドベクターpBR322を出発物質とする複合プ
ラスミドpSAK−HP2（該複合プラスミドによる
形質転換体としての大腸菌C600r^-m^-（pSAK−
HP2）はATCC寄託番号第39179号としてアメリ
カン タイプ カルチヤー コレクシヨンに寄託
済み。）とを酵素的に切断・連結したものであり、
枯草菌及び大腸菌を宿主菌として安定に自己複製
し、特に、枯草菌においては、その宿主細胞中で
sak遺伝子を形質発現させることにより、安定
に、かつ、効率よく、スタフイロキナーゼを生産
させるのに好適な組換えプラスミドpHSAK565
に係わるものである。 ここにいうスタフイロキナーゼ（以下SAKと
略記する）とは、スタフイロコツカス アウレウ
ス（以下S.アウレウスと略記する）が生成する繊
維素溶解酵素であつて、血中のプラスミノーゲン
をプラスミンに変換する作用を奏することから、
血液凝固防止剤や血栓治療剤などの、所謂、線溶
剤として医療の用に供しうるものである。 そして、このようなSAKの生成に関する遺伝
情報を担持するsak遺伝子に関しては、これをS.
アウレウスの溶原フアージSφ−Ｃから抽出して、
大腸菌のプラスミドベクターにクローニングし、
宿主としての大腸菌内で発現させ、これにより、
SAKを効率よく生産する系が、特開昭58−67181
号及び特開昭58−38435号として開示されている。 しかしながら、宿主としての大腸菌に関して
は、その遺伝学的及び菌学的性質がよく知られて
はいるものの、これをSAK等の蛋白質の生産に
指向させると、生産された蛋白質が菌体内に蓄積
されてしまうことから、その生産性に限度がある
こと、さらには、生産された蛋白質に対する発熱
因子の混入が危惧されること等の問題点があつ
た。 そこで、SAKの生産に関しては、溶原フアー
ジSφ−Ｃ由来のsak遺伝子が、グラム陽性菌であ
るS.アウレウスの細胞内で発現することにより、
実現させることと、一般に、あるグラム陽性菌内
で発現する遺伝子は他のグラム陽性菌内でも発現
する可能性が高いことに鑑み、大腸菌と同様に、
その遺伝学的及び菌学的性質がよく知られてはい
るが、大腸菌とは相違して、グラム陽性菌である
ところの枯草菌の宿主−ベクター系の採用が有望
視されるに至つた。 しかしながら、枯草菌に関しては、下記列挙の
理由により、優れた宿主−ベクター系の確立が困
難であつたので、該菌種に遺伝子操作を施して行
う物質生産はいまだに実用化の段階に至つていな
い。 (1) 枯草菌の細胞内では、多くの場合、組換えプ
ラスミドの安定保持が困難であること。 (2) 遺伝子発現の制御に関する解析が不十分であ
ることから、人為的な発現制御が困難であるこ
と。 (3) 生成された物質が蛋白分解酵素（プロテイア
ーゼ）によつて顕著に崩壊されること。 しかるところ、Palvaらの近年の報告（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 79、5582（1982）及びGene
22、229（1983））によれば、大腸菌に関しては、
生産された物質が、必ず、ペリプラズムあるいは
菌体内に蓄積されてしまうのであるが、枯草菌に
関しては、生産された物質が分泌蛋白質であれ
ば、これを菌体外に分泌することが明らかになつ
たので、分泌蛋白質の生産系として、枯草菌の有
望株が注目されるようになつた。 そこで、本発明者らは、先に開発された枯草菌
の宿主−ベクター系を対象として、特に、sak遺
伝子を枯草菌内に導入するのに好適な枯草菌の宿
主−ベクター系の確立につき、鋭意研究を重ねた
結果、先に開発された枯草菌の宿主−ベクター系
のうちの一つのベクターである複合プラスミド
pHY460と、先に開発され、特開昭58−6718号と
して開示されているsak遺伝子を含むプラスミド
pSAK−HP2（該プラスミドを保有する大腸菌
K12C600r_k ^-m_k ^-（pSAK−HP2）はATCC39179号
としてアメリカン タイプ カルチヤー コレク
シヨンに寄託済み。）とから新規な組換えプラス
ミドpHSAK565を合成することに成功して、本
発明を完成するに至つた。そして、本発明に係わ
る新規な組換えプラスミドpHSAK565は、先に
開発された枯草菌の宿主−ベクター系のうちの一
つの宿主である枯草菌YIT6007株（該枯草菌は
微工研菌寄第7326号として工業技術院微生物工業
研究所に寄託済み。）内に安定に導入保持されて、
効率よく、SAKを生産することも見い出された。 すなわち、本発明の目的は、sak遺伝子を有し
ていて、枯草菌及び大腸菌内で複製可能であり、
とりわけ、枯草菌内において、安定に、効率よ
く、SAKを生産させる際に有用な新規な組換え
プラスミドpHSAK565を提供することである。 このような目的に沿う本発明の構成は、第１図
〜第２図に示されるように、大腸菌に適用可能な
プラスミドベクターpACYC177（第１図Ａ）とス
トレプトコツカス フエカリス（Streptococcus
faecalis）由来のプラスミドpAMα1（第１図Ｂ）
とを制限酵素Hindにて切断してからT4リガー
ゼにて連結して中間体１としての複合プラスミド
pHY780（第１図Ｃ）を合成し、該中間体１を制
限酵素BamHにて切断してからT4リガーゼに
て連結して、中間体２としての複合プラスミド
pHY600（第１図Ｄ）を合成し、さらに、該中間
体２を制限酵素Xho、Salにて切断してから
T4リガーゼにて連結して、中間体３としての複
合プラスミドpHY460（第１図Ｅ）を合成し、一
方、スタフイロコツカスアウレウス
（Staphylococcus aurels）の溶原フアージSφ−
Ｃを制限酵素HindとPstにて切断して生成し
たsak遺伝子を含むDNA断片と、大腸菌に適用
可能なプラスミドベクターpBR322を制限酵素
EcoRとPstにて切断して生成したDNA断片
とをT4リガーゼにて連結して、中間体４として
の複合プラスミドpSAK−HP2（第２図Ｆ）を合
成し、前記中間体３としての複合プラスミド
pHY460（第２図Ｅ）と上記中間体４としての複
合プラスミドpSAK−HP2（第２図Ｆ）のそれぞ
れを二種類の制限酵素BamHとPstにて切断
してからT4リガーゼにて連結して成る組換えプ
ラスミドpHSAK565（第２図Ｇ）であり、約5.65
メガダルトン（以下、Mdと略記する）の分子量
を有し、第３図の詳細な制限酵素切断地図で表わ
される環状DNAである。 そして、本発明に係わる組換えプラスミド
pHSAK565は、その遺伝子（DNA）中に、スタ
フイロコツカス アウレウス（Staphylococcus
aures）の溶原フアージSφ−Ｃ由来のsak遺伝子
を有するので、該プラスミドが枯草菌あるいは大
腸菌に導入されると、これらの宿主菌に対して、
SAK生産能を付与する。 さらに、本発明に係わる組換えプラスミド
pHSAK565は、テトラサイクリン耐性遺伝子を
有するので、該プラスミドが導入されると、宿主
菌に対してテトラサイクリン耐性形質を付与す
る。この性質は、組換えプラスミドpHSAK−
565を保有する宿主菌、すなわち、形質転換体を
取得する際に、その検出及び選択のための指標
（遺伝子マーカ）として、重要な役割を果す。そ
の上、本発明に係わる複合プラスミドpHSAK−
565は、ある種の枯草菌、好適には、枯草菌
168YIT6007の宿主細胞内できわめて安定に保持
される性質を備えている。 続いて、本発明の参考例及び実施例について説
明すれば以下の通りである。 参考例 １ 複合プラスミドpHY780（中間体１）の合成 (1) pACYC177の調製 大腸菌K12WA802r^-m⁺（pACYC177）（東京
大学応用微生物研究所斎藤研究室保有）から、
ChangとCohen（T.Bacteriol 134、、1141
（1978））の方法により、第１図Ａの切断地図で
表わされるpACYC177 DNAを調製した。 (2) pAMα1の調製 ストレプトコツカス・フエカリス
（Streptococcus faecalis）DS5（ATCC14508）
から、Clewellら（Proc.Natl.Acad.Sci、
USA、72、1720（1975））の方法により、第１
図Ｂの切断地図で表わされるpAMα1DNAを調
製した。 (3) pACYC177及びpAMα1の切断と連結 上記(1)項(2)項記載の処理により得られた10μ
の各DNA溶液（0.1〜0.2μｇのDNAを含む）
に、1μの10倍濃度緩衝液（100ｍＭ Tris−
HCl（PH7.6）、70ｍＭ MgCl₂、70ｍＭ β−
メルカプトエタノール、500ｍＭ NaCl）を加
えた後、更に4uのHindを添加し、これを37
℃、60分間反応させて、両DNA（pACYC177
及びpAMα1）をHindの認識切断部位にて切
断した。そして、60℃、10分間でこの反応を停
止させた後、1/50量の5M NaClを加え、更に、
全量の２倍量の−20℃の冷エタノールを加え、
これを−20℃、30分間冷却した。更に、これを
15000rpm、０℃、５分間、遠心分離処理した
後、上清を捨てて、沈殿物を再び−20℃エタノ
ールで洗滌した。これを15000rpmn、０℃、２
分間、遠心分離処理した後、上清のエタノール
を捨てて、更に、エタノールを完全に蒸発させ
た。 これにより得られたDNA断片に20μの滅
菌水を加えて溶解させ、10ｍＭ ATP 3μ、
100ｍＭ ジチオスレイトール 3μ、660ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH7.6）−66ｍＭ MgCl₂ 3μ
を加え、更に、2.8u／μのT4リガーゼを0.5μ
加えた。そして、15℃で一夜反応を行わせ
て、Hindの認識切断部位にて、pACYC177
を切断して得られた一本の線状DNA断片と、
同じ認識切断部位にてpAMα1を切断して得ら
れた二本の線状DNA断片との各断片同志を連
結した。それから、120μの滅菌水を加えて、
全量を150μとした。 (4) 大腸菌の形質転換 大腸菌K12C600r^-m^-（東京大学応用微生物研
究所斎藤研究室保有）を、Ｌ−ブロス中で一夜
培養した。この培養液0.05mlを５mlのＬ−ブロ
スに加えて、37℃で２時間10分の振とう培養を
行つた。遠心分離処理にて集菌した後、得られ
た菌を０℃の0.1M CaCl₂水で洗滌し、0.25ml
の０℃、0.1M CaCl₂水に溶解することにより、
コンピテント細胞を作製した。そして、0.1ml
のコンピテント細胞に対して0.1mlの、上記(3)
項記載の処理にて連結されたDNA（濃度1μ
ｇ／ml）を加え、０℃にて５分間放置した後、
0.8mlのＬブロスを加え、37℃で１時間培養し
て、該コンピテント細胞を該連結されたDNA
によつて、形質転換させた。次いで、この培養
液をＬ−ブロスに1.5％寒天と、20μｇ／mlのテ
トラサイクリンと、30μｇ／mlのアンピリシン
とを添加して成る選択培地の表面上に塗布し
て、37℃で一夜培養した。その際、この選択培
地上でコロニーを形成した10株の形質転換体に
ついて、保有プラスミドの大きさを調べた。 (5) プラスミドDNAの抽出とその分子量の測定 上記(4)項記載の処理により生成された形質転
換体をＬ−ブロス中で一夜培養し、その培養液
５mlに遠心分離処理を施して、該培養液中の菌
を分離した。次いで、分離された菌を0.5mlの
50ｍＭ Tris−10ｍnM EDTA（PH7.4）に溶解
させた。この溶液に0.2mlの２mg／mlリゾチー
ム−0.5mg／ml RNaseを加えて、37℃で５分
間反応させて該菌を溶解させた。続いて、0.2
mlの２％ SDS溶液を加えて、30℃で１〜２分
間更に反応させて、該菌に対する溶解作用を続
行させ、０℃で10分間放置後、この溶液を
20000rpmで０℃、10分間、遠心分離処理した。
分離された上清0.5mlに対して緩衝液Ａで飽和
したフエノール0.5mlｎを加え、よく混合し
て、不所望の蛋白質を該フエノールにて変性さ
せた。更に、これを15000rpmで３分間室温で
遠心分離処理し、所望のDNAを含む水層を採
取し、その50μづつを0.8％アガロースゲル電
気泳動させて、その分子量を測定した。上記処
理により、10株の形質転換体について、プラス
ミドの大きさを調べたところ、その分子量は約
7.8Mdであつた。 このようにして、第１図Ａ，Ｂの切断地図で表
わされるpACYC177、pAMα1から合成された複
合プラスミドのうち、第１図Ｃの切断地図で表わ
されるものが、中間体１としてのpHY780であ
る。 これにより、少なくとも、第１図Ｃの切断地図
で表わされるpHY780が大腸菌の生態系内で安定
に増殖し、形質発現することが確認された。 参考例 ２ 複合プラスミドpHY600（中間体２）の合成 (1) pHY780の切断と連結 参考例１記載の処理により生成された形質転
換体である大腸菌K12C600r^-m^-（pHY780）か
ら、参考例１(5)項記載の処理と同様の処理を施
して、プラスミドDNAを抽出した。抽出され
たDNA1μｇ／20μに2μの緩衝液（100ｍＭ
Tris−HC1（PH7.6）、70ｍＭ MgCl₂、70ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール、500ｍＭ
NaCl）を加え、さらに4uの制限酵素BaｍＨ
を加えて、37℃で60分間反応させた。60℃、10
分間熱処理してこの反応を停止させた後、80μ
の水を加え、2μの5M NaClを加え、更に、
−20℃のエタノール200μを加えて、−20℃で
30分間放置し、次いで、０℃で５分間、
10000rpmの遠心分離処理によりDNAを集め
た。これを、200μの−20℃エタノールで洗
滌した後、乾燥させてから、20μの水に溶解
させ、その溶液にT4リガーゼを添加して、該
溶液中のDNAに対して前記参考例１(3)項記載
の処理と同様の連結処理を施した。 (2) 大腸菌の形質転換 次いで、上記(1)項記載の処理により生成され
たDNAを用いて、大腸菌K12C600r^-m^-を形質
転換させた。生成された形質転換体は、20μ
ｇ／mlテトラサイクリン、30μｇ／mlアンピシ
リンに耐性を示した。この形質転換体のうち、
10株について、前記参考例１(5)項記載の処理と
同様の処理により、プラスミドを抽出して、そ
の分子量を調べたところ、全て、分子量約
6Mdであつた。 このようにして、第１図Ｃの切断地図で表わ
されるpHY780から合成された、第１図Ｄの切
断地図で表わされる複合プラスミドが、中間体
２としてのpHY600である。そして、上記処理
により、このpHY600も、少なくとも、大腸菌
に対するクローニングベクターとして使用可能
であることが確認された。 参考例 ３ 複合プラスミドpHY460（中間体３）の合成及
び枯草菌の形質転換 (1) pHY600の切断と連結 参考例２記載の処理により合成された複合プ
ラスミドpHY600を、制限酵素Xho及びSol
を用いて参考例１(3)項記載の処理と同様の酵
素処理により、切断し、更に、そのDNA断片
をT4リガーゼを用いた酵素処理により連結し
てから、参考例１(4)項記載の処理と同様の処理
により、大腸菌を形質転換し、分子量約4.6Md
の複合プラスミドを分離した。このようにし
て、第１図Ｄの切断地図で表わされるpHY600
から合成された第１図Ｅの切断地図で表わされ
る中間体３としての複合プラスミドがpHY460
である。 (2) 枯草菌の形質転換 コンピテント細胞の調製 Ｌ−寒天平板上で一夜培養した枯草菌
（Baci−llus subtilis）Marburg 168（東京大
学応用微生物研究所斎藤研室保有）を培地
スピザイセン ミニマル培地（Spizizen
mini−mal medium）：K₂HPO₄ 1.4％、
KH₂PO₄ 0.6％、（NH₄）₂SO₄ 0.2％、クエン
酸ナトリウム 0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.02
％、グルコース 0.5％に対してカゼイン加
水分解物 0.02％、酵母エキス 0.02％、Ｌ
−トリプトフアン 50μｇ／mlを加えたも
の）に対して、１×10⁸／ml程度接触した。
これを37℃で振とう培養して、約４時間経過
後、静止期に入つた段階で、培地（培地
のＬ−トリプトフアンを5μｇ／ml、酵母エ
キス0.2％とし、更に、５ｍnM MgSO₄を加
え、カゼイン加水分解物を含まないもの）中
で、10倍に薄めて培養を続行した。培養液中
の菌は90分後に、コンピテント
（competent）状態に達した。このコンピテ
ント細胞0.9mlに上記(1)項記載の処理により
分離された複合プラスミドpHY460のDNA
溶液0.1mlを加えて37℃で、90分間振とう培
養しながら形質転換を行つた。 形質変換体の検出 複合プラスミドpHY460をとり込ませた形
質転換体を20μｇ／mlのテトラサイクリンを
含むＬ−寒天平板上に塗布して、37℃で24時
間培養した。得られたコロニーにつき、参考
例１と同様の処理によりプラスミドの存在を
確認した。得られたプラスミドは分子量約
4.6Mdであり、pHY460のそれと同量であつ
た。 そして、参考例１(5)項記載の処理と同様の
処理を施して、枯草菌から得られた複合プラ
スミドpHY460による大腸菌K12C600r^-m^-
の形質転換も確認された。これにより、複合
プラスミドpHY460は、少なくとも、大腸菌
と枯草菌の双方を宿主としうるクローニング
ベクター、即ち、シヤトルベクターであるこ
とが確認された。 なお、形質転換体としての大腸菌（pHY460）
及び枯草菌（pHY460）は、それぞれ、受託番号
微工研条寄第438号及び微工研条寄第439号とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託済みで
ある。 参考例 ４ 複合プラスミドpSAK−HP2（中間体４）の合
成 sak遺伝子は、スタフイロコツカス・アウレウ
ス（Staphylococcus aureus）の溶原フアージ
Sφ−ＣのDAN上にあつて、制限酵素Hindと
Pstの認識切断部位によつて挟まれる分子量約
1.7Mdの領域に位置している。そこで、この領域
のDNAを大腸菌のプラスミドベクターである
pBR322のEcoR及びPstの認識切断部位によ
つて挟まれる領域に挿入することにより、
pBR322にsak遺伝子をクローニングした。 上記の処理をより詳細に説明すれば以下の通り
である。 (1) 溶原フアージSφ−CDNAの切断 前記参考例１(3)項記載の処理と同様の処理に
より、Sφ−Ｃ DNAを制限酵素Hindにて
切断して、3.3MdのDNA断片を分離する。 このDNA断片の両端には、それぞれ４塩基
から成る一本鎖部分が存在しているので、1u
のT4DNAポリメラーゼと４種のデオキシリボ
ヌクレオシド−３リン酸（各25μM）によつて
67ｍＭ Tris−HC（PH8.0）、6.7ｍＭ
MgCl₂、6.7ｍＭ β−メルカプトエタノール
を含む緩衝液（20μ）中で18℃にて４時間反
応させて上記一本鎖部分を二本鎖とした。この
DNA断片を含む反応液に5μの1.5M酢酸ナト
リウム（PH7.0）と75μのエタノールを加え、
−70℃にて10分間保持した後、15000rpmで５
分間遠心分離して、DNAを沈澱物として回収
した。この沈澱物を冷エタノールで洗滌してか
ら乾燥させ、10ｍＭ Tris−HC1（PH7.6）７ｍ
Ｍ MgCl₂−７ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル−50ｍＭ NaClから成る緩衝液にとかし、
5uの制限酵素Pstを加え、37℃で１時間反応
させることにより、回収したDNA断片をさら
に２つのDNA断片に切断して、後述の連結反
応処理に備えた。 (2) プラスミドpBR322の開裂 1μｇのプラスミドpBR322 DNA（ベーリン
ガーマンハイム（Boehringer−Mannhem 社
製）に10uのEcoRを加えて参考例１(3)項記
載の処理と同様の処理により、反応させて、こ
の環状DNAを開裂させた。 上記開裂したDNA断片の両末端を上記(1)項
記載の処理と同様の処理により、二本鎖とし
た。この二本鎖末端（フラツシユエンド）の
DNA断片を、さらに上記(1)項後半部記載の処
理と同様の処理により、制限酵素Pstで切断
して、後続の連結反応処理に備えた。 (3) 連結反応処理 上記(1)、(2)項記載の処理により生成された各
DNA断片とベクターDNAを混合し、1uのT4
リガーゼを使用して参考例１(3)項記載の処理と
同様の連結反応処理を施した。 (4) 形質転換 続いて、参考例２(2)項記載の処理と同様の処
理により大腸菌K12C600r^-m^-を形質転換し、
テトラサイクリン耐性の菌株を選択抽出した。
そして、テトラサイクリン耐性の菌株の中から
SAK生産能をする菌株を選択抽出し、次いで、
その菌株から分子量約4.07Mdの複合プラスミ
ドを分離抽出した。 このようにして得られた、第２図Ｆの切断地図
で表わされる中間体４としての複合プラスミドが
pSAK−HP2である。そして、この複合プラスミ
ドpSAK−HP2に関しては、分子量約1.7Mdのフ
アージSφ−Ｃに由来するsak遺伝子を含んでいる
ことが確認された。 なお、形質転換体としての大腸菌（pSAK−
HP2）は、ATCC39179号としてアメリカン タ
イプ カルチヤー コレクシヨンに寄託済みであ
る。 実施例 １ 組換えプラスミドpHSAK565の合成 複合プラスミドpHY460に対して複合プラスミ
ドpSAK−HP2のsak遺伝子を含むDNA断片をク
ローニングして、組換えプラスミドpHSAK565
（Tc^rSAK⁺）を合成した。 すなわち、参考例３記載の処理により合成され
た中間体３としての複合プラスミドpHY460と、
参考例４記載の処理により合成された中間体４と
しての複合プラスミドpSAK−HP2の両DNAを
参考例１(3)項記載の処理と同様の処理により、そ
れぞれ別々に制限酵素BamHとPstにて切断
してから、両DNAを混合してT4リガーゼで連結
することにより、分子量約5.65Mdの組換えプラ
スミドを合成した。 このようにして、第２図Ｅの切断地図で表わさ
れる中間体３としての複合プラスミドpHY460
と、第２図Ｆの切断地図で表わされる中間体４と
しての複合プラスミドpSAK−HP2とから合成さ
れた、第２図Ｇの切断地図で表わされる組換えプ
ラスミドをpHSAK565と命名した。 なお、該プラスミドを保持した枯草菌
168YIT6007（pHSAK565）は微工研菌寄第7325
号として工業技術院微生物工業研究所に寄託済み
である。 実施例 ２ 組換えプラスミドpHSAK565による大腸菌の
形質転換 次いで、上記実施例２記載の処理により生成さ
れた組換えプラスミドpHHSAK565を用いて、
参考例１(4)項記載の処理と同様の処理によつて、
大腸菌K12C600r^-m^-を形質転換し、テトラサイ
クリン耐性株を選択した。 その形質転換体のうちの30株について、SAK
生産能をKondoとFujiseの方法（Infect.Immun.
18、266−272（1977））により測定したところ、上
記30株すべてにSAK生産能が認められた。さら
に、上記形質転換体が保持しているプラスミドの
分子量を参考例１(5)項記載の処理と同様の処理に
より、測定したところ、その分子量は、約
5.65Mdであつた。 実施例 ３ 組換えプラスミドpHSAK565による枯草菌の
形質転換 参考例３(2)項記載の処理に従つて、枯草菌168
YIT6007のコンピテント細胞を調製し、さらに、
これを組換えプラスミドpHSAK565により形質
転換した。 そして、形質転換体であるテトラサイクリン耐
性の50株について、SAK生産能を調べたところ、
全菌体がSAKを生産していた。更に、これらの
菌株が形成したコロニーを、４℃にて、１ケ月間
保存した後に、該コロニー中の菌体が保持してい
るプラスミドの分子量を測定したところ、その分
子量は約5.65Mdであつた。続いて、無作為に選
択した10個のコロニーについて、テトラサイクリ
ン20μｇ／mlを含む培地にて50代の継代培養を行
つたが、該継代培養後も、全菌株が組換えプラス
ミドpHSAK565を安定に保持していて、SAK生
産能を有していた。 実施例 ４ 形質転換体における組換えプラスミド
pHSAK565の安定性 上記実施例３の処理により生成された形質転換
体（クローン）としての枯草菌168 YIT−6007
（pHSAK565）における組換えプラスミド
pHSAK565の安定性を評価すべく、以下の処理
を施した。 すなわち、培地中、テトラサイクリン（10μ
ｇ／ml）添加と、テトラサイクリン無添加の各条
件下にて、上記実施例３により生成された形質転
換体をＬ−ブロス中37℃で継代培養して、2⁵⁰倍
に増殖させた後、各クローンのコロニーについて
テトラサイクリン耐性及びSAK生産能を調べた
ところ、総数100個のコロニーに対する、テトラ
サイクリン耐性を示すコロニーの数及びSAK生
産能を示すコロニーの数は第１表のとおりであつ
た。 これによれば、テトラサイクリン無添加の条件
下での試験例に関しても、テトラサイクリン耐性
を示すコロニー及びSAK生産能を示すコロニー
の比率が、それぞれ、70％〜80％に達しており、
このことは、テトラサイクリン無添加の条件下で
も、組換えプラスミドpHSAK565が枯草菌内に
比較的安定に保持されていることを意味してい
る。 さらに、テトラサイクリン（10μｇ／ml）添加
の条件下での試験例に関しては、ほとんどすべて
のコロニーがテトラサイクリン耐性のSAK生産
能を示しており、このことは、テトラサイクリン
の添加によつて、長期継代培養中での、組換えプ
ラスミドpHSAK565の、枯草菌における欠落が
完全に防止されていることを意味している。 【表】 数値は、コロニーの数を表わす
実施例 ５ 枯草菌168 YIT6007（pHSAK565）によるSAK
の生産 Ｌ−ブロスに対して10μｇ／mlのテトラサイク
リンと、0.5％のグルコースとを添加して成る培
地にて、一夜培養した枯草菌168 YIT−6007
（pHSAK565）を1/100量、上記培地に接種し、
37℃で激しく振とうしながら培養した。 その培養液の一定量を経時的に採取し、遠心分
離処理によつて該培養液から菌体を除去した後の
培養上清中のSAK生産能をフイブリンプレート
法によつて測定した。 SAK生産能の経時的変化に関しては、培養初
期には、低調であつたが、培養中期に至つて急激
な増加を示し、約17時間後に最大値（50000ユニ
ツト／ｉml）に達した。さらに、経時的に採取さ
れた培養液中の蛋白質について解析したところ、
以下の事項が判明した。 (1) SAK生産能の増加に伴つてSAK蛋白質の増
加が認められること。 (2) 培養開始後約17時間を経過するまでは、プロ
テアーゼによる分解がほとんど観察されないこ
と。 以上のことから、枯草菌168 YIT−6007
（pHSAK565）を、05％のグルコース及び10μ
ｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬ−ブロス中
で、37℃にて振とう培養することにより、培養16
〜17時間後に最も多量のSAKが培養上清中に生
産されることが確認された。 なお、上記実施例５にて実現されるSAK生産
能は、斎藤らにより報告（日本細菌学雑誌38(1)
（1983））されている、プラスミドpUBSF−13△
Ｈにsak遺伝子を組み込んで成る組換えプラスミ
ドを枯草層168 UOT−0734（微工研菌寄第6872
号）に導入する方法にて実現されるそれに対して
概ね５倍に達する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、中間体１〜３としての複合プラスミ
ドpHY780、pHY600及びpHY460の合成経路を
示す切断地図であり、図中、Tcは、テトラサイ
クリン耐性遺伝子領域、Ampは、アンピシリン
耐性遺伝子領域、Kmは、カナマイシン耐性遺伝
子領域を表わす。第２図は、中間体３及び中間体
４から組換えプラスミドpHSAK565への合成経
路を示す切断地図であり、図中、sakは、スタフ
イロキナーゼ遺伝子を表わす。第３図は、組換え
プラスミドpHSAK565の詳細な切断地図を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトコツカス・フエカリス
   （Streptcoccus faecalis）のプラスミドpAMα1
   由来の複製開始領域Oriα1と、エシエリシア・コ
   リ（Escherichia coli）のベクターpACYC177由
   来の複製開始領域Ori177と、スタフイロコツカ
   ス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の溶
   原フアージSφ−Ｃ由来のスタフイロキナーゼ遺
   伝子sakと、約5.65メガダルトンの分子量とを有
   し、下記の制限酵素認識切断部位の配列により特
   徴づけられる組換えプラスミドpHSAK565。