JPH0543359B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、リパーゼ定量用試薬に関し、特に濁
り測定によるリパーゼ定量用試薬に関する。 ［従来技術］ 臨床診断において血清中あるいは尿中のリパー
ゼ活性を定量することは膵臓炎等の診断に有用で
ある。 リパーゼは、脂肪酸残基を有するトリグリセリ
ドのエステル結合を切断してジグリセリド、モノ
グリセリドおよび脂肪酸に分解する酵素である。
このリパーゼの測定法としては、滴定による方
法、濁り測定のいわゆる比濁による方法、合成基
質を用いる比色による方法等種々の方法が知られ
ており、実際に利用されている。しかしながら、
滴定による方法は、部分的な取り扱いの困難性、
長い反応時間および多量の試料の必要なこと等の
ために、日常の臨床化学検査には汎用されていな
い。合成基質を用いる比色による方法は、特異
性、定量性等に欠けるという欠点がある。一方、
トリグリセリド−水エマルジヨンの濁りの清澄化
を光度測定してリパーゼ活性を追跡する比濁によ
る方法は、上記の欠点をほとんど回避できる。し
かし、比濁による方法においては、必須成分とし
てコリパーゼと尿素が共存しなければならない。
該成分は、高含量の胆汁塩酸により惹起される酵
素の阻害を取り除きかつ反応の進行の直線性を改
良すること、およびエマルジヨンの水−油表面に
対して影響を及ぼしかつエマルジヨンを安定化さ
せることによつて、反応動力学的に直線状に反応
を経過させる作用が考えられる［特公昭57−
28275号公報参照］。すなわち、該成分が存在しな
ければ、反応が直線的に進行せず、酵素反応が阻
害される現象がみられる。ところが、コリパーゼ
を用いると25〜30℃という比較的低い温度でしか
測定を行なうことができず、更にコリパーゼは安
定性が悪く、また高価であるという欠点を有して
いる。 ［発明の目的］ 本発明の目的は、比濁によるリパーゼの測定に
おいて用いることができる、コリパーゼおよび尿
素を含まないリパーゼ定量用試薬を提供すること
にある。 ［発明の構成］ 本発明の要旨は、 (イ) 液状トリグリセリド、 (ロ) アルキル硫酸塩およびアルキルスルホン酸塩
から成る群から選ばれた少なくとも１種のアニ
オン界面活性剤、 (ハ) 胆汁酸もしくはそのアルカリ塩、 (ニ) カルシウムイオン、 (ホ) PH７〜10を保持する緩衝剤 を含んで成る比濁法によるリパーゼ定量用試薬に
存する。 本発明の特徴は、トリグリセリド−水エマルジ
ヨンの濁りの清澄化を光度測定してリパーゼ活性
を追跡する比濁による方法において、反応系中に
アニオン界面活性剤を存在させることにある。 ところで、Ｓ−アシルエステルを基質としてリ
パーゼ活性を比色法にて定量する方法において、
血清中のアルブミンは一定過剰存在するとリパー
ゼ活性を阻止するが、この阻止効果はアニオン界
面活性剤（主にSDS）の添加により回復されるこ
とが知られている［特公昭58−4559号公報］。し
かし、該公報の記載によれば、SDS濃度０〜2.0
ｍＭの範囲で、牛血清アルブミン（BSA）が０
〜２mg／ml濃度存在する場合、リパーゼ活性は
BSA濃度に依存して大きく変化することが示さ
れている。従つて、Ｓ−アシルエステルを基質と
してリパーゼ活性を比色定量する方法において
は、SDSの添加によつてリパーゼ活性に及ぼすア
ルブミンの影響を解除したものではない。すなわ
ち、SDS無添加のときには、リパーゼ活性は
BSA濃度添加のときに比べてBSA0.25mg／mlの
存在下で活性化されるが、BSA濃度が0.5〜２
mg／mlにかけてリパーゼ活性が今度はBSAによ
つて阻害される。しかしながら、SDS添加によつ
て、リパーゼ活性のBSA濃度依存の逆転現象が
みられなくなり、リパーゼ活性はBSA濃度の上
昇と共に増大することが示されている。 従つて、本発明におけるアニオン界面活性剤の
添加の効果とＳ−アシルエステルを基質として用
いる該公報記載の方法におけるアニオン界面活性
剤の添加の効果は、明らかに異なるものであると
考えられる。 本発明の定量用試薬を用いてリパーゼを定量す
るには、まず、トリス緩衝剤の如き公知の緩衝液
に胆汁酸もしくはそのアルカリ塩、アニオン界面
活性剤、カルシウムイオン、要すれば保存剤を添
加した、溶液に撹拌下でトリグリセリドの溶液
（水溶性有機溶媒溶液）を加えてエマルジヨンを
形成させ、基質を調製する。 基質液を一定時間（通常５〜10分）、室温より
やや高温（たとえば30〜40℃）に保つた後、血清
または尿の如き検体を加えて、光度計によつて吸
光度の変化を測定することにより行える。 トリグリセリドとしては、炭素原子数約４〜22
の脂肪酸残基を有する天然並びに合成のトリグリ
セリドが好ましい。これらのトリグリセリドの中
でも、カルボキシエステラーゼや他のエステラー
ゼによつて加水分解を受けず、リパーゼによつて
特異的に加水分解される長鎖の不飽和脂肪酸残基
を有するトリグリセリド、特にその脂肪酸残基が
炭素原子10〜20個を有し、かつ、炭素−炭素二重
結合１〜８個、特に好ましくは１〜３個を有する
トリグリセリドが好ましい。特にトリオレインと
オリーブ油がきわめて好適である。 また、本発明で基質として用いられるトリグリ
セリド溶液は水溶性有機溶媒の溶液として調製さ
れ、トリグリセリドの濃度は５〜20ｍＭが好適で
ある。水溶性有機溶媒としては、たとえばエタノ
ールが好ましく用いられる。 基質液エマルジヨンの調製は、胆汁酸もしくは
胆汁酸塩、アニオン界面活性剤、カルシウムイオ
ン、要すれば保存剤を含有する緩衝液にトリグリ
セリド溶液を撹拌下で添加することによつて行い
得る。該基質液におけるトリグリセリドの濃度は
通常0.1〜0.5ｍＭである。 胆汁酸としては、公知のデオキシコール酸、タ
ウロデオキシコール酸もしくはそのアルカリ塩、
例えばナトリウム塩が該当する。その濃度は0.1
〜0.7（重量／容量）％が好適である。 アニオン界面活性剤は、アルキル硫酸塩および
アルキルスルホン酸塩、特にナトリウム塩および
リチウム塩の中から選ばれる。就中、アルキル残
基の炭素数が10〜20であるものが好ましく。特
に、リパーゼの反応直線性を改良する効果が大き
く、入手が容易であるラウリル酸ナトリウム
（SDS）の使用が最も好ましい。アニオン界面活
性剤の添加量は、0.01〜0.5（重量／容量）％が好
適である。カルシウムイオンの濃度は0.01〜0.1
ｍＭが好ましい。 緩衝剤としては、PH値を７〜10に調節し得るす
べての公知の緩衝剤を用いることができる。特に
優れた緩衝剤はトリス−緩衝剤であり、10〜50ｍ
Ｍ濃度が特に好ましい緩衝剤の濃度である。 保存剤としては、本発明の範囲内ではリパーゼ
の酵素活性を阻害しないアジ化アルカリが好適で
ある。保存剤の好ましい量は0.005〜0.01重量％
である。 以上記述した比濁法によるリパーゼ定量用試薬
は、それぞれ性状ならびに使用目的に応じた形態
で保存するのがよい。例えば、トリグリセリドは
水溶性有機溶媒の溶液として保存するのが良く、
胆汁酸、アニオン界面活性剤、カルシウムイオ
ン、保存剤は緩衝液中に溶解させて保存するのが
良い。 ［発明の効果］ 本発明によれば、従来の比濁による方法のリパ
ーゼ定量法において、反応の直線性を改良するた
めの必要成分であつたコリパーゼおよび尿素を用
いることなしに、アニオン界面活性剤の添加およ
び胆汁酸もしくはそのアルカリ塩の使用によつ
て、反応の直線性を改良し、血清中または尿中リ
パーゼの活性を特異的にしかも高感度で定量する
ことが可能となる。 以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
する。 実施例 １ 試薬の調製 (a) 基質原液（10ｍＭトリオレイン） 10ｍＭトリオレインの無水エタノール溶液を
調製し、基質原液とする。 (b) デオキシコール酸塩（0.1〜0.7％）、SDS
（0.01〜0.5％）、塩化カルシウム（0.01〜0.1ｍ
Ｍ）およびアジ化ナトリウム0.01％を含む25ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（PH9.2）を調製して緩
衝液とする。 これらをリパーゼの定量に供する為、以下のよ
うにして基質液を調製する。すなわち、緩衝液
150mlを撹拌しながら、(a)基質原液５mlを添加す
ることによつて基質液を調製する。この基質液を
リパーゼの定量に用いる。なお、少数の検体を定
量する場合には、緩衝液と基質原液の必要量を分
取し、前記に準じて基質液を調製し、リパーゼの
定量に供し、残りの緩衝液および基質原液は２〜
８℃で保存するのが望ましい。 実施例 ２ リパーゼの一般的定量法 ［試薬］ (a) 基質原液（10ｍＭ トリオレイン） (b) 緩衝液 ［定量方法］ 光路長１cmのキユベツト（３ml容）に試薬(a)お
よび(b)から調製した基質液2.5mlをとり37℃で５
分間温置し、適量の検体（ヒトの血清なら10μ
）を混合し、340nｍで37℃で水に対して光度
計により測定する。光度計で吸光度の変化を測定
し、単位時間当りの吸光度変化を求め、リパーゼ
活性を測定する。 検体混合前の基質液の吸光度をＡ sub、検体
混合後の吸光度をA₀min、そして５分後の吸光度
をA₅minとすると、検体１リツトル当りのリパー
ゼ活性は次の式によつて求められる： リパーゼ活性（単位／Ｌ）＝A₀min−Ａ ₅min／Asub ×1500 ここで述べるリパーゼ活性の単位は、37℃で１
分間に1μmolのトリオレインを分解する活性を１
単位としている。 比較例 ヒト血清にヒト膵臓より抽出し精製したリパー
ゼを一定量添加し、その100μを用い緩衝液中
のSDSの代りに他の界面活性剤（トリトンＸ−
100、ブリージ−35およびツイーン−20）を加え
る他は実施例２と同様にしてリパーゼ活性を測定
した。 その結果、これらの界面活性剤はリパーゼの活
性をむしろ阻害し、SDS添加によつて得られた反
応の直線性の改善は見られなかつた。 実施例 ３ ヒト膵リパーゼの一定量をヒトプール血清中に
添加したものならびに10ｍＭトリス緩衝液（PH
８）中に添加したものをそれぞれ検体とし、基質
液中のSDS濃度を０もしくは0.05％と変化させた
こと以外は実施例２と同様にリパーゼ活性を測定
し、第１図の結果を得た。 第１図から明らかなように、10ｍＭトリス緩衝
液検体ではSDSの添加を有無にかかわらず、吸光
度の減少速度すなわちリパーゼ活性はほぼ等し
く、しかも、反応動力学的に直線状に反応が進行
している。しかし、血清検体では、SDSを添加し
ない場合には反応の進行が直線状ではなく、反応
途中で吸光度の減少速度が急減し、リパーゼ活性
が阻害されている。一方、SDS0.05％添加した場
合には、そのような反応途中での阻害が取除か
れ、直線状に反応が臨港し、緩衝液検体と同等の
リパーゼ活性を示しており、SDS0.05％添加によ
り血清中のリパーゼ活性を正確に定量し得ること
が理解される。 また、リパーゼ血清を測定した試料をｎ−ヘキ
サンで抽出し濃縮した後、シリカゲルＧによる薄
層クロマトグラフイによつて生成物を分析した。
その結果、SDS濃度0.05％の試料において、トリ
オレインのリパーゼによる分解産物であるジオレ
イン、モノオレインおよび脂肪酸が確認され、血
清を含まない緩衝液検体で得られたSDS濃度０％
のときの分解産物と同一であつた。従つて、SDS
添加によつて認められる基質液の吸光度の減少
は、リパーゼ活性を反映していることが判つた。 実施例 ４ ヒト膵リパーゼの一定量をヒトプール血清なら
びに10ｍＭトリス緩衝液検体（PH８）中に添加し
たものを検体とし、SDS濃度を変化させたことな
らびに3μｇのコリパーゼを添加あるいは無添加
したこと以外は、実施例２と同様にしてリパーゼ
活性を測定し、第２図の結果を得た。 第２図から明らかなようえに、(1)SDS濃度０％
では血清検体のリパーゼ活性は10ｍＭトリス緩衝
液検体のそれの約50％に抑制されているが、SDS
の添加によつて血清検体のリパーゼ活性の抑制は
解除され、10ｍＭトリス緩衝液検体と同等もしく
はそれ以上のリパーゼ活性が発現されること、(2)
コリパーゼの添加によつてSDS濃度０％での血清
検体のリパーゼ活性の抑制が解除されるのと同等
に、SDS添加によつてリパーゼ活性の抑制が解除
されること、(3)SDS添加によつて回復したリパー
ゼ活性はコリパーゼの添加によつては、もはやそ
れ以上には活性化され得ないこと、(4)SDS濃度が
0.01〜0.1％の範囲で最も効果的にリパーゼ活性
の抑制を回復させ得ることが判る。 実施例 ５ 種々のリパーゼ活性をもつヒト膵リパーゼをヒ
トプール血清中あるいは10ｍＭトリス緩衝液検体
（PH８）中に添加したものを検体とし、実施例２
と同様にしてリパーゼ活性を測定し、第３図の結
果を得た。 第３図から明らかなように、測定したリパーゼ
活性は添加したリパーゼ量に比例していること、
ならびに血清検体と10ｍＭトリス緩衝液検体との
間でリパーゼ活性の値に差がみられないことを考
慮した場合、本測定系においては、血清検体中の
リパーーゼを特異的にしかも添加したリパーゼ活
性を正確に、いわゆる理想的な添加回収率で測定
し得ることが判る。 実施例 ６ 一定量のヒト膵リパーゼをヒトプール血清もし
くは10ｍＭトリス緩衝液中に添加したものを検体
とし、緩衝液中のSDS濃度を０％もしくは0.05％
とし、それぞに牛血清アルブミン（BSA）を最
終濃度で０〜２mg／ml濃度となるように調製した
緩衝液を用いた以外は実施例２と同様にしてリパ
ーゼ活性を測定し、第４図の結果を得た。 第４図から明らかなように、血清検体をSDS濃
度０％で測定した場合には、BSA濃度と上昇と
共にリパーゼ活性の抑制が認められたが、10ｍＭ
トリス緩衝液検体ではリパーゼ活性はBSA濃度
のは無関係に一定であり、ならびにSDS濃度0.05
％は両方の検体共に、BSA濃度とは無関係に一
定のリパーゼ活性を示す。従つて、特公昭59−
4559号公報に示されたようなリパーゼ活性がSDS
添加によつてもBSA濃度に大きく依存する現象
は、本測定系においては認められないことが判
る。 実施例 ７ ５例のヒト血清中のリパーゼ活性を本発明試薬
（実施例２）および市販のキツト（ベーリンガ
ー・マンハイム社）（特公昭57−28275号公報に記
載のキツト）を用いて測定し、次の結果を得た。

【表】 上表から本法とベーリンガー社との相関を求め
ると、次の通りであつた： Ｙ＝0.283X−2.01 γ＝0.991 （Ｘ：ベーリンガー社、Ｙ：本発明）。 従つて、本発明に従つて測定したリパーゼ活性
とベーリンガー社の方法で測定したリパーゼ活性
との間に相関係数0.991と非常に良好な相関が得
られた。なお、本発明とベーリンガー社法とはリ
パーゼ活性の表示単位が異なるため、回帰式はＹ
＝0.283X−2.01となつていることを考慮した場
合、本法で得られた値に3.5を乗ずることによつ
て、国際単位(V)への変換も可能である。 さらに、本発明に従つて測定したリパーゼ活性
の日間再現性（ｎ＝10）は6.0〜13.7％であり、
同時再現性（ｎ＝10）は2.1〜9.2％であり、本発
明によつて血清中のリパーゼ活性を精確に測定で
きることが判る。 実施例 ８ 通常血清検体では記述のように、SDSを添加す
ることによつてリパーゼ活性を定量することが可
能であるが、血清中には、リパーゼ活性に対し阻
害や干渉作用を示す物質がしばしば混入する場合
がある。そのような物質としてヘモグロビン（臨
床検査20、75−77、1976）、高値のトリグリセリ
ド検体（治療64、179−183、1982）、乳濁検体、
さらに高値のビリルビン検体等が挙げられるが、
本測定法がこれらのいずれの物質にも干渉、阻害
されることなくリパーゼ活性を定量することがで
きた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３におけるSDSの有無による
血清検体ならびに緩衝液検体のリパーゼ活性測定
のチヤート、第２図は、実施例４におけるリパー
ゼ活性に及ぼすSDS濃度の効果を示す図、第３図
は、実施例５におけるリパーゼ量とリパーゼ活性
の関係を示す図、および第４図は、実施例６にお
けるリパーゼ活性に及ぼすBSAの影響を示す図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (イ) 液状トリグリセリド、 (ロ) アルキル硫酸塩およびアルキルスルホン酸塩
   から成る群から選ばれた少なくとも１種のアニ
   オン界面活性剤、 (ハ) 胆汁酸もしくはそのアルカリ塩、 (ニ) カルシウムイオン、 (ホ) PH７〜10を保持する緩衝剤 を含んで成る比濁法によるリパーゼ定量用試薬。 ２ トリグリセリドの脂肪酸残基が、炭素原子10
   〜20個および炭素−炭素二重結合１〜８個を有し
   ている特許請求の範囲第１項記載のリパーゼ定量
   用試薬。 ３ トリグリセリドの濃度が、0.2〜3.0重量％で
   ある特許請求の範囲第１項または２項記載のリパ
   ーゼ定量用試薬。 ４ トリグリセリドを水溶性有機溶媒の溶液とし
   て含む特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記
   載のリパーゼ定量用試薬。 ５ アルキル硫酸塩およびアルキルスルホン酸塩
   のアルキル残基が炭素原子10〜20個を有している
   特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のリ
   パーゼ定量用試薬。 ６ アルキル硫酸塩およびアルキルスルホン酸塩
   が、ナトリウム塩またはリチウム塩である特許請
   求の範囲第５項記載のリパーゼ定量用試薬。 ７ アニオン界面活性剤の濃度が、0.01〜0.5（重
   量／容量）％である特許請求の範囲第１〜５項の
   いずれかに記載のリパーゼ定量用試薬。 ８ 胆汁酸もしくはそのアルカリ塩が、デオキシ
   コール酸もしくはデオキシコール酸塩である特許
   請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のリパー
   ゼ定量用試薬。 ９ 胆汁酸もしくはアルカリ塩の濃度が、0.1〜
   1.0（重量／容量）％である特許請求の範囲第１〜
   ７項のいずれかに記載のリパーゼ定量用試薬。