JPH054373B2 - - Google Patents
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- JPH054373B2 JPH054373B2 JP63232991A JP23299188A JPH054373B2 JP H054373 B2 JPH054373 B2 JP H054373B2 JP 63232991 A JP63232991 A JP 63232991A JP 23299188 A JP23299188 A JP 23299188A JP H054373 B2 JPH054373 B2 JP H054373B2
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、インターロイキン−２、及びインタ
ーフエロン−γ誘起剤（以下、それぞれIL−２、
IFN−γという。）、特にナンバンギセルの種子を
原料とするIL−２、およびIFN−γ誘起剤とその
製造方法に関する。 〔従来の技術〕 インターフエロン誘起剤は、ヒト、動物の細胞
に作用して、インターフエロンを誘起する物質で
あり、インターフエロン誘起作用を有する天然物
質は種々知られているが、それらの多くは強い副
作用を有している。そのため漢方薬当帰を熱水で
処理し、その抽出液からIFN誘起活性を有する物
質が単離され（特開昭53−32107号公報）、また漢
方薬桑白皮から同様にIFN誘起活性物質が単離さ
れる（特開昭53−99313号公報）等いくつかの報
告がなされている。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、強壮剤として知られている（広川書
店、総合薬用植物、第106〜107頁、昭和11年発
行）ナンバンギセル（Aeglnetia Indica Ｌ；
AIL）の種子からの抽出物質が、著しいIL−２、
及びIFN−γ誘起活性を有する成分を有し、かつ
副作用を有しないことを見出し、その提供と有効
分画の分離、精製手段の提供を課題とする。 〔課題を解決するための手段〕 ナンバンギセルは、ハマウツボ科ナンバンギセ
ル属の１年生無葉緑植物で、ススキ、ミヨウガ、
サトウキビ等の根に寄生し、果実のうちに無数の
ほこりのように細かい種子を入れている。 本発明のインターロイキン−２、及びインター
フエロン−γ誘起剤は、このナンバンギセルの種
子から単離されることを特徴とし、ナンバンギセ
ルの種子より蒸溜水、特に蒸溜水がリン酸緩衝生
理食塩水により抽出されることを特徴とし、また
ナンバンギセルの種子より水飽和ブタノールによ
り抽出され、得られた水層をプロナーゼ処理し、
その沈澱除去液を限外濾過して回収されるか、ま
たナンバンギセルの種子より水飽和フエノールに
より抽出され、得られた水層を酢酸カリウム、及
びエタノール処理し、その沈澱除去液を蒸溜水に
対して透析し、その透析内液よりRNAを除去後、
得られた水層を更に酢酸カリウム、及びエタノー
ル処理し、沈澱除去液を蒸溜水に対して透析し、
その透析内液を濃縮することを特徴とするもので
ある。 〔作用〕 本発明の抽出物質は、ナンバンギセルの種子か
ら蒸溜水、特にリン酸緩衝生理食塩水により抽出
されるか、またはこの種高分子多糖体の抽出手段
としては公知であるモリソン等の方法
（Morrison＆Leive.Fractions of
Lipopolysaccharide from Escherichia coli
0111：B4 Prepared by Tw−ｏ Extraction
Procedures.J.Biol.Chem.250；2911−2919、
1975）により抽出され、著しいIL−２、及びIFN
−γ誘導能を有することを見出したものである。
またこの種高分子多糖類の抽出手段として同様の
方法であるウエストフアール等の方法
（Westphal，Ｏ，．and Lu¨deritz，O.Chemische
Erf−orschung von Lipopolysacchriden
grammnegativ−er Bakterien、Angew.Chem．
66；407−417、1954）により得られる多糖類は、
モリソン等の方法による抽出物質より強いIFN−
γ誘導能を示す。 本発明により抽出される多糖類の構造、組成
は、いまだ十分には判明していないが、ナンバン
ギセルの種子を抽出する際に、ウエストフアール
等の方法により水飽和フエノールで抽出すると、
蛋白質成分が殆ど結合していない多糖類が得られ
るのに対して、モリソン等の方法を使用し、水飽
和ｎ−ブタノールにより抽出すると、脂質である
リピドＡが蛋白により結合した多糖類が抽出され
るものと思われる。本発明の抽出物質は後述する
ように水可溶性、ｎ−ブタノール不溶性であり、
RNA（オルシノール反応を利用したメジヤバウム
（Mezbaum）法、および紫外部吸収による）は
含有されてなく、分子量は10万〜20万の範囲と思
われる。 〔実施例 １〕 ナンバンギセルの種子のリン酸緩衝生理食塩水
抽出物（以下、粗抽出物という）の調製 ナンバンギセルの種子40mgに、カルシウムイ
オン、マグネシウムイオンを含有しない0.1モル
リン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）１mlを加え、乳
鉢中において粉砕した。この粉砕物を15000xg、
15分間、４℃て遠心処理し、得られた上清を、
0.45μm径のミリボアフイルターを通して無菌化
し、本発明の抽出物を得た。 〔実施例 ２〕 上記ナンバンギセルの種子の粉砕物に、等容量
の水飽和ｎ−ブタノールを加え、０℃で15分間攪
拌した。この混和物を35000xgで20分間遠心し
て、分離した下層の水層を集めた。なおブタノー
ル層および沈澱物は更に２回ブタノール抽出を行
つた。このようにして得られた水層分画を更に遠
心処理して不溶物を除去し、蛋白質分解酵素であ
るプロナーゼを最終濃度20μg／mlになるように
添加し、37℃で一夜処理した。このプロナーゼ処
理によりプロナーゼを含む蛋白質からなる白色沈
澱が生じ、この沈澱を遠心処理により除去した。
次いでカツトオフ分子量3500、コアサイド3000の
限外濾過膜（アミコン社、米国）を圧力1.5Kg／
cm2で使用して濃縮し、本発明の抽出物を得た。収
量は、ウロン酸定量によりナンバンギセルの種子
1gにつき45mgであつた。 次に上記ウエストフアール等の方法によるナン
バンギセルの種子からの多糖類抽出方法を実施例
３として示す。 〔実施例 ３〕 上記ナンバンギセルの種子の粉砕物に、等容量
の水飽和フエノールを加えて０℃で30分間攪拌し
た後、200xgで10分間遠心処理し、水層を分離し
た。水層中に混入しているフエノールをエーテル
で抽出除去し、水層に溶解したエーテルは窒素ガ
スを通気することにより除去した。このようにし
て得られるフエノール抽出物に酢酸カルウムを２
％（ｗ／ｗ）の割合で添加し、10倍容量の95％エ
タノールを添加し、４℃、一夜静置した後形成さ
れる沈澱物を蒸溜水に溶解させた。この溶液に上
記同様２％の割合に酢酸カリウムを添加した後等
容量のエタノールと混和させ、０℃で30分間静置
した。その後5000xg、20分間遠心し、主として
RNAを含有する沈澱を廃棄した。更に上清に６
倍容量のエタノールを添加し、１時間静置した後
生じた沈澱を5000xg、20分間遠心処理して集め、
蒸溜水に溶解させ、蒸溜水に対して透析した。こ
の透析内液には多糖類と微量のRNAが混在して
いるので、RNAを破壊する目的で１mlあたり30
〜40μgの牛膵由来RNA分解酵素（Pancreatic
RNase）を添加し、38℃で１時間処理した。処
理後、酢酸カリウム２％と６倍容量のエタノール
を添加し、生じた沈澱を遠心処理により集め、蒸
溜水に溶解し、200xgで遠心処理した。得られた
上清を蒸溜水に対して透析し、透析内液を濃縮し
実施例３による標品とした。収量はウロン酸定量
によりナンバンギセルの種子1gあたり、38mgで
あつた。 上記各実施例、及び実施例３により調製した多
糖類分画についての化学分析は、次のように行つ
た。 ウロン酸の定量は、カルバゾール反応を利用し
たビター等の方法（Bitter，T.，and Ewins，R.
Amodified carbazole reaction for uronic
acids.Biochem.J.81；43，1961.）により、また
RNAはオルシノール反応を利用したメジヤバウ
ムの方法｛Mezbaum，W.Color reactions of
nucleic acid components；In The nucleic
acids.（Chargaff，E.，and Davidson，J.，
editors）．Academic Press，New York.１；
283−305，1939.｝、及び紫外部吸収を指標として
定量した。また蛋白質定量はフオリン等の方法
（Follin，O.，and Clocalteau，V.On tyrosine
and tryptohane determination in proteins.J.
Biol.Chem.73；627−650，1927.）、及び紫外部吸
収を指標として定量した。 （IL−２、及びIFN−γ活性検索） 検索用標品の調製 ヘパリン添加ヒト末梢血より密度勾配遠心法
（密度、1.077、Bo¨yum，A.Isolation of mono−
ｎ−uclear cells and granulocytes from
human blo−od.Scan.J.Clin.Invest.21；77−89，
1967.）を用いて、末梢血単核球（以下、PBMC
という）を分離し、10％胎児牛血清を含有する白
血球増殖培養液（RPM1−1640）を使用して
107／mlの細胞浮遊液を調製した。 このPBMC浮遊液１mlに上記実施例１、実施
例２、実施例３で調製した各分画を各々１ml添加
し、５％炭酸ガスを含む空気中で37℃で24時間、
48時間培養した。この培養上清を500xg、15分間
遠心した後、ミリボアフイルターを通して無菌化
した標品を得、以下に記載するIL−２、及びIFN
−γ活性検索に供した。 IL−２活性測定法 細胞増殖がIL−２依存性であるCTLL細胞を、
96穴マイクロプレートに、10％被検標品を含む増
殖培養液500μlに５×103個のCTLL細胞を浮遊さ
せ各ホールに植え込み、５％炭酸ガス培養器中で
37℃で24時間培養した。その後各ホールに3Ｈ−
チミジン（アマシヤム社、英国）50μCiを添加し
て更に16時間培養を継続し、3Ｈ−チミジンの取り
込み量を液体シンチレーシヨンカウンターで測定
した。この場合、IL−２力価の算定は、組み換
え型IL−２（シオノギ社製）を、最終濃度5.0，
2.5，1.25，0.63，0.31単位／mlになるように調製
した標準標品によりCTLL細胞を処理した場合の
３Ｈ−チミジンの取り込み量より換算した。 IFN−γ活性測定法 ヒト羊膜由来FL細胞（106）を60mm径のプラス
チツクペトリ皿に植え込み、５％炭酸ガス培養器
中で37℃、２日間培養し、FL単層細胞を調製し
た。 次に被検標品0.2mlに最少必須倍地0.8mlを添加
して、被検標品の５倍希釈したもの0.5mlにより
FL単層培養細胞を12時間、37℃で処理した。そ
の後この処理FL単層培養細胞における水疱性口
内炎ウイルス（Vesicular Stomatitis vi−rus、
以下、VSVという）のブラツク形成能を、未処
理FL単層培養細胞でのVSVブラツク形成能との
比較により算定した。IFN力価はVSVブラツク
形成能を50％減じるために必要な被検標品の最高
希釈率でもつて表現される。 IFNのタイピング方法 被検標品中に含有されるIFNのタイピングは、
被検標品0.2mlに抗IFN−α／β抗体（米国国立
衛生研究所（NIH）INC.米国）を0.2ml、そして
被検標品0.2mlに抗IFN−γ抗体（インターフエ
ロン サイエンシーズ INC.米国）0.2mlを添加
して、30分間、37℃で培養した後、最少必須倍地
0.6mlを添加して総容量１mlとした。この標品0.5
mlによりFL単層培養細胞を37℃、12時間処理し、
上記同様にVSVブラツク減少率を測定した。尚
抗IFN−α／β抗体、或いは抗IFN−γ抗体は、
IFN−α、またはIFN−βの100単位、或いは
IFN−γの100単位を中和する力価を有するよう
に調製し、試験に供した。 抽出物のクロマトグラフイー 実施例２で調製した抽出物を、カラムクロマト
グラフイー（Sephadex Ｇ−200 フアーマシア、
スエーデン、カラムサイズ；φ0.9cm×30cm）を使
用し、0.15モルNaCl−0.02モルTris−HCl緩衝液
（pH7.4）により溶出させ、１分画２mlとして20
分画採取した。それぞれの分画について、
PBMC1×107個／mlを24穴プレートの各ホールに
植え込み、更に各分画0.1mlずつ添加して24時間、
37℃で培養した。その後培養上清を採取し、IFN
活性、IL−２活性を測定した。 次に、実施例１で調製したナンバンギセルの種
子の粗抽出標品のIL−２誘導能測定方法を示す。 実施例１で調製したナンバンギセルの種子粗抽
出標品とPBMCとを、24時間、48時間培養して
調製した培養上清について、上記IL−２力価の
測定方法により測定した。 第１図は標準IL−２（組み換えIL−２）を用い
て作成された定量曲線であり、横軸は、標準IL
−２（単位／ml）、縦軸は、3Ｈ−チミジンの取り込
み量を表す。上記24時間、48時間培養して調製し
た培養上清についての、それぞれの3Ｈ−チミジ
ンの取り込みを示すカウント数（単位はDPM）
を計測し、第１図によりそのカウント数に相当す
るIL−２（単位／ml）を求めた。 【表】 第１表により本発明におけるナンバンギセルの
種子の粗抽出標品は、IL−２誘導能を有してい
ることが確認される。 次に実施例１で調製したナンバンギセルの種子
の粗抽出標品のIFN産生能測定方法を示す。 実施例１で調製したナンバンギセルの種子の粗
抽出標品とPBMCとを、24時間、或いは48時間
培養した後採取し、得られた上清を10倍に希釈し
たものにより、FL単層培養細胞を処理してVSV
ブラツク形成能を測定した。またブラツク減少率
は下式により算出される。２回にわたつて実験し
た結果を第２表に示す。 （１−標品処理でのブラツク数／未処理対照でのグラツ
ク数）×100 【表】 第２表により、ナンバンギセルの種子の粗抽出
標品は、IFN産生能を有していることが確認され
る。特に24時間標品は、48時間標品に比較して
IFN活性が高値である。 続いて、ナンバンギセルの種子の粗抽出標品よ
り誘導されるIFNのタイピング方法を示す。 ナンバンギセルの種子の粗抽出標品により
PBMCを24時間処理して得た培養上清を５倍に
希釈した標品を本実験で使用した。２回実験し、
その測定結果を第３表に示す。 【表】 尚、表の数値はブラツク数を示し、２プレート
の平均値を示す。（ ）内の数値は、未処理対照
FL単層培養細胞上でのVSVブラツク数に対する
抗体処理、或いは未処理被検IFN標品で処理した
FL単層培養細胞上でのVSVブラツク数の減少率
（％）を示している。 本実験によりナンバンギセルの種子の粗抽出標
品は、IFN−γ誘導能を有していることが確認さ
れる。 またナンバンギセルの種子の粗抽出標品を上記
クロマトグラフイーにかけ、その各分画における
IL−２、及びIFN誘導能の検索、及びウロン酸
（OD530nm，カルバゾール反応）、蛋白質
（ODD280nm）の定量を行い、その結果を第２図
に示す。尚この測定においてIFN力価は５倍希釈
品についてのVSVブラツク減少率（％）を示す。 第２図からわかるように、各分画におけるIL
−２、及びIFN誘導能、ウロン酸量、及び蛋白質
量は同一の傾向を示しており、このことから本発
明の粗抽出物は単一物質であることが想定され
る。 次にナンバンギセルの種子から実施例２、およ
び実施例３により調製した分画をそれぞれ500μg
ウロン酸定量による）ずつ用いて、PBMCを24
時間刺激して、その培養上清についてIL−２力
価を測定した。PBMCはＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆの６人の人から調製した。IL−２力価の測定
結果について下記第４表に示す。 単位は、単位／ml。 【表】 第４表からわかるように、実施例２、実施例３
により調製した抽出物はいずれもIL−２誘導能
を有するが、実施例２による抽出物はより強い
IL−２誘導能を保有することが明らかである。 また下記第５表に実施例２、実施例３により調
製した抽出物のIFN−γ力価の測定結果を示す。
測定にあたつては、まず実施例２、実施例３によ
り調製した各多糖類分画により24時間、PBMC
を処理して得た培養上清を５倍に希釈し、この希
釈した標品を抗IFN−γ処理したもの、または未
処理のものにわけ、次いでこの標品をFL単層培
養細部を処理してVSVブラツクを形成させ、抗
IFN−γ処理、または未処理のFL単層培養細胞
でのVSVブラツク数を比較したものである。尚、
数値は減少率（％）を示す。 【表】 この第５表から分かるように実施例２、実施例
３により抽出された標品の方は共に強いIFN−γ
誘導能を保有していることがわかる。 次に実施例２で調製した多糖類分画でPBMC
を24時間刺激して得た培養上清について、IL−
２、及びIFN力価を測定した結果を第３図に示
す。IFN力価はPBMC上清を５倍希釈した標品
についてVSVのブラツク減少率により測定した。
尚黒丸によりIL−２活性の推移を示し、白三角
によりIFN力価の推移を示す。 この第３図からわかるように、本発明の多糖類
の量に応じてIL−２、IFN力価共に増大すること
がわかる。 次いで本発明の実施例２で調製した多糖類につ
いての毒性試験の結果について説明する。 バルブ−シーマウス（Balb−Ｃマウス）10匹
の腹腔に実施例２で調製した多糖類を、ウロン酸
定量で500μgを１mg、３mgを注射したが、28日後
においても異常は認められなかつた。 〔発明の効果〕 本発明は、ナンバンギセルの種子から単離され
たインターロイキン−２、及びインターフエロン
−γ誘起剤を提供すると共に、ナンバンギセルの
種子よりリン酸緩衝生理食塩水により抽出される
か、またはナンバンギセルの種子より水飽和ブタ
ノールにより抽出され、得られた水層をプロナー
ゼ処理し、その沈澱除去液を限外濾過して回収さ
れるか、更にナンバンギセルの種子より水飽和フ
エノールにより抽出され、得られた水層を酢酸カ
リウム、及びエタノール処理し、その沈澱除去液
を蒸溜水に対して透析し、その透析内液より
RNAを除去後、得られた水層を更に酢酸カリウ
ム、及びエタノール処理し、沈澱除去液を蒸溜水
に対して透析し、その透析内液を濃縮することに
より得られるIL−２、及びIFN−γ誘起剤は、著
しいIL−２、及びIFN−γ誘起活性を有し、ヒト
及び動物の各種ウイルス感染症の予防、及び治療
に有用であることが期待される。
ーフエロン−γ誘起剤（以下、それぞれIL−２、
IFN−γという。）、特にナンバンギセルの種子を
原料とするIL−２、およびIFN−γ誘起剤とその
製造方法に関する。 〔従来の技術〕 インターフエロン誘起剤は、ヒト、動物の細胞
に作用して、インターフエロンを誘起する物質で
あり、インターフエロン誘起作用を有する天然物
質は種々知られているが、それらの多くは強い副
作用を有している。そのため漢方薬当帰を熱水で
処理し、その抽出液からIFN誘起活性を有する物
質が単離され（特開昭53−32107号公報）、また漢
方薬桑白皮から同様にIFN誘起活性物質が単離さ
れる（特開昭53−99313号公報）等いくつかの報
告がなされている。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、強壮剤として知られている（広川書
店、総合薬用植物、第106〜107頁、昭和11年発
行）ナンバンギセル（Aeglnetia Indica Ｌ；
AIL）の種子からの抽出物質が、著しいIL−２、
及びIFN−γ誘起活性を有する成分を有し、かつ
副作用を有しないことを見出し、その提供と有効
分画の分離、精製手段の提供を課題とする。 〔課題を解決するための手段〕 ナンバンギセルは、ハマウツボ科ナンバンギセ
ル属の１年生無葉緑植物で、ススキ、ミヨウガ、
サトウキビ等の根に寄生し、果実のうちに無数の
ほこりのように細かい種子を入れている。 本発明のインターロイキン−２、及びインター
フエロン−γ誘起剤は、このナンバンギセルの種
子から単離されることを特徴とし、ナンバンギセ
ルの種子より蒸溜水、特に蒸溜水がリン酸緩衝生
理食塩水により抽出されることを特徴とし、また
ナンバンギセルの種子より水飽和ブタノールによ
り抽出され、得られた水層をプロナーゼ処理し、
その沈澱除去液を限外濾過して回収されるか、ま
たナンバンギセルの種子より水飽和フエノールに
より抽出され、得られた水層を酢酸カリウム、及
びエタノール処理し、その沈澱除去液を蒸溜水に
対して透析し、その透析内液よりRNAを除去後、
得られた水層を更に酢酸カリウム、及びエタノー
ル処理し、沈澱除去液を蒸溜水に対して透析し、
その透析内液を濃縮することを特徴とするもので
ある。 〔作用〕 本発明の抽出物質は、ナンバンギセルの種子か
ら蒸溜水、特にリン酸緩衝生理食塩水により抽出
されるか、またはこの種高分子多糖体の抽出手段
としては公知であるモリソン等の方法
（Morrison＆Leive.Fractions of
Lipopolysaccharide from Escherichia coli
0111：B4 Prepared by Tw−ｏ Extraction
Procedures.J.Biol.Chem.250；2911−2919、
1975）により抽出され、著しいIL−２、及びIFN
−γ誘導能を有することを見出したものである。
またこの種高分子多糖類の抽出手段として同様の
方法であるウエストフアール等の方法
（Westphal，Ｏ，．and Lu¨deritz，O.Chemische
Erf−orschung von Lipopolysacchriden
grammnegativ−er Bakterien、Angew.Chem．
66；407−417、1954）により得られる多糖類は、
モリソン等の方法による抽出物質より強いIFN−
γ誘導能を示す。 本発明により抽出される多糖類の構造、組成
は、いまだ十分には判明していないが、ナンバン
ギセルの種子を抽出する際に、ウエストフアール
等の方法により水飽和フエノールで抽出すると、
蛋白質成分が殆ど結合していない多糖類が得られ
るのに対して、モリソン等の方法を使用し、水飽
和ｎ−ブタノールにより抽出すると、脂質である
リピドＡが蛋白により結合した多糖類が抽出され
るものと思われる。本発明の抽出物質は後述する
ように水可溶性、ｎ−ブタノール不溶性であり、
RNA（オルシノール反応を利用したメジヤバウム
（Mezbaum）法、および紫外部吸収による）は
含有されてなく、分子量は10万〜20万の範囲と思
われる。 〔実施例 １〕 ナンバンギセルの種子のリン酸緩衝生理食塩水
抽出物（以下、粗抽出物という）の調製 ナンバンギセルの種子40mgに、カルシウムイ
オン、マグネシウムイオンを含有しない0.1モル
リン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）１mlを加え、乳
鉢中において粉砕した。この粉砕物を15000xg、
15分間、４℃て遠心処理し、得られた上清を、
0.45μm径のミリボアフイルターを通して無菌化
し、本発明の抽出物を得た。 〔実施例 ２〕 上記ナンバンギセルの種子の粉砕物に、等容量
の水飽和ｎ−ブタノールを加え、０℃で15分間攪
拌した。この混和物を35000xgで20分間遠心し
て、分離した下層の水層を集めた。なおブタノー
ル層および沈澱物は更に２回ブタノール抽出を行
つた。このようにして得られた水層分画を更に遠
心処理して不溶物を除去し、蛋白質分解酵素であ
るプロナーゼを最終濃度20μg／mlになるように
添加し、37℃で一夜処理した。このプロナーゼ処
理によりプロナーゼを含む蛋白質からなる白色沈
澱が生じ、この沈澱を遠心処理により除去した。
次いでカツトオフ分子量3500、コアサイド3000の
限外濾過膜（アミコン社、米国）を圧力1.5Kg／
cm2で使用して濃縮し、本発明の抽出物を得た。収
量は、ウロン酸定量によりナンバンギセルの種子
1gにつき45mgであつた。 次に上記ウエストフアール等の方法によるナン
バンギセルの種子からの多糖類抽出方法を実施例
３として示す。 〔実施例 ３〕 上記ナンバンギセルの種子の粉砕物に、等容量
の水飽和フエノールを加えて０℃で30分間攪拌し
た後、200xgで10分間遠心処理し、水層を分離し
た。水層中に混入しているフエノールをエーテル
で抽出除去し、水層に溶解したエーテルは窒素ガ
スを通気することにより除去した。このようにし
て得られるフエノール抽出物に酢酸カルウムを２
％（ｗ／ｗ）の割合で添加し、10倍容量の95％エ
タノールを添加し、４℃、一夜静置した後形成さ
れる沈澱物を蒸溜水に溶解させた。この溶液に上
記同様２％の割合に酢酸カリウムを添加した後等
容量のエタノールと混和させ、０℃で30分間静置
した。その後5000xg、20分間遠心し、主として
RNAを含有する沈澱を廃棄した。更に上清に６
倍容量のエタノールを添加し、１時間静置した後
生じた沈澱を5000xg、20分間遠心処理して集め、
蒸溜水に溶解させ、蒸溜水に対して透析した。こ
の透析内液には多糖類と微量のRNAが混在して
いるので、RNAを破壊する目的で１mlあたり30
〜40μgの牛膵由来RNA分解酵素（Pancreatic
RNase）を添加し、38℃で１時間処理した。処
理後、酢酸カリウム２％と６倍容量のエタノール
を添加し、生じた沈澱を遠心処理により集め、蒸
溜水に溶解し、200xgで遠心処理した。得られた
上清を蒸溜水に対して透析し、透析内液を濃縮し
実施例３による標品とした。収量はウロン酸定量
によりナンバンギセルの種子1gあたり、38mgで
あつた。 上記各実施例、及び実施例３により調製した多
糖類分画についての化学分析は、次のように行つ
た。 ウロン酸の定量は、カルバゾール反応を利用し
たビター等の方法（Bitter，T.，and Ewins，R.
Amodified carbazole reaction for uronic
acids.Biochem.J.81；43，1961.）により、また
RNAはオルシノール反応を利用したメジヤバウ
ムの方法｛Mezbaum，W.Color reactions of
nucleic acid components；In The nucleic
acids.（Chargaff，E.，and Davidson，J.，
editors）．Academic Press，New York.１；
283−305，1939.｝、及び紫外部吸収を指標として
定量した。また蛋白質定量はフオリン等の方法
（Follin，O.，and Clocalteau，V.On tyrosine
and tryptohane determination in proteins.J.
Biol.Chem.73；627−650，1927.）、及び紫外部吸
収を指標として定量した。 （IL−２、及びIFN−γ活性検索） 検索用標品の調製 ヘパリン添加ヒト末梢血より密度勾配遠心法
（密度、1.077、Bo¨yum，A.Isolation of mono−
ｎ−uclear cells and granulocytes from
human blo−od.Scan.J.Clin.Invest.21；77−89，
1967.）を用いて、末梢血単核球（以下、PBMC
という）を分離し、10％胎児牛血清を含有する白
血球増殖培養液（RPM1−1640）を使用して
107／mlの細胞浮遊液を調製した。 このPBMC浮遊液１mlに上記実施例１、実施
例２、実施例３で調製した各分画を各々１ml添加
し、５％炭酸ガスを含む空気中で37℃で24時間、
48時間培養した。この培養上清を500xg、15分間
遠心した後、ミリボアフイルターを通して無菌化
した標品を得、以下に記載するIL−２、及びIFN
−γ活性検索に供した。 IL−２活性測定法 細胞増殖がIL−２依存性であるCTLL細胞を、
96穴マイクロプレートに、10％被検標品を含む増
殖培養液500μlに５×103個のCTLL細胞を浮遊さ
せ各ホールに植え込み、５％炭酸ガス培養器中で
37℃で24時間培養した。その後各ホールに3Ｈ−
チミジン（アマシヤム社、英国）50μCiを添加し
て更に16時間培養を継続し、3Ｈ−チミジンの取り
込み量を液体シンチレーシヨンカウンターで測定
した。この場合、IL−２力価の算定は、組み換
え型IL−２（シオノギ社製）を、最終濃度5.0，
2.5，1.25，0.63，0.31単位／mlになるように調製
した標準標品によりCTLL細胞を処理した場合の
３Ｈ−チミジンの取り込み量より換算した。 IFN−γ活性測定法 ヒト羊膜由来FL細胞（106）を60mm径のプラス
チツクペトリ皿に植え込み、５％炭酸ガス培養器
中で37℃、２日間培養し、FL単層細胞を調製し
た。 次に被検標品0.2mlに最少必須倍地0.8mlを添加
して、被検標品の５倍希釈したもの0.5mlにより
FL単層培養細胞を12時間、37℃で処理した。そ
の後この処理FL単層培養細胞における水疱性口
内炎ウイルス（Vesicular Stomatitis vi−rus、
以下、VSVという）のブラツク形成能を、未処
理FL単層培養細胞でのVSVブラツク形成能との
比較により算定した。IFN力価はVSVブラツク
形成能を50％減じるために必要な被検標品の最高
希釈率でもつて表現される。 IFNのタイピング方法 被検標品中に含有されるIFNのタイピングは、
被検標品0.2mlに抗IFN−α／β抗体（米国国立
衛生研究所（NIH）INC.米国）を0.2ml、そして
被検標品0.2mlに抗IFN−γ抗体（インターフエ
ロン サイエンシーズ INC.米国）0.2mlを添加
して、30分間、37℃で培養した後、最少必須倍地
0.6mlを添加して総容量１mlとした。この標品0.5
mlによりFL単層培養細胞を37℃、12時間処理し、
上記同様にVSVブラツク減少率を測定した。尚
抗IFN−α／β抗体、或いは抗IFN−γ抗体は、
IFN−α、またはIFN−βの100単位、或いは
IFN−γの100単位を中和する力価を有するよう
に調製し、試験に供した。 抽出物のクロマトグラフイー 実施例２で調製した抽出物を、カラムクロマト
グラフイー（Sephadex Ｇ−200 フアーマシア、
スエーデン、カラムサイズ；φ0.9cm×30cm）を使
用し、0.15モルNaCl−0.02モルTris−HCl緩衝液
（pH7.4）により溶出させ、１分画２mlとして20
分画採取した。それぞれの分画について、
PBMC1×107個／mlを24穴プレートの各ホールに
植え込み、更に各分画0.1mlずつ添加して24時間、
37℃で培養した。その後培養上清を採取し、IFN
活性、IL−２活性を測定した。 次に、実施例１で調製したナンバンギセルの種
子の粗抽出標品のIL−２誘導能測定方法を示す。 実施例１で調製したナンバンギセルの種子粗抽
出標品とPBMCとを、24時間、48時間培養して
調製した培養上清について、上記IL−２力価の
測定方法により測定した。 第１図は標準IL−２（組み換えIL−２）を用い
て作成された定量曲線であり、横軸は、標準IL
−２（単位／ml）、縦軸は、3Ｈ−チミジンの取り込
み量を表す。上記24時間、48時間培養して調製し
た培養上清についての、それぞれの3Ｈ−チミジ
ンの取り込みを示すカウント数（単位はDPM）
を計測し、第１図によりそのカウント数に相当す
るIL−２（単位／ml）を求めた。 【表】 第１表により本発明におけるナンバンギセルの
種子の粗抽出標品は、IL−２誘導能を有してい
ることが確認される。 次に実施例１で調製したナンバンギセルの種子
の粗抽出標品のIFN産生能測定方法を示す。 実施例１で調製したナンバンギセルの種子の粗
抽出標品とPBMCとを、24時間、或いは48時間
培養した後採取し、得られた上清を10倍に希釈し
たものにより、FL単層培養細胞を処理してVSV
ブラツク形成能を測定した。またブラツク減少率
は下式により算出される。２回にわたつて実験し
た結果を第２表に示す。 （１−標品処理でのブラツク数／未処理対照でのグラツ
ク数）×100 【表】 第２表により、ナンバンギセルの種子の粗抽出
標品は、IFN産生能を有していることが確認され
る。特に24時間標品は、48時間標品に比較して
IFN活性が高値である。 続いて、ナンバンギセルの種子の粗抽出標品よ
り誘導されるIFNのタイピング方法を示す。 ナンバンギセルの種子の粗抽出標品により
PBMCを24時間処理して得た培養上清を５倍に
希釈した標品を本実験で使用した。２回実験し、
その測定結果を第３表に示す。 【表】 尚、表の数値はブラツク数を示し、２プレート
の平均値を示す。（ ）内の数値は、未処理対照
FL単層培養細胞上でのVSVブラツク数に対する
抗体処理、或いは未処理被検IFN標品で処理した
FL単層培養細胞上でのVSVブラツク数の減少率
（％）を示している。 本実験によりナンバンギセルの種子の粗抽出標
品は、IFN−γ誘導能を有していることが確認さ
れる。 またナンバンギセルの種子の粗抽出標品を上記
クロマトグラフイーにかけ、その各分画における
IL−２、及びIFN誘導能の検索、及びウロン酸
（OD530nm，カルバゾール反応）、蛋白質
（ODD280nm）の定量を行い、その結果を第２図
に示す。尚この測定においてIFN力価は５倍希釈
品についてのVSVブラツク減少率（％）を示す。 第２図からわかるように、各分画におけるIL
−２、及びIFN誘導能、ウロン酸量、及び蛋白質
量は同一の傾向を示しており、このことから本発
明の粗抽出物は単一物質であることが想定され
る。 次にナンバンギセルの種子から実施例２、およ
び実施例３により調製した分画をそれぞれ500μg
ウロン酸定量による）ずつ用いて、PBMCを24
時間刺激して、その培養上清についてIL−２力
価を測定した。PBMCはＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆの６人の人から調製した。IL−２力価の測定
結果について下記第４表に示す。 単位は、単位／ml。 【表】 第４表からわかるように、実施例２、実施例３
により調製した抽出物はいずれもIL−２誘導能
を有するが、実施例２による抽出物はより強い
IL−２誘導能を保有することが明らかである。 また下記第５表に実施例２、実施例３により調
製した抽出物のIFN−γ力価の測定結果を示す。
測定にあたつては、まず実施例２、実施例３によ
り調製した各多糖類分画により24時間、PBMC
を処理して得た培養上清を５倍に希釈し、この希
釈した標品を抗IFN−γ処理したもの、または未
処理のものにわけ、次いでこの標品をFL単層培
養細部を処理してVSVブラツクを形成させ、抗
IFN−γ処理、または未処理のFL単層培養細胞
でのVSVブラツク数を比較したものである。尚、
数値は減少率（％）を示す。 【表】 この第５表から分かるように実施例２、実施例
３により抽出された標品の方は共に強いIFN−γ
誘導能を保有していることがわかる。 次に実施例２で調製した多糖類分画でPBMC
を24時間刺激して得た培養上清について、IL−
２、及びIFN力価を測定した結果を第３図に示
す。IFN力価はPBMC上清を５倍希釈した標品
についてVSVのブラツク減少率により測定した。
尚黒丸によりIL−２活性の推移を示し、白三角
によりIFN力価の推移を示す。 この第３図からわかるように、本発明の多糖類
の量に応じてIL−２、IFN力価共に増大すること
がわかる。 次いで本発明の実施例２で調製した多糖類につ
いての毒性試験の結果について説明する。 バルブ−シーマウス（Balb−Ｃマウス）10匹
の腹腔に実施例２で調製した多糖類を、ウロン酸
定量で500μgを１mg、３mgを注射したが、28日後
においても異常は認められなかつた。 〔発明の効果〕 本発明は、ナンバンギセルの種子から単離され
たインターロイキン−２、及びインターフエロン
−γ誘起剤を提供すると共に、ナンバンギセルの
種子よりリン酸緩衝生理食塩水により抽出される
か、またはナンバンギセルの種子より水飽和ブタ
ノールにより抽出され、得られた水層をプロナー
ゼ処理し、その沈澱除去液を限外濾過して回収さ
れるか、更にナンバンギセルの種子より水飽和フ
エノールにより抽出され、得られた水層を酢酸カ
リウム、及びエタノール処理し、その沈澱除去液
を蒸溜水に対して透析し、その透析内液より
RNAを除去後、得られた水層を更に酢酸カリウ
ム、及びエタノール処理し、沈澱除去液を蒸溜水
に対して透析し、その透析内液を濃縮することに
より得られるIL−２、及びIFN−γ誘起剤は、著
しいIL−２、及びIFN−γ誘起活性を有し、ヒト
及び動物の各種ウイルス感染症の予防、及び治療
に有用であることが期待される。
第１図は標準IL−２（組み換えIL−２）を用い
て作成された定量曲線を示す図、第２図はナンバ
ンギセルの種子の粗抽出標品をクロマトグラフイ
ーにかけ、その各分画におけるIL−２、及びIFN
誘導能の検索結果、及びウロン酸（OD530nm、
カルバゾール反応）、蛋白質（ODD280nm）の定
量結果を示す図、第３図は実施例２で調製した多
糖類分画でPBMCを24時間刺激して得た培養上
清について、IL−２、及びIFN力価を測定した結
果を示す図である。
て作成された定量曲線を示す図、第２図はナンバ
ンギセルの種子の粗抽出標品をクロマトグラフイ
ーにかけ、その各分画におけるIL−２、及びIFN
誘導能の検索結果、及びウロン酸（OD530nm、
カルバゾール反応）、蛋白質（ODD280nm）の定
量結果を示す図、第３図は実施例２で調製した多
糖類分画でPBMCを24時間刺激して得た培養上
清について、IL−２、及びIFN力価を測定した結
果を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ナンバンギセルの種子から単離されたインタ
ーロイキン−２、及びインターフエロン−γ誘起
剤。 ２ ナンバンギセルの種子より蒸溜水により抽出
されることを特徴とするインターロイキン−２、
及びインターフエロン−γ誘起剤の製造方法。 ３ 上記蒸溜水がリン酸緩衝生理食塩水である請
求項２記載のインターロイキン−２、及びインタ
ーフエロン−γ誘起剤の製造方法。 ４ ナンバンギセルの種子より水飽和ブタノール
により抽出され、得られた水層をプロナーゼ処理
し、その沈澱除去液を限外濾過して回収されるこ
とを特徴とするインターロイキン−２、及びイン
ターフエロン−γ誘起剤の製造方法。 ５ ナンバンギセルの種子より水飽和フエノール
により抽出され、得られた水層を酢酸カリウム、
及びエタノール処理し、その沈澱除去液を蒸溜水
に対して透析し、その透析内液よりRNAを除去
後、得られた水層を更に酢酸カリウム、及びエタ
ノール処理し、沈澱除去液を蒸溜水に対して透析
し、その透析内液を濃縮することを特徴とするイ
ンターロイキン−２、及びインターフエロン−γ
誘起剤の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63232991A JPH0283331A (ja) | 1988-09-17 | 1988-09-17 | インターロイキン−２、及びインターフェロン−γ誘起剤とその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63232991A JPH0283331A (ja) | 1988-09-17 | 1988-09-17 | インターロイキン−２、及びインターフェロン−γ誘起剤とその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0283331A JPH0283331A (ja) | 1990-03-23 |
| JPH054373B2 true JPH054373B2 (ja) | 1993-01-19 |
Family
ID=16948087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63232991A Granted JPH0283331A (ja) | 1988-09-17 | 1988-09-17 | インターロイキン−２、及びインターフェロン−γ誘起剤とその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0283331A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0645550B2 (ja) * | 1990-06-27 | 1994-06-15 | 新也 大久保 | 抗癌剤 |
-
1988
- 1988-09-17 JP JP63232991A patent/JPH0283331A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0283331A (ja) | 1990-03-23 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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