JPH0544272B2 - - Google Patents
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- JPH0544272B2 JPH0544272B2 JP1257203A JP25720389A JPH0544272B2 JP H0544272 B2 JPH0544272 B2 JP H0544272B2 JP 1257203 A JP1257203 A JP 1257203A JP 25720389 A JP25720389 A JP 25720389A JP H0544272 B2 JPH0544272 B2 JP H0544272B2
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- pyruvate oxidase
- alanine
- oxidase
- plasmid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/03—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with oxygen as acceptor (1.2.3)
- C12Y102/03003—Pyruvate oxidase (1.2.3.3)
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- Immunology (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は野生型酵素よりも安定であり、従つて
ピルベート及びピルベート放出性反応の酵素的測
定に好適であるピルベートオキシダーゼの突然変
異に関する。 〔従来の技術水準〕 ピルベートオキシダーゼ（E.C.1.2.3.3）は、ピ
ルベートをホスフエートイオン及び酸素の存在
で、H2O2の形成下に脱カルボキシル化する酵素
である〔Federation Proceedings 13、（1954）、
734〜738参照〕。反応生成物燐酸アセチル、CO2
及びH2O2のうち、特に最後のものは、分析的に
良好に測定可能であり、従つて、この酵素は、ピ
ルベート及びピルベート形成性酵素もしくはその
基質の定量的測定のために好適である。 欧州特許（EP−Ａ）第0117550号明細書から、
FAD、チアミン−ピロ燐酸（TPP）及び２価金
属イオンの添加なしに活性であるピルベートオキ
シダーゼは公知である。この酵素は、血清及びマ
グネシウムイオンの存在で不溶性沈殿を形成せ
ず、優れた貯蔵安定性を有する。しかしながら、
この血清の高い塩濃度並びに＞７のPH値では、こ
のピルベートオキシダーゼは限定された安定性を
有するだけである。 〔発明の構成〕 ところで、塩に対し、かつアルルカリ性PH領域
で高い安定性を有するラクトバシルルス・プラン
タルム（Lactobacillus Plantarum）
（DSM2571）からのピルベートオキシダーゼの突
然変異体を発見した。 従つて、本発明の目的物は、ピルベートを
H2O2形成下に脱カルボキシルし、FAD、TPP及
び２価金属イオンの添加なしに安定であるピルベ
ートオキシダーゼであり、これは、アミノ酸配列
中に、178の位置のプロリンの及び／又は458の位
置のアラニンの少なくとも１個の交換部を有す
る。プロリン178がセリンと、かつ／又はアラニ
ン458がバリンと交換されている突然変異酵素が
有利である。 この突然変異酵素は、次の特性値を有する： 分子量：250000（Amesによる超遠心で測定）、 至適PH：6.5、ピルベートとのKm（25℃）：約0.4
ｍモル／、 ホスフエートとのKm（25℃）約23ｍモル／。 この突然変異酵素は、NaCl0.15モル／を含
有する燐酸カリウム緩衝剤0.1モル／（PH８）
中、25℃で30分の後に、最低45％の残留活性を有
する。 この条件下で、有利な突然変異酵素は、最低70
％の残留活性を有する。特に有利な突然変異酵素
は、最低85％の残留活性を有する。 本発明による突然変異酵素の製造は、公知の遺
伝子操作法により、実質的に野生型酵素の配列
（第１図）を有するが、付加的に塩基532、533、
534、1372、1373及び／又は1374の少なくとも１
個の交換部を有するピルベートオキシダーゼ遺伝
子を有する組換えDNAを適当な宿主株をトラン
スフオームする１個の表現ベクター中に導入し、
この表現ベクター上で選択し、このようにトラン
スフオームされた宿主株を適当な条件下で培養
し、このバツチから本発明による突然変異酵素を
収獲することよりなる。 組換えDNAとしては、塩基532及び／又は塩基
1373の所でＣをＴと交換するDNAを使用するの
が有利である。 本発明のもう１つの目的物は、塩基532、533、
534、1372、1373及び／又は1374の少なくとも１
個の交換部を有するピルベートオキシダーゼを含
有する組換えDNAである。塩基532及び／又は塩
基1373が交換されているのが有利である。特に、
これら塩基がＴで交換されているのが有利であ
る。 しかしながら、コドン532、533、534がプロリ
ン以外のアミノ酸に関してコードしかつ／又はコ
ドン1372、1373、1374がアラニン以外のアミノ酸
をコードするような各々他の交換も可能である。 特に組換えDNAとしてプラスミドpBP201、
pBP202、pBP203、pBP203a又はpBP2006の１
つを使用するのが有利である。宿主系としては、
グラム陽性及びグラム陰性の微生物例えばバシル
スSpec.（Bacillus spee.）又はE.コリー（E.coli）
が好適であるる。E.コリー属の微生物を使用する
のが有利である。特に、Ｅ・コリーLaqIq
（DSM3689）。 ED8654（DSM2102）、E.コリー（DSM4105）
及びE.コリー（DSM4106）を使用するのが有利
である。表現プラスミドとしては、殊にベクター
例えばpBP322及び誘導体が好適である。 本発明のもう１つの目的物は、プラスミド
pBP201、pBP202、pBP203、pBP203a及び
pBP2006である。これらは、野生型のピルベート
オキシダーゼ遺伝子を含有し（第１図）、ここで
DNA−面上に次の交換部が存在する：
ピルベート及びピルベート放出性反応の酵素的測
定に好適であるピルベートオキシダーゼの突然変
異に関する。 〔従来の技術水準〕 ピルベートオキシダーゼ（E.C.1.2.3.3）は、ピ
ルベートをホスフエートイオン及び酸素の存在
で、H2O2の形成下に脱カルボキシル化する酵素
である〔Federation Proceedings 13、（1954）、
734〜738参照〕。反応生成物燐酸アセチル、CO2
及びH2O2のうち、特に最後のものは、分析的に
良好に測定可能であり、従つて、この酵素は、ピ
ルベート及びピルベート形成性酵素もしくはその
基質の定量的測定のために好適である。 欧州特許（EP−Ａ）第0117550号明細書から、
FAD、チアミン−ピロ燐酸（TPP）及び２価金
属イオンの添加なしに活性であるピルベートオキ
シダーゼは公知である。この酵素は、血清及びマ
グネシウムイオンの存在で不溶性沈殿を形成せ
ず、優れた貯蔵安定性を有する。しかしながら、
この血清の高い塩濃度並びに＞７のPH値では、こ
のピルベートオキシダーゼは限定された安定性を
有するだけである。 〔発明の構成〕 ところで、塩に対し、かつアルルカリ性PH領域
で高い安定性を有するラクトバシルルス・プラン
タルム（Lactobacillus Plantarum）
（DSM2571）からのピルベートオキシダーゼの突
然変異体を発見した。 従つて、本発明の目的物は、ピルベートを
H2O2形成下に脱カルボキシルし、FAD、TPP及
び２価金属イオンの添加なしに安定であるピルベ
ートオキシダーゼであり、これは、アミノ酸配列
中に、178の位置のプロリンの及び／又は458の位
置のアラニンの少なくとも１個の交換部を有す
る。プロリン178がセリンと、かつ／又はアラニ
ン458がバリンと交換されている突然変異酵素が
有利である。 この突然変異酵素は、次の特性値を有する： 分子量：250000（Amesによる超遠心で測定）、 至適PH：6.5、ピルベートとのKm（25℃）：約0.4
ｍモル／、 ホスフエートとのKm（25℃）約23ｍモル／。 この突然変異酵素は、NaCl0.15モル／を含
有する燐酸カリウム緩衝剤0.1モル／（PH８）
中、25℃で30分の後に、最低45％の残留活性を有
する。 この条件下で、有利な突然変異酵素は、最低70
％の残留活性を有する。特に有利な突然変異酵素
は、最低85％の残留活性を有する。 本発明による突然変異酵素の製造は、公知の遺
伝子操作法により、実質的に野生型酵素の配列
（第１図）を有するが、付加的に塩基532、533、
534、1372、1373及び／又は1374の少なくとも１
個の交換部を有するピルベートオキシダーゼ遺伝
子を有する組換えDNAを適当な宿主株をトラン
スフオームする１個の表現ベクター中に導入し、
この表現ベクター上で選択し、このようにトラン
スフオームされた宿主株を適当な条件下で培養
し、このバツチから本発明による突然変異酵素を
収獲することよりなる。 組換えDNAとしては、塩基532及び／又は塩基
1373の所でＣをＴと交換するDNAを使用するの
が有利である。 本発明のもう１つの目的物は、塩基532、533、
534、1372、1373及び／又は1374の少なくとも１
個の交換部を有するピルベートオキシダーゼを含
有する組換えDNAである。塩基532及び／又は塩
基1373が交換されているのが有利である。特に、
これら塩基がＴで交換されているのが有利であ
る。 しかしながら、コドン532、533、534がプロリ
ン以外のアミノ酸に関してコードしかつ／又はコ
ドン1372、1373、1374がアラニン以外のアミノ酸
をコードするような各々他の交換も可能である。 特に組換えDNAとしてプラスミドpBP201、
pBP202、pBP203、pBP203a又はpBP2006の１
つを使用するのが有利である。宿主系としては、
グラム陽性及びグラム陰性の微生物例えばバシル
スSpec.（Bacillus spee.）又はE.コリー（E.coli）
が好適であるる。E.コリー属の微生物を使用する
のが有利である。特に、Ｅ・コリーLaqIq
（DSM3689）。 ED8654（DSM2102）、E.コリー（DSM4105）
及びE.コリー（DSM4106）を使用するのが有利
である。表現プラスミドとしては、殊にベクター
例えばpBP322及び誘導体が好適である。 本発明のもう１つの目的物は、プラスミド
pBP201、pBP202、pBP203、pBP203a及び
pBP2006である。これらは、野生型のピルベート
オキシダーゼ遺伝子を含有し（第１図）、ここで
DNA−面上に次の交換部が存在する：
次の実施例につき本発明を更に詳述する。
例 １
プラスミドpBP201、pBP202、pBP203、
pBP203a又はpBP2006を有するE.コリーED
LacIq（DSM3689）の細胞を１−醗酵槽中、28
〜30℃で１晩培養する。培地として、乳糖0.4％
及び燐酸塩（7.5）100ｍモル／を含有する完全
培地（酵母／ペプトンエキス）を使用する。 8000r.p.m.で15分間遠心分離の後に、細胞をリ
ンチーム（Lysozym）で溶解させ、ピルベート
オキシダーゼをDEAE−セフアデツクスを介し、
ゲル濾過（Sephacryl S200）により精製する。 例 ２ 塩溶液中での安定性の検査 ａ 活性測定 酵素の安定性の検査のために、次の反応に基づ
き酵素の活性を測定する： (1) ピルベート＋Pi＋D2Py−OD ――――→ アセチル−Ｐ＋CO2＋H2O2 (2) H2O2＋４−アミノアンチピリン（4AAP）＋
２−ヒドロキシ−３，５−ジクロルベンゾール
スルホン酸（HDBS） POD ――→ キノン−色素（546nm）＋2H2O2＋HCl H2O2は当モル量の色素を消費する。 Py−OD1U＝ピルベート変換1Uモル／min（25
℃）。ピルベートオキシダーゼ（Py−OD）の活
性の測定は、次のものよりなる試薬（テスト中の
最終濃度）：燐酸カリウム緩衝剤（PH6.7）72ｍモ
ル／、４−AAP8ｍモル／、HDBS6.8ｍモ
ル／、ピルベート50ｍモル／、ペルオキシダ
ーゼ（POD）10U／ml。 を用いて行なう。 この試薬２mlに試験すべきピルベートオキシダ
ーゼ溶液0.1mlを加え、25℃、層厚１cm（＝16.5
ml／ｕモル）で546nmにおける１分当りの吸光度
変化（Ｅ／min）を測定する。活性を次式で計算
する： 活性（Ｕ）＝Ｅ／min・Ｖ／ε Ｖ：キユベツト容量 ｂ PH7.5における温置（Belastung） ピルベートオキシダーゼを、燐酸カリウム緩衝
剤（PH7.5）0.1モル／及び塩化ナトリウム0.15
モル／よりなるインキユベーシヨン溶液中、25
℃もしくは37℃で、第１表に記載の時間温置し、
例2aに記載のように活性を測定する。結果を第
表及び第に示す。第２図は、種々のPH−値に
おける燐酸カリウム緩衝剤0.1モオ／中、37℃
で20時間温置後の結果を示している。 これから、本発明のプラスミドでコードされた
ピルベートオキシダーゼは、野性型酵素よりも優
れていることが明らかである。殊に突然変異体
pBP2066は、アルカリ性PH−値及び塩に対して高
い安定性を有する。
pBP203a又はpBP2006を有するE.コリーED
LacIq（DSM3689）の細胞を１−醗酵槽中、28
〜30℃で１晩培養する。培地として、乳糖0.4％
及び燐酸塩（7.5）100ｍモル／を含有する完全
培地（酵母／ペプトンエキス）を使用する。 8000r.p.m.で15分間遠心分離の後に、細胞をリ
ンチーム（Lysozym）で溶解させ、ピルベート
オキシダーゼをDEAE−セフアデツクスを介し、
ゲル濾過（Sephacryl S200）により精製する。 例 ２ 塩溶液中での安定性の検査 ａ 活性測定 酵素の安定性の検査のために、次の反応に基づ
き酵素の活性を測定する： (1) ピルベート＋Pi＋D2Py−OD ――――→ アセチル−Ｐ＋CO2＋H2O2 (2) H2O2＋４−アミノアンチピリン（4AAP）＋
２−ヒドロキシ−３，５−ジクロルベンゾール
スルホン酸（HDBS） POD ――→ キノン−色素（546nm）＋2H2O2＋HCl H2O2は当モル量の色素を消費する。 Py−OD1U＝ピルベート変換1Uモル／min（25
℃）。ピルベートオキシダーゼ（Py−OD）の活
性の測定は、次のものよりなる試薬（テスト中の
最終濃度）：燐酸カリウム緩衝剤（PH6.7）72ｍモ
ル／、４−AAP8ｍモル／、HDBS6.8ｍモ
ル／、ピルベート50ｍモル／、ペルオキシダ
ーゼ（POD）10U／ml。 を用いて行なう。 この試薬２mlに試験すべきピルベートオキシダ
ーゼ溶液0.1mlを加え、25℃、層厚１cm（＝16.5
ml／ｕモル）で546nmにおける１分当りの吸光度
変化（Ｅ／min）を測定する。活性を次式で計算
する： 活性（Ｕ）＝Ｅ／min・Ｖ／ε Ｖ：キユベツト容量 ｂ PH7.5における温置（Belastung） ピルベートオキシダーゼを、燐酸カリウム緩衝
剤（PH7.5）0.1モル／及び塩化ナトリウム0.15
モル／よりなるインキユベーシヨン溶液中、25
℃もしくは37℃で、第１表に記載の時間温置し、
例2aに記載のように活性を測定する。結果を第
表及び第に示す。第２図は、種々のPH−値に
おける燐酸カリウム緩衝剤0.1モオ／中、37℃
で20時間温置後の結果を示している。 これから、本発明のプラスミドでコードされた
ピルベートオキシダーゼは、野性型酵素よりも優
れていることが明らかである。殊に突然変異体
pBP2066は、アルカリ性PH−値及び塩に対して高
い安定性を有する。
【表】
【表】
例 ３
非稀釈血清を用いる安定性の検査
非稀釈血清9.5mlを、10％酢酸又はNaCl2モ
ル／の滴加により第表に記載のPH値に調節す
る。引続き、ピルベートオキシダーゼ溶液
（150U／ml）0.5mlを加え、37℃で温置する。残
留活性の測定は、例2aの記載と同様にして行な
う。 結果を第表に示す。
ル／の滴加により第表に記載のPH値に調節す
る。引続き、ピルベートオキシダーゼ溶液
（150U／ml）0.5mlを加え、37℃で温置する。残
留活性の測定は、例2aの記載と同様にして行な
う。 結果を第表に示す。
【表】
例 ４
プラスミドpBP203aからのピルベートオキシ
ダーゼの安定性の検査 プラスミドpBP203aを有する又は有しないE.コ
リーLaq Iq（DSM3689）のコロニーを0.2％乳糖
（最終濃度）含有最少培地−プラスミド上でセル
ロースフイルターを付し、37℃で24時間培養す
る。引続クロロホルム／トルオールで溶解させ、
フイルターを燐酸カリウム緩衝剤0.1モル／
（PH7.5）及び塩化ナトリウム0.15モル／中、37
℃で20分間温置する。次いで、このフイルター
を、ピルビン酸ナトリウム40ｍモル／、４−ア
ミノ−アンチピリン0.24mg／、Ｎ−エチル−Ｎ
−（３−メチルフエニル）−２−アミノエタンスル
ホン酸EST1.5mg／ml、ペルオキシダーゼ12.5μ
ｇ／ml、低融点アガロース１％、燐酸カリウム緩
衝剤（PH7.2）50ｍモル／よりななる指示媒体
を含有するプレート上に施与し、１分後に呈色反
応を観察する。pBP302aを含有する微生物のコ
ロニーみが呈色反応を示し、その結果、なおピル
ベートオキシダーゼが存在することが明らかあ
る。野生型プラスミドを含有する微生物は、もは
や呈色反応を示さない。このことは、pBP203a
からのピルベートオキシダーゼ変異体も野生型酵
素に比べて優れた安定性を有することを意味す
る。 例 ５ ピルベートオキシダーゼ−変異酵素の製造 ピルベートオキシダーゼの野生型遺伝子を有す
るプラスミドpBP200（製法は例６参照）から出発
し、所望の突然変異生成法で、相応する突然変異
をDNA−面上実施する。この方法は、Proc.Nat.
Acad.Sci，USA 82（1985）、488〜492頁及びNat.
Enzymol，1987並びにBulletin 1313 von
Biorod Laboratoris，Richmond USA zu
Muta−GeneR in Vitro−Mutagenesis−Kit中
に記載されている。 pBP201の製造のために、次の配列のオリゴヌ
クレオチドＡ： 5′−CGTTCAGCTGAAATCTGTTG−3′ を使用する。 pBP203aを製造するために、次の配列を有す
るオリゴヌクレオチドＢ： 5′−AACTTGCGTCACCAAATCTT−3′ を使用する。 pBP203を製造するために、オリゴヌクレオチ
ドＡ及びＢを使用する。 pBP201と同様に塩基532でのＣのＴに対する交
換並びに付加的に野生型遺伝子の500bPの大きさ
のBan Eco RV−フラグメント上に１個の
突然変異を有するプラスミドpBP202をドイイツ
微生物寄託局（DSM）に寄託した。 プラスミドpBP202から合目的突然変異性成に
より、オリゴヌクレオチドＢを用いてプラスミド
pBP2006を製造した。 他の突然変異酵素は、次のオリゴヌクレオチド
を用いて製造できる： オリゴヌクレオチドＣ： 5′−CGTTCAGCGCTAATCTGTTG−3′ （プロリン178とセリンの交換） オリゴヌクレオチドＤ： 5′−CGTTCAGCGACAATCTGTTG−3′ （プロリン178とバリンの交換） オリゴヌクレオチドＥ： 5′−CGTTCAGCAGAATCTGTTG−3′ （プロリン178とアラニンの交換） オリゴヌクレオチドＦ： 5′−AACTTGCGTGGTCAAATCTT−3′ （アラニン458とスレオニンの交換） オリゴヌクレオチドＧ： 5′−AACTTGCGTAAGCAAATCTT−3′ （アラニン458とリジンの交換） オリゴヌクレオチドＨ： 5′−AACTTGCGTGCCCAAATCTT−3′ （アラニン458とグリシンの交換） 例 ６ pBP200（DSM4875）の製造 プラスミドpKK177−３（DSM3062）をEco.RI
及びSma Ｉで切断する。ピルベートオキシダー
ゼ−コードされたDNA−フラグメント（第１図
から、約1kbのEco.RI−SaiI−フラグメント及び
約1.2kbのSalI−co.RV−フラグメントを単離す
る。３フラグメント全てを相互に連結させる。こ
れをE.コリー（DSM3689中にトランスフオーム
させ、アンピシリン−抵抗性に関し選択する。こ
のピルベートオキシダーゼ−コードされたプラス
ミドpBP200は、第３図に示すような制限位置を
有する。 プラスミドpBP200は、同様に、プラスミド
pBP202から、約2.2kbの大さのEco.RI−Eco.RV
−フラグメントを欠失させ、このフラグメントを
第１図のDNAの約1kbの大きさのEco RI−SalI
及び約1.2kbの大きさのSalI−Eco.RV−フラグメ
ントで換えることにより得られる。
ダーゼの安定性の検査 プラスミドpBP203aを有する又は有しないE.コ
リーLaq Iq（DSM3689）のコロニーを0.2％乳糖
（最終濃度）含有最少培地−プラスミド上でセル
ロースフイルターを付し、37℃で24時間培養す
る。引続クロロホルム／トルオールで溶解させ、
フイルターを燐酸カリウム緩衝剤0.1モル／
（PH7.5）及び塩化ナトリウム0.15モル／中、37
℃で20分間温置する。次いで、このフイルター
を、ピルビン酸ナトリウム40ｍモル／、４−ア
ミノ−アンチピリン0.24mg／、Ｎ−エチル−Ｎ
−（３−メチルフエニル）−２−アミノエタンスル
ホン酸EST1.5mg／ml、ペルオキシダーゼ12.5μ
ｇ／ml、低融点アガロース１％、燐酸カリウム緩
衝剤（PH7.2）50ｍモル／よりななる指示媒体
を含有するプレート上に施与し、１分後に呈色反
応を観察する。pBP302aを含有する微生物のコ
ロニーみが呈色反応を示し、その結果、なおピル
ベートオキシダーゼが存在することが明らかあ
る。野生型プラスミドを含有する微生物は、もは
や呈色反応を示さない。このことは、pBP203a
からのピルベートオキシダーゼ変異体も野生型酵
素に比べて優れた安定性を有することを意味す
る。 例 ５ ピルベートオキシダーゼ−変異酵素の製造 ピルベートオキシダーゼの野生型遺伝子を有す
るプラスミドpBP200（製法は例６参照）から出発
し、所望の突然変異生成法で、相応する突然変異
をDNA−面上実施する。この方法は、Proc.Nat.
Acad.Sci，USA 82（1985）、488〜492頁及びNat.
Enzymol，1987並びにBulletin 1313 von
Biorod Laboratoris，Richmond USA zu
Muta−GeneR in Vitro−Mutagenesis−Kit中
に記載されている。 pBP201の製造のために、次の配列のオリゴヌ
クレオチドＡ： 5′−CGTTCAGCTGAAATCTGTTG−3′ を使用する。 pBP203aを製造するために、次の配列を有す
るオリゴヌクレオチドＢ： 5′−AACTTGCGTCACCAAATCTT−3′ を使用する。 pBP203を製造するために、オリゴヌクレオチ
ドＡ及びＢを使用する。 pBP201と同様に塩基532でのＣのＴに対する交
換並びに付加的に野生型遺伝子の500bPの大きさ
のBan Eco RV−フラグメント上に１個の
突然変異を有するプラスミドpBP202をドイイツ
微生物寄託局（DSM）に寄託した。 プラスミドpBP202から合目的突然変異性成に
より、オリゴヌクレオチドＢを用いてプラスミド
pBP2006を製造した。 他の突然変異酵素は、次のオリゴヌクレオチド
を用いて製造できる： オリゴヌクレオチドＣ： 5′−CGTTCAGCGCTAATCTGTTG−3′ （プロリン178とセリンの交換） オリゴヌクレオチドＤ： 5′−CGTTCAGCGACAATCTGTTG−3′ （プロリン178とバリンの交換） オリゴヌクレオチドＥ： 5′−CGTTCAGCAGAATCTGTTG−3′ （プロリン178とアラニンの交換） オリゴヌクレオチドＦ： 5′−AACTTGCGTGGTCAAATCTT−3′ （アラニン458とスレオニンの交換） オリゴヌクレオチドＧ： 5′−AACTTGCGTAAGCAAATCTT−3′ （アラニン458とリジンの交換） オリゴヌクレオチドＨ： 5′−AACTTGCGTGCCCAAATCTT−3′ （アラニン458とグリシンの交換） 例 ６ pBP200（DSM4875）の製造 プラスミドpKK177−３（DSM3062）をEco.RI
及びSma Ｉで切断する。ピルベートオキシダー
ゼ−コードされたDNA−フラグメント（第１図
から、約1kbのEco.RI−SaiI−フラグメント及び
約1.2kbのSalI−co.RV−フラグメントを単離す
る。３フラグメント全てを相互に連結させる。こ
れをE.コリー（DSM3689中にトランスフオーム
させ、アンピシリン−抵抗性に関し選択する。こ
のピルベートオキシダーゼ−コードされたプラス
ミドpBP200は、第３図に示すような制限位置を
有する。 プラスミドpBP200は、同様に、プラスミド
pBP202から、約2.2kbの大さのEco.RI−Eco.RV
−フラグメントを欠失させ、このフラグメントを
第１図のDNAの約1kbの大きさのEco RI−SalI
及び約1.2kbの大きさのSalI−Eco.RV−フラグメ
ントで換えることにより得られる。
第１図は野生型酵素の配列列を示す図、第２図
は野生型酵素（WT）と本発明のピルベートオキ
シダーゼの37℃、20時間温置後の残留活性とPH値
の関係を示す図、第３図はプラスミドpBP200の
制限地図である。
は野生型酵素（WT）と本発明のピルベートオキ
シダーゼの37℃、20時間温置後の残留活性とPH値
の関係を示す図、第３図はプラスミドpBP200の
制限地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ピルベートをH2O2の形成下に脱カルボキシ
ル化する、FAD、チアミンピロ燐酸及び２価金
属の添加なしに活性であるピルベートオキシダー
ゼにおいて、これは、 (a) アミノ酸配列内に、セリン、バリン又はアラ
ニンと交換するプロリンの178位及び／又はス
レオニン、リジン又はグリシンと交換するアラ
ニンの458位の少なくとも１個のアミノ酸交換
部を有し、 (b) 至適PH約6.5、 (c) ピルベートに対するKm約0.4mM25℃）及び
ホスフエートに対するKm約2.3mM（25℃） を有することを特徴とする、ピルベートオキシダ
ーゼ。 ２ 請求項１記載のピルベートオキシダーゼを製
造するため、少なくとも１個の塩基の交換部532、
533、534、1372、1373及び／又は1374を有するピ
ルベートオキシダーゼ遺伝子を含有する組換え
DNAを、適当な宿主株中にトランスフオームし、
表現ベクター上で選択し、このようにトランスフ
オームされた宿主株を適当な条件下で培養し、こ
のバツチからピルベートオキシダーゼを収穫する
ことを特徴とする請求項１記載のピルベートオキ
シダーゼの製法。 ３ 請求項１記載のピルベートオキシダーゼを用
い、生じるH2O2、CO2又は燐酸アセチルを測定
するか又は酸素消費量を測定することを特徴とす
る、ピルベートの測定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3833601A DE3833601A1 (de) | 1988-10-03 | 1988-10-03 | Pyruvatoxidase-mutanten |
| DE3833601.4 | 1988-10-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02177884A JPH02177884A (ja) | 1990-07-10 |
| JPH0544272B2 true JPH0544272B2 (ja) | 1993-07-05 |
Family
ID=6364285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1257203A Granted JPH02177884A (ja) | 1988-10-03 | 1989-10-03 | ピルベートオキシダーゼ及びその製法及びピルベートの測定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5096821A (ja) |
| EP (1) | EP0365836A1 (ja) |
| JP (1) | JPH02177884A (ja) |
| AU (1) | AU617535B2 (ja) |
| CA (1) | CA2000098A1 (ja) |
| DE (1) | DE3833601A1 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3306719A1 (de) * | 1983-02-25 | 1984-08-30 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Pyruvatoxidase |
| EP0274425B1 (en) * | 1987-01-06 | 1993-12-15 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Pyruvate oxidase, its preparation and use |
-
1988
- 1988-10-03 DE DE3833601A patent/DE3833601A1/de not_active Ceased
-
1989
- 1989-09-23 EP EP89117605A patent/EP0365836A1/de not_active Ceased
- 1989-10-02 AU AU42404/89A patent/AU617535B2/en not_active Ceased
- 1989-10-03 JP JP1257203A patent/JPH02177884A/ja active Granted
- 1989-10-03 CA CA002000098A patent/CA2000098A1/en not_active Abandoned
-
1991
- 1991-03-14 US US07/670,362 patent/US5096821A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3833601A1 (de) | 1990-04-05 |
| CA2000098A1 (en) | 1990-04-03 |
| JPH02177884A (ja) | 1990-07-10 |
| AU4240489A (en) | 1990-04-05 |
| AU617535B2 (en) | 1991-11-28 |
| EP0365836A1 (de) | 1990-05-02 |
| US5096821A (en) | 1992-03-17 |
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