JPH0546499B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体クロマトグラフイー系に用いら
れ、クロマトグラフイーすべき物質を高圧で予備
濃縮するための耐圧力材料の前置カラムに関する
ものである。 液体クロマトグラフイーは、微量分析（trac−
ing）ついで液体に溶解し又は分散している物質
の同定および濃度決定用に、並びに液体からのか
かる物質の分取スケールでの分離用に頻繁に用い
られる分離技術である。前者の場合は分析液体ク
ロマトグラフイーであり、後者の場合は分取液体
クロマトグラフイーである。液体クロマトグラフ
イー（LC）、特に所謂「ハイ・パーフオーマンス
液体クロマトグラフイー」（HPCL）は液−固ク
ロマトグラフイー（LSC）、分配クロマトグラフ
イー、例えば液−液クロマトグラフイー（LLC）
およびバウンデイド−フエイズクロマトグラフイ
ー（bounded‐phase chromatography）
（BPC）、イオン交換クロマトグラフイー、アフ
イニテイークロマトグラフイー（affinity
chromatography）、並びにイクスクル−ジヨン
クロマトグラフイー（exclusion
chromatography）例えばゲルパーミエーシヨン
クロマトグラフイー（GPC）およびゲル濾過ク
ロマトグラフイーに分けることができる。 これらクロマトグラフイー技術の殆どは、通常
粒状の担体材料で満される１個以上のカラムが使
用される。担体材料の選択はクロマトグラフイー
すべき物質、上記物質が存在する液体およびクロ
マトグラフイー処理に使用される溶媒に左右され
る。従つて、使用すべき溶媒および担体は解決し
ようとする分離問題によつて決定される。 分離又は検出しようとする物質が液中に極少
量、即ち著しく低濃度で存在する場合には、予備
濃縮を用いるのが一般的である。この場合、実際
のクロマトグラフイーカラムまたは分離カラムの
前に連結することのできる予備濃縮カラム又は前
置カラムがしばしば使用される。液体クロマトグ
ラフイーに使用すべきかかる前置カラム（濃縮カ
ラム）は米国特許第4070284号明細書に開示され
ている。かかる明細書に披歴されている円筒形カ
ラムは直径0.4インチ、長さ0.6インチの最大寸法
および高々3MPaの耐圧性を有する。然し、かか
るカラムは前述の目的の殆どに、例えばHPLCを
使用して、体液内の薬物および／または代謝物質
を予備濃縮するのに適していない。この理由は捕
集容量および分解能が共に極めて小さいことによ
る。予備濃縮処理中容認し難い圧力増加を明らか
に回避するために、上記特許発明に推奨されるよ
うな比較的大きな粒径のものを充填したカラムを
使用しても尚分解能に悪影響を及ぼす。HPLC技
術に前置カラムを使用することは、例えばJ.
Chrom.222．（1981）、pp.13−22においてロート
（Roth）等によつて述べられている。この文献は
体液内の薬物または代謝物質の微量分析に関する
ものである。これら体液内の微量成分の濃度は極
めて小さく、例えば１ml当りナノグラムのオーダ
であるので、予備濃縮が必要である。ロート等が
用いた前置カラムは、目的とする用途に適した担
体を乾燥状態で満した長さ25mmのまつすぐなカラ
ムである。このカラムに試験すべき体液試料が供
給され、検出すべき微量成分が担体材料に吸着さ
れる。ついで微量成分が、この目的のために選ば
れた溶媒により前置カラムまたは分離カラムから
溶離される。クロマトグラフイーカラムまたは分
離カラムは微量成分を種々の成分に分離するのに
適する担体材料で満される。分離カラムの溶離に
より、各成分を多少純粋な状態で捕集し、検出す
ることができる。 然し、例えば上記文献においてロート等によつ
て述べられているようなまつすぐな前置カラムを
用いた場合に、前置カラムに吸着された物質を１
個以上の分離カラムにより種々の成分に実際に分
離することが阻害されることが分かつた。実際の
ところ、引き続いて行なわれる溶離において阻害
因子として目詰りおよびゴーストイフエクト
（ghost effect）が生じ、同時に分解能が通常悪
くなる。また、特に一層大きな容積をクロマトグ
ラフイーする際に同様の現象が生ずることがJ.
Chrom.136．（1977），65においてシヤオベーカー
（Schauwecker）等によつて確証された。 然し現在上記問題は、内部が両端に向うにつれ
狭くなり且つ予備濃縮すべき送込管と上流で、分
離カラムと下流で封止連結するための手段を有す
る容器形状本体から成る予備濃縮用前置カラムを
使用する場合に生じないことを見出した。かかる
前置カラムを使用する場合、クロマトグラフイー
カラムにおける次の分離で妨害ゴーストイフエク
トおよび不十分な分解能が生じないようにして、
体液内に存在する代謝物質等の微量成分を予備濃
縮することが可能であることが証明された。 本発明の前置カラムでは尿、腰椎液、唾液およ
び血漿の如き種々の体液のみならず臓器の均等質
および糞の予備濃縮を行なうことができる。この
結果、かかる液体および排出物中の薬物および代
謝物質の微量成分を検出し決定し更にこれらを分
離することも可能となる。然し、本発明の前置カ
ラムは薬学上または臨床上の使用に意図されるだ
けでなく、微量分析を行なわなければならない他
のすべての液体に使用でき、例えば廃水、飲料
水、雨水、地下水および地表水の定量および定性
分析に、並びに代謝物質および農作物、汚物、地
下水および地表水に含まれる例えば殺虫剤の検
出、決定および分離に使用することができる。 理論的考察に基づいて、セツド（J.High Res.
Chrom.Commun.Feb.1979．pp．63−67）はクロ
マトグラフイーカラムまたは分離カラムに関して
は円錐形状の方が段階構成（複合）形状（step‐
wise composed（composite）shape）よりも好ま
しいとの認識に至つた。然し、他に分離問題に関
係し予備濃縮には関係しないこの理論的考察は如
何なる実施例によつても具体化されてない。更
に、この大きささのクロマトグラフイーカラムは
それ自体予備濃縮カラムに使用することができな
い。この理由はかかる大きさがカラムを展開する
目的によりなかんずく決定されるからである。ま
たこのことも、1mの長さに亘り直径が３cmから
１cmに円錐状に変化するセツドにより考え出され
た分離カラムの理論的に好ましいモデルにより明
らかとなる。かかる寸法は前置カラムには適さな
い。実際のところ、前置カラムの容量は効果的予
備濃縮のために大き過ぎてはならない。更に、分
離中溶離液中の微量成分の濃度は小さくなり過ぎ
て正確な検出および測定をすることができない。
従つて、前置カラムの長さは約10cm未満であるの
が好ましいが、入口と出口は十分に広くしてカラ
ムに形成される著しく高い圧力を回避しなければ
ならない。更に本発明の前置カラムは高圧で予備
濃縮するのに役立つ。即ち、かかかる前置カラム
はこの用途に対して一般的である100KPaと
10MPa間の圧力で使用しなければならない。セ
ツドの考えではかかる圧力は考慮されていない。
分離処理中、従つて前置カラムが分離カラムに連
結されている場合に前置カラム内の圧力は約
40MPaまで上昇することさえあり得る。カラム
を設計する際、かかる高圧力を考慮しなければな
らないことは疑う余地がない。従つて、カラムの
形状は、溶離中に生ずる前述の現象を回避し乍ら
クロマトグラフイーすべき物質を予備濃縮するこ
とができるだけでなく、更に約40MPaまでの圧
力に耐えることができるようにしなければならな
い。 本発明の前置カラムは、カラムを必要とする前
述のクロマトグラフイー分離処理、例えば液−液
クロマトグラフイー（LLC）、液−固クロマトグ
ラフイー（LSC）、イオン交換クロマトグラフイ
ー、アフイニテイークロマトグラフイーおよびゲ
ルパーミエーシヨンクロマトグラフイー（GPC）
の如何なる場合にも使用することができる。 好適例において本発明の前置カラムは、容器形
状本体の内壁が円錐状にまたは一体的にかかる本
体の両端に向つて収束するような形状を有する。
上流の予備濃縮すべき送込管と下流の分離カラム
との連結手段は容器形状本体の両端で相互に相対
して存在するのが好ましい。これら連結は少なく
とも40MPaの圧力に耐え得るねじ連結または緊
締結合とすることができる。他の好適例において
は、容器形状本体の内壁がその下流端部方向より
も上流端部方向に一層急激に狭くなる。この結
果、ある最大直径が供給液体に対してすぐに達成
され、一方最大カラム直径を下流口直径に減ずる
ことが極めて緩徐である。他の利点は、容器形状
本体の下流口の径が前置カラムに連結すべき分離
カラムの径とほぼ等しいので、クロマトグラフイ
ー分離処理中に前置カラムを分離カラムに連結す
る場合に所謂「層流」パターンの乱れが最少限と
なる。 カラムを好ましくはステンレス鋼から製造し、
これを一体的に形成することができるが、耐圧方
式で相互に固定される２個以上のセグメントから
構成することもできる。適当なる連結は、例えば
セグメント外側にフランジを設け締付環または締
付バンドによりあるいは該フランジを貫通するね
じボルトによりフランジを相互に締付けることに
よつて得ることができる。所要に応じて、良好な
る耐圧封止を適当な材料のガスケツトにより達成
することができる。製造技術の観点から、数個の
セグメントから成る前置カラムは一体的に形成さ
れるカラム以上の利点を有する；これは特に径の
大きなカラムに適用される。前述の如く、前置カ
ラムは少なくとも40MPaの圧力に耐えることが
できなければならない。この耐圧は、カラムを数
個のセグメントから構成することにより更に容易
に達成することができる。 前置カラムを使用する前に、このカラムに適当
な担体材料または吸着剤を充填する。体液の
HPLC試験に関しては、例えば撥水処理
（hydrophobated）して撥水剤（water‐
repellent）となるシリカゲルの如き前処理した
シリカゲルが適当である。他の用途に関しては、
液体クロマトグラフイー技術に有用である他の担
体材料、例えば酸化アルミニウムまたはイオン交
換樹脂も使用することができる。カラムに担体材
料を乾燥状態で充填することができるが、或いは
また担体をスラリとしてカラムに供給することも
できる。カラムの先細上流部分において、不活性
充填剤を担体材料に供給するのが好ましい。撥水
処理したシリカゲルを担体材料として使用する場
合に、ガラス玉またはシリカゲルを不活性充填剤
として使用することができる。不活性充填剤を使
用することにより、前置カラムに供給されたクロ
マトグラフイーすべき物質がカラム全体に亘り一
層均一に分布することが達成される。また、かか
る充填はデ・ヨング（de Jong）等（J.Chrom.
148．（1978），pp．127−141）により提案されて
いる。担体材料は、例えばカラム内の焼結金属の
２個のフイルター間に収納されるのが好ましい。
前置カラムの通常のコンデイシヨニングを行なつ
た後、試験すべき液体試料を、連結シリンジを有
する管により或いは大きな容積に関する場合には
ポンプによりカラムに加える。吸着された成分は
担体上に残存し、一方未吸着物質は液によりカラ
ムを介して流出する：かかる廃液は排出管を介し
てカラムから流出する。ついで前置カラムをその
下流において分離カラムまたはクロマトグラフイ
ーカラムに連結する。尚このカラムは通常法でコ
ンデイシヨニングする。ついで吸着物質を適当な
溶媒または溶媒混合液により分離カラムに溶離さ
せ、然る後分離カラムを好ましくは同じ溶媒また
は溶媒混合液で溶離する。一定組成の溶離液の代
りに、組成を連続的に変化させる溶媒混合液をし
ばしば使用する（傾斜溶離法）。また、連続的傾
斜溶離法に加え、段階的傾斜溶離法を用いること
もできる。クロマトグラフイー処理に要求される
圧力は、１個以上のポンプを使用することにより
得られる。更に、液体クロマトグラフは通常の制
御装置、自動画分コレクターおよび試験すべき成
分を検出するのに適した検出器を備える。 上述の如き液体クロマトグラフイー装置を使用
する場合に、必然的に連結の頻繁な切り換えを伴
なう。実際、先ず前置カラムをコンデイシヨニン
グし、ついでクロマトグラフイーすべき液体で処
理しなければならない。カラムをコンデイシヨニ
ングするのに必要な溶液と、担体への吸着により
微量成分が除去された廃液とをカラムから流出さ
せなければならない。従つて、下流端部で排出管
と連結できることが必要である。ついで実際の分
離処理（溶離）に関して、前置カラムをその下流
端部で分離カラムと連結しなければならない。コ
ンデイシヨニングを可能にするために、分離カラ
ムにも液体用送込管と上流で連結するための装置
を設ける。種々の目的、例えば多くの液体試料の
同時クロマトグラフイー処理、カラム溶離液の繰
返し予備濃縮またはより一層高度の純度を得るこ
とを目的とするクロマトグラフイー処理の繰返し
に対し、数個の前置カラムを随意に数個の分離カ
ラムに連結するのが更に一層好ましい。 従つて、また本発明は、簡単な方法で１個以上
の前置カラムを廃液用排出管または１個以上の分
離カラムに随意に連結することを可能にする連結
装置に関するものである。かかる目的のために、
(1)１個以上の前置カラムと、(2)１個以上の前置カ
ラムおよび液体用送込管を１個以上の分離カラム
および廃液用排出管に連結するため部材と、(3)所
要に応じて１個以上の分離カラムを備える液体ク
ロマトグラフイー系に用いる装置を開発した。か
かる前置カラムは前述のタイプのものでもよい。 また、液体クロマトグラフイー系に用いる装置
は前述の米国特許第4070284号明細書に開示され
ている。かかる明細書に示されている装置は、前
置カラムを分離カラムに連結するための若干の多
方弁（multi‐way valves）を備えている。然
し、これらの多方弁は数メガパスカルスケールよ
りも高い圧力に耐えられない。 本発明の特別な面として、上記装置に関して少
なくとも20MPaの耐圧性を有する連結部材を開
発した。本発明の連結部材は、相互に封止連結状
態にありお互いが回転可能である２個の同心円板
から成り、１個以上の前置カラムおよび液体用送
込管との封止連結用開口を該同心円板の一方に備
え、１個以上の分離カラムおよび廃液用排出管と
の封止連結用開口をもう一方の同心円板に備え、
２個の円板における上記開口を、一方の円板をも
う一方に対して回転させることにより相互に随意
に連通させることができる。 好ましくはステンレス鋼で造る連結部材の円板
は、例えばテフロンガスケツトにより封止状態で
相互に連結する。断面が円形であり且つ円板に設
けた円周溝に取り付けられるガスケツトを使用す
ることにより、円板を相互に回転させることがで
きる。この連結部材は約40MPaまでの圧力に耐
えることができる。また所望に応じて、円板にお
ける開口への連結は、好ましくはステンレス鋼お
よびテフロン封止で行なう。 前置カラム、分離カラム、送込管および排出管
を円板に設けた開口に連結させることができるよ
うにするために、例えばねじ連結または緊締結合
の形態による連結手段がある。他の適当なる連結
部材は中心孔を有するインサートにより形成さ
れ、かかるインサートはこれに連結される送込管
または排出管用カラムまたはニツプルと円板の一
方に設けた開口において封止状態で嵌合し、該イ
ンサートは、円板に設けた開口により形成された
シヨルダーと掛合するフランジをその外面に備え
る。インサートの中心孔はその外側で、例えば溶
接またはねじ連結によりインサートに連結される
カラムまたはニツプルと連通し、その内側で円板
における細くした孔と連通する。インサートにお
ける中心孔の径はカラムまたはニツプルの内系と
ほぼ等しいのが好ましい。同じ外径および外部形
状のインサートを有するカラムを使用することに
より、任意カラムを、連結部材の円板の一方に設
けた関連開口に迅速に随意に連結させることがで
きる。円板を互に手動でまたは自動的に容易に回
転できるようにするため、一方の円板を、例えば
この円板に連結した取手をスタンドで締付けるこ
とにより固定でき、一方、もう一方の円板に補助
装置を設けて所望回転を達成する。後者の円板の
手動操作に関しては、取手または取手に関する連
結装置を外側縁部に設けるのが好ましい。更に円
板は、ロツク装置、例えばアバツトメントピンま
たはプレート、ミルド溝におけるアバツトメント
ピン、あるいは円板における開口が相互に連結す
る場所を固定する固定用キヤツチまたはねじを備
える。 次に本発明を図面により説明する。 第１図に縦断面図として示す前置カラムは１個
の組立体から成り、ステンレス鋼で製造する。円
筒状中央部１は両端方向に円錐状に収束し、部分
２は下流端部５に向う部分４よりも一層急激に上
流端部３方向に収束する。上流端部３は、外部ね
じ山を有するニツプルを螺合できる内部ねじ山を
有する。クロマトグラフイーすべき液体用送込管
を前記ニツプルに連結させることができる。下流
端部は、例えば第６図に示す如く前置カラムを連
結部材に螺合することのできるねじ山を外側に有
して、且つガスケツト用マウントを形成する突設
周辺縁部または棟６を有する。 第２〜３図は、２個の部分、即ち夫々容器形状
部７０と５４および夫々カバー４８と５５から成
る本発明の前置カラムの断面図である。第２図に
示す前置カラムのカバーは送込管と連結できるニ
ツプル７１を有しており、液体を該ニツプルを通
りついで中央内腔７２を通つてカラム内部に到達
させることができる。カバーは容器形状部と螺合
できる外部ねじ山７３を有し、該容器形状部はそ
のマウント７６に嵌合するガスケツト７５に至る
まで内部ねじ山７４を有する。焼結金属５０のフ
イルターを取り付けたガスケツト７５を図面では
拡大して示す。下流端部における容器形状部７０
はガスケツト用マウントを形成する外部周辺棟７
７を有し、且つ例えば第７〜８図に示す如くカラ
ムを連結部材に螺合できるねじ山７８を有する。 第３図に示す２部分に分かれたカラムの夫々の
部分を、カバーの凹所７９と７９ａおよび容器形
状部のタツプ形状口８０と８０ａを通してボルト
により該部分の一方を他方の頂部に螺合させるこ
とができる。ガスケツト８１と８２は夫々カバー
と容器形状部に設けた周辺溝８３と８４に掛合
し、一方フイルターホールダ８５に存在する１個
または複数のフイルターはガスケツト間の１か所
または複数のか所で維持させる。カバーは容器形
状部の外側端部に近接する周辺縁部８６を有す
る。内部にねじ山を有する、送込管と連結するた
めのニツプル用連結口６０がカバー５５に存在す
る。カラムは内部が両端に向うにつれ上流方向は
75゜の角度で、下流方向は27゜の角度で狭くなる。
最終的に、下流端部におけるカラムの容器形状部
は外側に周辺棟８７とねじ山８８を有する。 第４図は、前置カラムと９６で連結させること
ができる液体クロマトグラフイー系に用いる装置
の連結部材の平面図である。第４図の夫々−
線および−線に沿つて切断しした同じ装置の
断面図に示す第５図および第６図に明らかに見ら
れるように、連結部材はやはりステンレス鋼の同
心円板７と８から成り、円板７は軸受けボス９の
まわりを回転できる。円板は、ボルトの如く構成
され円板７を介してねじ込まれる上記ボス９によ
り互いに緊締させる。ほぼ環状断面を有するテフ
ロンの環状ガスケツト（例えば１０と１１）は、
２個の円板間の一方に設けた溝に存在する。環状
ガスケツトは円板間に存在し、円板の孔の周囲に
設ける（後述）。前置カラム用連結口９は、カラ
ムを強化テフロンの封止ガスケツト１２に至るま
でかかる装置内に螺合させることができるように
外部ねじ山を有する。連結口９６はガスケツトの
もう一方の側において狭くなり、より一層小さな
径を有する内腔を形成し、円板状の焼結金属９０
のフイルターが連結口と内腔の間に存在する。前
置カラム用連結口を有する上記円板の縁部外側に
取手１３を備える。更にこの円板はコンデイシヨ
ニング液用送込管との連結に関与するニツプル１
４を有する。コンデイシヨニング液は、クロマト
グラフイー処理前に分離カラムをコンデイシヨニ
ングするのに使用する。連結部材はもう一方の円
板には取手１５を２個のボルトにより連結し、か
かる取手１５を円板から離間するその端部１６で
スタンドに取り付けることができる。分離カラム
との連結に関する、中心に孔を有するインサート
１８は円板のマウント１７に存在する。更に、こ
の後者の円板は廃液用排出管との連結に関するニ
ツプル１９を備える。更にまた、この円板はアバ
ツトメントプレートおよびピン２０，２１を備
え、この結果、円板の連結口を相互に連通させる
のに必要な円板相互間の回転距離を容易に決定す
ることができる。 第７〜８図に示す液体クロマトグラフイー系に
用いる装置はシヤフト２３のまわりを回転可能な
２個の同心ステンレス鋼円板から成る連結部材２
２を備え、かかるシヤフトは円板の開口に嵌込ま
れた軸受けを両端で有する。前述の第４〜６図の
例と同じテフロンガスケツトが存在する。上部円
板２４はボルト２５により中央シヤフト２３のフ
ランジ２６に連結させる。この上部円板は底部円
板に対して回転可能であり、従つてシヤフトもま
た回転する。上部円板に６個の開口を設け、（２
９，３０および３１で）前置カラムとあるいは３
２でインサート３３と螺合できるようにかかる開
口にねじ山を設ける。尚インサート３３は中心孔
を有し、ニツプルを備えあるいはニツプルと連結
させることができる。すべての開口は、縮小した
径の孔として内部に続く。また、開口３４を底部
円板に設け、この開口は、中心孔を有しニツプル
または分離カラムと連結させることができるイン
サート３５用マウントを形成する。円板における
このマウントは、第４〜６図に関して記載したも
のと同じ形状を有する。上部円板は、取手３６に
より底部円板に対して回転させることができる。
更に、底部円板２８は上部円板２４に対するロツ
ク装置を備え、かかる装置は上部円板の外側縁部
に設けた開口に掛合する爪６１を有する弾性アー
ム３７から成る。これにより上部円板を底部円板
に関する所定位置で固定させることができる。こ
の固定は、ノブ３８を有する爪をスプリングの作
用に対抗して上部円板の外側縁部の開口から引き
出すことにより解除することができる。 底部円板をその外側縁部でスタンド３９に螺合
する。尚このスタンドは中央シヤフト２３に平行
して延在し相対して位置する２本のロツド状エレ
メント４０から成る。連結部材から上方に若干離
れた所で２個の環状ステンレス鋼プレート４１，
４２を中央シヤフト２３に連結し、これらプレー
トのうち上方のプレート４１を連結バーまたはス
ポーク４３によりスタンドのロツド状エレメント
４０に連結させる。プレートは密封状態で一方を
他方に緊締させ、ここで環状テフロンガスケツト
を連結部の円板における場合のようにプレート間
に設ける。下方プレート４２をボルト４４により
軸受けシヤフト２３に固定し、これにより該下方
プレートは連結部材２３の上部円板２４と一緒に
回転する。両プレート４１，４２は、これらプレ
ートに設けた孔と連結するニツプル２７，２７ａ
を備える。下方プレート４２におけるニツプル
は、液体管により連結部材２２の上部円板２４に
おけるニツプルまたは前置カラムと連結させるこ
とができる。上方プレート４１におけるニツプル
は各種液体、例えばコンデイシヨニング用液、ク
ロマトグラフイーすべき液体、種々の溶離液を含
有する容器と連結させることができる。第７〜８
図に示す装置は自動クロマトグラフイー処理に極
めて適している。この理由は、コンデイシヨニン
グ、分離すべき微量成分を有する前置カラムの装
填および種々の溶離を行なう際に送込管をはずす
必要がないからである。任意所望液を、上部連結
円板の単純な回転により前置カラムまたは分離カ
ラムの一つに導入することができる。 第７〜８図に示す装置では、本発明の３個のス
テンレス鋼前置カラムを連結部材２２の上部円板
２４に螺合させて設ける。上記円板の開口２９に
螺合する前置カラム４５は第２図に示す如き型を
有する。円板２４の開口３０および３１に螺合す
るカラム４６および４７は第３図に示す如き型を
有する。カラム４５はねじ連結部および連結ニツ
プルを有するカバー４８を備える。担体材料はカ
ラム内の焼結金属の２個のフイルター５０と５１
の間に収納させる。カラムの上流端部側の円錐状
部分において、不活性重点剤５２がフイルター上
に存在する。カラムは、上部連結円板２４に設け
た開口２９の細長い孔６２にテフロンガスケツト
により封止状態で連結させる。カラム４６はボル
ト５６により相互に連結した２部分（５４と５
５）から成る。カラム４５におけるように、焼結
金属５７，５８のフイルターがカラム４６にも存
在し、この際上部連結円板２４との封止はテフロ
ンガスケツト５９により形成する。カラムは下流
端部で円板２４の開口６３と連通する。 上記装置は種々の改良が可能であることは勿論
である。例えば、連結部材の円板および環状プレ
ートに設けた多数の開口を随意に変えることがで
き、種々の連結、例えばインサートまたはねじ連
結に適するようにすることができる。また、当業
者に明らかな他の多くの改良例を本発明の範囲か
ら逸脱することなく行なうことが可能である。 本発明の前置カラムを使用する場合、先ず担体
材料、例えば撥水処理したシリカゲル、例えばコ
ラシル（Corasil）、ニユークレオシル
（Nucleosil）、ゾルバツクス（Zorbax）また
はリクロプレプ（Lichroprep）をカラム内の
焼結金属の２個のフイルター間に収納させる。不
活性充填剤、この場合ガラス玉をカラムの上流端
部側の円錐部内のフイルター上に設ける。この前
置カラムを第５〜６図または第７〜８図に示す連
結部材に連結する。第７〜８図に示す装置におい
て本発明の前置カラムを多数使用する。更に該装
置は、好ましくは同じタイプの担体材料で満たし
た１個以上の分離カラムを有する。前置カラムお
よび分離カラムをコンデイシヨニングする場合
は、コンデイシヨニング用液をカラムに通して洗
浄し、ついで廃液容器に捕集する。然る後前置カ
ラムは、クロマトグラフイーすべき物質、例えば
尿試料を排出管と連結したかかる前置カラムに流
し込むことにより該試料を充填する。充填後前置
カラムを分離カラムに連結し、然る後カラムを溶
離させる。この溶離中、所謂傾斜溶離法を用いる
のが好ましい。この方法を用いることは、溶離処
理中溶離液の組成を変化させることである。溶離
速度、即ち溶離液がカラムの中を圧送させる速度
は前置カラムおよび分離カラムの直径、クロマト
グラフイーすべき物質、担体材料並びに溶離液に
左右される。溶離は室温で行なうのが好ましく、
溶離中カラムおよび連結装置内の圧力は20〜
30MPa、あるいは40MPaまでも増大させること
ができる。微量成分の検出は種々の方法で行なう
ことができ、例えばUV−分光分析の如き分光学
的方法により行なうことができる。然し殆どの場
合、溶出液に極めて多くの発色性「不純物」が存
在するのでUV−分光分析を好首尾に用いること
はできない。従つて、放射能測定を用いるのが好
ましい。この場合、代謝物質試験において試験す
べき化合物、通常薬物に、例えば放射性ラベル付
き炭素または水素（¹⁴Cまたは³H）で放射性ラベ
ル付けをする。放射した放射能を測定することに
より、化合物自体とラベル付けしたフラグメント
から成り得る代謝物質の両者を検出することがで
きる。この検出は溶出流における「オン−ライ
ン」または、即ち捕集した溶出フラクシヨンにお
ける「オフ−ライン」で行なうことができる。前
者の方法は後者よりも迅速に行うことができる。
通常、後者の「オフ−ライン」検出法ではより一
層正確な結果を得ることができる。 尿に含まれるイソツクススプリン （Isoxsuprine）および代謝物質を検出し得る
ために、200mlの尿を上記クロマトグラフイー処
理に供した。イソツクススプリン、即ちｐ−ヒド
ロキイ−α−〔１−｛（１−メチル−２−フエノキ
シエチル）アミノ｝エチル〕ベンジルアルコール
は血管拡張活性を有する。この薬物または代謝物
質はクロマトグラフイーすべき試料の極微量で即
ち全体量で数マイクログラムで存在する。予備濃
縮に関し、容量27mlの第３図に示す如き型の本発
明のステンレス鋼カラムを使用した。前置カラム
用充填剤として、ニユークレオシル30C8、撥水
処理したシリカゲルを使用した。分離カラムは内
径９mm、長さ50cmを有し、ゾルバツクス7C8およ
び撥水処理したシリカゲルを充填した。イソツク
ススプリンに³Hでラベル付けをした。水とメタ
ノールの混合液で、メタノール容量を０から100
％まで増加させて傾斜溶離を行なつた。溶離速度
は１分当り約５mlとした。微量成分をオフ−ライ
ンで検出し、第９図に示すクロマトグラムを得
た。このクロマトグラムでは、１分当りのカウン
ト数で測定した放射能RAを時間に対してプロツ
トした。Ｊによりクロマトグラムに示されるピー
クはイソツクススプリンであり、その他ピークは
イソツクススプリンの代謝物質を示す。 比較のため、上記実験を本発明の前置カラムで
はなく、この目的に対して一般的であるまつすぐ
な前置カラムで繰返し行なつた。まつすぐな前置
カラムは内径が一定で９mm、長さ15cmを有する。
実際にはこれ以上長いカラムを使用できなかつ
た。この理由は、かかるカラムを使用した場合に
充填中にカラムに加わる圧力が大きくなり過ぎて
しまうからである。更に実験を、本発明の前置カ
ラムに対して示したものと同じ装置、同じタイプ
の物質、同じ反応条件で行なつた。得られたクロ
マトグラムを第１０図に示す。このクロマトグラ
ムから、所謂「ゴースト・イフエクト」がGEで
生じていることは明らかである。 また本発明の前置カラムを、第１１，１２，１
３および１４図に示すクロマトグラムから明らか
なように種々の他の分離問題を解決するのに使用
した。第４〜６図に示す如き単一連結装置はまた
は第７〜８図に示す如き６連式装置を用いた。 第１１〜１２図に示すクロマトグラムは、〔２
−｛４−（３−トリフルオロメチルフエニル）−１
−ピペラジニル｝エチル〕−尿素、反攻撃活性を
有する化合物およびこれらの代謝物質から成る試
料のカラムクロマトグラフイーにより得た。 第１１図に示すクロマトグラムは、ニユークレ
オシル30C8を充填した容量1.5mlの第２図に示す
如きステンレス鋼前置カラム、およびニユークレ
オシル7C8を充填した長さ500mm、内径９mmの分
離カラムを用いて得た結果を示す。供給試料は犬
の血しよう22mlとした。溶離法は、メタノール含
有量を０から100％まで増大させる水とメタノー
ルとの混合液での傾斜溶離法を用いた。化合物は
¹⁴Cでラベル付けして、この放射能RAをオフ−
ラインにおいて１分当りのカウント数で測定して
検出を行なつた。Ｔでのピークは活性化合物を、
その他のピークは代謝物質を示す。 第１２図に示すクロマトグラムは、ニユークレ
オシル7C8を充填した容量27mlの第３図に示す如
きステンレス鋼前置カラム、および同じくニユー
クレオシル7C8を充填した長さ500mm、内径９mm
のステンレス鋼分離カラムを用いて得た結果を示
す。供給試料は犬の尿620mlとした。溶離法は、
メタノール含量を０から100％まで増大させる水
とメタノールとの混合液での傾斜溶離法を用い
た。化合物は¹⁴Cでラベル付けし、オン−ライン
で検出を行なつた。Ｔでのピークは活性化合物
を、その他のピークは代謝物質を示す。メタノー
ル％による溶離の傾斜プロフイールをGPにより
示す。 第１３図に、0.5ppbのDESを添加した尿試料を
クロマトグラフイーにより得たクロマトグラムを
示す。DES、即ちジエチルスチルベストロール
はエストロゲン（oestrogenic）活性を有する物
質である。本発明のステンレス鋼前置カラムは容
量13mlを有し、これにリクロプレプRP2、撥水処
理したシリカゲルを充填した。分離カラムは、ニ
ユークレオシル7C8を充填した長さ250mm、内径
９mmのステンレス鋼カラムを用いた。供給試料は
尿50mlとした。溶離法は、メタノール含量を０か
ら100℃まで増大させる水とメタノールとの混合
液での溶離傾斜法を用いた。DESを³Hでラベル
付けした。検出はオフ−ラインで行ない、Ｄで
DESのピークを得た。 第１４図のクロマトグラムは、極微量のＮ−
（２，６−ジフルオロベンゾイル）−N′−（４−ト
リフルオロメチルフエニル）尿素およびこの代謝
物質を含有するラツトの尿試料のカラムクロマト
グラフイーにより得た。この尿素化合物は農業、
園芸および森林における殺虫剤として使用するこ
とができる。ニユークレオシル30C8を充填した
容量27mlの第３図に示す如きステンレス鋼前置カ
ラム、およびゾルバツクス7C8を充填した長さ
500mm、内径９mmのステンレス鋼性分離カラムを
使用した。供給試料は尿121mlとした。溶離法は、
メタノール含量を０から100％まで増大させる水
とメタノールとの混合液での傾斜溶離法を用い
た。化合物は¹⁴Cでラベル付けをした。オン−ラ
イン法で検出したところ、Ｐで活性化合物のピー
クを示し、その他は他謝物質のピークを示した。
メタノール％による溶離の傾斜プロフイールを
GPにより示す。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は夫々本発明の前置カラムの断面
図、第４図は液体クロマトグラフイー系に用いる
本発明の連結部材の平面図、第５〜６図は第４図
に示す装置を夫々−線および−線に沿つ
て切断した断面図、第７図は本発明の前置カラム
および連結部材を有する液体クロマトグラフイー
系に用いる装置の断面図、第８図は第７図に示す
装置の平面図、第９〜１４図はクロマトグラフイ
ーにより得た時間（分）と放射能（RA）との関
係を示すクロマトグラムである。 １……円筒状中央部、２，４……部分、３……
上流端部、５……下流端部、６……棟、７，８…
…同心円板、９……軸受けボス、１０，１１，１
２，５９……ガスケツト、１３，３６……取手、
１４，７１……ニツプル、１７……マウント、１
８，３３，３５……インサート、２０，２１……
ピン、２２……連結部材、２３……シヤフト、２
４……上部ボルト、２５，５６……ボルト、２６
……フランジ、２９，３０，３１……前置カラム
用開口、３２……インサート用開口、３４，６３
……開口、３７……弾性アーム、３８……ノブ、
３９……スタンド、４０……エレメント、４１，
４２……環状ステンレス鋼プレート、４３……ス
ポーク、４５，４６，４７……カラム、４８，５
５……カバー、５０，５１，５７，５８……焼結
金属フイルター、５２……不活性充填剤、５４，
７０……容器形状部、６０……連結口、６１……
爪、６２……細長い孔、７２……中央内腔、７３
……外部ネジ山、７４……内部ねじ山、７７……
外部周辺棟、７８，８８……ねじ山、７９，７９
ａ……凹所、８０，８０ａ……タツプ形状口、８
３，８４……周辺溝、８５……フイルターホール
ダ、８６……周辺縁部、８７……周辺棟、９６…
…前置カラム用連結口。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ クロマトグラフイーすべき物質を高圧で予備
   濃縮するための耐圧力材料の前置カラムであつ
   て、予備濃縮すべき液体用送込管と該前置カラム
   の上流端部３で、また分離カラムと該前置カラム
   の下流端部５で封止連結するための手段と、該前
   置カラムの内部の横断面に亘り濃縮すべき液体を
   分布させるために、その内部で該送込管方向に向
   かつて収束する上流部分２と、予備濃縮の目的に
   適した担体材料を収納するように適合された容器
   １，４とを有し、該容器は該前置カラム内におい
   てその周縁部が封止結合された２個のフイルター
   により境界が定められ、該フイルターの一方が該
   容器の上流端部であつて前置カラムの収束部分の
   下５０，８５に設けられ、もう一方が容器の下流
   端部に対応する担体材料の底部７７，８７に設け
   られている前置カラムにおいて、 容器１，４が第１円筒状中央部分１と第２部分
   ４とからなり、上記第２部分が第１部分と同軸の
   回転対称の立体であり、第１円筒状部分から前置
   カラムの下流端部５に向けて内部が狭くなつてい
   ることを特徴とする前置カラム。 ２ 容器の第２部分４が下流端部に向かつて円錐
   状に収束するかまたは漸次湾曲した特許請求の範
   囲第１項記載の前置カラム。 ３ 耐圧方式で相互に連結された２個以上のセグ
   メント７０と４８，５４と５５からなる特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の前置カラム。 ４ 約40MPaの耐圧性を有する特許請求の範囲
   第１〜３項のうちいずれか一項記載の前置カラ
   ム。