JPH0547191B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 以下の工程からなる生物組織へ生理活性物質
を、該物質の濃度を所定のパターンで変化させて
いくことによつて供給する方法： (a) 上記組織へ作用する既知の濃度および既知の
容量の生理活性物質含有液を上記組織へ供給す
ることで開始し； (b) 上記組織への作用から第１の既知の容量の生
理活性物質含有液を除去し、それにより上記組
織へ作用する第２の既知の濃度の上記液が残
り； (c) 上記組織へ作用する既知の容量の上記液へ、
異なつた既知の濃度を有する第２の既知の容量
の生理活性物質含有液を加え、それによつて該
組織に作用する第３の既知の濃度の生理活性物
質含有液を形成し； (d) 該組織に作用する生理活性物質の該第３の既
知の濃度を、該組織から除かれた生理活性物質
含有液の第１の既知の容量および該組織に加え
られた異なつた既知の濃度の生理活性物質含有
液の第２の既知の容量から決定し；および (e) 工程(a)ないし(d)を繰り返して時間内のどの時
点においても組織に作用する生理活性物質の濃
度が既知であるようにする。

２ 第２の既知の容量の生理活性物質含有液を第
１の既知の容量の関係として放出速度を選択して
加え、それにより、組織へ作用する生理活性物質
の濃度を実質的に直線的に変化させる特許請求の
範囲第１項の方法。

３ 生物組織が器官である特許請求の範囲第１項
の方法。

４ 生物組織が器官系である特許請求の範囲第１
項の方法。

５ 生物組織が細胞系である特許請求の範囲第１
項の方法。

６ 生理活性物質含有液がそれを通して供給でき
る入口および生理活性物質含有液をそれを通して
除去する出口をもつ培養チエンバー内に位置させ
ることによつて組織が分離される特許請求の範囲
第１項の方法。

７ 組織をその天然の栄養供給から分離する特許
請求の範囲第１項の方法。

８ 除去される生理活性物質含有液の第１の既知
の容量が、加えられる生理活性物質含有液の第２
の容量にほぼ等しい特許請求の範囲第１項の方
法。

９ 生理活性物質含有液が同時に除去および供給
される特許請求の範囲第８項の方法。

１０ 以下の工程からなる生物組織へ生理活性物
質を、該物質の濃度を所定のパターンで変化させ
ていくことによつて供給する方法： (a) 上記組織へ作用する既知の濃度および既知の
容量の生理活性物質含有液を上記組織へ供給す
ることで開始し； (b) 上記組織への作用から第１の既知の容量の生
理活性物質含有液を除去し、それにより上記組
織へ作用する第２の既知の濃度の上記液が残
り； (c) 上記組織へ作用する既知の容量の上記液へ、
異なつた既知の濃度を有する第２の既知の容量
の生理活性物質含有液を加え、それによつて該
組織に作用する第３の既知の濃度の生理活性物
質含有液を形成し； (d) 該組織に作用する生理活性物質の該第３の既
知の濃度を、該組織から除かれた生理活性物質
含有液の第１の既知の容量および該組織に加え
られた異なつた既知の濃度の生理活性物質含有
液の第２の既知の容量から決定し； (e) 工程(a)ないし(d)を繰り返して時間内のどの時
点においても組織に作用する生理活性物質の濃
度が既知であるようにし； (f) 組織へ作用する最初の容量の生理活性物質含
有液から除去された選択された第１の既知の容
量の生理活性物質含有液を分析し； (g) 生理活性物質の選択された濃度に関する組織
応答の相関を確立するために、選択され分析さ
れた生理活性物質含有液の第１の容量を、組織
に作用する生理活性物質の順に対応する第３の
既知の濃度に適合させる；および (h) 個々の応答と生理活性物質の対応する濃度と
を組み合わせて、期間中の生理活性物質の濃度
の変化に対する組織の反応を確立する相関を形
成させる。

１１ 以下の工程からなる生物組織へ生理活性物
質を、該物質の濃度を所定のパターンで変化させ
ていくことによつて供給する方法： (a) 上記組織へ作用する既知の濃度および既知の
容量の生理活性物質含有液を上記組織へ供給す
ることで開始し； (b) 上記組織への作用から第１の既知の容量の生
理活性物質含有液を除去し、それにより上記組
織へ作用する第２の既知の濃度の上記液が残
り； (c) 上記組織へ作用する既知の容量の上記液へ、
異なつた既知の濃度を有する第２の既知の容量
の生理活性物質含有液を加え、それによつて該
組織に作用する第３の既知の濃度の生理活性物
質含有液を形成し； (d) 該組織に作用する生理活性物質の該第３の既
知の濃度を、該組織から除かれた生理活性物質
含有液の第１の既知の容量および該組織に加え
られた異なつた既知の濃度の生理活性物質含有
液の第２の既知の容量から決定し；および (e) 工程(a)ないし(d)を繰り返して時間内のどの時
点においても組織に作用する生理活性物質の濃
度が既知であるようにし； (f) 組織へ作用する最初の容量の生理活性物質含
有液から除去された選択された第１の既知の容
量の生理活性物質含有液を分析し； (g) 生理活性物質の選択された濃度に対する組織
応答の相関を確立するために、選択され分析さ
れた生理活性物質含有液の第１の既知の容量
を、組織に作用する生理活性物質の順に対応す
る第３の既知の濃度に適合させ； (h) 個々の応答と生理活性物質の対応する濃度と
を組み合わせて、期間中の生理活性物質の濃度
の変化に対する組織の反応を確立する相関を形
成させ；および (i) 第２の組織からの所望の応答に良好に作用す
る濃度で工程(a)から(e)に記載されているように
して第２の組織へ生理活性物質含有液を供給す
る。

１２ 組織に多数の生理活性物質を供給するため
の工程(a)から(e)を実施し、その際各々すべての生
理活性物質の濃度が時間内のどの時点でも既知で
ある特許請求の範囲第１項の方法。

１３ 工程(a)から(e)を繰り返す時、第２の既知の
容量の生理活性物質含有液を異なつた供給源から
供給する特許請求の範囲第１項の方法。

１４ 生物組織へ作用する既知の濃度および既知
の容量の生理活性物質含有液を上記組織へ供給す
ることで開始し、該物質の濃度を所定のパターン
で変化させることによつて生理活性物質含有液を
生物組織へ供給するための器具であつて、以下の
手段からなる器具： (a) 上記組織への作用から第１の既知の容量の生
理活性物質含有液を除去し、それにより上記組
織へ作用する第２の既知の濃度の上記液を残す
手段； (b) 上記組織へ作用する既知の容量の上記液へ、
異なつた既知の濃度を有する第２の既知の容量
の生理活性物質含有液を加え、それによつて該
組織に作用する第３の既知の濃度の生理活性物
質含有液を形成するための手段； (c) 該組織に作用する生理活性物質の該第３の既
知の濃度を、該組織から除かれた生理活性物質
含有液の第１の既知の容量および該組織に加え
られた異なつた既知の濃度の生理活性物質含有
液の第２の既知の容量によつて決定する手段；
および (d) 上記(b)の添加手段、上記(a)の除去手段、上記
(c)の決定手段の操作を制御して、組織に作用す
る生理活性物質の濃度の変化が時間内のどの時
点においても、実質的に直線上であり且つわか
るようにする手段。

１５ 添加手段、除去手段、決定手段の操作を制
御する(d)の手段がプログラムされたデジタルコン
ピユータである特許請求の範囲第１４項の装置。

１６ 生物組織へ作用する既知の濃度および既知
の容量の生理活性物質含有液を上記組織へ供給す
ることで開始し、該物質の濃度を所定のパターン
で変化させることによつて生理活性物質含有液を
生物組織へ供給するための器具であつて、以下の
手段からなる器具： (a) 上記組織への作用から第１の既知の容量の生
理活性物質含有液を除去し、それにより上記組
織へ作用する第２の既知の濃度の上記液を残す
手段； (b) 上記組織へ作用する既知の容量の上記液へ、
異なつた既知の濃度を有する第２の既知の容量
の生理活性物質含有液を加え、それによつて該
組織に作用する第３の既知の濃度の生理活性物
質含有液を形成するための手段； (c) 該組織に作用する生理活性物質の該第３の既
知の濃度を、該組織から除かれた生理活性物質
含有液の第１の既知の容量および該組織に加え
られた異なつた既知の濃度の生理活性物質含有
液の第２の既知の容量によつて決定する手段； (d) 上記(b)の添加手段、上記(a)の除去手段、上記
(c)の決定手段の操作を制御して、組織に作用す
る生理活性物質の濃度の変化が時間内のどの時
点においても、実質的に直線上であり且つわか
るようにする手段； (e) 組織へ作用する最初の容量の生理活性物質含
有液から除去された選択された第１の既知の容
量の生理活性物質含有液を分析するための手
段； (f) 生理活性物質の選択された濃度に対する組織
応答の相関を確立するために、選択され分析さ
れた生理活性物質含有液の第１の既知の容量
を、組織に作用する生理活性物質の順に対応す
る第３の既知の濃度に適合させる手段；および (g) 個々の応答と生理活性物質の対応する濃度と
を組み合わせて、期間中の生理活性物質の濃度
の変化に対する組織の反応を確立する相関を形
成させる手段。

技術分野 本発明は、その自然の栄養供給から分離された
生理組織へ生理活性物質を与える方法に関する。
特に、時間内のどの時点においても組織へ作用す
る生理活性物質の濃度が概知であり、種々の強
さ、持続時間、速度の動力学、周期性、振動の度
数、ノツチ、プラトー、２項値および化学刺激の
期相関などのパラメーターが制御でき利用できる
ような生理活性物質の供給方法に関する。

背景技術 自然の栄養供給から分離された器官のごとき生
物組織の維持は非常に重要である。体から除去さ
れた器官に関して多くの研究がなされている。単
に特定の器官を体外で生存させる事の試みから
種々の生理活性物質に対する分離された器官の複
雑な応答の研究まで多くの種類の研究がある。培
養培地は器官の老廃物および自然の分泌物により
非常に速かに汚染されるので、この型の系は器官
を生物的に生きている状態に維持する能力により
限定される。

静的な系の不完全さは、培養培地および器官を
保つているチエンバーが補充され、かなり長い間
生物的生命を維持できるような動的な系の発達を
導く事となつた。これらの系は通常潅流、ペリフ
ユージヨンまたはスーパーフユージヨン系と言わ
れており、体外での器官および他の組織の研究に
使用できる時間を顕著に増加させた。

ペリフユージヨン系は、器官を栄養を含む培養
培地で周囲を囲み器官が栄養を吸収する系であ
る。潅流系では器官の心血管系を通して器官に栄
養を供給する。スーパーフユージヨン系は潅流お
よびペリフユーズ系両方の系で栄養を器官に与え
る系である。

典型的には動的系にはチエンバーがあり、その
中へ器官または他の組織を置く。チエンバーには
栄養含有培養培地を提供する入口およびチエンバ
ー中の培養培地の量を一定に保つのに良好な速度
で培養培地を除去する出口がある。動的系はいく
つかの利点を持つている。第１に、培地を連続的
に交代しそれにより分泌物および老廃物の蓄積の
影響を最小にしているので静的系の条件に比べ動
的系の条件は体内の条件とよりぴつたりと類似し
ている。第２に、チエンバーから器官を除去する
事なしに異つた試薬と接触させる事ができる。第
３に、栄養および他の生理活性物質の影響をチエ
ンバーの出口からの試料を集め分析する事により
研究できる。

しかしながら、先行技術の潅流、ペリフユージ
ヨンおよびスーパーフユージヨン系もいくつかの
限界がある。第１に、生理活性物質の静的濃度の
みを器官に供給し、それにより期間中どの時点で
もその濃度が既知となる。生理活性物質を“パル
ス”により与え濃度を動的に変化させると、培養
チエンバー中の器官に作用する生理活性物質の経
時的濃度が未知となる。その結果動的系を用いた
種々の濃度の生理活性物質の器官への応答を測定
する研究は、しばしば意味がなくなる。

第２に、器官に対しては静的またはパルス状濃
度の栄養または他の生理活性物質のだけしか存在
しえないのでしばしば過剰量または過少量とな
る。器官を生物的に生きている状態に維持しよう
とすると、時間により器官の栄養要求が変化する
ので適当な濃度の器官への供給が、器官の生物的
生命の延長または動的状態での生理活性物質への
器官の応答を分析しようと試みる場合は特に重要
である。

発明の開示 本発明は生物組織へ生理活性物質を制御された
方法で供給する方法である。生理活性物質の制御
は期間中どの時点においても組織に作用する生理
活生物質の濃度が既知であるように行い、使用者
にイン−ビボ条件または他の条件にまさろうと努
める事を可能にする。

本方法は組織に作用する既知の濃度の生理活性
物質を含む既知の容量の養育培地で出発する。第
１の既知容量の養育培地を組織から除き、組織へ
作用する第２の濃度の第２の容量の該培地を残
し；組織へ作用している該第２の容量の養育培地
へ、異なつた既知の濃度の生理活性物質を含む第
２の既知容量の養育培地を加え、それにより組織
へ作用する第３の容量の養育培地を形成する。上
述のように、添加された第２の既知容量の養育培
地は異なつた濃度を持ち、組織へ作用している前
記第２の容量の養育培地中に拡散し、その濃度を
変化させる。組織へ作用する濃度は、前の容量お
よびその濃度が分かつているので計算できる。前
記工程を組織へ作用する化学刺激の濃度が期間中
のすべての時点で既知となるように繰り返す。

本発明の方法は時間に関して、組織へ作用する
生理活性物質の濃度の変化を制御する。生理活性
物質の濃度の増加または減少を望む時は、加える
生理活性物質の濃度を増加または減少させる。本
方法は時間に関しての生理活性物質のふらつきを
正確に制御する事を可能にし、それにより、強
さ、持続時間、速度の動力学周期性、振動の度数
などをノツチ、プラトー、二項値および期相関な
どと同様に研究できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は先行技術の方法を用いる生理活性物質
または薬物の静的量の受渡しを図示したグラフで
あり； 第２図は生理活性物質または薬物の濃度を段階
的方法で変化させた先行技術の過程を用いる生理
活性物質または薬物の受渡しを図示したグラフで
あり； 第３図は生物組織へ受渡されるべき生理活性物
質または薬物の濃度の典型的に望まれる変化を図
示したグラフであり； 第４図はペリフユージヨン、潅流およびスーパ
ーフユージヨンなどの先行技術を用い、生理活性
物質または薬剤の濃度が不明な期間を図示したグ
ラフであり； 第５図は同時に２つの生理活性物質または薬剤
の濃度を制御する本発明の能力を図示したグラフ
であり； 第６図は本発明の方法を図示した図式であり； 第７図は本発明の方法の構成図であり； 第７Ａ図は本発明の他の具体例の構成図であ
り； 第８図は本発明の方法を制御する適したコンピ
ユーター制御系の図式であり； 第９図は培養チエンバー中の薬剤濃度を予測し
実施例で得られたデータポイント間の相関を図示
したグラフであり； 第１０図は多くの可能なＲ／Ｖ比を図示したグ
ラフであり； 第１１Ａおよび１１Ｂは本明細書に記載されて
いる実施例で使用した器具の構成図であり； 第１２図は本明細書に記載されている実施例の
実験結果を示した一連のグラフであり； 第１３図は本明細書に記載されている実施例で
使用した時間に関する濃度の希望の変化を図示し
たグラフであり； 第１４−１６図は本明細書に記載されている実
施例において培養卵巣のエストロジエン分泌を図
示したグラフである。

発明を実施するための最良の形態 本発明の方法は自然の栄養供給から分離された
生物的に生きている組織に対し、イン−ビボ条件
または他の条件と劣らないようにしようとするも
のである。先行技術においては自然の栄養供給か
ら分離された組織には第１図に実線で図示したよ
うに栄養またはホルモンの如き生理活性物質また
は薬剤の静的量を一定に投与するか、または組織
を増加または減少させた生理活性物質濃度の液へ
移し、第２図の実線で図示した如く、組織にとつ
て時間に関して濃度の段階型プロツトができる。
望ましいパターンは各々の図において点線で示し
てある。

静的系または一定量の過程においては（第１図
に図示）組織は時間が進行するにつれ、過少量ま
たは過剰量の特定の生理活性物質または薬剤を受
けそれは多くの生理活性物質濃度が時間に関して
動的であるイン−ビボの環境における刺激の自然
な供給とかなり異なつた様式となる。栄養の如き
物質の一定濃度での定常的供給は、代表的には移
植に使用する為器官の生存を保つような状況の際
使用される。定常的量ではある程度の期間器官を
生きたまゝ保てるが、その期間は短く、器官はす
ばやく移植しなければならない。静的な系は、イ
ン−ビボで栄養または薬剤が供給されている最適
の方法と同様な方法で器官へ渡す栄養量が制御さ
れない。

濃度を増加したりまたは減少させたりする他の
先行技術の方法は第２図に図示してある。この方
法における組織はより以上またはより以下の物質
濃度を含む養育培地に物理的に移される。組織が
暴露される物質濃度はその結果段階型様式として
グラフに表わされる。第２図に図式で図示された
この方法は前記の静的な系よりイン−ビボ条件に
より正確に似ているが、過少量および過剰量が短
い時間々隔で起こる。さらに、器官を、ある濃度
の培地から他の濃度の培地へ移す事は一般的には
器官にとつて有害である。

イン−ビボ条件に劣らないように組織へ供給さ
れる刺激量を変化させようとした、ペリフユージ
ヨン潅流、スーパーフユージヨンの如き他の以前
の試みも失敗した。しばしば器官に供給される物
質量は一連の段階ですばやく変化し、または数種
の物質は同調しないで変化する。例えば、第３図
に図示した如く、薬剤量を２段階で減少させ、第
３段階で増加させ、再び第４段階で減少させる事
が器官の要求に応答して望まれる。典型的には物
質の初期濃度で培養チエンバー中に位置している
器官に、既知濃度の物質を既知量培養チエンバー
に注入して、培養チエンバー内で新しく、異つた
濃度のものを与えると放置により培養チエンバー
内で以前の濃度の中へ拡散し、平衝に達し、新し
い濃度となる。器官に作用している物質の初期濃
度および容量が既知であり、注入した物質の濃度
および容量が既知であるので、この時点で器官に
作用する新しい濃度がわかる。しかしながら、系
は流れ去る系であるので、組織に作用する濃度は
時間とともに変化する。物質注入後の器官に作用
する物質の濃度は未知となる結果に終る。この事
は第４図に図式的に図示してあるが、第１および
第２のパルスが図示されているが、パルス間の濃
度は未知である。

本発明の方法はイン−ビボの状態または他の期
待されるどのような条件にも匹敵でき、理論的に
は第５図のグラフに図示した如く、先行技術のど
れもが全くかなわないものである。本発明の方法
を用いると、生理活性物質量は制御された方法で
変化可能であり、その際組織に作用する濃度の変
化は実質的に直線的である。器官に用いる生理活
性物質濃度は期間内どの時点においても既知であ
り、期間内どの時点においても制御可能であり、
第５図の実線および点線で示した如く、多数の物
質が同時にこの方法で制御できる。使用できる物
質の数は養育培地への溶解性に依存する。

本発明の方法による１つの重要な利点は実験に
“無傷の生体”（生きている動物）の使用を避ける
事ができる点である。その代わり、組織または器
官はイン−ビトロで望ましいまたはイン−ビボに
匹敵する条件下保たれる。ホルモン、放出因子、
神経伝達物質、神経ペプチド調整物質、パラクリ
ン、“サイベルニン”、成長因子、薬物の如き物質
の効果は、グルコース、トリプトフアン、乳酸お
よびグリセロールおよび他の物質と同様に、これ
らの物質の既知の変動をシミユレートし、それら
を分離した器官、組織または細胞株に与える事に
より決定される。発明の方法は批判が年々増して
いる生きている動物の試験に代わる方法を提供
し、不必要な痛みおよび動物の苦しみを除き、実
験のコストも減じる。本方法はイン−ビボ条件に
匹敵し、培養における組織は無傷の生体中にある
如く応答する。

例えば、最近消費者製品安全委員会を含む連邦
機関は化粧品の試験のためドレイズ（Draize）
試験の使用を要求した。推定500000のウサギが毎
年この試験のため化粧品会社で利用され、この試
験は生きているウサギの目に化学物質をのせ、試
薬が炎症を起こさないのみでなく動物に痛みを与
えない事もしらべるものである。

ドレイズ（Draize）試験は炎症性応答の機構
を含んでいる。本質的に、哺乳類生体中のすべて
の組織は刺激物に応答して炎症反応を起こす能力
がある。本発明の方法は選択された組織（例え
ば、皮膚結合組織、角膜細胞）をイン−ビトロで
維持でき、時間に関して前もつて決定されている
量の刺激物を供給しその間普通のイン−ビボの動
力学に匹敵する。炎症反応を示すいくつかの機構
が知られており、容易に検定される。イン−ビト
ロで既知の刺激物から炎症性応答を誘起するのに
必要な最適の条件を決定した後、潜在的な刺激物
の使用者適用をシミユレートするのに本方法を使
用できる。本方法で培養した組織の応答をモニタ
ーする事により、動物に痛みや苦しみを与える事
なく非常に正確で費用のかからない試験を行え
る。

本発明の方法はまた薬物試験に応用できる。生
きている動物に“50％致死”量（LD−50）の薬
物を注入するかわりに、動物の循環系中のすべて
の時間の薬物の濃度を決定し、かわりにイン−ビ
ボに匹敵する条件下の分離組織にイン−ビトロで
与える。この方法で、より生理的に有効な方法で
の量および時間の投与系列を決定する事により、
最も適しかつ便利な方法での薬物投与が求められ
る。副作用はより容易に決定および最小にでき発
ガン効果もわかりやすい。

製薬工業は医師が生体機構を左右するのに使用
する薬物の処方または放出系を提供する。全身性
療法は薬物のパルス（例えば食事時）または化学
物質の一定の血清水準を得ようとする試みの両方
から成る。両方の場合の見解は“治療のウインド
ウ”、すなわちそれ以下の時は薬物は少しまたは
まつたく効果がなく、それ以上の時は毒性がある
という血清濃度または体内総量の範囲である。こ
の型の見解は何が最適のパターン化された物質濃
度であるべきについての単なる根本的技術的近似
であることを証明する。なぜなら変化する濃度を
波に変えて情報を運ぶからである。これらの波
は、細胞がそれらを処理してそれらの行動を決定
する信号である。治療のウインドウの見解は動的
でなく、それ故信号でもない。本方法を利用する
と、特定の量の薬物の量および投与予定のみでな
く放出の速度もまた決定できるような方法を医科
学者に提供できる。本発明に従うイン−ビトロ試
験により副作用をより容易に決定でき薬物が直接
に原因となつているのか否かを確認 別の応用としては移植器官の保存がある。典型
的には、一旦その供与者から除去されたらそのよ
うな器官は非常に限られた期間しか生存できな
い。静的投薬量の系を用いると器官の要求は前に
議論したように時間に関して変わるので、器官の
生物的寿命を長くするためには過剰量または過少
量の栄養が要求される。イン−ビボ条件をまねた
栄養を供給する事により器官を生物学的に生きて
いる状態に保つのに必要な最適の栄養量を決定す
るため、本発明の方法を使用し、流出物の生物的
応答を検定する。各々および期間中のすべての時
点で器官に作用する栄養量は既知であるので、こ
れらの栄養量を検定結果と合わせる事ができ、目
的の時間に目的の量を投与する前もつて決定され
たプログラムを決定する。前もつて決定された投
与の予定を決定したら、器官に目的の時間に目的
の濃度を供給するために本発明の方法を使用すれ
ば、イン−ビボでと同様に一連の生理活性物質に
対し器官は応答する。これはいままで決して達成
されなかつた。

本方法を使用し、ラツト卵巣を維持でき、イン
−ビトロでシミユレートした４日周期の間生理学
的活性を残している事が示される、それは４日周
期の終りに排卵するラツトのイン−ビボ条件を模
倣した一連の化学刺激に応答する。さらに、卵巣
は成長し、イン−ビボの卵巣と非常に類似した物
質を分泌する。この分野に精通する者はこの事は
注目すべき成果である事を認めるだろう。この方
法において更に長時間卵巣が応答を続けないとい
う指摘はない。

また別の応用には薬物またはその類似物の静脈
内投与がある。患者に与える薬物または類似物の
用量はすべての時間制御可能である。その結果、
薬物の予定された投与が決定されたら、薬物は目
的の時間に目的の量だけ与えられる。

すべての生物的現象は生理化学的であることが
知られているので、適当な動力学的記述が可能で
あろう。本方法を利用して、該現象の動力学的特
性を研究し、どのように細胞活性の制御をしてい
るかを見い出す事が可能である。結局目標は治療
の目的で細胞の応答を制御する事である。この事
が達成されたら、ガン、糖尿病、生まれつきの欠
陥、老化合併症、肥満およびホルモンの不均衝と
いう名前の少なからぬ病気などの治療法の発見に
非常に貴重な情報が得られる。

本発明の方法は第６図にダイアグラムとして図
示してある。典型的には、自然の環境および栄養
供給から摘出された組織を第７図に図示した構成
図系に置く。第８図に図示した系には、ガス入口
２２および圧力抜き口２４を持つ保持フラスコ２
０がある。ポンプ２６は生理活性物質または薬物
を培養チエンバー２８に送り込み、チエンバー内
に組織３０が位置する。最初の既知の濃度の生理
活性物質（薬物または栄養）の既知量を培養チエ
ンバー２８内の組織３０に供給する。採集系３２
は分析のため潅流液を採集する。

あるいは、組織は体内に残つているがその自然
栄養供給から切断されている場合でもよい。栄養
液の如き生理活性物質を潅流系に類似した該組織
の無傷のままの自然の心血管系３４を通し第７ａ
図に図示した如く組織に供給する。ここで器官の
動脈および静脈系は無傷のまま維持され、培地は
動脈を通して器官に入れ、静脈を通して出てく
る。生きている器官の血管を、組織の生活能力を
維持するために使用される人工液の導管として役
立てるわけである。

組織に作用する既知量の生理活性物質含有液を
第１の既知容量から除いて第２の既知容量とす
る。その結果、残存する容量およびその生理活性
物質濃度は既知となる。同時に、既知量の既知の
しかし異つた濃度の生理活性物質を組織に作用し
ている量に加えて第３の既知容量とする。その結
果、組織に作用する最終容量は最終濃度とともに
決定できる。

前記工程をすぐに繰り返し、もし連続的な条件
で行えば、培養チエンバーペリフユージヨン系ま
たは潅流系の両方へ適用できる連続的フロー系と
して定義される。

培養チエンバー内の物質の濃度を変える為、良
好なのは多数の保持フラスコを用い、各々には培
養チエンバー内の物質の出発濃度と異つた濃度の
物質を含んでいる。例えば、もし保持フラスコ中
の物質濃度が培養チエンバー内の濃度より高けれ
ば、培養チエンバー内の濃度は特定の保持フラス
コから供給される物質が培養チエンバー内の物質
とおき代わるので時間とともに増加する。

既知の量既知速度で培養チエンバーに運搬され
る物質濃度の既知の供給に応答する培養チエンバ
ー内の物質濃度の変化は、デジタルコンピユータ
ーを結合した系の使用により容易に決定される。

本方法においてはある速度依存の容量が既知の
時間間隔で培養チエンバーから除去される。同時
に、培養チエンバーの頂上から他の速度依存の量
の滴下がある。結局このしずくは培養チエンバー
にはいり、培養チエンバー内の物質と平衝とな
る。

シミユレーシヨン系列を始めるため、下記のパ
ラメーターを定義する： 培養チエンバー容積−ml 培養チエンバーの出発濃度（Ci）−ユニツト／
ml 保持フラスコ中の供給薬物出発濃度（Cs）−ユ
ニツト／ml 液体運搬速度(R)−ml／hr 積分間隔(T)−秒 これらの定義したパラメーターとともに、下記
のループをデジタルコンピユーターにプログラム
し過程をシミユレートする。下記の仕事を各々の
生理活性物質の各々のループの間に実行する： １ 培養チエンバー内の総ユニツト数（U_T）を
決定する（U_T＝Ciユニツト／ml×Ｖml）。

２ 培養チエンバーから容量（V_R）を除去する。
V_RはＲおよびＴの関数である。

（V_R＝Ｒml／時間×Ｔ秒／3600hr／秒） ３ 培養チエンバーの新しい容量を決定する （Ｖ＝Ｖ−V_R） ４ V_Rを決定する事による培養チエンバーから
除去されたユニツトの量（U_R） U_RはCiおよびV_Rの関数 （U_R＝（Ciユニツト／ml）（V_Rml）） ５ 培養チエンバー中の新しいU_Tの決定 （U_T＝U_T−U_R） ６ 保持フラスコから培養チエンバーへ加えた量
（V_A）。もし培養チエンバーに空気もれがない
ならV_AはV_Rと等しくなる（V_A＝V_R） ７ 培養チエンバーの新しい容積の決定 （Ｖ＝Ｖ＋V_A） ８ V_Aを決定する事による培養チエンバに加え
られたユニツト数 （V_A＝（Ciユニツト／ml）（V_Aml）） ９ 培養チエンバー中の新しいU_Tの決定 （U_T＝U_T＋U_A） 10 新しいCiの決定 （Ci＝Ｕユニツト／Ｖml） 培養チエンバー容量が一定に保たれている時、
どんな拡散できる物質の濃度も数学的に決定でき
る（式(1)）。この方程式は本方法のコンピユータ
ー補助分析から誘導される。

（Ｃ(t)＝C_S＋（Ci−C_S）ｅ−RT／Ｖ） (1) 式中、 Ｃ(t)＝時間Ｔにおける培養チエンバーの濃度 C_S＝保持フラスコ中の生理活性物質の濃度 （Ｔ＝∞における最終培養チエンバー濃度） Ci＝初期培養チエンバー濃度（ｔ＝０） Ｒ＝保持フラスコから培養チエンバーへの物質
送り出し供給速度（ml／hr） Ｖ＝培養チエンバー内の培地の容量（ml） Ｔ＝時間（時間） より高いまたはより低い濃度の同じ薬物を一定
の速度で培養チエンバーに送り出した時培養チエ
ンバー中の物質の濃度を式(1)が正確に予測するか
どうかを試験するため以下の実験を実施した。色
素、メチルオレンジ（MO）、をこれらの実験の
供給物質として選択した。その理由は：(1)培養チ
エンバー中の色素の濃度は分光々度計を利用し、
460ナノメーターの極大吸収における透過パーセ
ントを測定する事により容易に検出でき、および
(2)検定終了後、培養チエンバー液体の試料は培養
チエンバーに戻す事ができる。この事は式(1)のど
んなパラメーター（即ち培養チエンバー容積およ
びCi）も変える事なく、すべての時間連続的にサ
ンプリングできるので重要な事である。

より高い濃度の同じ薬剤を保持フラスコから一
定の速度で送り出した時培養チエンバー濃度の変
化を予想する式(1)の能力を試験するため、100ml
の標準溶液を保持フラスコ中に入れる。このMO
溶液は、10％透過の値になるように調整されてお
り、100％濃度溶液と考える。20mlの蒸留水（100
％透過）を培養チエンバーに入れ、０％濃度溶液
と考える。10および100パーセント透過度の値は
既知のMO濃度およびパーセント透過度と比べて
0.99995の相関係数で標準曲線の直線部分にのる。
100％溶液を18.5ml／hrの速度で培養チエンバー
に送り出す。２時間の期間15分間隔で、ポンプを
切り、培養チエンバーから２mlの試料を取り、分
光々度計で検定する。パーセント透過度は光学的
濃度に変換し、標準曲線から濃度を記録する。試
料は培養チエンバーに再び戻し、ポンプを再スタ
ートする。

より低い濃度の供給薬物を保持フラスコから送
り出した時培養チエンバー濃度の変化を式(1)が予
想する能力があるかどうか試験するため、100ml
の蒸留水（０％濃度）を保持フラスコに入れる。
20mlのMOの100％濃度溶液を培養チエンバーに
入れる。０％濃度溶液を培養チエンバーにポンプ
で押し出し前記の如く、メチルオレンジの濃度を
決定する。これらの実験の結果は第９図に示して
ある。それは本方法を表示する表現として式(1)が
使用できる事を示している。

培養チエンバー中の濃度変化を正確に予測でき
る能力とともに、培養チエンバー中で時間の関数
として拡散できる物質濃度がプロツトできるよう
なデータに匹敵する可能性がある。培養チエンバ
ーの物質の初期濃度が既知で、培養チエンバー中
の目的の最終濃度の値（C_S.t）が既知の時間々隔
の間また既知である。保持フラスコ中に入れられ
る物質の濃度は式(1)から誘導される式(6)を利用し
て決定される。

C_S.t＝Ｃ(t)であるので代入して 因数分解し： 両辺から を引き： 因数分解し： C_Sについて解くと： イン−ビボ条件により正確に匹敵するため、培
養チエンバー中の組織に作用する望ましい送り出
し速度(R)および望ましい容量(V)を決定しなければ
ならない。他の表現で行うと、もし、培養チエン
バー内の物質濃度を初期濃度（Ci）から異つた濃
度（Ｃ(t)）に変化させる時は時間に対して直線性
を示す事が望ましく、CiからＣ(t)への変化はＲお
よびＶの関数である。図１０にグラフとして示し
たように、Ｒ／Ｖ比は最大パーセント変化に影響
し、既知の時間々隔すべてで起つている。既知の
時間々隔の間に可能な最大パーセント変化は直接
的にＲ／Ｖ比で変化している。しかしながら、初
期点（Ci）および最終点（Ｃ(t)）間の線の直線性
は既知の時間々隔の間Ｒ／Ｖ比と逆に変化してい
る。

もし、培養チエンバー中で大きな濃度の直線的
増加を、与えられた時間々隔で望むなら、Ciから
Ｃ(t)への直線の傾きが大きくなくてはならない。
培養チエンバー中の濃度の増加の直線性はＲ／Ｖ
比の逆関数であり、大きな増加はＣ(t)点に与えら
れた時間々隔で直線的になるかどうかは問題があ
る。供給する物質の濃度を増加させる事で濃度変
化の直線性が維持され、従つてＲ／Ｖ比を変化さ
せなくてもよくなる。

保持フラスコ中の物質の最小濃度はゼロである
ので、培養チエンバー中の濃度を大きく減少させ
たい時は前記の場合と異る。それ故、最小Ｒ／Ｖ
比（最大直線性）が決定できる。このＲ／Ｖ比を
第１０図と比較する。計算したＲ／Ｖ比が問題の
データポイント間（CiおよびＣ(t)）の直線性の望
ましい範囲に匹敵するか決定する。

CiおよびＣ(t)間のパーセント濃度変化を達成す
るのに最小Ｒ／Ｖ比が必要とされるかを決定する
為、供給する物質濃度（C_S）をゼロとして既知の
望ましい時間々隔の間濃度減少の負勾配を分析し
た。CiおよびＣ(t)間の時間々隔ｔにおける変化量
（△ｃ）を式(7)により決定した： △ｃ＝Ci−Ｃ(t)／Ci (7) もしＣ(t)がゼロであれば100％の変化が起こる
（△ｃ＝１）。従つてＣ(t)の濃度は100％変化（△
ｃ＝１）および実際の変化の差であり、式(8)で表
現される： Ｃ(t)＝１−△ｃ (8) 100％変化を起こすためには供給物質濃度（C_S）
がゼロでなければならない。もし、初期濃度
（Ci）が１と仮定すると式(8)は式(3)に代入でき、
（その決定は次に議論する）C_S＝０およびCi＝１
であれば最小Ｒ／Ｖ比から誘導される表現は： 式(2)を(3)に代入して式(4)を得る： 簡単にして： 簡単にして： ln（１−△ｃ）＝−RV／Ｖ (12) Ｒ／Ｖについて解くと： Ｒ／Ｖ＝−１／Ｔln（１−△ｃ）(13) (7)式を(13)式に代入して Ｒ／Ｖ＝−１／Ｔln（１−Ci−Ｃ(t)／Ci (14) 簡単にして Ｒ／Ｖ＝−１／Ｔln（Ｃ(t)／Ci (15) 式(15)は培養チエンバー内、与えられた時間々隔
で目的の濃度に達するのに必要な最小Ｒ／Ｖ比の
表現型を提供する。もし、計算したＲ／Ｖ比によ
る直線性が与えられたデータの群に匹敵するほど
十分でなければ、濃度の変化は少くとも２つの段
階にわけられる。初期濃度Ciから最終濃度Ｃ(t)ま
でｔの時間々隔で直線的に変化するようなデータ
の群に匹敵しようと望む事を仮定すれば、第１段
階は２つの間隔へこの変化を分裂させる。この事
はCiおよびＣ(t)の間の中間点に新しい点Ａを設定
する事により達成される（即ち、ｔ＝1/2ｔに）。
それ故第２に、保持フラスコ中の新しいC_Sおよび
新しい最小Ｒ／Ｖ比はCiを初期点とし、変化点Ａ
を最終点のための新しいＣ(t)として用いて計算で
きる。CiおよびＡ間に必要なパーセント変化はCi
および元来のＣ(t)間より小さいので、最小Ｒ／Ｖ
はより小さくなり、直線性は増加する。この過程
は十分な直線性が達成されるまで繰り返す事がで
きる。このようにして、本発明の方法はイン−ビ
ボ条件および他の条件に匹敵し、各々の期間中の
どの時点においても組織に作用する濃度を知る方
法を提供する。

実際的には、各々供給物質の異つた濃度（C_S）
のものを含む多数の保持フラスコを用い、良好な
方法を使用して供給物質濃度を変化させる。異つ
た濃度の供給薬物が必要な時は、１つの保持フラ
スコを他のものと交換する。この分野に精通する
者は、必要なフラスコの数およびフラスコ中の供
給薬物の濃度間の相違は本過程の特定の応用の関
数である事を理解されたい。

ぜん動性ポンプは保持フラスコから培養チエン
バーに供給物質を運ぶのに良好な器具である。運
搬の速度は適当な速度可変式のモーターで制御
し、制御体はポンプを運転する。

培養チエンバーから既知の量を取り出し、物質
に対する組織の応答を決定するため検定する。さ
らに、培養チエンバーはプローブを受け入れるよ
うに設計されており、それにPH、酸素消費、温
度、選択的イオン、膜電位および興味のある他の
変動をモニターするため適した器械に接続する。

時間の関数として既知の組織の応答および時間
の関数として既知の組織に作用する物質の濃度か
ら、既知の数学的方法で原因と効果として相関を
確立する。直ちに前記の過程を繰り返し、“対照”
見本に対して実施し、特定の組織に対する適当な
薬物濃度および投与を決定する。

この分野に精通するものには明らかなように、
本方法は同じ保持フラスコ中に一緒に物質を混合
する事により、培養チエンバーへ、同時に一つ以
上の生理活性物質を送り出す事ができる。多数の
物質を利用する場合においては、最小Ｒ／Ｖ比は
各々の時間々隔の最大の勾配から決定されなけれ
ばならない。この結果はその間隔におけるすべて
の変化と同じであろう。以前は不可能であつた複
雑な実験も本発明を使用し、既知のイン−ビボお
よび他の条件に匹敵するイン−ビトロ条件下で実
施できる。イン−ビトロ条件は思うまゝに調整で
き、高価な生きている動物の実験なしに応答を観
察できる。さらに加え、特定の組織に対する実験
への体の応答からの不必要な妨害が除けるので、
統計的な信頼性を達成するのに必要な実験の数を
減じる事ができる。

一度、生理活性物質および組織間の相関が決定
されたら、続いての組織に対し最適の方法で生理
活性物質を与えるのに本方法を使用する。例え
ば、移植片が栄養を要求するのにあわせた速度お
よび濃度で本方法を用い栄養を供給し、器官移植
組織をより長く生物学的に生きた状態に保てる。

本発明の他の重要な利点は、特に適当なインタ
ーフエース回路と一緒のプラグラムされたデジタ
ルコンピユーターの如き、電気的手段で制御する
のに非常に適している（第８図に図示したよう
に）。より特別には、投与の際の放出速度、およ
び組織へ供給する生理活性物質の濃度は適当なマ
イクロプロセツサーを基本にした制御系で制御可
能である。一度時間に関して目的の濃度変化でプ
ログラムされたら、マイクロプロセツサーはぜん
動性ポンプなどの本方法の器具を動かす。もし異
つた濃度の生理活性物質を保持するのに多数のフ
ラスコを使用したら、フラスコからフラスコへの
転換はマイクロプロセツサーにより制御される。

本発明の方法のより十分な説明のため、実施例
を以下に説明する。実施例は特に詳細に説明され
るが、どの点においても本発明の方法の範囲を制
限すると解釈してはならない。

実施例 序 論 本実験は波状にホルモンを投与した場合は同量
のホルモンを静的に投与する場合と比べて分離さ
れた器官において異なる応答を誘導するか否かを
試験するため企図された。

使用するモデル系は発情後期ラツトの単離され
た卵巣である。卵巣ホルモン（LH）はラツトで
は脳の脳下垂体前方より脈打つように遊離される
事が知られている。このためLHのプラズマ中の
濃度がラツト体内で変動する事となり、LH濃度
は１時間毎にピークとなる。このピークは第１１
図に図示してある。本発明の方法の前にはこの変
動の意味について試験できなかつた。

LHはアンドロジエンの生成を促進させる事が
知られている。これは卵巣内の卵胞の生長速度に
間接的に影響を与える。そのため、LHがパルス
的に投与された場合と、静的に投与された場合
で、異なる効果を示すか否かを試験するため、分
泌されるエストラジオール−17βの量と卵胞の増
殖様式を検定した。ホルモンFSHはアンドロジ
エンをエストラジオール−βの如きエストロジエ
ンに転換する酵素を活性化する。

動 物 ９匹の成熟したメスのスプラグ−ドーリー
（Sprague−Dawley）のラツトを温度、湿度およ
び光の制御された状態下で保持した。動物は12
光／12暗サイクルにさらした。発情サイクルは
0800時間と1000時間の間膣垢を取つて毎日モニタ
ーした。成熟したラツトは実験する前に連続した
３サイクルの間観察した。呼吸器の障害、乳腺腫
瘍および他の大きな病気のないラツトのみ実験に
使用した。

培養系 本研究に使用するフロー系の概略を第１１図に
図示した。500mlのガラスの吸引フラスコを保持
フラスコ４０ａ−ｃとして使用した。20c.c.の注射
筒は培養チエンバー４２ａ，４２ｂとして使用し
た。保持フラスコ４０ａ−ｃ内の培地は22.8ml／
hrの一定速度でぜん動性ポンプ４４ａ−ｃによつ
てTygon食物チユーブ（1/8″O.D.）を通して輸
送される。培養チエンバー４２ａ，４２ｂはゴム
のシールで密封する事により培養チエンバー中の
培地の容量が一定になる。培養チエンバー４２
ａ，４２ｂはThelco恒温器中で37℃に保維され
る。潅流液はそれぞれの培養チエンバー４２ａ，
４２ｂからフラクシヨンコレクター４８ａ，４８
ｂにより採取される。15分毎に分画を採取する。

第１３図に図示したようなLHの３時間パルス
を模倣するため、２つの保持フラスコを培養チエ
ンバー毎に使用した。最初の保持フラスコ４０ｂ
は144nｇ／mlのLH−RP−１と200nｇ／mlの
FSH−RP−１を含有する。保持フラスコ４０ｃ
は0.56nｇ／mlのLH−RP−１および200nｇ／ml
のFSH−RP−１を含有する。培養チエンバー４
２ｂは最初の濃度が10nｇ／mlのLH−RP−１と
200nｇmlのFSH−RP−１である。第１の保持フ
ラスコ４０ｂから培養チエンバーへ実験の各時間
の最初の0.2時間の間輸送される。0.2時間後最初
の保持フラスコポンプ４４ｂが閉じられ第２の保
持フラスコポンプ４４ｃが始動し、各時間の残り
の0.8時間の間稼動する。このように第１４図に
図示されたグラフ通りに培養チエンバー４２ｂに
おいて正確に行なわれる。LHをパルス的に投与
する効果を試験するため対照として３時間で輸送
したLHの全量を第１３図におけるパルス曲線の
面積を積分する事により決定した。この積分の結
果は３時間の間、培養チエンバーへ供給したLH
と正確に同量であり、３時間静的に投与するLH
の量を決定するために使用した。29.25nｇ／mlの
LH−RP−１が計算され対照として決まり、保持
フラスコ４０ａ中に200nｇ／mlFSH−RP−１と
混合された。この混合物は培養チエンバー４６ａ
に同じ初期濃度で輸送された。

試薬の製法 2.4単位／mg（活性の１単位＝1.0mgのNIH−
LH−SI）の生物活性を持つ牛卵巣ホルモン
（NIAMDD−6LH−４）と9.0単位／mg（活性の
１単位＝1.0mgのNIH−FSH−SI）の生物活性を
持つ羊卵胞刺激ホルモンは1.0mgのホルモンの10
mlの生理食塩水溶液を連続的に希釈する事により
製する。500mg／mlのLHと50000nｇ／mlのFSH
の最終的な溶液は添加培地199中に製する。

培地199（Gibco）は２回蒸留した脱イオン水を
使用して濃縮溶液を希釈して製する。溶液には
2.2ｇ／LNaHCO₃、２ｇ／Ｌ牛血清アルブミン、
１ｇ／Ｌグルコース、50mg／Ｌ硫酸ストレプトマ
イシンおよび100000I.U.／LK−ペニシリンＧ（貯
蔵TC199）を添加した。培地は際ピペツライング
系（Labindustries）で保持フラスコと培養チエ
ンバーに±0.10mlの正確さで分配した。貯蔵ホル
モン溶液のマイクロリツトル量はミクロピペツト
（Oxford）で±0.05mlの正確さで添加した。すべ
ての培地は続いて酸素中５％CO₂と7.40±0.05に
調整したPHに平衝化した。その後培地はミリポア
フイルター（HA45）を通過させ滅菌した保持フ
ラスコと培養チエンバーに移し５℃で貯蔵した。
すべての保持フラスコは25℃に加温し（培養チエ
ンバーは37℃に加温した）200I.U／Ｌの普通のイ
ンスリン（Lente）を注入し、使用前20分間、酸
素中５％CO₂で平衝化した。保持フラスコは操作
時1psiより低い圧力で20秒／10分の間通気する。

実験手順 ３匹の成熟ラツトを発情後期の朝0930hと
0950hの間に検視した。卵巣を切除し、過剰の脂
肪を除き200I.U／Ｌインスリン(I)と400I.U／Ｌ硫
酸ヘパリン(H)を添加し、酸素中５％CO₂で平衝化
し、37℃に加温した貯蔵TC−199中に置いた。10
分後卵巣を９つの培養チエンバー中に入れた。そ
れぞれの動物の１つの卵巣は“パルス式”のチエ
ンバーに他は“静的”なチエンバーに入れた。
1000hにおいてペリスタポンプをスタートさせ、
すべての箱に適切なレベルのホルモンをさらし
た。

結 果 第１２図は卵胞の分布パターンの結果である。
上段は３つの培養しない卵巣（無傷の卵巣）の卵
胞分布パターンを示す。中段は本発明のパルス的
なLH刺激にさらした培養卵巣からの卵胞の分布
パターンである。このパターンは無傷の卵巣と有
意に異つていないが、下段に示すように静的な
LH刺激にさらされた培養卵巣のものとは有意に
（chi ２乗検定を使用して＜ ．05の確立）異つ
た。

第１４−１６図ではそれぞれの動物からの培養
卵巣のエストロジエン分泌を図示した。第１４−
１６図における実線は静的なLH刺激にさらした
卵巣を示し、点線は本発明の過程を使用したパル
ス的なLH刺激にさらした卵巣を示す。静的およ
びパルス的に刺激した両卵巣はエストロジエンの
パルス的な遊離を示す。しかしパルス的刺激にさ
らされた卵巣ではLHパルスに関係してエストロ
ジエン分泌の３つの異なるピークを示した。さら
にパルス的刺激にさらされた卵巣では静的刺激に
さらされた卵巣よりも有意に（toro−tailed
students“ｔ”検定で＜0.01の確率で）エストロ
ジエンをより多く分泌した。

結 論 本発明の方法は強力な研究手段であり、そして
内部血液信号の動力学の研究を可能にする。これ
らの結果は細胞の機能を制御するのはホルモンの
量だけでなく、ホルモンを輸送する様式である異
の証拠を提供する。

本発明を良好な具体例を参考に記述したが、こ
の分野に精通する者は本発明の精神と範囲から離
れる事なくその形式および詳細な点の変更がなさ
れる事を認めるであろう。