JPH0549473A - ラツト脳ミクログリアセルライン - Google Patents
ラツト脳ミクログリアセルラインInfo
- Publication number
- JPH0549473A JPH0549473A JP3204343A JP20434391A JPH0549473A JP H0549473 A JPH0549473 A JP H0549473A JP 3204343 A JP3204343 A JP 3204343A JP 20434391 A JP20434391 A JP 20434391A JP H0549473 A JPH0549473 A JP H0549473A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell line
- rat brain
- gene
- cell
- microglia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、ａ）直径約６０±５０μｍのほぼ
球形、ｂ）無限な継代培養可能、ｃ）神経細胞の生存、
成長、神経突起伸展を促進する新規な因子を産生し、培
養上清中に放出する、以上の性質を有するラット脳ミク
ログリアセルラインであり、ラット脳ミクログリアの遺
伝子内に無限増殖化遺伝子を組み込み該ラット脳ミクロ
グリアセルラインを樹立する方法である。さらに、神経
細胞の生存、成長、神経突起伸展を促進する新規な神経
栄養因子を含むラット脳ミクログリアセルラインの培養
上清および細胞ホモジネートである。 【効果】 ラット脳ミクログリアセルラインを大量培養
することで、神経細胞の生存、成長、神経突起伸展を促
進する新規な神経栄養因子を大量に生産でき、神経細胞
の機能障害を伴う脳疾患の治療に有用な物質を得ること
ができる。
球形、ｂ）無限な継代培養可能、ｃ）神経細胞の生存、
成長、神経突起伸展を促進する新規な因子を産生し、培
養上清中に放出する、以上の性質を有するラット脳ミク
ログリアセルラインであり、ラット脳ミクログリアの遺
伝子内に無限増殖化遺伝子を組み込み該ラット脳ミクロ
グリアセルラインを樹立する方法である。さらに、神経
細胞の生存、成長、神経突起伸展を促進する新規な神経
栄養因子を含むラット脳ミクログリアセルラインの培養
上清および細胞ホモジネートである。 【効果】 ラット脳ミクログリアセルラインを大量培養
することで、神経細胞の生存、成長、神経突起伸展を促
進する新規な神経栄養因子を大量に生産でき、神経細胞
の機能障害を伴う脳疾患の治療に有用な物質を得ること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、周産期ラット脳より得
られるミクログリアの遺伝子に外来の無限増殖化遺伝子
を組み込むことによって得られるラット脳ミクログリア
セルライン、そのセルラインの樹立方法、および神経細
胞の生存、成長、神経突起伸展を促進する作用（以下神
経栄養効果という）を有する前記セルラインの培養上清
および／または前記セルラインの細胞ホモジネートに関
する。
られるミクログリアの遺伝子に外来の無限増殖化遺伝子
を組み込むことによって得られるラット脳ミクログリア
セルライン、そのセルラインの樹立方法、および神経細
胞の生存、成長、神経突起伸展を促進する作用（以下神
経栄養効果という）を有する前記セルラインの培養上清
および／または前記セルラインの細胞ホモジネートに関
する。
【０００２】
【従来の技術】中高年層に多く見られる疾患である脳血
管障害やアルツハイマー型老年痴呆の治療においては、
ホパンテン酸カルシウム、イデベノンなどの脳代謝賦括
薬や、イフェンプロジル、シンナリジン、ニカルジピン
等の脳循環改善薬が多用されているが、これらの薬物の
作用メカニズムについては不明な点が多く、臨床的な治
療効果も不十分であり、対症療法的に用いられているの
が実状である。これに対して、前記脳疾患の直接原因で
ある神経細胞の虚血による障害や老化による機能低下を
回復させることによる本質的治療を目的として、神経成
長因子（ＮＧＦ）などの神経栄養効果を有する因子（神
経栄養因子、以下ＮＴＦと略称する）を生体より探索・
発見し、医薬品として応用する試みが盛んに行なわれて
いる。
管障害やアルツハイマー型老年痴呆の治療においては、
ホパンテン酸カルシウム、イデベノンなどの脳代謝賦括
薬や、イフェンプロジル、シンナリジン、ニカルジピン
等の脳循環改善薬が多用されているが、これらの薬物の
作用メカニズムについては不明な点が多く、臨床的な治
療効果も不十分であり、対症療法的に用いられているの
が実状である。これに対して、前記脳疾患の直接原因で
ある神経細胞の虚血による障害や老化による機能低下を
回復させることによる本質的治療を目的として、神経成
長因子（ＮＧＦ）などの神経栄養効果を有する因子（神
経栄養因子、以下ＮＴＦと略称する）を生体より探索・
発見し、医薬品として応用する試みが盛んに行なわれて
いる。
【０００３】一方、中枢神経系の主要な構成細胞の１つ
であるミクログリアは、１９３２年、リオ−ホルテガ
（Ｒｉｏ−Ｈｏｒｔｅｇａ）が初めてその存在を報告し
て以来、その生理的意義については不明な点が多かった
が、近年、脳におけるグリオーシス、免疫反応、損傷の
修復等の過程に何らかの関与をしているとの考えが提出
されて、その機能を調節することが前出の脳疾患の治療
につながるとの考えから注目を集めている。本発明者ら
は、ミクログリアが産生するＮＴＦを見いだすため、ミ
クログリアの単離、培養方法について研究を重ね、ラッ
ト脳からミクログリアを純粋な形で得るための優れた方
法を開発し、さらに、その方法により得られたミクログ
リアの培養上清に、神経栄養効果があることを見いだし
た（バイオメディカル リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅ
ｓ．）１０（Ｓ３），４１１−４２３，１９８９）。一
方、リジイ（Ｒｉｇｈｉ）らはマウス脳初代培養細胞に
発ガン遺伝子ｖ−ｍｙｃまたはｖ−ｍｉｌを持ったレト
ロウイルスＭＨ２を感染させることによってミクログリ
アの不死性クローンを得、それがＩＬ−１、ＩＬ−６、
ＴＮＦ−αを産生していることを報告した（ヨーロピア
ン ジャーナル オブイムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．）１９，１４１３−１４１８，１９８
９）。また、ブラシ（Ｂｌａｓｉ）らも同様に発癌遺伝
子ｖ−ｒａｆ／ｖ−ｍｙｃを持ったレトロウイルスＪ２
をもちいてマウス脳ミクログリアの不死化に成功したと
報告している（ジャーナル オブ ニューロイムノロジ
ー（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．）２７，２２９−
２３７，１９９０）。しかしながら、上記２種のマウス
脳ミクログリアセルラインでは神経栄養効果の報告はさ
れていない。
であるミクログリアは、１９３２年、リオ−ホルテガ
（Ｒｉｏ−Ｈｏｒｔｅｇａ）が初めてその存在を報告し
て以来、その生理的意義については不明な点が多かった
が、近年、脳におけるグリオーシス、免疫反応、損傷の
修復等の過程に何らかの関与をしているとの考えが提出
されて、その機能を調節することが前出の脳疾患の治療
につながるとの考えから注目を集めている。本発明者ら
は、ミクログリアが産生するＮＴＦを見いだすため、ミ
クログリアの単離、培養方法について研究を重ね、ラッ
ト脳からミクログリアを純粋な形で得るための優れた方
法を開発し、さらに、その方法により得られたミクログ
リアの培養上清に、神経栄養効果があることを見いだし
た（バイオメディカル リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅ
ｓ．）１０（Ｓ３），４１１−４２３，１９８９）。一
方、リジイ（Ｒｉｇｈｉ）らはマウス脳初代培養細胞に
発ガン遺伝子ｖ−ｍｙｃまたはｖ−ｍｉｌを持ったレト
ロウイルスＭＨ２を感染させることによってミクログリ
アの不死性クローンを得、それがＩＬ−１、ＩＬ−６、
ＴＮＦ−αを産生していることを報告した（ヨーロピア
ン ジャーナル オブイムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．）１９，１４１３−１４１８，１９８
９）。また、ブラシ（Ｂｌａｓｉ）らも同様に発癌遺伝
子ｖ−ｒａｆ／ｖ−ｍｙｃを持ったレトロウイルスＪ２
をもちいてマウス脳ミクログリアの不死化に成功したと
報告している（ジャーナル オブ ニューロイムノロジ
ー（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．）２７，２２９−
２３７，１９９０）。しかしながら、上記２種のマウス
脳ミクログリアセルラインでは神経栄養効果の報告はさ
れていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】脳血管障害やアルツハ
イマー型老年痴呆など、神経細胞の機能低下による脳疾
患の原因療法薬は未だ現われていないのが実状であり、
高齢化社会の到来により社会問題化しつつあるこれら疾
患の、本質的治療薬の開発が切望されている。本発明者
らの最終目的は、神経系の低下した機能を改善する作用
を持つ新規なＮＴＦを探索、発見して上記のような治療
薬を開発する事であるが、その第一段階として、そのよ
うな新規なＮＴＦを産生する培養細胞株を開発し、その
物質を効率的に生産する方法を提供することが本発明の
課題である。
イマー型老年痴呆など、神経細胞の機能低下による脳疾
患の原因療法薬は未だ現われていないのが実状であり、
高齢化社会の到来により社会問題化しつつあるこれら疾
患の、本質的治療薬の開発が切望されている。本発明者
らの最終目的は、神経系の低下した機能を改善する作用
を持つ新規なＮＴＦを探索、発見して上記のような治療
薬を開発する事であるが、その第一段階として、そのよ
うな新規なＮＴＦを産生する培養細胞株を開発し、その
物質を効率的に生産する方法を提供することが本発明の
課題である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、前記課題を解
決するために周産期ラット脳より得られるミクログリア
の遺伝子内に外来の無限増殖化遺伝子を組み込むことに
よって得られるラット脳ミクログリアセルライン、その
セルラインの樹立方法、および神経栄養効果を有する前
記セルラインの培養上清および／または前記セルライン
の細胞ホモジネートを提供するものである。
決するために周産期ラット脳より得られるミクログリア
の遺伝子内に外来の無限増殖化遺伝子を組み込むことに
よって得られるラット脳ミクログリアセルライン、その
セルラインの樹立方法、および神経栄養効果を有する前
記セルラインの培養上清および／または前記セルライン
の細胞ホモジネートを提供するものである。
【０００６】すなわち本発明は、以下の性質を有するラ
ット脳ミクログリアセルラインを提供するものである。 ａ）細胞の形態：直径約６０±５０μｍのほぼ球形 ｂ）継代培養：無限な継代培養可能 ｃ）機能的特徴：神経細胞の生存、成長、神経突起伸展
を促進する新規な因子を産生し、培養上清中に放出す
る。
ット脳ミクログリアセルラインを提供するものである。 ａ）細胞の形態：直径約６０±５０μｍのほぼ球形 ｂ）継代培養：無限な継代培養可能 ｃ）機能的特徴：神経細胞の生存、成長、神経突起伸展
を促進する新規な因子を産生し、培養上清中に放出す
る。
【０００７】さらに、本発明のラット脳ミクログリアセ
ルラインはラット脳ミクログリアの遺伝子内に、無限増
殖化遺伝子を組み込むことによって樹立した場合に好適
である。
ルラインはラット脳ミクログリアの遺伝子内に、無限増
殖化遺伝子を組み込むことによって樹立した場合に好適
である。
【０００８】特に、本発明のラット脳ミクログリアセル
ラインは前記無限増殖化遺伝子がＳＶ４０温度感受性変
異株のラージＴ遺伝子である場合に好適である。
ラインは前記無限増殖化遺伝子がＳＶ４０温度感受性変
異株のラージＴ遺伝子である場合に好適である。
【０００９】本発明のラット脳ミクログリアセルライン
は微工研菌寄第１２４２６号であるＲＢＭ１０３、微工
研菌寄第１２４２７号であるＲＢＭ１１２、または、微
工研菌寄第１２４２８号であるＲＢＭ１２９である場合
に好適である。
は微工研菌寄第１２４２６号であるＲＢＭ１０３、微工
研菌寄第１２４２７号であるＲＢＭ１１２、または、微
工研菌寄第１２４２８号であるＲＢＭ１２９である場合
に好適である。
【００１０】また、本発明はラット脳ミクログリアセル
ラインを樹立するにあたり、組換えＤＮＡ技術によって
ラット脳ミクログリアの遺伝子内に、無限増殖化遺伝子
としてＳＶ４０のラージＴ遺伝子を組み込むことを特徴
とするラット脳ミクログリアセルラインの樹立方法を提
供する。
ラインを樹立するにあたり、組換えＤＮＡ技術によって
ラット脳ミクログリアの遺伝子内に、無限増殖化遺伝子
としてＳＶ４０のラージＴ遺伝子を組み込むことを特徴
とするラット脳ミクログリアセルラインの樹立方法を提
供する。
【００１１】さらに本発明は、初代培養ラット脳ミクロ
グリアの培養上清と同様な神経細胞の生存、成長、神経
突起伸展を促進する作用を有する新規な因子を含有する
前記セルラインの培養上清および／または前記セルライ
ンの細胞ホモジネートを提供する。
グリアの培養上清と同様な神経細胞の生存、成長、神経
突起伸展を促進する作用を有する新規な因子を含有する
前記セルラインの培養上清および／または前記セルライ
ンの細胞ホモジネートを提供する。
【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】本発明のラット脳ミクログリアセルライン
は以下の様にして得られる。胎生期あるいは新生児のラ
ット脳を摘出し、トリプシン、パパイン、コラゲナーゼ
などの酵素で処理することにより細胞を分散させ、１〜
２０％牛胎児血清および成長因子などを含有するダルベ
ッコ改変型イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの細胞培養用
培地にて適当な培養容器に播種して初代培養を行う。３
日以上経過した後、培養容器を振とうすることにより浮
遊してくるミクログリアを得る。これを新たな培養容器
に接着させ、さらに培養を継続する。
は以下の様にして得られる。胎生期あるいは新生児のラ
ット脳を摘出し、トリプシン、パパイン、コラゲナーゼ
などの酵素で処理することにより細胞を分散させ、１〜
２０％牛胎児血清および成長因子などを含有するダルベ
ッコ改変型イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの細胞培養用
培地にて適当な培養容器に播種して初代培養を行う。３
日以上経過した後、培養容器を振とうすることにより浮
遊してくるミクログリアを得る。これを新たな培養容器
に接着させ、さらに培養を継続する。
【００１４】この細胞に無限増殖化遺伝子をｐＵＣ１９
などの適当な発現ベクターと結合させ、遺伝子内に導入
することにより恒久的に継代可能なセルラインを得るこ
とができる。該無限増殖化遺伝子は例えばＳＶ４０のラ
ージＴ遺伝子、特に、ＳＶ４０温度感受性変異株由来の
ラージＴ遺伝子などを使うことができるが、他のもので
も可能である。また、遺伝子が導入された細胞を容易に
選別するためにトランスポゾン５などの薬剤耐性遺伝子
を共導入することもできる。細胞に遺伝子を導入する方
法としてはリン酸カルシウム共沈澱法、リポソーム封入
法、電気ショック法、あるいはウイルス感染による方法
などがあるが、他の適当な方法でも可能である。遺伝子
導入操作後は、通常、単一クローン株を得るための操作
が必要である。すなわち、培養を継続、観察し、増殖性
コロニーが形成された時、それを新たな培養容器に継代
する。充分な細胞数が得られた状態で、限界希釈法によ
りウェルあたり細胞が１個となるように継代する。その
後分裂、増殖してきた各クローンを取り出し、表面積が
漸増する培養容器を用いて細胞を継代して単一クローン
株として下記の性質を有する本発明のラット脳ミクログ
リアセルラインを得ることができる。 ａ）細胞の形態：直径約６０±５０μｍのほぼ球形 ｂ）継代培養：無限な継代培養可能 ｃ）機能的特徴：神経細胞の生存・成長・神経突起伸展
を促進する新規な因子を産生し、培養上清中に放出す
る。 さらに、このミクログリアセルラインは下記の性質を有
する。 ｄ）細胞増殖性：通常の細胞培養用培地にて良好に増殖
する。世代倍加時間は１６±４時間である。 ｅ）保存条件：−８０℃で凍結保存可能
などの適当な発現ベクターと結合させ、遺伝子内に導入
することにより恒久的に継代可能なセルラインを得るこ
とができる。該無限増殖化遺伝子は例えばＳＶ４０のラ
ージＴ遺伝子、特に、ＳＶ４０温度感受性変異株由来の
ラージＴ遺伝子などを使うことができるが、他のもので
も可能である。また、遺伝子が導入された細胞を容易に
選別するためにトランスポゾン５などの薬剤耐性遺伝子
を共導入することもできる。細胞に遺伝子を導入する方
法としてはリン酸カルシウム共沈澱法、リポソーム封入
法、電気ショック法、あるいはウイルス感染による方法
などがあるが、他の適当な方法でも可能である。遺伝子
導入操作後は、通常、単一クローン株を得るための操作
が必要である。すなわち、培養を継続、観察し、増殖性
コロニーが形成された時、それを新たな培養容器に継代
する。充分な細胞数が得られた状態で、限界希釈法によ
りウェルあたり細胞が１個となるように継代する。その
後分裂、増殖してきた各クローンを取り出し、表面積が
漸増する培養容器を用いて細胞を継代して単一クローン
株として下記の性質を有する本発明のラット脳ミクログ
リアセルラインを得ることができる。 ａ）細胞の形態：直径約６０±５０μｍのほぼ球形 ｂ）継代培養：無限な継代培養可能 ｃ）機能的特徴：神経細胞の生存・成長・神経突起伸展
を促進する新規な因子を産生し、培養上清中に放出す
る。 さらに、このミクログリアセルラインは下記の性質を有
する。 ｄ）細胞増殖性：通常の細胞培養用培地にて良好に増殖
する。世代倍加時間は１６±４時間である。 ｅ）保存条件：−８０℃で凍結保存可能
【００１５】このようにして得られたラット脳ミクログ
リアセルライン中のＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２および
ＲＢＭ１２９と命名したものを、通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所に平成３年８月１３日にそれぞれ
微工研菌寄第１２４２６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４２
６）、微工研菌寄第１２４２７号（ＦＥＲＭＰ−１２４
２７）、および微工研菌寄第１２４２８号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２４２８）として寄託している。
リアセルライン中のＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２および
ＲＢＭ１２９と命名したものを、通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所に平成３年８月１３日にそれぞれ
微工研菌寄第１２４２６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４２
６）、微工研菌寄第１２４２７号（ＦＥＲＭＰ−１２４
２７）、および微工研菌寄第１２４２８号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２４２８）として寄託している。
【００１６】このようにして得られたセルラインは、導
入した遺伝子産物に対する抗体を用い、免疫染色法ある
いはウエスタンブロット法などにより、当該遺伝子産物
が発現されていることが確められる。また、ミクログリ
アのマーカーであるＥＤ−１などに対する抗体を用いた
免疫染色法などにより、当該セルラインがミクログリア
であることが確認できる。実際にこれらの検討を行った
結果を以下に示す。
入した遺伝子産物に対する抗体を用い、免疫染色法ある
いはウエスタンブロット法などにより、当該遺伝子産物
が発現されていることが確められる。また、ミクログリ
アのマーカーであるＥＤ−１などに対する抗体を用いた
免疫染色法などにより、当該セルラインがミクログリア
であることが確認できる。実際にこれらの検討を行った
結果を以下に示す。
【００１７】図１は、実施例１で示されている抗ラージ
Ｔ抗原抗体を用いて、当該セルラインホモジネートをウ
エスタンブロット法により染色した結果である。このよ
うに、ミクログリアに外来性に導入した遺伝子の発現産
物であるラージＴ抗原が当該セルラインにおいて発現し
ているのが確認できる。
Ｔ抗原抗体を用いて、当該セルラインホモジネートをウ
エスタンブロット法により染色した結果である。このよ
うに、ミクログリアに外来性に導入した遺伝子の発現産
物であるラージＴ抗原が当該セルラインにおいて発現し
ているのが確認できる。
【００１８】表１には、中枢神経系細胞のマーカー蛋白
の抗体による免疫染色性、レクチン結合性、酵素活性、
ラテックスビーズ貪食能などの種々の細胞特性につい
て、本発明のラット脳ミクログリアセルラインをラット
脳より得た初代培養ミクログリアおよび初代培養アスト
ログリアと詳細に比較した結果を示す。
の抗体による免疫染色性、レクチン結合性、酵素活性、
ラテックスビーズ貪食能などの種々の細胞特性につい
て、本発明のラット脳ミクログリアセルラインをラット
脳より得た初代培養ミクログリアおよび初代培養アスト
ログリアと詳細に比較した結果を示す。
【００１９】 表 １ ─────────────────────────────────── 本発明 初代培養 初代培養 項 目 セルライン1) ミクログリア2) アストログリア3) ─────────────────────────────────── 免疫染色性2) ＥＤ−１ 有り 有り 無し ニューロフィラメント 無し 無し 無し ＧＦＡＰ 無し 無し 有り ＭＢＰ 無し 無し 無し ガラクトセレブロシド 無し 無し 無し Ｂ４イソレクチン結合性2) 有り 有り 無し 非特異的エステラーゼ活性2) 高い 高い 低い 貪食能2) 高い 高い 低い 無限増殖能 有り 無し 無し ───────────────────────────────── ＧＦＡＰ グリア線維性蛋白質 ＭＢＰ ミエリン塩基性蛋白質 1) 実施例１により調製したミクログリアセルライン、
ＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２、およびＲＢＭ１２９ 2) ナカジマ（Ｎａｋａｊｉｍａ）らの方法による（バ
イオメディカル リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．）
１０（Ｓ３），４１１−４２３，１９８９） 3) マッカーシー（ＭｃＣａｒｔｈｙ）らの方法による
（ジャーナル オブセル バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）８５，８９０−９０２，１９８０）
ＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２、およびＲＢＭ１２９ 2) ナカジマ（Ｎａｋａｊｉｍａ）らの方法による（バ
イオメディカル リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．）
１０（Ｓ３），４１１−４２３，１９８９） 3) マッカーシー（ＭｃＣａｒｔｈｙ）らの方法による
（ジャーナル オブセル バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）８５，８９０−９０２，１９８０）
【００２０】表１に示されるように、初代培養で得たミ
クログリアと本発明のラット脳ミクログリアセルライン
の細胞特性は、本発明セルラインが無限増殖能を有する
ことを除いてよく一致していた。従って本発明のラット
脳ミクログリアセルラインは初代培養のミクログリアの
細胞特性を保持したまま無限増殖能が付与されたセルラ
インであると考えられる。
クログリアと本発明のラット脳ミクログリアセルライン
の細胞特性は、本発明セルラインが無限増殖能を有する
ことを除いてよく一致していた。従って本発明のラット
脳ミクログリアセルラインは初代培養のミクログリアの
細胞特性を保持したまま無限増殖能が付与されたセルラ
インであると考えられる。
【００２１】本発明のラット脳ミクログリアセルライン
は、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭなどで恒久的
に継代培養が可能である。細胞が培養容器内で密集状態
になったときは、例えばトリプシンなどを用いて細胞を
培養容器から一旦離脱させ、新たな培養容器で繰り返し
継代、培養することができる。また、本発明のラット脳
ミクログリアセルラインは、血清あるいは血清を含む培
地などに５〜２０％となるようにジメチルスルホキシド
のような保存剤を添加した溶媒に懸濁し凍結させ、液体
窒素中などで保存できる。さらに凍結保存状態から例え
ば温湯につけて融解し、再び継代培養することもでき
る。
は、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭなどで恒久的
に継代培養が可能である。細胞が培養容器内で密集状態
になったときは、例えばトリプシンなどを用いて細胞を
培養容器から一旦離脱させ、新たな培養容器で繰り返し
継代、培養することができる。また、本発明のラット脳
ミクログリアセルラインは、血清あるいは血清を含む培
地などに５〜２０％となるようにジメチルスルホキシド
のような保存剤を添加した溶媒に懸濁し凍結させ、液体
窒素中などで保存できる。さらに凍結保存状態から例え
ば温湯につけて融解し、再び継代培養することもでき
る。
【００２２】上記セルラインの培養に用いる血清として
は、牛胎児血清のほか、牛準胎児血清、仔牛血清、ラッ
ト血清、馬血清などを用い、培地としては、最小必須培
地（ＭＥＭ）、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０な
どを用いることができる。また、必要に応じて、インシ
ュリン、トランスフェリン、プトレッシン、セレンなど
の成長因子や、ゲンタマイシン、カナマイシンなどの抗
菌剤を培地に添加すると良い。
は、牛胎児血清のほか、牛準胎児血清、仔牛血清、ラッ
ト血清、馬血清などを用い、培地としては、最小必須培
地（ＭＥＭ）、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０な
どを用いることができる。また、必要に応じて、インシ
ュリン、トランスフェリン、プトレッシン、セレンなど
の成長因子や、ゲンタマイシン、カナマイシンなどの抗
菌剤を培地に添加すると良い。
【００２３】本発明の細胞培養上清および細胞ホモジネ
−トは、本発明のラット脳ミクログリアセルラインを培
養することによって得られる。すなわち、本発明のラッ
ト脳ミクログリアセルラインを一定期間培養した後、無
血清の培地により数回洗浄し、同じ無血清の培地で１２
〜２４時間培養し、さらに細胞を遠心分離で除くことに
より、培養用血清に含まれる成長因子などの挟雑物を除
外した形で細胞培養上清を得る。また、上記細胞を適当
な緩衝液で数回洗浄後、ワ−リングブレンダ−、超音波
破砕機等で破砕することにより細胞ホモジネートを得
る。
−トは、本発明のラット脳ミクログリアセルラインを培
養することによって得られる。すなわち、本発明のラッ
ト脳ミクログリアセルラインを一定期間培養した後、無
血清の培地により数回洗浄し、同じ無血清の培地で１２
〜２４時間培養し、さらに細胞を遠心分離で除くことに
より、培養用血清に含まれる成長因子などの挟雑物を除
外した形で細胞培養上清を得る。また、上記細胞を適当
な緩衝液で数回洗浄後、ワ−リングブレンダ−、超音波
破砕機等で破砕することにより細胞ホモジネートを得
る。
【００２４】このように得られた培養上清や、細胞ホモ
ジネートより、塩析、陰イオンあるいは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグ
ラフィーなどの操作を組み合わせることにより、神経栄
養効果の本体であるＮＴＦを精製、取得することもでき
る。
ジネートより、塩析、陰イオンあるいは陽イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグ
ラフィーなどの操作を組み合わせることにより、神経栄
養効果の本体であるＮＴＦを精製、取得することもでき
る。
【００２５】本発明の細胞培養上清または細胞ホモジネ
−トから得られたＮＴＦの遺伝子をクローニングし、そ
れをプローブとしてヒトのｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、ヒトでの当該因子に相当する物質を得る
こともできる。また、本発明の培養上清または細胞ホモ
ジネ−トのＮＴＦの抗体を作製し、この抗体に反応する
ヒト由来のＮＴＦを、ヒトでの同一因子に相当する物質
として得ることもできる。
−トから得られたＮＴＦの遺伝子をクローニングし、そ
れをプローブとしてヒトのｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、ヒトでの当該因子に相当する物質を得る
こともできる。また、本発明の培養上清または細胞ホモ
ジネ−トのＮＴＦの抗体を作製し、この抗体に反応する
ヒト由来のＮＴＦを、ヒトでの同一因子に相当する物質
として得ることもできる。
【００２６】本発明の培養上清は、後に実施例３で説明
するように、顕著な神経栄養効果を示す。すなわち、本
発明のラット脳ミクログリアセルラインのＲＢＭ１２
９、ＲＢＭ１０３またはＲＢＭ１１２の培養上清を、ラ
ット脳大脳皮質神経細胞の培養液に１０ないし５０％
（ｖ／ｖ）となるように加え、数日間培養することによ
り、対照試料に対して１．５〜１０倍の生細胞数を示
す。上記培養系に、既知の種々の成長因子を十分な濃度
加え、数日間培養しても、本発明の細胞培養上清の神経
栄養効果に匹敵する効果を示さない。また神経突起の伸
展も本発明の培養上清の添加によってのみ促進される。
従って、本培養上清中に含まれているＮＴＦはこれら既
存の成長因子とは異なる、新規な物質である。
するように、顕著な神経栄養効果を示す。すなわち、本
発明のラット脳ミクログリアセルラインのＲＢＭ１２
９、ＲＢＭ１０３またはＲＢＭ１１２の培養上清を、ラ
ット脳大脳皮質神経細胞の培養液に１０ないし５０％
（ｖ／ｖ）となるように加え、数日間培養することによ
り、対照試料に対して１．５〜１０倍の生細胞数を示
す。上記培養系に、既知の種々の成長因子を十分な濃度
加え、数日間培養しても、本発明の細胞培養上清の神経
栄養効果に匹敵する効果を示さない。また神経突起の伸
展も本発明の培養上清の添加によってのみ促進される。
従って、本培養上清中に含まれているＮＴＦはこれら既
存の成長因子とは異なる、新規な物質である。
【００２７】本発明の細胞培養上清は、神経細胞の成
長、生存を促進することから、本発明の細胞培養上清中
のＮＴＦを有効成分として含有する医薬組成物は、脳血
管障害やアルツハイマー型老年痴呆など神経細胞の機能
障害による脳疾患の治療薬として有効に利用できる。
長、生存を促進することから、本発明の細胞培養上清中
のＮＴＦを有効成分として含有する医薬組成物は、脳血
管障害やアルツハイマー型老年痴呆など神経細胞の機能
障害による脳疾患の治療薬として有効に利用できる。
【００２８】
【実施例】以下、本発明の実施例を挙げて本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれに限るものではない。
的に説明するが、本発明はこれに限るものではない。
【００２９】（実施例１）不死化ミクログリアセルライ
ンの樹立 新生児ラット脳より大脳皮質を摘出し、０．２５％トリ
プシン溶液とともに１０分間インキュベートし、ピペッ
トで撹拌することにより細胞を分散させ、１０％牛胎児
血清含有ＤＭＥＭにて２回洗浄した後、同じ培地に再懸
濁して３７℃、１０％ＣＯ2 で初代培養を行った。５日
後、培養容器を静かに振とうする事により浮遊してくる
細胞を新たな培養容器に播いて数時間培養することによ
り接着性細胞を得た。
ンの樹立 新生児ラット脳より大脳皮質を摘出し、０．２５％トリ
プシン溶液とともに１０分間インキュベートし、ピペッ
トで撹拌することにより細胞を分散させ、１０％牛胎児
血清含有ＤＭＥＭにて２回洗浄した後、同じ培地に再懸
濁して３７℃、１０％ＣＯ2 で初代培養を行った。５日
後、培養容器を静かに振とうする事により浮遊してくる
細胞を新たな培養容器に播いて数時間培養することによ
り接着性細胞を得た。
【００３０】以下、図２により説明する。ＳＶ４０温度
感受性変異株であるｔｓ１００（ジャーナル オブ バ
イロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）１５，１２９７−１３
０１，１９７５）より抽出精製したＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＰｖｕＩＩにより消化した。ＳＶ４０初期遺
伝子領域を含むＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩサイトに挿入し、ｐＢＲ３
２２ｔｓＴを作製した。ｐＢＲ３２２ｔｓＴをグルツマ
ン（Ｇｌｕｔｚｍａｎ）らの方法（プロシーディングス
オブ ナショナルアカデミー オブ サイエンシーズ
オブ ザ ユナイテッド ステイト オブ アメリカ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７
７，３８９８−３９０２，１９８０）に従い、複製開始
部位欠損変異体ｐＢＲ３２２ＯＤｔｓ Ｔを作製した。
これをＥｃｏＲＩ、ＰｖｕＩＩで消化後、ＸｂａＩリン
カーを結合し閉環させ、ＳＶＯＤｔｓＴを作製した。そ
の後、ＸｂａＩで消化し、ＳＶ４０初期遺伝子領域を含
む断片を発現ベクターｐＵＣ１９に挿入し、ｐＵＣ．Ｓ
ＶＯＤｔｓＴを作製した。次いで、ｐＵＣ．ＳＶＯＤｔ
ｓＴを常法により大腸菌を宿主として増幅し、プラスミ
ドＤＮＡを調製した。なお、使用した制限酵素は宝酒造
社製のものを用いた。
感受性変異株であるｔｓ１００（ジャーナル オブ バ
イロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）１５，１２９７−１３
０１，１９７５）より抽出精製したＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＰｖｕＩＩにより消化した。ＳＶ４０初期遺
伝子領域を含むＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩサイトに挿入し、ｐＢＲ３
２２ｔｓＴを作製した。ｐＢＲ３２２ｔｓＴをグルツマ
ン（Ｇｌｕｔｚｍａｎ）らの方法（プロシーディングス
オブ ナショナルアカデミー オブ サイエンシーズ
オブ ザ ユナイテッド ステイト オブ アメリカ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７
７，３８９８−３９０２，１９８０）に従い、複製開始
部位欠損変異体ｐＢＲ３２２ＯＤｔｓ Ｔを作製した。
これをＥｃｏＲＩ、ＰｖｕＩＩで消化後、ＸｂａＩリン
カーを結合し閉環させ、ＳＶＯＤｔｓＴを作製した。そ
の後、ＸｂａＩで消化し、ＳＶ４０初期遺伝子領域を含
む断片を発現ベクターｐＵＣ１９に挿入し、ｐＵＣ．Ｓ
ＶＯＤｔｓＴを作製した。次いで、ｐＵＣ．ＳＶＯＤｔ
ｓＴを常法により大腸菌を宿主として増幅し、プラスミ
ドＤＮＡを調製した。なお、使用した制限酵素は宝酒造
社製のものを用いた。
【００３１】このｐＵＣ．ＳＶＯＤｔｓＴ １０μｇと
カナニ（Ｃａｎｎａｎｉ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９，５１６６−５１７０，
１９８２）により示されている別に調製したｐＳＶ２Ｎ
ｅｏ ５μｇを混合し、リン酸カルシウム法に基づく遺
伝子導入試薬（セル フェクト トランスフェクション
キット（Ｃｅｌｌ Ｐｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ）：ファルマシア社製）を用い、上記の
通り得たミクログリア細胞に添加し、３７℃、１０％Ｃ
Ｏ2 で培養した。６時間後、培地を交換しさらに４８時
間培養した。次にＧ４１８ ４００μｇ／ｍｌを添加し
培養を継続した。２週間後、Ｇ４１８抵抗性のコロニー
が観察されたので単離し、Ｇ４１８ ２００μｇ／ｍｌ
を含む培地で維持培養した。増殖してきた細胞をトリプ
シン処理により剥離して新しい培地に懸濁し、９６ウェ
ル−プレートにウェルあたり１個の細胞が入るように播
種した。光学顕微鏡下に１個の細胞のみが入っているウ
ェルを確認し、培養を継続した。増殖してきたモノクロ
ーナルな細胞は多数あったが、そのうち３種について、
ガラスカバースリップ上にホルマリン固定し、ミクログ
リアのマーカーであるＥＤ−１に対する抗体を用いて免
疫染色を施したところ、陽性であった。また、細胞ホモ
ジネートを調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行
い、ニトロセルロース膜上に転写後、抗ラージＴ抗体を
用いてウェスタンブロット解析を行った。結果を図１に
示す。図１中のＡはポジティブコントロールであるｃｏ
ｓ−７、Ｂは初代培養ミクログリア、Ｃはラット脳ミク
ログリアセルラインであるＲＢＭ１２９である。ＲＢＭ
１２９細胞ホモジネートでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ポ
ジティブコントロールであるｃｏｓ−７同様、分子量約
９４キロダルトンの位置に単一のバンドが認められ、導
入した遺伝子の産物であるラージＴ蛋白質の発現が確か
められた。また、これらの細胞を３０回継代培養しても
その増殖能は衰えなかった。これらの細胞をそれぞれ、
ラット脳ミクログリアセルラインＲＢＭ１０３、ＲＢＭ
１１２およびＲＢＭ１２９と命名した。
カナニ（Ｃａｎｎａｎｉ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９，５１６６−５１７０，
１９８２）により示されている別に調製したｐＳＶ２Ｎ
ｅｏ ５μｇを混合し、リン酸カルシウム法に基づく遺
伝子導入試薬（セル フェクト トランスフェクション
キット（Ｃｅｌｌ Ｐｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ）：ファルマシア社製）を用い、上記の
通り得たミクログリア細胞に添加し、３７℃、１０％Ｃ
Ｏ2 で培養した。６時間後、培地を交換しさらに４８時
間培養した。次にＧ４１８ ４００μｇ／ｍｌを添加し
培養を継続した。２週間後、Ｇ４１８抵抗性のコロニー
が観察されたので単離し、Ｇ４１８ ２００μｇ／ｍｌ
を含む培地で維持培養した。増殖してきた細胞をトリプ
シン処理により剥離して新しい培地に懸濁し、９６ウェ
ル−プレートにウェルあたり１個の細胞が入るように播
種した。光学顕微鏡下に１個の細胞のみが入っているウ
ェルを確認し、培養を継続した。増殖してきたモノクロ
ーナルな細胞は多数あったが、そのうち３種について、
ガラスカバースリップ上にホルマリン固定し、ミクログ
リアのマーカーであるＥＤ−１に対する抗体を用いて免
疫染色を施したところ、陽性であった。また、細胞ホモ
ジネートを調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行
い、ニトロセルロース膜上に転写後、抗ラージＴ抗体を
用いてウェスタンブロット解析を行った。結果を図１に
示す。図１中のＡはポジティブコントロールであるｃｏ
ｓ−７、Ｂは初代培養ミクログリア、Ｃはラット脳ミク
ログリアセルラインであるＲＢＭ１２９である。ＲＢＭ
１２９細胞ホモジネートでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ポ
ジティブコントロールであるｃｏｓ−７同様、分子量約
９４キロダルトンの位置に単一のバンドが認められ、導
入した遺伝子の産物であるラージＴ蛋白質の発現が確か
められた。また、これらの細胞を３０回継代培養しても
その増殖能は衰えなかった。これらの細胞をそれぞれ、
ラット脳ミクログリアセルラインＲＢＭ１０３、ＲＢＭ
１１２およびＲＢＭ１２９と命名した。
【００３２】これらのラット脳ミクログリアセルライン
ＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２およびＲＢＭ１２９の細胞
生物学的および機能的性質を挙げると、以下の通りとな
る。
ＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２およびＲＢＭ１２９の細胞
生物学的および機能的性質を挙げると、以下の通りとな
る。
【００３３】ＲＢＭ１０３（微工研菌寄第１２４２６
号） ａ）細胞の形態：直径約５５±４０μｍのほぼ球形 ｄ）細胞増殖性：通常の細胞培養用培地にて良好に増殖
する。世代倍加時間は１５±３時間である。 ｅ）染色体数：表２の通り
号） ａ）細胞の形態：直径約５５±４０μｍのほぼ球形 ｄ）細胞増殖性：通常の細胞培養用培地にて良好に増殖
する。世代倍加時間は１５±３時間である。 ｅ）染色体数：表２の通り
【００３４】ＲＢＭ１１２（微工研菌寄第１２４２７
号） ａ）細胞の形態：直径約６５±５０μｍのほぼ球形 ｄ）細胞増殖性：通常の細胞培養用培地にて良好に増殖
する。世代倍加時間は１６±４時間である。 ｅ）染色体数：表２の通り
号） ａ）細胞の形態：直径約６５±５０μｍのほぼ球形 ｄ）細胞増殖性：通常の細胞培養用培地にて良好に増殖
する。世代倍加時間は１６±４時間である。 ｅ）染色体数：表２の通り
【００３５】ＲＢＭ１２９（微工研菌寄第１２４２８
号） ａ）細胞の形態：直径約６０±５０μｍのほぼ球形 ｄ）細胞増殖性：通常の細胞培養用培地にて良好に増殖
する。世代倍加時間は１７±３時間である。 ｅ）染色体数：表２の通り
号） ａ）細胞の形態：直径約６０±５０μｍのほぼ球形 ｄ）細胞増殖性：通常の細胞培養用培地にて良好に増殖
する。世代倍加時間は１７±３時間である。 ｅ）染色体数：表２の通り
【００３６】さらに、上記３種のラット脳ミクログリア
セルラインは以下に示す通りの共通な性質を有する。 ｂ）継代培養：無限な継代培養可能 ｃ）機能的特徴：神経細胞の生存、成長、神経突起伸展
を促進する新規な因子を産生し、培養上清中に放出す
る。 ｅ）保有条件：−８０℃で凍結保存可能
セルラインは以下に示す通りの共通な性質を有する。 ｂ）継代培養：無限な継代培養可能 ｃ）機能的特徴：神経細胞の生存、成長、神経突起伸展
を促進する新規な因子を産生し、培養上清中に放出す
る。 ｅ）保有条件：−８０℃で凍結保存可能
【００３７】
【００３８】（実施例２）培養上清の取得 実施例１にて得られたラット脳ミクログリアセルライン
ＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２およびＲＢＭ１２９を、各
々１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地８ｍｌを用いて７
５ｃｍ2 の培養用フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ
2 で培養した。５日後、この細胞を無血清のＤＭＥＭ培
地にて数回洗浄した後、無血清の同じ培地でさらに２４
時間培養し、細胞数約１０8 個とした。次いで細胞成分
を遠心分離で除くことにより、本発明の細胞培養上清約
８ｍｌを得た。
ＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２およびＲＢＭ１２９を、各
々１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地８ｍｌを用いて７
５ｃｍ2 の培養用フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ
2 で培養した。５日後、この細胞を無血清のＤＭＥＭ培
地にて数回洗浄した後、無血清の同じ培地でさらに２４
時間培養し、細胞数約１０8 個とした。次いで細胞成分
を遠心分離で除くことにより、本発明の細胞培養上清約
８ｍｌを得た。
【００３９】（実施例３）培養上清の神経栄養効果 吉田らの方法（ニューロサイエンス レターズ（Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ），６６，１８１，
１９８６）に従い、胎生１６〜１８日齢のラット脳の大
脳皮質より神経細胞を単離して、１％牛胎児血清および
成長因子などを含むＭＥＭ培地に懸濁し、予めポリリジ
ンをコーティングした培養プレートに１０5 個／ｍｌ／
ウェルにて、３７℃、５％ＣＯ2 で培養した。２４時間
後に実施例２で取得した本発明のラット脳ミクログリア
セルラインＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２およびＲＢＭ１
２９の培養上清を神経細胞の培養液に１０あるいは５０
％（ｖ／ｖ）の割合で加え、５日間培養した後に位相差
顕微鏡を用いて神経突起の状態を観察し、生細胞数をＭ
ＴＴ法（モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ Ｔ），ジャーナル
オブ イムノロジカル メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），６５，５５−６３，１９８３）
にて測定した。結果を表３に示す。実験の結果、本発明
のラット脳ミクログリアセルライン、ＲＢＭ１２９、Ｒ
ＢＭ１０３、またはＲＢＭ１１２の培養上清は、対照の
平均を１００として、それぞれ表３に示す生細胞数を示
した。同時に検討した既知の種々の成長因子は、各々の
作用発現に十分な濃度を添加したにもかかわらず、本発
明の培養上清の効果に匹敵する効果を示す因子はなかっ
た。また神経突起の伸展も本発明の培養上清の添加によ
ってのみ促進されていた。従って、本培養上清中に含ま
れているＮＴＦはこれら既存の成長因子とは異なる、新
規な物質であることが示された。
ｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ），６６，１８１，
１９８６）に従い、胎生１６〜１８日齢のラット脳の大
脳皮質より神経細胞を単離して、１％牛胎児血清および
成長因子などを含むＭＥＭ培地に懸濁し、予めポリリジ
ンをコーティングした培養プレートに１０5 個／ｍｌ／
ウェルにて、３７℃、５％ＣＯ2 で培養した。２４時間
後に実施例２で取得した本発明のラット脳ミクログリア
セルラインＲＢＭ１０３、ＲＢＭ１１２およびＲＢＭ１
２９の培養上清を神経細胞の培養液に１０あるいは５０
％（ｖ／ｖ）の割合で加え、５日間培養した後に位相差
顕微鏡を用いて神経突起の状態を観察し、生細胞数をＭ
ＴＴ法（モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ Ｔ），ジャーナル
オブ イムノロジカル メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），６５，５５−６３，１９８３）
にて測定した。結果を表３に示す。実験の結果、本発明
のラット脳ミクログリアセルライン、ＲＢＭ１２９、Ｒ
ＢＭ１０３、またはＲＢＭ１１２の培養上清は、対照の
平均を１００として、それぞれ表３に示す生細胞数を示
した。同時に検討した既知の種々の成長因子は、各々の
作用発現に十分な濃度を添加したにもかかわらず、本発
明の培養上清の効果に匹敵する効果を示す因子はなかっ
た。また神経突起の伸展も本発明の培養上清の添加によ
ってのみ促進されていた。従って、本培養上清中に含ま
れているＮＴＦはこれら既存の成長因子とは異なる、新
規な物質であることが示された。
【００４０】 表 ３ ───────────────────────────────── サンプル（用量） 生細胞数（対照の平均を１００とした） ───────────────────────────────── 対照 １００± ２ ＲＢＭ１２９の培養上清（１０％ (v/v)） １９３± ２ （５０％ (v/v)） ３３９±１０ ＲＢＭ１０３の培養上清（５０％ (v/v)） ２９８± ９ ＲＢＭ１１２の培養上清（５０％ (v/v)） ３１５±１１ ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ） １０３± ４ ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ） １０３± １ ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ） １０２± １ ＴＧＦα（１００ｎｇ／ｍｌ） １０３± ２ ＴＧＦβ（１００ｎｇ／ｍｌ） ９５±１４ ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ） ９９± １ ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ） １０９± ３ ＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ） １００± ６ ＩＦＮα（１０Ｕ／ｍｌ） １２０± ５ ＩＬ−１（１０Ｕ／ｍｌ） １０８± ５ ＩＬ−６（１０Ｕ／ｍｌ） １１３± １ ───────────────────────────────── ＮＧＦ 神経成長因子 ｂＦＧＦ 塩基性線維芽細胞成長因子 ＥＧＦ 上皮細胞成長因子 ＴＮＦ 腫瘍壊死因子 ＰＤＧＦ 血小板由来増殖因子 ＩＮＦα インタ−フェロンアルファ ＴＧＦα 腫瘍増殖因子アルファ ＩＬ−１ インタ−ロイキン−１ ＴＧＦβ 腫瘍増殖因子ベータ ＩＬ−６ インタ−ロイキン−６ ＩＧＦ−Ｉ インシュリン様成長因子
【００４１】
【発明の効果】本発明のラット脳ミクログリアセルライ
ンは、無限増殖性を有するため、試験管内で大量に培養
することができ、ＮＴＦを多量に取得するのに極めて適
している。さらにこのラット脳ミクログリアセルライン
は、ラット由来であるため、既存のマウス由来ミクログ
リアセルラインとは異なった、新規のＮＴＦを提供する
ことができる。
ンは、無限増殖性を有するため、試験管内で大量に培養
することができ、ＮＴＦを多量に取得するのに極めて適
している。さらにこのラット脳ミクログリアセルライン
は、ラット由来であるため、既存のマウス由来ミクログ
リアセルラインとは異なった、新規のＮＴＦを提供する
ことができる。
【００４２】本発明のラット脳ミクログリアセルライン
はミクログリアの生理機能を有しているため、ミクログ
リアの基礎的機能の研究およびその機能を調節する物質
の探索などに幅広く利用することができる。
はミクログリアの生理機能を有しているため、ミクログ
リアの基礎的機能の研究およびその機能を調節する物質
の探索などに幅広く利用することができる。
【００４３】また、本発明のラット脳ミクログリアセル
ラインは、ＳＶ４０温度感受性変異株由来の無限増殖化
遺伝子を導入しており、培養液の温度を調節することに
より増殖性が調節できるため、ＮＴＦの産生に適してい
る。
ラインは、ＳＶ４０温度感受性変異株由来の無限増殖化
遺伝子を導入しており、培養液の温度を調節することに
より増殖性が調節できるため、ＮＴＦの産生に適してい
る。
【００４４】さらに温度変化により、あるいはリポポリ
サッカライド、ＩＦＮ−γなどの刺激剤やレチノイン酸
などの分化誘導剤などの各種薬剤によって処理すること
により、ＮＴＦの産生増大が期待され、また細胞分化の
研究資料として用いることもできる。
サッカライド、ＩＦＮ−γなどの刺激剤やレチノイン酸
などの分化誘導剤などの各種薬剤によって処理すること
により、ＮＴＦの産生増大が期待され、また細胞分化の
研究資料として用いることもできる。
【００４５】本発明の培養上清および／または細胞ホモ
ジネ−トは、神経細胞の生存、成長を直接促進し、神経
細胞の機能を賦活する作用を有するため、神経細胞の機
能が虚血により低下している脳血管障害やそれによる後
遺症、神経細胞の老化により発症すると考えられている
アルツハイマー型老年痴呆など、神経細胞の機能障害を
伴う脳疾患の治療に有効に用いることができる。
ジネ−トは、神経細胞の生存、成長を直接促進し、神経
細胞の機能を賦活する作用を有するため、神経細胞の機
能が虚血により低下している脳血管障害やそれによる後
遺症、神経細胞の老化により発症すると考えられている
アルツハイマー型老年痴呆など、神経細胞の機能障害を
伴う脳疾患の治療に有効に用いることができる。
【００４６】ＮＴＦの持つ、神経細胞の成長、生存の促
進作用は、上記脳疾患の直接的な原因である神経細胞の
機能低下そのものを回復させるため、いままでこのよう
な疾患に用いられてきた脳代謝賦活剤や脳循環改善剤な
どのような対症療法剤と異なり、本質的な治療剤として
医療に貢献することができる。
進作用は、上記脳疾患の直接的な原因である神経細胞の
機能低下そのものを回復させるため、いままでこのよう
な疾患に用いられてきた脳代謝賦活剤や脳循環改善剤な
どのような対症療法剤と異なり、本質的な治療剤として
医療に貢献することができる。
【００４７】本発明は、ラットの脳から得られるＮＴＦ
を含む培養上清および／または細胞ホモジネ−トに関す
るものであるが、同様の物質がヒトの脳にも存在するこ
とが容易に想定されるため、そのような物質を遺伝子工
学などの手法により取得、同定する研究においても、本
発明は有用である。
を含む培養上清および／または細胞ホモジネ−トに関す
るものであるが、同様の物質がヒトの脳にも存在するこ
とが容易に想定されるため、そのような物質を遺伝子工
学などの手法により取得、同定する研究においても、本
発明は有用である。
【００４８】本発明の培養上清および／または細胞ホモ
ジネ−トは非常に重要な生理活性を有するため、必要に
応じて医学、理学上の基礎的な研究に使用するための試
薬としても有効に利用することができる。
ジネ−トは非常に重要な生理活性を有するため、必要に
応じて医学、理学上の基礎的な研究に使用するための試
薬としても有効に利用することができる。
【図１】抗ラージＴ抗原抗体を用いて、当該セルライン
ホモジネートをウエスタンブロット法により染色した結
果を示す図である。
ホモジネートをウエスタンブロット法により染色した結
果を示す図である。
【図２】ミクログリア不死化プラスミドの作製手順を示
す図である。
す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】 以下の性質を有するラット脳ミクログリ
アセルライン。 ａ）細胞の形態：直径約６０±５０μｍのほぼ球形 ｂ）継代培養：無限な継代培養可能 ｃ）機能的特徴：神経細胞の生存、成長、神経突起伸展
を促進する新規な因子を産生し、培養上清中に放出す
る。 - 【請求項２】 ラット脳ミクログリアの遺伝子内に、無
限増殖化遺伝子を組み込むことによって樹立した請求項
１に記載のラット脳ミクログリアセルライン。 - 【請求項３】 前記無限増殖化遺伝子がＳＶ４０温度感
受性変異株のラージＴ遺伝子である請求項２に記載のラ
ット脳ミクログリアセルライン。 - 【請求項４】 微工研菌寄第１２４２６号である請求項
１〜３のいずれかに記載のラット脳ミクログリアセルラ
インＲＢＭ１０３。 - 【請求項５】 微工研菌寄第１２４２７号である請求項
１〜３のいずれかに記載のラット脳ミクログリアセルラ
インＲＢＭ１１２。 - 【請求項６】 微工研菌寄第１２４２８号である請求項
１〜３のいずれかに記載のラット脳ミクログリアセルラ
インＲＢＭ１２９。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載のラット
脳ミクログリアセルラインを樹立するにあたり、組換え
ＤＮＡ技術によってラット脳ミクログリアの遺伝子内
に、無限増殖化遺伝子としてＳＶ４０のラージＴ遺伝子
を組み込むことを特徴とするラット脳ミクログリアセル
ラインの樹立方法。 - 【請求項８】 初代培養ラット脳ミクログリアの培養上
清と同様な神経細胞の生存、成長、神経突起伸展を促進
する作用を有する新規な因子を含有する請求項１〜６の
いずれかに記載のラット脳ミクログリアセルラインの培
養上清および／または当該セルラインの細胞ホモジネー
ト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3204343A JPH0549473A (ja) | 1991-08-14 | 1991-08-14 | ラツト脳ミクログリアセルライン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3204343A JPH0549473A (ja) | 1991-08-14 | 1991-08-14 | ラツト脳ミクログリアセルライン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0549473A true JPH0549473A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=16488937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3204343A Withdrawn JPH0549473A (ja) | 1991-08-14 | 1991-08-14 | ラツト脳ミクログリアセルライン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0549473A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998039415A1 (en) * | 1997-03-05 | 1998-09-11 | Japan Science And Technology Corporation | Established microglia |
| US20230113221A1 (en) * | 2020-03-13 | 2023-04-13 | Sungkwang Medical Foundation | Method for producing bankable and subculturable mature microglia |
-
1991
- 1991-08-14 JP JP3204343A patent/JPH0549473A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998039415A1 (en) * | 1997-03-05 | 1998-09-11 | Japan Science And Technology Corporation | Established microglia |
| US6673605B2 (en) | 1997-03-05 | 2004-01-06 | Japan Science & Technology Corporation | Established cell line of microglia |
| US20230113221A1 (en) * | 2020-03-13 | 2023-04-13 | Sungkwang Medical Foundation | Method for producing bankable and subculturable mature microglia |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4585124B2 (ja) | 神経幹細胞培養物の調製におけるコラゲナーゼの使用 | |
| Yan et al. | Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton’s jelly to dopamine neurons mediated by the Lmx1a and neurturin in vitro: potential therapeutic application for Parkinson’s disease in a rhesus monkey model | |
| US20030161818A1 (en) | Cultures, products and methods using stem cells | |
| EP2368974A1 (en) | Methods for isolating mesenchymal stem cells from embryos of human or animals and extracting secretion substances thereof | |
| JP6648259B2 (ja) | 向上された臍帯由来付着型幹細胞、その製造方法及びその用途 | |
| US20090181087A1 (en) | Use of human cord blood-derived pluripotent cells for the treatment of disease | |
| CN106574243B (zh) | 表达腺病毒e4orf1的神经细胞及其制备方法和应用 | |
| Aposhian | The use of DNA for gene therapy—the need, experimental approach, and implications | |
| CN101421394A (zh) | 存在lif时的神经干细胞扩增 | |
| CN118086207B (zh) | 一种毛囊干细胞诱导分化为神经干细胞的方法 | |
| US20220010280A1 (en) | A composition comprising mesenchymal stem cells for inhibiting adipogenesis | |
| KR102314158B1 (ko) | 중간엽 줄기세포를 포함하는 지방 생성을 억제하기 위한 조성물 | |
| US11702636B2 (en) | Composition inducing cell reprogramming and production method for multifunction cells using said composition | |
| Kuriyama et al. | Mass cultivation of human retinal pigment epithelial cells with microcarrier | |
| Kholodenko et al. | Mouse retinal progenitor cell (RPC) cocultivation with retinal pigment epithelial cell culture affects features of RPC differentiation | |
| JP2022521868A (ja) | 網膜色素上皮細胞シート及びその作製方法 | |
| CN114426951A (zh) | 利用多能干细胞制备小胶质细胞样细胞的方法 | |
| CN110628712A (zh) | 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用 | |
| JP2010535020A (ja) | 頚動脈小体由来の幹細胞及びその使用 | |
| WO2005095587A1 (ja) | 胚性幹細胞から分化した体性幹細胞の製造方法、及びその用途 | |
| EP4703465A1 (en) | Pluripotent stem cell-derived rpe cell, formulation, pharmaceutical composition, reagent, method, and kit | |
| EP1231263A1 (en) | Multipotent O-2A progenitors from the neurohypophysis | |
| CN111235093A (zh) | 一种胚胎干细胞培养基及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19981112 |