JPH0549483A - 生細胞レ−ザ照射方法 - Google Patents
生細胞レ−ザ照射方法Info
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- JPH0549483A JPH0549483A JP3199156A JP19915691A JPH0549483A JP H0549483 A JPH0549483 A JP H0549483A JP 3199156 A JP3199156 A JP 3199156A JP 19915691 A JP19915691 A JP 19915691A JP H0549483 A JPH0549483 A JP H0549483A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- laser
- cell
- cells
- mixed solution
- irradiating
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【目的】レーザを用いた細胞への物質移入において、従
来法よりも高効率で移入を行う方法を得る。 【構成】レ-ザ照射による細胞膜の穴が修復するまでの
間、混合液を低温下に保持しレーザ処理することで達成
される。
来法よりも高効率で移入を行う方法を得る。 【構成】レ-ザ照射による細胞膜の穴が修復するまでの
間、混合液を低温下に保持しレーザ処理することで達成
される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はレーザ光を用いた細胞へ
の物質移入に係り、特に効率良く行なう細胞への物質移
入を行なう生細胞レーザ照射方法に関する。
の物質移入に係り、特に効率良く行なう細胞への物質移
入を行なう生細胞レーザ照射方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、レーザ光を用いた細胞への物質移
入については特公昭62-7837号公報に記載のものがあ
る。この方法はレンズにより細く絞ったレーザビームを
生細胞上に照射して穿孔し、外部溶液中の物質を移入す
るもので、操作性に優れた特徴がある。
入については特公昭62-7837号公報に記載のものがあ
る。この方法はレンズにより細く絞ったレーザビームを
生細胞上に照射して穿孔し、外部溶液中の物質を移入す
るもので、操作性に優れた特徴がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術は、レ−
ザ光による細胞の穴は通常は短時間で修復してしまい、
修復に要する時間を延長することについては述べられて
はいない。また電気パルス法において混合液を低温保持
し、物質を移入した例は一般的に知られているが、レ−
ザ式インジェクションについては述べられていない。
ザ光による細胞の穴は通常は短時間で修復してしまい、
修復に要する時間を延長することについては述べられて
はいない。また電気パルス法において混合液を低温保持
し、物質を移入した例は一般的に知られているが、レ−
ザ式インジェクションについては述べられていない。
【０００４】本発明の目的は、移入しようとする物質と
宿細胞と緩衝液の混合溶液中の細胞に単にレ−ザ照射す
るだけでなく、何らかの工夫を施し高効率で物質移入体
が得られる生細胞レーザ照射方法を提供することにあ
る。
宿細胞と緩衝液の混合溶液中の細胞に単にレ−ザ照射す
るだけでなく、何らかの工夫を施し高効率で物質移入体
が得られる生細胞レーザ照射方法を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を解決するため
には、移入しようとする物質と宿細胞と緩衝液の混合溶
液中の細胞に単にレ−ザ照射するだけでなく、混合液を
低温に保持しレ−ザ照射による細胞膜の穴が修復する時
間を延長することにより、達成される。
には、移入しようとする物質と宿細胞と緩衝液の混合溶
液中の細胞に単にレ−ザ照射するだけでなく、混合液を
低温に保持しレ−ザ照射による細胞膜の穴が修復する時
間を延長することにより、達成される。
【０００６】
【作用】移入しようとする物質と宿細胞と緩衝液を加え
た混合溶液を、低温に保持することによって、レ−ザ照
射による生体膜の穴が修復する時間を遅くさせる。この
状態でレ−ザ照射を行なうことにより従来より高効率で
細胞内に物質を取り込ませることが出来る。
た混合溶液を、低温に保持することによって、レ−ザ照
射による生体膜の穴が修復する時間を遅くさせる。この
状態でレ−ザ照射を行なうことにより従来より高効率で
細胞内に物質を取り込ませることが出来る。
【０００７】
【実施例】以下、本発明の一実施例を説明する。使用し
た装置はＹＡＧレーザを用い、顕微鏡の対物レンズを通
してレーザ光を生細胞に照射するレーザ式セルプロセッ
サである。すなわち、このレ−ザ照射装置は、倒立顕微
鏡を介して紫外パルスレ-ザ(YAGレ-ザ、355nm)をφ0.5
μm程度のマイクロスポットとして集約でき、それを試
料上の任意の位置に照射することができる。従って、目
的とする細胞に微小の穴を開け、その穴が修復する間に
細胞内に細胞の周囲の遺伝子を含んだ溶液を取り込ませ
細胞の形質転換を行わせるものである。以下実験材料及
び手順について示す。
た装置はＹＡＧレーザを用い、顕微鏡の対物レンズを通
してレーザ光を生細胞に照射するレーザ式セルプロセッ
サである。すなわち、このレ−ザ照射装置は、倒立顕微
鏡を介して紫外パルスレ-ザ(YAGレ-ザ、355nm)をφ0.5
μm程度のマイクロスポットとして集約でき、それを試
料上の任意の位置に照射することができる。従って、目
的とする細胞に微小の穴を開け、その穴が修復する間に
細胞内に細胞の周囲の遺伝子を含んだ溶液を取り込ませ
細胞の形質転換を行わせるものである。以下実験材料及
び手順について示す。
【０００８】細胞はラット腎臓由来細胞（ＮＲＫ）を用
いた。導入する物質は、Mulligan等によって開発された
優性選択遺伝子であるグアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ遺伝子（Ecogpt）を用いた。この遺伝子はほ
とんどの高等生物が持っていない。従って、アミノプテ
リンやマイコフェノール酸でＧＭＰ合成系を阻害すると
培養細胞は生存できない。ところが、この細胞にEcogpt
とキサンチンを導入するとＧＭＰ合成の経路ができて生
存可能となる。つまり、Ecogptの導入実験を行った後、
アミノプテリン、マイコフェノール酸、キサチンを含む
培地で培養するとこの遺伝子が導入された細胞のみ生存
できることになる。
いた。導入する物質は、Mulligan等によって開発された
優性選択遺伝子であるグアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ遺伝子（Ecogpt）を用いた。この遺伝子はほ
とんどの高等生物が持っていない。従って、アミノプテ
リンやマイコフェノール酸でＧＭＰ合成系を阻害すると
培養細胞は生存できない。ところが、この細胞にEcogpt
とキサンチンを導入するとＧＭＰ合成の経路ができて生
存可能となる。つまり、Ecogptの導入実験を行った後、
アミノプテリン、マイコフェノール酸、キサチンを含む
培地で培養するとこの遺伝子が導入された細胞のみ生存
できることになる。
【０００９】レ−ザ処理に用いるガラスシャ−レは、直
径25mmで、底面には10mmの穴が開いており、底には厚さ
0.15mmのカバ−グラスがはりつけられている。このガラ
スシャ−レを図１に示す。
径25mmで、底面には10mmの穴が開いており、底には厚さ
0.15mmのカバ−グラスがはりつけられている。このガラ
スシャ−レを図１に示す。
【００１０】以下、レ−ザ照射時の操作手順について説
明する。図１において、ＮＲＫ細胞を培養しているガラ
スシャ−レ１中の培養液を吸いとる。この時ＮＲＫ細胞
は付着性の細胞であるためガラス面からとれない。次
に、20μg/mlの遺伝子を含む培地を200ml添加する。そ
してガラスシャ−レ１に蓋をし、パラフィルムで密封す
る。このガラスシャ−レ１を、ＮＲＫの細胞膜が固相で
ある温度、５℃のインキュベ−タ−中に約１時間静置し
た後、５℃の冷却水が循環しているレ−ザ照射装置の試
料台の上に置く。この時、試料台とガスシャ−レ１の接
触面に水、又はグリスを塗布し双方を密着させる。次に
レ−ザ処理を行う。レ−ザ処理後、再びインキュベ−タ
−中に約１時間静置した後、培地を1ml加え、37℃,5%CO
2で培養した。
明する。図１において、ＮＲＫ細胞を培養しているガラ
スシャ−レ１中の培養液を吸いとる。この時ＮＲＫ細胞
は付着性の細胞であるためガラス面からとれない。次
に、20μg/mlの遺伝子を含む培地を200ml添加する。そ
してガラスシャ−レ１に蓋をし、パラフィルムで密封す
る。このガラスシャ−レ１を、ＮＲＫの細胞膜が固相で
ある温度、５℃のインキュベ−タ−中に約１時間静置し
た後、５℃の冷却水が循環しているレ−ザ照射装置の試
料台の上に置く。この時、試料台とガスシャ−レ１の接
触面に水、又はグリスを塗布し双方を密着させる。次に
レ−ザ処理を行う。レ−ザ処理後、再びインキュベ−タ
−中に約１時間静置した後、培地を1ml加え、37℃,5%CO
2で培養した。
【００１１】本実施例によれば、以上の操作により、細
胞膜の流動性が低下するため、穴の修復に要する時間を
延長することが出来る。
胞膜の流動性が低下するため、穴の修復に要する時間を
延長することが出来る。
【００１２】
【発明の効果】本発明によれば、移入しようとする物質
と細胞と緩衝液を加えた混合液を低温に保持することに
より、従来行っていた方法よりも高効率で細胞内に物質
を移入することができる。
と細胞と緩衝液を加えた混合液を低温に保持することに
より、従来行っていた方法よりも高効率で細胞内に物質
を移入することができる。
【図１】本実験に用いたガラスシャーレでのレ−ザ処理
時の概略説明図である。
時の概略説明図である。
１…ガラスシャーレ、３…カバーガラス、４…細胞、５
…レーザー、９…混合液（移入物質、培地）。
…レーザー、９…混合液（移入物質、培地）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｕ 7236−4Ｂ 5/10 13/00 2121−4Ｂ
Claims (4)
- 【請求項１】顕微鏡の対物レンズを通してレ−ザ光を生
細胞に照射する方法に於いて、前記移入しようとする物
質、生細胞、緩衝液を加えた混合液を低温に保持し、レ
ーザ光を照射して細胞への物質移入を行なうことを特徴
とする生細胞レーザ照射方法。 - 【請求項２】前記細胞の入った混合液を低温に保持する
温度が、細胞のリン脂質膜が固相となる温度以下である
ことを特徴とする請求項１記載の生細胞レーザ照射方
法。 - 【請求項３】前記細胞の入った混合液を低温に保持する
方法が、冷却水が循環する台の上に混合液の容器を置く
ことを特徴とする請求項１記載の生細胞レーザ照射方
法。 - 【請求項４】前記細胞の入った混合液を低温に保持する
方法が、必要とする温度に制御された部屋の中に混合液
の容器を置くことを特徴とする請求項１記載の生細胞レ
ーザ照射方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3199156A JPH0549483A (ja) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | 生細胞レ−ザ照射方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3199156A JPH0549483A (ja) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | 生細胞レ−ザ照射方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0549483A true JPH0549483A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=16403090
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3199156A Pending JPH0549483A (ja) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | 生細胞レ−ザ照射方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0549483A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4593857B2 (ja) * | 1999-09-09 | 2010-12-08 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | 膜の穿孔方法および装置 |
| JP2015167551A (ja) * | 2014-03-11 | 2015-09-28 | 国立大学法人山口大学 | 細胞内への外来物質の導入方法 |
| CN108472417A (zh) * | 2015-11-12 | 2018-08-31 | 托德.F.奥沃凯蒂斯 | 用于生成、使用和递送活化的干细胞的方法和系统 |
| US11905510B2 (en) | 2014-05-30 | 2024-02-20 | Todd Frank Ovokaitys | Methods and systems for activating cells to treat aging |
| US12246037B2 (en) | 2020-12-08 | 2025-03-11 | Todd Frank Ovokaitys | Methods and systems for increased production of stem cells |
-
1991
- 1991-08-08 JP JP3199156A patent/JPH0549483A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4593857B2 (ja) * | 1999-09-09 | 2010-12-08 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | 膜の穿孔方法および装置 |
| US8507258B2 (en) | 1999-09-09 | 2013-08-13 | Akita Prefectural University | Apparatus for perforating membrane |
| JP2015167551A (ja) * | 2014-03-11 | 2015-09-28 | 国立大学法人山口大学 | 細胞内への外来物質の導入方法 |
| US11905510B2 (en) | 2014-05-30 | 2024-02-20 | Todd Frank Ovokaitys | Methods and systems for activating cells to treat aging |
| CN108472417A (zh) * | 2015-11-12 | 2018-08-31 | 托德.F.奥沃凯蒂斯 | 用于生成、使用和递送活化的干细胞的方法和系统 |
| US12246037B2 (en) | 2020-12-08 | 2025-03-11 | Todd Frank Ovokaitys | Methods and systems for increased production of stem cells |
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