JPH05500310A - 融合蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 融合蛋白質の製造方法 主凱公宜景 本発明は組換えポリペプチドの生産に関し、特に複数の融合ドメインを有する合 成蛋白質の製造に関する。更に詳しくは、本発明は２つの生化学的活性を有する 組換え融合蛋白質の製造方法に関し、例えば選択された特性や活性を有する結合 分子とレセプター蛋白質のような組換え融合蛋白質等である。このような融合蛋 白質は、画像化処理、種々ヒト癌、感染症、機能性疾患の治療及び診断に役立て たり、ワクチンの研究開発に応用することができる。

２つの活性及び／又は機能を有する融合蛋白質は公知であり、ペプチドホルモン 、酵素、輸送（トランスポート）蛋白質、レセプター蛋白質、ウィルス外殻（コ ート）蛋白質、インターロイキン、リンフ才力イン、免疫グロブリン（Ｉｇｓ） およびこれらの（フラグメント）の結合などが知られている。

これらの融合蛋白質のあるものは、増強された抗原性をもっていることが知られ ワクチンの製造に有用であり、あるものは高い生化学的活性があるため感染症、 欠乏症、その他の疾患の治療に役立つ。またあるものは、増強された標的能力が あるために診断薬として使用できる。（参考：融合蛋白質の例としてｔｌ、ｓ、 　４，２２３，２７０．　Ｕ、Ｓ、　４，８０１．５８６　ＣＡ　１２１７１５ ６Ａ、　ＷＯ３８０６６３０Ａ、　ＪＰ　６３２６７２７８Ａ）免疫グロブリン 分子は融合蛋白質（例キメラ抗体）として生産されていた。免疫グロブリン分子 は、ある特殊な特異性をもつ種から最初の１ｇ分子を最初の蛋白質ドメイン（例 可変部領域）にもち、別の特異性を持つ異なった種からの第２のＩｇを第２ドメ イン（不変部領域）にもつ融合ポリペプチドを形成やすい構造をもつ。免疫グロ ブリン分子は非キメラモノクローナル抗体に代わるものとして開発されたが、そ の多くは非ヒト由来（例ウィルス）であるためヒトに抗原性をもつ、ヒトモノク ローナル抗体は、最も好ましい治療剤であり極めてヒトの免疫反応を減少させる 作用がある。しかし細胞融合によるヒトモノクローナル抗体の生産方法は、免疫 になったヒト膵臓細胞が難しくて簡単につくれないし、ヒトのハイブリドーマは とりわけ不安定であるため困難をきわめる。

ヒトのアミノ酸配列と非ヒトアミノ酸配列からなるキメラ抗体は、ヒトの免疫反 応を減少させ、それ故に良好な治療効果がある。更にハイブリッド抗体分子は異 なった哺乳動物からのＩｇのｌｉｇｈｔ（Ｌ）鎖とｈｅａｖｙ（Ｈ）１１のアミ ノ酸配列が提案されていた。このようにしてできたキメラ抗体は、哺乳動物に通 常マウス）由来の可変部（Ｖ）　Ｓｉ域とヒト又は他の哺乳動物由来の不変部（ Ｃ）　Ｓｉ域から構成されている。（例えばＥＰＯ１出願番号逼８４３０２３６ ８．０　（ジェネテック社）８５１０２６６５．８　（日本のリサーチテベリッ プメント社）　８５３０５６０４．２　（スタッフォード大学）　；　Ｐ、Ｃ， Ｔ、出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＧＢ８５１００３９２　（セルテンク社）；モリソンｅ ｔ　ａｌ、　Ｐｒｏ、　Ｎｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８１：　５８５１ −６８５５；ボウリアンｅｔ　ａｔ、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１上６ ４３−６４６；　スハーゲンｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｊ、　Ｉｍｍｏｌ、 １３７　：１０６６−１０７４）予め決められた特性を持つ組換えキメラ抗体の 生産は、特にクローン化したゲノムＤＮＡフラグメントを使用する６例えば、Ｈ 鎖とＬ鎖をコードしたゲノムＤＮへ配列は、再配列した形（即ち、Ｂ細胞が成熟 している間の組換えから生じたＤＮＡ配列）でクローン化することができる。こ れらのゲノム配列はそれ自体の発現に必要な情報を保持している（即ち５′末端 の翻訳されていない配列、プロモーター、エンハンサ−１蛋白質コード領域、ド ナースプライスサイト）。

■遺伝子フラグメントの３′末端の供与体スプライスシグナルは、他の種のＩｇ ｅＩ域の５′末端のスプライスアクセプターサイトに対応している。即ち２つの スプライス産物は、正しいフレームシフトを保っている。例えば、マウスＶとヒ トＣに片が接合し、適当な宿主細胞に形質転換された時、最初の転写は正しくス プライスされ、その結果■およびＣ領域を通じて成熟したメンセンジャーＲＮＡ 　（ｍＲＮＡ）分子の中にオープンフレームシフトすることになる。

組換えキメラ抗体の発現にゲノム■領域フラグメントを使用することは欠点があ る。まず、ゲノムＶｅＩ域断片を単一コピー遺伝子にクローニングさせるのは骨 の折れる仕事であり、ファージライブラリーの多数の独立したクローンのスクリ ーニングが必要である。更に多くのハイブリドーマは、多様に再配列した■遺伝 子を含んでいて、それらの多くは生産性のないハイブリドーマである。発現した ＶＬやＶＨ断片の同定方法は、発現したｍＲＮＡ　（相補ＤＮＡ又はｃ　ＤＮＡ ）のＤＮＡコピーをクローニングし配列決定することによって確認すると同様、 真人なりＮＡ配列分析を必要とする。

もっとも直接的な方法として、Ｌ鎖Ｈ鎖両方に対しｃ　ＤＮＡをクローンし、そ のｃ　ＤＮＡ発現ベクターを利用する方法がある。この場合、ＩｇのｍＲＮ八は ハイブリドーマ細胞中に非常に豊富なため、クローニングは単純で早いし、また ｃ　ＤＮＡをクローニングするには最も効果的方法である。しかしこの方法では 、異なったｒｇのｃ　ＤＮＡから異なったｖ領域とＣ領域（キメラ抗体の場合、 マウスｙ　Ｓｉ域とヒトＣ領域）を別々に発現させたい場合問題が起こる。Ｉｇ のｃ　ＤＮＡはｍＲＮＡを直接コピーしそのｍＲＮＡは連続したポリペプチド配 列中へ通常のｉｎ　ｖｉｖｏ　ＲＮＡスプライシングによる■エクソンとＣエク ソンの融合である。

例えばマウス■８とヒトＣＹＩの正確な切除と組換えは、適当な制限酵素切断サ イトが両方の配列のＶＣ接合部に存在しないため不可能である。キメラ抗体の発 現には、クローン化したｃ　ＤＮＡを使用しなければならない。この方法は、Ｖ Ｃ接合部付近のマウスＶ′６′ｆ４域とヒトＣ領域の両方の配列の突然変異の誘 発をも必要とする。これによって、通常の制限酵素切断サイトを直接接合したｃ 　ＤＮＡフラグメントにつくることができる。

（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　Ｇｅｎｅ５４：３３−４０）本発明の目 的は、融合したポリペプチドを生産する方法を提供することにある。第２の目的 は、予め決められた抗原特性を持つキメラ免疫グロブリン分子のような、２つの 活性及び又は機能を持つ融合蛍白質を生産する方法を提供することにある。第３ の目的は、ヒト／非ヒト哺乳動物キメラ抗体をつくる比較的単純で早い方法を提 供することであり、ヒトの体へ低い抗原性を持つトランケーテンドバージョンを 造る方法を提供することにある。更に第４の目的は、オーダーメート型のキメラ 免疫グロブリンを、特に他の遺伝子に容易にくっついて形質導入され宿主細胞に 発現するエンジニアＶｅＩ域遺伝子を利用して速やかに生産する方法を提供する ことにある。

１１と【ｈ 本発明は、融合蛍白質の生産に一般的に通用する方法を提供するもので、本発明 の融合蛋白質は少なくとも酵素、毒素ペプチド、ホルモンペプチド、リンフ才力 イン、ホルモン、インターロイキン、免疫グロブリンを含む。本発明はまた、ク ローン化されたｃ　ＤＮＡ５、例えばＩｇ　ｃＤＮＡの修飾に関し、予め決めら れた特異性のあるＶｍＩ域のようなポリペプチドは同種または異種のＩｇＨＮ域 のような種々ポリペプチドの一つと融合した独立したユニットや独立カセットと して発現することができる。

本発明の新しい方法として、天然杉制限酵素切断サイト又は３′末端を持つ第１ のポリペプチドをコードしたＤＮ八へ列と、第２のポリペプチドをコードしたＤ ＮＡ配列との融合を可能にするリンカ−／アダプター（２／ａ）の造設がある。

そのｊＬ’ａ配列は、３′末端近くの制限酵素切断サイトから３′末端までの第 １のポリペプチドをコードしたＤＮＡ配列を５′末端からの配列中に含む。スプ ライスドナーサイトは、第２のポリペプチドをコードしたＤＮＡの５′末端のス プライスアクセプターサイトに対応する。好ましくは、長さ８０のヌクレオチド 塩基より大きい共通のイントロンを含む。

融合蛋白質を生産するために、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、 遺伝子配列の３゛末端の近くの適当な制限サイトを切断する。このためＣ／ａの ５′末端は制限酵素切断サイトで連結し、５′末端でスプライスドナーサイトと カセットをつ（る。宿主の真核細胞は、第２のポリペプチドをコードし且つその ５′末端で相補するスプライス　アクセプターを持つ第２のＤＮＡ配列と同様、 そのカセットを形質導入される。

第１のポリペプチドをコードしている第１のＤＮＡ配列は、３′から５′末端付 近との間にある制限酵素切断サイドで切断するため、第１のＤＮＡ配列に新しい ５′末端をつくる。

ｌ／ａは第１のＤＮＡ配列の新しい５′末端に連結する。この！／ａは３′末端 からの配列中に、５′末端近（の制限酵素切断サイトから５′末端までの第１の ポリペプチド部分をコードしているＤＮＡを含み、第２のポリペプチドをコード しているＤＮＡの３′末端上のスプライスドナーサイトに対応するスプライス　 アクセプタ一部位を含んでいる。本発明のためには、１／ａは長さ８０ヌクレオ チド塩基以上のものを含む。

融合蛋白質を生産するために、第１のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列 は、遺伝子５′末端近くの適当な制限酵素切断サイトを切断する。このためＱ／ ａの３′末端はその制限酵素切断サイトと結合し、その５′末端でスプライス　 アクセプタ一部位とカセットをつくる。宿主の真核細胞は、第２のポリペプチド をコードし且つその３′末端で符号するスプライス　アクセプターを持つ第２の ＤＮＡ配列と同様、そのカセットを形質転換される。形質転換された細胞は培養 すると、カセットと第２のＤＮＡ配列を単鎖融合蛋白質のように発現する。

キメラ抗体を生産する場合、その方法はｃ　ＤＮへの再造設を必要とする。ｃ　 ＤＮＡの■領域をコードする部分に特異的な天然杉制限酵素切断サイトにおいて 、ｃ　ＤＮＡはＶ領域の移動した３′末端と入れ代わった合成されたＤＮＡ配列 に接合することで制限され、且つ■領域にコードしているゲノムＤＮ＾上に通常 見られる供与体スプライスサイトのふりをする３′　ドナースプライスサイトを 連結されている。このＶＴｉｌＴｉｌツカセット的５′スプライスアクセプター サイトを持ち、ＣＭ域をコードしている他のＤＮＡ配列と連結するのに使用され たり、他の蛋白質をコードしたエクソンとの連結に利用されたりする。

ｃ　ＤＮＡは逆転写酵素と、少なくともＩｇＶ領域をコードしている　ｍ　ＲＮ Ａ配列を使って合成される。このＶｊＩ域をコードしているＤＮＡ配列は５′側 に制限酵素切断サイトをもち、その制限酵素切断サイトはｙ　６１域配列をＣ領 域をコードしているフランキング配列の接合部付近に存在している。特徴的制限 酵素切断サイトは特別のＤＮＡ配列として選択される必要があり、例えばまれに ■領域ＤＮＡに見られるＤＮＡ配列あるいは、ＤＮＡ切断能力のある特殊な制限 エンドヌクレアーゼで認識できるＤＮＡ　＝己列でなければならない。

特徴的制限酵素切断サイトの消化はフラグメントをつくり、このフラグメントは ほとんどのＶｅｉ域をコードしており、好ましいものは３′末端を有している。

３′末端には、本明細書中ではｌ／ａ配列として書かれているオリゴデオキシヌ クレオチドが結合している。２／ａ配列はＶＣ接合部５′側から制限酵素切断サ イトまでのＤＮＡ部分を含んでいる。更に！／ａ配列は３′末端にドナースプラ イスサイトがあり、ｍ　ＲＮＡ組立ての間核の中で起るスプライシングや再配合 に先立って、■領域をコードしているゲノムＤＮＡに存在するスプライスサイｌ −のような機能をはたす。接合が起った時、■領域をコードしている制限ｃ　Ｄ ＮＡとｌ／ａ配列との形が、本発明の■領域カセットである。

ハイブリドーマやミエローマのような適当な宿王細胞は、Ｖ？＋Ｉ域力セントを 含むベクター、及びＣ領域配列のように５′末端にスプライスアクセプタ一部位 とストップシグナルを持つポリペプチドをコードしているＤＮＡと共に形質転換 される。

そのスプライスアクセプターサイトは、ｙ　６Ｉ域力セント３′末端上のスプラ イスドナーサイトと適合する。第２のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列 は、容易にヒトゲノムライブラリーから取り出すことができる。−世分離したな らば、ヒトＣＮ域をもつＩｇの製造はくり返して行うことができる。

形質転換細胞は、培養され■領域カセットとＣ領域ＤＮＡを同時に発現する。■ 領域カセットとＣｅＭ域ＤＮＡを接合したクローンは、それぞれのＶとＣ領域の ＤＮＡをスプライスして、完全な長さの■領域とＣ？ＩＩ域からなる合成融合蛋 白質をコードしたｖｓ　ＲＮＡを生産する。適切にＣＭ配列とＣＬ配列の中に導 入され、■８と■、をコードしている。■工とＣＬ配列を並列して適切に導入さ れる■Ｈと■、をコードする構成とともに協形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ ｉｏｎ）することで、希望する種類からのオリジナルＩｇとＣ領域のそれと似た 結合特性を有する明確なＦｖ　ドメインををする結合蛍白質を発現する。

本発明によれば、ポリペプチドはマウス由来のＩｇＶ領域とヒトＣｐｎ域の一部 を含み、キメラｒｇあるいはそのフラグメントを形成する。キメラＩｇという冨 葉は異った特異性及び又は異った種のＩｇからのアミノ酸配列をもつＩｇとして 使われている。

しかし、与えられたＶ領域はこのようにして結合しＩｇＣ領域を除いたポリペプ チドをつ（す、１ｇ以外のキメラ結合分子を生産する。さらに、■領域はできる 融合蛋白質の一部である必要は全くない。

凹血皇呈車星註肌 本発明自体並びに該発明に関する上述の記載、目的及び特徴は、添付の図面と共 に以下の記載を読むことにより、より良く理解されうるであろう。

第１Ａ及び第１Ｂは、本発明の方法に係る略図である。

第２図は、ヌクレオチド配列及びマウスモノクローナル抗体の１４，１８Ｈ鎖ｖ 領域の演纏された対応アミノ酸配列であり、該領域はリーダー配列、■領域、Ｖ Ｃジャンクション及びＣＭ域の一部を包含する。

第３図は、ヌクレオチド配列及びマウスモノクローナル抗体の１４．１８Ｈ鎖■ 領域の演鐸された対応アミノ酸配列であり、該領域はリーダー配列、■領域、Ｖ Ｃジャンクション及びＣｗｊｌ域の一部を包含する。

第４図は、代表的Ｈ鎖領域カセットの構成を概略的に示す。

第４Ａ図は、■領域及びＣ？、Ｉ域を含むマウスＨ鎖ｃ　ＤＮＡの略図である。

第４Ｂ図は、■領域カセットの概略図Ｓｃａ　ｌサイトで、■領域の３′末端の コピーとスプライスドナーサイト（Ｓｃａｌ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ）よりなる１、　 ／ａＤＮ＾配列に連鎖された■領域ｃ　ＤＮＡ配列を含むｙ　ｇＪ域カセットの 略図である。

第４Ｃ図は、アミノ酸配列及びＶＳＩ域にある独特制限酵素切断サイト（本文で はＳ　ｃ　ａ　ｔ）からＶＣジャンクション（垂直線で示される）を通って伸び ているマウスＨ１ｊゲノムＤＮＡの一部に対応するｃ　ＤＮＡである。

第４Ｄ図は、独特制限酵素切断サイトＶＣジャクジョンに伸びていて、Ｖ　？、 Ｎ域末端末端接してスプライスドナーサイトを有する「ユニバーサルイントロン 」を含む■領域配列の一部よりなるｆ／ａの略図である。

第５図は、代表的り鎖ｙ　６Ｂ域カセントの構成を概略的に示す。

第５Ａ図は、■領域及びｃ　ｉＩ域を含むマウスＬ鎖ｃ　ＤＮＡの略図である。

第５Ｂ図は、ｙ　６Ｉ域力セントの概略図でＡｆｌＩ［［部で■領域の３′末端 のコピーとスプライスドナーサイト（Ｓｃａｌ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ［Ｉ）よりな るｌ　／ａＤＮＡ配列に連鎖されたｙ　ｊｌ域ＣＤＮＡ配列を含むＶ領域カセッ トの略図である。

第５Ｃ図は、アミノ酸配列及び■領域にある独特制限酵素切断サイト（本文では ＡｆｌＩ［）からＶＣジャンクション（垂直線で示される）を通って伸びている マウスＬ鎖の一部の対応するｃ　ＤＮＡである。

第５Ｄ図は、独特制限酵素切断サイ）ＶＣジャンクションに伸びていて、Ｖｆｉ Ｉ域末端に隣接してスプライスドナーサイトラ有する「ユニバーサルイントロン 」を含む■領域ＤＮＡ配列の一部よりなるｌ／ａのヌクレオチド配列である。

第５Ｅ図は、Ｉｌ／ａの略図である。第６図は、キメラＩｇ発現ベクターの構成 のための典型的クローニング　ストラテジ−（ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｔｒａｔｅｇ ｙ）を示す。第６Ａ図は、ＶＨ領領域上セントＶＨとヒトＣ領域ＤＮＡよりなる ）のｐＤＥＭ発現ベクターへのインテグレーションに係る概略図である。

第６Ｂ図は、■ＨＨ域カセットとヒトＣｅ１ｌ域遺伝因子を含む完全Ｈ鎖ｐＤＥ Ｍ−ＶＣ発現ベクターの概略図である。

第６Ｃ図は、■Ｌ領域カセットとヒトＣｗｉ域遺伝因子を含む完全り鎖ｐＤＥＫ −ＶＣ発現ベクターの概略図で、ｐＤＥＭ−ＶＣベクターにＤＮＡ配列を融合し たＶＬＳＩＬＳＩツカセット定常領域の挿入位置を示す。

光里夏昆鞭星止匪 本発明に係る方法は、ＤＮＡ配列を含むポリペプチドをコードするカセットの構 築に関する。これにより、該ポリペプチドコードＤＮＡフラグセメントを相補性 のスプライス配列を有する第２の該ポリペプチドコードＤＮＡフラグセメントに スプライスし、よって融合蛍白の以後の転写・翻訳をさせる。第１図は、本発明 に係る方法を概略的に示す。

第１Ａ図において、カセットの構築が示され、それはスプライスドナーサイト（ ｓ、ｄ、）の３′末端の再構成並びにスプライスドナーサイトのＤＮＡ配列また は第一のポリペプチド（例えば、毒素、酵素、リンフ才力イン、インターロイキ ン、ホルモン、成長因子あるいは可変■領域１ｇ分域遺伝子）をコードしている エクソンの３′末端に対するその付加を示す。

該カセットは、第二のポリペプチド相補性のスプライス供給体（ｓ、ａ、）をそ の５′末端に有する（例えば、成長因子、毒素、酵素、リンフ才力イン、インタ ーロイキンあるいは不変Ｃ領域遺伝子）に対して発現可能なりＮＡ　（構造遺伝 子）で形質転換（ｔｒａｎｓｅｆｅｃｔ）される。形質転換細胞の発現に至る配 列中に、二個のエクソンがスプライスされ、第一のポリペプチドをコードし、も う一つの蛋白分域、例えば、ヒトＣ領域の全部または一部をコードする３′末端 を有する成熟ｍＲＮＡをつくる、結果として形成される単鎖ポリペプチドは、第 一のポリペプチドと第二のポリペプチド融合体である。

第１Ｂ図において、カセットの構築が示され、それはスプライスアクセプターサ イト（Ｓ、ａ、　）の５′末端の再形成及びそのＤＮＡ配列の５′末端あるいは 第一のポリペプチド（例えば、毒素、酵素、リンフ才力イン、インターロイキン 、成長因子あるいは不変Ｃ領域のようなＩｇ分域遺伝子）をコードしているエク ソンを示す。該カセットは、第二のポリペプチド相補性のスプライスアクセプタ ー（Ｓ、ａ、）部をその５′末端に有する（例えば、成長因子、毒素、酵素、リ ンフ才力イン、インターロイキンあるいは不変Ｃ領域遺伝子）に対して発現可能 なりＮＡ　（構造遺伝子）で協形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｅｆｅｃｔ）される。

形質転換細胞の発現に至る配列中に、二個のエクソンがスプライスされ、第一の ポリペプチドをコードし、もう一つの蛋白分域をコードする５′末端を有する成 熟ｍＲＮＡをつくる。結果として形成される単鎖ポリペプチドは、第一のポリペ プチドと第二のポリペプチド融合体である。

例えば、ＩｇＶ領域カセントをＣ８ｉ域免疫グロブリンに至るまでスプライスす ることができ、その結果完全なＩｇ、ＨあるいはＬ鎖あるいはその一部分の発現 ができる。

択一的に、毒素遺伝子−コードカセットをＩｇＳＩ域をスプライスして、［魔法 の弾丸（ｍａｇｉｃ　ｂｕｌｌｅｔ）　」タイプの治療剤をつくることができる 。

形質転換細胞の発現に至る配列中に、二個のＤＮＡ配列から誘導されたｍ　ＲＮ Ａがスプライスし、完全ＶＨあるいはＶＬＡコードした５′末端、もう一つの蛋 白分域、例えば、ヒトＣ領域の全部または一部をコードしている３′末端とを有 する成熟ｍ　ＲＮＡをつ（る。結果として形成される単鎖ポリペプチドは、ｙ　 ９ｉ域と構造遺伝子のエクソンによりコードされたペプチドとの融合体である。

例えば、■領域カセットをＣＭ域配列に至るまでスプライスすることができ、そ の結果１ｇ分子、ＨあるいはＬ鎖あるいはその一部分ができる。

代表的な場合には、抗体の様なキメラ結合蛋白の形成を含む。

第１図に示された方法によると、ＩｇＶ６１域カセ・ノドがつくられ、それはｖ ＢＢ域の３′末端の再構築とスプライスドナーサイトのｖｈ及びもしくはＶｌコ ードｃ　ＤＮＡ配列（第一ポリペプチド）への付加を含む、ｄＡ成された■領域 ｃ　ＤＮＡは、５′末端においてスプライスドナーサイトを有するＩｇ定常領域 （第二ポリペプチド）に対して構造遺伝子と協形質転換される。

ｃ　ＤＮＡは、一定の特異性を有するＨあるいはＬ領領域（大抵はヒト以外、例 えばマウス）をコードし、一方Ｃ領域エクソンはもう一つの（大抵はヒト）１ｇ 種のＨあるいはＬ鎖■領域領域をコードする。

単独のコンピテント宿主細胞中のＨ及びＬ構成体の発現は、結果として望ましい 特異性を有する完全なキメラ免疫グロブリン及び、例えば、完全なヒト定常領域 がつくられる。

有用なＶＨ域には、多くの神経芽細胞腫、黒色腫、膠腫及び小肺癌系統と組織の 表面にジシアルガングリオシノド（ｄｉｓ−ｉａｌｏｇａｎｇｉｉｏｓｉｄｅ） 　Ｇ　Ｄ　２を認めるマウスモノクローナル抗体４　、　１８　（Ｍｕｊｏｏ　 ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｃａｎｃｃｒ　Ｒｅｓ、　４７：１０９８１１０ ４）のＶＨ及びＶＬ分域を含む。この■領域を１ｇヒト　ガンマ（Ｈ）及びカン パ（Ｌ）鎖のそれのような種々のＣ領域と結合することができる。択一的に、ｙ 　％ｐ域をヒト起源としてもよい。

■領域を含む融合ポリペプチドをつ（るために、■領域カセットかつ（られ、そ れは例えば、ＤＮＡコードＣ９Ｍ域配列と共に、適切なベクター中に配置される 。

■領域カセットは、次のようにつくられる。ｃ　ＤＮＡは、ｍＲＮＡをコードし たＣ領域中に富んでいる細胞から単離したｍＲＮＡから合成される。

有用な細胞源にはリンパ球、骨髄腫及びハイブリドーマのようなリンパ様細胞が ある。ｍＲＮＡの単離及びｃ　ＤＮＡの合成には、多数の確立されたプロトコー ルが利用可能である。

（例えば、マニアテスらを参照）Ｌ鎖あるいはＨ鎖Ｃｗ４域の何れか、両者を検 出するため、最も長いｃ　ＤＮＡ分子を、例えば特定のＣｈ　（Ｃ７０，ＣＬ　 （Ｃｋ）配列あるいは他のニックトランスレートされ、あるいはオリゴヌクレオ チドプローブで確認する。その上で、■領域３′末端のＤＮＡ配列を確認し、ｖ ６１域内でＶＣジャンクションにできるだけ近くにある独特制限酵素切断サイト を捜し出すために配列される。

次の段階は、独特制限酵素切断サイトとスプライスドナーサイトとの間の配列を 再生するために用いられるオリゴヌクレオチドを合成することである。完全なｃ 　ＤＮＡにおいて、ＶＣジャンクションの丁度５′のＤＮＡ配列が源細胞のゲノ ムからの天然スプライスドナーサイトの５′半分を構成する。各天然スプライス 部の失われる部分は、ｃ　ＤＮＡから演鐸することができない。と言うのは、ス プライシング中に源細胞におけるｍＲＮＡ合成中にイントロンの一部として除去 されるからである。

本発明によると、ＤＮＡ片が合成され、ドナーサイトスプライス部の３′側ある いは選択的に受容体スプライス部の５′側を回復する。接片には、存効なスプラ イス　パートナ−配列で行われるようにするための充分なりＮＡ　（少なくとも 約８０ヌクレオチド　塩基）を挿入するべきである。さらに、結果としてもとの 読み枠を維持するスプライスがつくられるよう、スプライス供給体／受容体の組 を用いるべきことが必須である。

この目的のために、ｌｅａ　ＤＮＡ　配列が合成された。それは、３′末端にお いて、スプライス供給体配列を含む多くのイントロンと共通して配列の一部を有 するイントロンを含む。

このユニバーサルイントロン（Ｕ）（第１図参照）は、スプライスドナー配列Ｇ ＴＡＡＴＧＴＧを含む。しかしながら、他の配列は同様にスプライスドナーサイ トと同じように有用であり、同様に使用されうる。典型的な有用スプライスドナ ーサイト配列（５′および３′部分）の部分的リスト第１表に示される。この配 列は、既知のマウスＶＨ及びＶＩゲノムＤＮＡを源としている。５′末端は、種 々のマウスｃＤＮＡＳのＶＣジャンクションに見いだされ、３′末端はスプライ シング中に除去される。ここで用いられるユニバーサルイントロンの配列は、ま た比較のためリストにして示す。ＶＣジャンクションのすぐ前にある配列は（こ こでの突然変異はＲＮＡのスプライシング問題となるかも知れないので）示され ているそれとは異なってはならないが、多くの発現されているＩｇ遺伝子中のＶ ＴｒＩ域の３′部分（即ち、Ｊあるいは接合領域）が体細胞突然変異を受けるこ とを述べておくべきである。これらの変化もまた合成ｌｅａ配列中に含ませるべ きである。と言うのは、この領域は抗原との結合に寄与するかも知れないからで ある。

第１表 Ｍｕｒｉｎｅ　Ｉ　Ｖ（Ｊ）　Ｒｅ　ｉｏｎ　Ｓ　１ｉｃｅ　Ｄｏｎｏｒ　Ｓｅ 　ｕｅｎｃｅｓ５　’　ｅｎｄ　３　’　ｅｎｄ Ｊ　に　１　・・・・・・ＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴ八へＧＴＡＧ・・ ・・・・Ｊ　に　２　・・・・・・ＧＣＴＧＧ八＾ＡＴへＡＡＡＣＧＴ八へＧＴ ＡＧ・・・・・・Ｊ　χ　３　・・・・・・ＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴ ＡＡにＴＡＧ・・・・・・Ｊに４・・・・・・ＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧ ＴＡＡＧＴＡＣ・・・・・・Ｊエト・・・・・ＣＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＡＧ　 ＧＴＡＡＧＣＴＧ・・・・・・Ｊ、２　・・・・・・ＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣ ＡＧ　ＧＴＧＡＧＴ（：（１：・・・・・・Ｊ　）ｌ　３−−ＣＡＣＴＧＴＣＴ ＣＣＧＣＡＧ　ＧＴＧＡＧＴＣＣ・＝−Ｊイ　４・・・・・・ＣＡＣＣＧＴＣＴ ＣＣＴＣＡＧ　ＧＴＡＡＧＡＡＴ・・自・・（ユニバーサルイントロン）　ＧＴ ＡＡＴＧＴＧ・・・・・・ユニバーサルイントロン 同一のユニバーサルイントロン配列が、他の■領域で首尾よ（用いられている。

あらゆる場合において、ＩｇＩ及びＨ鎖が効果的に発現され、この方法の一般性 を示している。

回復された３′末端片をもつ切断ｃ　ＤＮＡ及び最初のポリペプチドをコードし たドナースプライスサイトとよりなる組み換えＤＮＡが、第２ポリペプチドをコ ードした領域のスプライスドナーサイト５′を有するもう一つのＤＮＡと共に発 現され°る。例えば、スプライス受容体は、免疫グロブ９７０Ｍ域の全部または 一部をコードにするゲノムＩｇＤＮＡから誘導することができる。スプライス受 容体部を有する万能イントロンを服務ｌｅａが用いられる場合には、このような 既知の受容体部配列に包含させることができる。典型的には、スプライス受容体 部の５′末端は、ピリミジンに冨んだ領域（例えばＴ、Ｃ）を含み、配列ＡＣ及 びスプライスジャンフシボンが従う。

従って、用いるべき２／ａが、最初のＤＮＡ配列の５′末端を、３′末端の代わ りに連鎖させるとすると５′の末端は、このようなスプライスアクセプター配列 をユニバーサルイントロンに含ませることができる。

適切なスプライスアクセプターよりなる典型的配列部は、第２表に示される。こ の配列は、次のアクセプター配列である。即ち、Ｃｙ１遺伝子の（１）ＣＨＩ、 （２）ヒンジ（３）ＣＨ２及び（４）ＣＨ３エクソンである。しかしながら、他 の多くの適切なスプライスアクセプター配列が文献中に見いだされうる。

第２表 Ｍｕｒｉｎｅ　Ｉ　Ｓ　１ｉｃｅ　Ａｃｃｅ　ｔｏｒ　５ｉｔｅｓ５’ｅｎｄ　 ３’ｅｎｄ （１）　ＣＴＣＴＴＧＣＡＧ　ＣＣＴＣＣ＜　２　）ＴＣＴＣＴＧＣＡＧ　ＡＧ ＣＣＣ（３）　ＣＴＴＣＣＴＣＡＧ　ＣＡｆ；ＣＴ（４）　ＧＴＣＣＴＡＣＡＧ 　ＧＧＣＡＧ２種頚のＤＮＡの協調発現において、宿主細胞中の核内酵素は通常 のスプライシング作業を実施することでｍＲＮＡを産生じ、その結果として融合 蛋白質をコードするｎ＋ＲＮＡを生産する。キメラ結合蛋白質の場合に、ｍ　Ｒ Ｎ　ＡはＶＣ結合まで天然型配列と同一であって■イあるいは■１を（５′がら ３′に）コードする。そしてこのｍＲＮＡは、例えば人の配列からなる少なくと も一つのＣ領域ドメインの少なくとも一部分の他のポリペプチドに直接に接合し ていて、ドナースプライスサイトの３′半分（そして全下流部のヌクレオチド） とアクセプタースプライスサイトの５′半分（そして全上流部のヌクレオチド） がイントロンとして取り出され、適切に融合された蛋白質をコードしている。

接合している５′スプライスアクセプターサイトを有するＣ−領域をふくむＤＮ Ａのための他の適切な原料は、人あるいは他の哺乳動物ゲノミックライブラリー である。他に適切な配列を有するスプライスアクセプターサイトは、発現を希望 するいずれのＤＮＡ配列の５′末端にも接続される。該ＤＮＡ配列とは、次に有 効なモノクローナル抗体の特異性によって、あるいは既知の技術によって生産の 限定された特異性を有している■ドメインをコードするＤＮＡ配列に融合される 配列のことである。

通常キメラＩｇ分子の場合に両エクソンは、単一制御配列の制御下で同一ベクタ ー上に配置される。そこで両りとＨ鎖を協調発現し、その結果として宿主細胞は 完全な融合蛋白質を分泌する。この方法はＤＮＡスプライスシグナルを認識し、 正確な切断に影響する酵素を有する宿主細胞を特徴とする特別なベクター構成、 宿主細胞の選択、形質転換そして発現方法は本発明を、本質的に構成してはいな い。しかし熟練研究者によって個人の好みと利便に基づいてこれらが選択され実 施される。

本発明の使用のため適用される技術は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅ。

４３０　Ｆｏｕｒｔｈ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、　Ｎ、　Ｙ、、） に報告されている。ここで使われるベクターは、関連する遺伝子の翻訳と転写の だめの正確なシグナルを含む全て１！！！ｍの既知のプラスミドを含む。

これに増幅因子が使われるかも知れない。そしてポリアデニル化とスプライスの ための付加シグナルが、使われる遺伝子内に準備されてない場合には用意されな ければならない。例えば、機能的に再配列されたＩｇ遺伝子の発現のためのシグ ナルの全てがひとつのＤＮＡの連続的鎖車に存在する。それらには転写プロモー ター、ポリアデニル化サイト、終末サイトそしてイントロン配列の切取りのため の切断シグナルが含まれる。またベクター中に準備されねばならない付加情報は 、形質導入体選択のためのマーカー遺伝子である。この遺伝子は選択される表現 型の発現のためのシグナルを含む（例えばメトトレキサートのような毒性試薬の 致死作用に普通は耐性である）。それ故、もしベクターが画筆１と第２ポリペプ チドをコードするならば、制限された空間内に３つの別の転写単位のための配列 情報を１！備する必要がある。

次に組み換え力セント含有ベクターは、適切な宿主細胞中に形質転換される。上 述の基準に加えて、宿主細胞の系統の選択には、形質転換後の選択の容易さに加 え、成長培地中での成長能力好ましくは市販の成長培地、そして無血清培地中で の成長能力に基づいて行なう。キメラ抗体の産生のため有益な宿主細胞にはミエ ローマ、あるいは例えばネズミ非−Ｉｇ−生産５ｐ２１０　Ａｇ１４ハイブリド ーマ細胞系のようなハイブリドーマを含む。使用可能な細胞は貯Ｍ庫や市販の原 料を広く利用でき、当分野の熟練研究者によって天然原料から容易に分離される 。

細胞中に組み換えＤＮＡを導入するための方法には、電気的穴開は法（Ｐｏｔｔ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　［ｌ５Ａ８１ニア１６１−７１６５を参照）があるが、これは特別な装 置と高度に精製されたＤＮＡを要求する。しかしながら、もし実施条件がそれぞ れの細胞型に合うように最適化されるならば、多くの異なった系統がこの方法を 用いて形質転換され得る。

他の形質転換法は、プロトプラスト（スフェロプラスト）融合である（Ｓａｎｄ ｒｉ−Ｇｏｌｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１． 　Ｂｉｏｌ。

１ニア４３−７５２を参照）。関連する組み換えプラスミドを獲得する細菌は化 学試薬、一般には等張の緩衝液中の４５〜５０％ポリエチレングリコールを用い てリンパ細胞に融合される。この方法は単純でプラスミド、　ＤＮＡの過度の精 製を必要としない。加えて大変に高い形質転換頻度が得られ、そして高度に生産 性の形質転換性細胞系を得るための処理時間が減少する。なぜならこの形質転換 法は多コピーを含む形質転換体を得るのに好ましいものであるからである。

カセット含有ベクターで継続的に形質転換された細胞は、次に形質転換されなか った細胞から分離されねばならない。多（の方法が形質転換細胞の選択のために 利用される。例えば、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとネオマイシ ン耐性マーカーがリンパ細胞の選択目的のために利用される。マーカーをコード する遺伝子は■領域をコードするベクター上に含まれる。ジヒドロ葉酸還元酵素 （ＤＨＦＲ）の耐性型が目的遺伝子の隣でマーカーの増幅に続いて行なわれ、ハ イプリドーマ細胞形質転換体の選択に用いられる。

形質転換細胞は、次にカセットによってコードされたポリペプチドを発現するた め培養される。培養はインビトロであるか、あるいは組み換え抗体の場合には、 腹水溶液内でのインビボ培養のような他の手段を使・うことによって達成される 。

形質転換細胞の生産性の改良は、関連する配列がＤＨＰＲマーカーと協調発現さ れる時ＭＴＸの存在化において多段階の継代クローンを通して可能である。例え ば、限界希釈による２回の継代クローニング後、消費された分散培地内で抗体を ３５〜１００μｇ／讃１のレベルに生産できる細胞が得られる。これらの発現の レベルは、もし細胞がＭＴＸの無い条件下で行なわれたならば大きく減少する。

しかしながら試薬の存在下で保存培地を維持し、次に最後のスケールアンプ段階 で試薬を省略することは可能である。この場合の抗体の最終収量はＭＴＸの省略 によって減少しない。

開放分散培養法に加えて、他のスケールアップ環流技術、例えばホローファイバ ー反応器（Ｖｏｎ　Ｗｅｄｅｌ　（１９８７）　ｉｎ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　 Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　５ｃａｌｅＵｐ　（Ｓｅａｖｅｒ、　ｅｄ、）　Ｍａ ｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅ＋ｍ　Ｙｏｒｋ）を参照）とマイ クロカプセル化（Ｒｕｐｐ　（１９８６）Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｅ　Ｍ ｉｃｒ。

ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｌａｒｇｅ　５ｃａｌｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”　ｉｎ　Ｌａｒ ｇｅ　５ｃａｌｅ　ＭａｌＩｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　（Ｔｏ ｌｂｅｒｔａｎｄ　Ｆｅｄｅｒ、　ｅｄｓ、）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を参照）が特に本発明の発現系にはを用である。例えば 、マウスハイブリドーマ形質転換体を用いるマイクロカプセル内での組み換えヒ ト抗体の高レベルの発現が可能である。内部にとじ込められた細胞培養では、子 牛血清を大きく減少させた状態で培地を維持でき、ある場合には完全に無血清培 地の状態で維持される。

環流法は、細胞を高密度に保つばかりでなく　（細胞−細胞相互作用を促進しそ こで血清要求を減少するのであろう）、抗体の精製前に培地からＭＴＸを除去す るためにも有益である。これは半透膜のカプセル膜が高分子量抗体分子を保持し 、低分子のカプセルからの拡散による通過を許容するマイクロカプセル化培地を 用いることによって可能である。環流培養の作業の終りに、細胞分裂は長く停止 するが、しかし抗体の生産は続く。そして培地はｉＴＸ無しで維持される。さら に細胞の破壊前に生理食塩水でカプセルを洗浄と、透析することによって試薬の 除去が可能である。

本発明は、下記の実施例によってさらに詳細に理解されるが、これにより制限さ れるものではない。

夫−一に一一± ２つの別のＨ鎖とＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーが、カプラー等（Ｇｕｂｉｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、　（ｇｅｎｅ　（１９８３）　２５：２６３−２６９）、参照文献と して挿入）の方法に従って調整される。２本鎖のブルントエンドｃＤＮＡが、マ ウスハイブリドーマ細胞系１４．１８より分離されたポリアデニレートポリＡ　 ｍＲＮＡから合成された。

下記配列を有した２本鎖ポリリンカー ５’　）ｔｏ−ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴ（：ＡＧＣＴＧ −ＰＯ４５’が次にｃＤＮＡに連結された。このリンカ−はいくつかの目的で使 われる。最初はブルントエンドｃＤＮＡをＡＡＴＴステイノキー（ｓ　ｔｉｃｋ ｙ）末端配列を経てλｇｔｌＯファージＤＮＡのＥｃｏＲＩ　サイト中にクロー ンされるのを許容する。５′ブルントエンドは、ブルント化ｃＤＮＡに連結のた めにのみリン酸化されることを述べる。５　’　ＥｃｏＲＩスティッキー末端を リン酸化しないと、連結ｃＤＮ＾のポリメリゼーションが起らず、続くリンカ一 連結後の酵素消化が不必要である。これによって工程内中でカットされる内部の ＥｃｏＲＩサイトをメチル化する必要がない。ＥｃｏＲＩ消化λｇｔｌｏ　ＤＮ Ａによって準備された５′リン酸化ステイツキー末端は、ｃＤＮへのファージ宿 主内への連結と、その後に続くクローニングのために充分である。

このリンカ−配列の他の機能は、これに続く増幅のためのＸｈｏｌ　（ＣＴＣＧ ＡＧ）と５ａｌｔ　（ＧＴＣＧＡＣ）サイトを準備することである。

これらのサイトは、はとんどマウスＩｇ　ｃＤＮＡ内には無く、そしてこうして ５′と３′末端に独特の制限酵素切断サイトを提供する。両サイトは制限酵素切 断サイト（ＴＣＧＡ）について同じ５′オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）配 列を？１！備しているので、いずれかがＸｈｏＩクローニングサイトとともに発 現ベクター内で使われる。もし１個のサイトがｃＤＮＡ配列中で発現されても、 第２のサイトが発現されるチャンスは小さい。

連結ｃＤＮＡは、次にポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）によって全長さのＬ とＨ１ＮｃＤＮ＾をえるために分画された。全長さのＬ鎖（９００−１００ｂｐ ）とＨ鎖（１４００−１６００ｂｐ）に一致するｃＤＮＡの２つの分画が別々に 分離された。めいめいのゲル分画内のＤＮＡは別々に溶出され、そしてＥｃｏＲ Ｉ消化λｇｔｌＯＤＮＡに連結された。市販されているバゲージング混合物（ス トラテジン、サンジエゴ、カルフォルニア）でのインビトロパンケージングに続 いて、組み換えファージが種々ＣＴｌＩ域プローブを用いるフィルターハイブリ ダイゼーションによってスクリーニングされた。

各々のスクリーニングから１０個のファージコロニーがＥｃｏＲＩを用いる制限 酵素分析によってさらに分析された。これは制限酵素消化に充分なりＮＡを準備 することと、挿入されたｃＤＮＡの長さの決定のための小スケールのファージラ イセードを調整することによって、最もすばやく達成される。全長さが挿入され たクローンは放射活性で標識される。たとえば５′と３′末端での特異なＥｃｏ ＲＩサイトで標識される。第２の酵素での消化に続いてクローンは、Ｍａｘａｍ 　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ　（Ｍｅｔｈ、　ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９８０）６ ５　：　４９９−５５９、参照文献）の方法によって配列決定される。そしてマ ウスＣｒ３とＣに配列のためのプローブでスクリーニングされる。

最も長いＨ鎖ｃＤＮＡ配列が図２に示される。Ｈ鎖りローンは、もし配列内の第 ２のＡＴＧが真の開始コドンであると仮定するならば、全長さに大変近（表現さ れる。両ＡＴＧコドンは正確なリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａ ｓ＋ｅ）中にあるけれども、最初のコドンはたぶん効率的開始のためのｍＲＮＡ の５′末端に非常に密接に存在している。そしてもし翻訳されたならば、非特徴 的な長いリーダー配列をコードするであろう。第２のＡＴＧコドンの使用は、１ ９アミノ酸の大変典型的なＩｇリジーー配列の合成に帰結する。付加的５′非翻 訳配列が発現ベクター内のこのｃＤＮＡに加えられると（下記参照）、最初のＡ ＴＧはもはや得られる照合ｍＲＮＡの５′末端にないので、そこで変形リーダー 配列の翻訳は増加するだろう。この問題を避けるため、ｃＤＮＡ配列が限定Ｂａ １３１エクソヌクレアーゼ処置によって先端が切断される。得られる修飾ｃＤＮ ＾（４１２ｃ）は、次にＸｈｏｌリンカ−に接続する（図２参照）。このｃＤＮ Ａの発現は、正常１ｇ’Ｊ−ダー配列をコードするｍＲＮＡに帰結する。クロー ンされたｃＤＮＡの■イ部位の残りは正常で機能的な可変領域に思われる。

ＬｔＪｆクローンの実施例（図３）に、１９アミノ酸リーダーをコードし、■に 遺伝子のａｎｔｉ−ＧＡＴファミリーに高度に相似している配列が続く典型的り 鎖配列を示す。

マウスにＣ領域は１１４位でアルギニン残基で始る。

■イとＶＬのためのクローン化ｃＤＮＡの３′末端上のドナーサイトの再構成が 図４と５に示されたように実施される。最初のステツプは、両■、と■Ｌ領領域 配列決定で、次に■とＣＭ域の結合部付近に独特な制限酵素切断部位を同定する ことである（図２と３参照）。

ゲノミンクＶ遺伝子フラグメント内の独特な制限酵素切断サイトとオリジナルド ナーサイト間の配列が、次に先に表１に示されたユニバーサルイントロン配列を もちいて再創製された。

利便性のために、イントロン配列を再構成するために用いられたオリゴヌクレオ タイドがＳｒ＋ａＢ１　として旧ｎｄ　ＩＩＩ断片（後者のサイトはイントロン の最初の部位ではない）にクローンされた。

５ｎａＢｌ　サイトは、次にＧＴＡ　（スプライシングシグナルを再構成すると ころの塩基）ではじまるブルントエンドを作るためカントされる。そして、３′ クローニングサイトとして発現ベクター中へのカセットの挿入のためにＨｉｎｄ 　ＩＩＩサイトが、３′クローニングサイトとして使われる。

ブルント３′末端と同様に適当な°“スティッキー（Ｓｔｉｃｋｙ）”５′末端 を有したフラグメントを生産するため、図４と５に示される■領域の小さな連結 部分が、オーバーランプヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、その連結に よって合成された。

次に、各々の合成ｒ／ａ配列が配列検定のため、プラスミツドベクター中にクロ ーンされた。いくつかの場合に、５′クローニングサイトは特別なものではなく 、手近かのプラスミツド中に存在しているだろう。この場合に、付加的制限酵素 切断サイトがクローニング目的の為、合成りＮＡの５′末端に加えられることが できる。ＤＮＡ配列決定後、２／ａフラグメントがｙ　ＳＩ域の残部に連結され た。次に、完全な■９と■に領域のカセットがＸｈｏＩとしてＨｉｎｄ　ＩＩＩ フラグメント中にクローンされた。

キメラ１４．１８抗体の発現のために用いられた哺乳動物の発現ベクターが、図 ６に示されている。それは、リンパ細胞中でｃＤＮＡ配列を発現するために用い られたｐＤＥＮベクター（図６Ａ）から誘導された。このベクターは、下記の様 にデザインされた。

直線的表現で図解した左末端に選択のためのマーカー遺伝子、Ｄ　ＨＰ　Ｒが位 置づけられ、その結果転写が右から左に進む。この転写単位は５ｖ４０１１節シ グナル（増幅因子とプロモーター）、マウスＤＨＰＲの耐性型をコードするｃＤ ＮＡそしてＳＶ４０ポリＡサイトから成る。

この遺伝子（ＳａｌＩサイト）に隣接して関連するｃＤＮＡのための転写ユニッ トがある。配列中の最初のブロックはＩｇｈＭ増幅因子（Ｅμ）、つまりそれは Ｉｇｈ鎖遺伝子の活性のある転写に含まれる配列である。増幅因子配列後に、マ ウスメタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子のためのプロモーターがつづく。多くの他 のプロモーターがこの位置で用いることができる。それらには、図６Ｃに示され たＬ鎖転写ユニットのようなＩｇ遺伝子からのものも含まれる。合成制限酵素切 断部位（ＸｈｏＩ用の）力＜ＭＴ配列の５′非翻訳領域に配置され、その結果ｃ ＤＮＡはこの位置で挿入される。

そして肘プロモーターからの融合ｍＲＮＡとして転写される。この場合にｃＤＮ Ａは自身の翻訳開始コドンを含む必要がある。なぜならそれはベクターによって 準備されないからである。ＸｈｏＩサイトを越えると（ｃＤＮＡのための挿入サ イト後）マウスＣに領域の３′非翻訳領域から誘導されたフラグメントがあり、 それはボＩＪ　Ａ付加サイトを含んでいる。この転写ユニットで発現されたｃＤ ＮＡは、ＭＴＩｌｌＲＮＡからの５′非翻訳配列、関連する特異的なコード配列 そしてマウスにｍＲＮＡに通常見出される３′非翻訳配列から成る。

キメラ抗体の本例において、このプラスミドの成分の幾つかは余分なものである 。つまり３′非翻訳配列とに遺伝子フラグメントのポリＡサイトがそれである。

これらの成分の代りに、プラスミドｐＤＥ？ＩのＸｈｏＩと５ａｌＩサイト間に 、ヒトＣ領域遺伝子フラグメントと■領域力セントが挿入される（図６Ａ参照） 。Ｃ領域遺伝子はすでに３′非翻訳配列とポリＡサイトを保有しているので、プ ラスミドから用いられるためのシグナルのみがｃＤＮＡ　（増幅因子とプロモー ター）の転写のために必要である。得られたプラスミドは、図６Ｂに示される。

同様の構成は、Ｌ鎖についても成される。しかしこの場合には、プラスミドは最 終ベクターには存在していないグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇ ｐｔ）を有する。そしてＣｅＭ域は人に遺伝子のそれである。Ｌ鎖ｃＤＮＡ発現 のために用いられるプロモーターは、■に遺伝子から誘導される。そして特異な Ｘｈｏ！サイトがｃＤＮＡへの融合のため、５′非翻訳領域に配置される。この 後者の構成がデザインされると完全なＬ鎖転写ユニットは５ａｌＩサイトの側面 に接する。そしてＨ鎖ベクターの場合に、唯一の５ａｌｔサイトのみが保持され る。この方法の場合に完全なし鎖の転写ユニット（約３ｋｂ）を削除し、そして 次にＨ鎖発現ヘクターの唯一の５ａｌＩサイト中にそれを挿入することが可能で ある（図５Ｃ）。

Ｉｇ発現ベクターの他の重要な工夫は、ＨとＬｉＮの両者の発現のためＥμ増幅 因子を使用したことにある。このエンハンサ−は、Ｌ鎖の片割れよりもさらに強 力であるので（少なくとも形質転換実験において）、両鎖のより高く、よりバラ ンスのとれた発現が可能である。Ｌ鎖転写ユニットは、また５ａｌＩとＥμ配列 の間に幾つかの付加的配列を含む。この配列はλＩＬ鎖プロモーターから誘導さ れる。そしてｃＤＮＡ　（ＥＰｏ　８７／３００６５８．９）の転写の増幅に影 響を与えずに、一方向での（Ｌ鎖転写ユニットに近付かない）Ｅμの増幅効果を ２方向に滅弱するように作用する。Ｌ鎖転写ユニットが図６に示される発現ベク ター中に挿入されるとき、この配列は上記方向における増幅効果をブロックする ことによって、隣接マーカー遺伝子の過発現を防げる。この方法で形質転換体は 、マーカー遺伝子の産物に比較して関連する形質転換蛋白質をより多く生産でき るであろうことが期待される。

マウスの非−１ｇ−生産ハイブリドーマ細胞系統、５ｐ２１０　Ａｇ１４細胞が 修飾プロトプラスト融合法を用いて上述したキメラＩｇプラスミド成分とともに 形質転換された（Ｇｉｌｌｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　３ ３ニア１７−７２８）。

９６穴培養皿に移植後、ＭＴＸ　（０，１μ門）を含む選択培地（１０％子牛血 清を含むダルベツコ−修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）　）が加えられた。細胞は ５０％培地中で３〜４日の間隔で全３培養回の培地交換で培養された。ＭＴＸ耐 性細胞のコロニーは、１０〜１４日後に出現した。

この時点で培地上清は、分泌されたヒト抗体の検出のため分析された。はとんど 全てのＭＴＸ耐性コロニーは、有意のヒト抗体を培地中に分泌する。

最も抗体を分泌するコロニーを同定後、発現レベルは培地中のＭＴＸ　ｆｉ度を 増加することによって増加された。細胞はほとんど、あるいは全く細胞の死無し に、すばやく濃度の激しい上昇（単一ステップで約１０倍のアンプ）に適応した 。ＭＴＸのレベルは、約３週間の期間に０．１から１０μ門に増加した。この期 間中に、抗体の濃度は消費培地当り２から８μｇ／ｎ＋１　（０，１μＭ　ＭＴ Ｘ）の範囲から１０から４０μｇ／ｍｌの範囲（１０μＭ　ＭＴＸ）に増加した 。消費培地当り１００μｇ／ｍｌの過剰の産生レベルが本発明のこれと、そして 他の似た構成の実施例を用いて得られた。

本発明は、その精神あるいは本質的な特徴の範囲以内で、他の特定の形態で実施 することが可能である。

この実施例は、それゆえに、すべての点において実施可能であり、制限されるも のではなく、本発明の範囲は前記した説明によるよりも、むしろ添付されたクレ ームによって示されるものであり、そして、クレームの内容及びその均等の範囲 以内でのあらゆる変更は、それゆえに、容認されるべきものである。

第１Ａ図 第１Ｂ図 国際調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の工程からなる融合蛋白質を製造する方法。 （ａ）第１のポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列を調製し、そしてその ３′末端に隣接する５′に位置する制限酵素切断サイトを特定する工程、 （ｂ）当該第１のＤＮＡ配列を当該制限酵素切断サイトで切断して３′末端を作 製する工程、 （ｃ）当該３′末端に、リンカー／アダプター（ｌ／ａ）ＤＮＡであって、その ５′末端側の配列中に、当該制限酵素切断サイトから当該第１のＤＮＡ配列の３ ′末端に及ぶ当該第１のポリペプチドの部分をコードするＤＮＡ、及びスプライ スドナーサイトからなる当該ｌ／ａＤＮＡを連結して、カセットを作製する工程 、 （ｄ）真核宿主細胞を、当該カセット、及び第２のＤＮＡ配列であって、第２の ポリペプチドをコードするＤＮＡと、ｌ／ａＤＮＡ配列上のスプライスドナーサ イトと適合する当該第２のＤＮＡ配列の５′末端におけるスプライスアクセプタ ーサイトを特定するＤＮＡとからなる当該第２のＤＮＡ配列で形質転換する工程 、 （ｅ）当該カセット及び第２のＤＮＡ配列を、一本鎖の融合蛋白質として発現さ せるために、当該形質転換細胞を培養する工程。
2. ２．以下の工程からなる融合蛋白質を製造する方法。 （ａ）第１のポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列を調製し、そしてその ５′末端に隣接する３′に位置する制限酵素切断サイトを特定する工程、 （ｂ）当該第１のＤＮＡ配列を当該制限酵素切断サイトで切断して５′末端を作 製する工程、 （ｃ）当該５′末端に、リンカー／アダプター（ｌ／ａ）ＤＮＡであって、その ３′末端側の配列中に、当該制限酵素切断サイトから当該第１のＤＮＡ配列の５ ′末端に及ぶ当該第１のポリペプチドの部位をコードするＤＮＡ、及びスプライ スアクセプターサイトからなる当該ｌ／ａＤＮＡを連結して、カセットを作製す る工程、 （ｄ）真核宿主細胞を、当該カセット、及び第２のＤＮＡ配列であって、第２の ポリペプチドをコードするＤＮＡと、ｌ／ａＤＮＡ配列上のスプライスドナーサ イトと適合する当該第２のＤＮＡ配列の３′末端におけるスプライスアクセプタ ーサイトを特定するＤＮＡとからなる当該第２のＤＮＡ配列で形質転換する工程 、 （ｅ）当該カセット及び第２のＤＮＡ配列を、一本鎖の融合蛋白質として発現さ せるために、当該形質転換細胞を培養する工程。
3. ３．当該調製工程ａ）が、当該第１のポリペプチドをコードする相補的ＤＮＡ（ ｃＤＮＡ）配列を調製することからなる請求項１又は２記載の方法。
4. ４．工程ｃ）で連結される当該ＤＮＡ配列が、約８０ヌクレオチド塩基よりも大 きいものである請求項１記載の方法。
5. ５．工程ｃ）で連結される当該ＤＮＡ配列が、約８０ヌクレオチド塩基より大き いユニバーサルイントロンからなる請求項１記載の方法。
6. ６．当該第１のポリペプチドが、成長因子、酵素、ホルモン、リンフォカイン、 インターロイキン、免疫グロブリン、それらの類似物、及びそれらの部分の群か ら選択される請求項１又は２記載の方法。
7. ７．当該融合蛋白質が、キメラ融合蛋白質である請求項１又は２記載の方法。
8. ８．工程ａ）で調製される第１のＤＮＡ配列が、ヒト以外の免疫グロブリンＶ領 域をコードするＤＮＡ配列からなり、当該融合蛋白質が、キメラ結合蛋白質から なる請求項１記載の方法。
9. ９．工程ｃ）で調製される第２のＤＮＡ配列が、ヒト以外の免疫グロブリンＶ領 域をコードするＤＮＡ配列からなり、当該融合蛋白質がキメラ結合蛋白質からな る請求項９記載の方法。
10. １０．工程ａ）で調製される第１のＤＮＡ配列が、ネズミの免疫グロブリンのＶ 領域をコードするＤＮＡ配列からなる請求項８記載の方法。
11. １１．工程ｃ）で調製される第２のＤＮＡ配列が、ネズミの免疫グロブリンのＶ 領域をコードするＤＮＡ配列からなる請求項９記載の方法。
12. １２．当該第２のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン定常部（Ｃ）領域 部分を含み、そして当該キメラ結合蛋白質は、少なくともキメラ免疫グロブリン 部分を含む請求項８記載の方法。
13. １３．当該第１のポリペプチドは、少なくとも、免疫グロブリン定常（Ｃ）領域 部分を含み、そして当該キメラ結合蛋白質は、少なくともキメラ免疫グロブリン 部分を含む請求項９記載の方法。
14. １４．当該第２のポリペプチドは、少なくともヒト免疫グロブリンの定常（Ｃ） 領域を含む請求項１２記載の方法。
15. １５．当該第１のポリペプチドは、少なくともヒト免疫グロブリンの定常（Ｃ） 領域を含む請求項１３記載の方法。
16. １６．以下の工程からなるキメラ結合蛋白質を製造する方法。 （ａ）免疫グロブリンの可変（Ｖ）領域をコードするＤＮＡ配列を調製し、そし て、当該Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列と免疫グロブリンの定常（Ｃ）領域をコ ードするＤＮＡの連結部位に隣接する５′に位置する制限酵素切断サイトを特定 する工程、 （ｂ）当該Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを当該制限酵素切断サイトで切断して３ ′末端を作製する工程、（ｃ）当該３′末端に、リンカー／アダプター（ｌ／ａ ）ＤＮＡであって、その５′末端からの配列中に、当該制限酵素切断サイトの５ ′末端が当該ＶＣ連結部位に及び当該Ｖ領域をコードするｃＤＮＡ部分をコード するＤＮＡと、スプライスドナーサイト部位からなる当該ｌ／ａＤＮＡ配列を連 結してＶ領域カセットを作製する工程、 （ｄ）当該カセット、及びＤＮＡ配列であって、その５′末端に、当該ｌ／ａＤ ＮＡ配列上のスプライスドナーサイト部位と適合するスプライス受容体を特定す るＤＮＡとポリペプチドをコードするＤＮＡからなる当該ＤＮＡ配列で真核宿主 細胞を形質転換する工程、 （ｅ）当該カセットと、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、一本鎖の 融合したキメラ結合蛋白質として発現させるために、当該形質転換細胞を培養す る工程。
17. １７．工程ａ）で調製される当該ＤＨＡが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である請 求項１６記載の方法。
18. １８．工程ａ）で調製される当該ＤＮＡが、免疫グロブリンＬ鎖のＶ領域をコー ドするＤＮＡからなる請求項１６記載の方法。
19. １９．当該ＤＮＡが、ヒト以外の免疫グロブリンのドメイン又はその部分をコー ドする請求項１８記載の方法。
20. ２０．ｃＤＮＡが、ネズミの免疫グロブリンのドメイン又はその部分をコードす る請求項１９記載の方法。
21. ２１．工程ａ）で調製される当該ＤＮＡが、免疫グロブリンＨ鎖の領域からなる 請求項１６記載の方法。
22. ２２．工程ｃ）で連結される当該ｌ／ａＤＮＡ配列が、約８０ヌクレオチド塩基 より大きいものである請求項１６記載の方法。
23. ２３．工程ｃ）で連結される当該ｌ／ａＤＮＡ配列が、約８０ヌクレオチド塩基 より大きいユニバーサルイントロンからなる請求項１６記載の方法。
24. ２４．工程ｄ）における形質転換が、ポリペプチドをコードするＤＮＡで宿主細 胞を形質転換することからなり、当該ポリペプチドは、少なくともヒト免疫グロ ブリンＣ領域部分を含むものである請求項１６記載の方法。