JPH05500506A - Ｇｔｐアーゼ活性化タンパク質（ｇａｐ）からのペプチドおよびその診断および治療学的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＴＰアーゼ活性化タンパクｆ（ＧＡＰ）からのペプチドおよびその診断および 治療学的使用正常細胞の成長の調節においである役割を演すると考えられるいく つかの遺伝子が確認された。ｒａｓと呼ばれるこれらの遺伝子のサブセットは、 少なくとも３種の構成質Ｎ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ及びＫｒａｓ２から成る。腫瘍 遺伝子と呼ばれるこれらの遺伝子の変形体は癌における病原性因子として関係づ けられてきた。正常の細胞遺伝子および腫瘍遺伝子の両者は、一般にｒａｓ　ｐ ２１タンパク質と呼ばれる化学的に関係するタンパク質をコードする。

ｒａｓｌ！ｌ瘍遺伝子、およびそれらの正常細胞対応物は種々の種からクローニ ングおよび配列決定されてきている。これらの２つの遺伝子の構造の比較は、そ れらがｒａｓ　ｐ２１タンパク質のアミノ酸配列を変更する点突然変異により異 なることを明らかにした。ｒａｓｌｌｌ瘍遺伝子の中に天然に存在する突然変異 は、コドン１２，１３．５９および６１において同定された。試験管内の突然変 異誘発の研究において、コドン６３，１１６，１１７および１１９における突然 変異は、また、形質転換活性を生ずることが示された。正常細胞のｒａｓ遺伝子 をそのＩＩｌ瘍遺伝子対応物に転化する最も頻繁に観察される突然変異は、プロ リン以外の他のアミノ酸残基による位置１２におけるグリシンの置換である。グ リシンが欠失されるか、あるいは位置１１におけるアラニンと位置１２における グリシンとの間にアミノ酸が挿入される場合にも形質転換活性が観測される。

位置６１における突然変異もまた、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質の腫瘍遺伝子の発 生において重要な役割を演する。細胞のｒａｓ遺伝子における、プロリンまたは グルタミン酸以外の他のアミノ酸によるグルタミンの置換は形質転換活性をもつ ｒａｓ腫瘍遺伝子を生させる。

正常細胞ｒａｓ遺伝子およびそれらの腫瘍遺伝子対応物に関して、形質転換活性 を示す少なくとも４つの既知のレトロウィルスのｒａｓ腫瘍遺伝子が存在する。

非レトロウィルスと異なり、レトロウィルスの遺伝子は２つの変異を示す。これ らの二重の変異の生物学的意味は現在不明瞭である。

正常のｒａｓ　ｐ２１タンパク質および腫瘍遺伝子のｒａｓ　ｐ２１タンパク質 の両者は、それらの系統発生的起源に無関係に、グアニンヌクレオチド、ＧＴＰ およびＧＤＰに結合し、そして固有のＧＴＰアーゼ活性を有する。Ｔｅｍｅ　ｌ ｅｓら、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ、３上−３：　７００を参照のこと。ｒａｓ　 ｐ２１タンパク質の生物学的活性に対するこれらの生化学的性質の意味は、次の ように実証された：第１に、グアニンヌクレオチド結合を妨害する抗ｒａｓ　ｐ ２１抗体のマイクロインジェクションは、ｒａｓ腫瘍遺伝子により形質転換され たＮＩＨ３Ｔ３細胞の悪性表現型を逆転させる。Ｃ１ａｒｋら、１９８５　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：５２８０およびＦｅｒａｍ ｉ−ｓｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：６３９を参照のこと。第２に、グアニン ヌクレオチドにｐ２１が結合できないようにする突然変異を示すｒａｓ腫瘍遺伝 子のタンパク質はＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換しない。Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎら、 １９８６　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ　、６：２６４６゜第３に、いくつかの ｒａｓ腫瘍遺伝子は正常細胞対応物と比較してＧＴＰアーゼ活性が非常に減少し たｐ２１タンパク質を産生ずる。

最近、正常のｒａｓ　ｐ２１ＧＴＰアーゼを刺激するが、腫瘍遺伝子の変異に関 連するＧＴＰアーゼ活性に作用しない細胞質因子が同定された。Ｍ、Ｔｒａｈｅ ｙおよびＦ、　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、１９８７　５ｃｉｅｎｃｅ、２３８：５４ ２を参照のこと。この活性はＧＴＰアーゼ活性活性化タンパクワいての頭文字で あるＧＴＰと呼ぶタンパク質に関連づけられた。ＧＡＰは細胞質のタンパク質で あると考えられるが、多分細胞質ゾルから血漿膜に動くことができ、ここでそれ はｐ２１と相互作用する。

上に言及したように、ｒａｓ腫瘍遺伝子は種々の腫瘍の発生に関係づけられてき ており、そしてヒトの癌の最も普通の形態の約１０〜４０％に関係することが示 された。Ｈ，Ｖａｒｍｕｓ、１９８４　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ−上 ｃｓ、１８：５５３およびＭ、Ｂａｒｂａｃｉｄ、１９８６、胆農字に遺ｙ」Ｉ ■じ■ＩＬ℃Ｌ膓Ｌ１Ｌ工旦」−±−込」旦ｎｃｅｓ　ｉｎ　０ｎｃｏｌｏ　、 Ｂ、ＤｅＶｉｔａ。

Ｓ、Ｈｅｌｍａｎ、Ｓ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ編、２．３−２２、フィラデルフィ ア：リポンコントを参照のこと。例えば、ｒａｓ腫瘍遺伝子は、膀胱、結腸、腎 臓、肝臓、肺、膵臓および胃の癌において一貫して同定されてきている。それら は、また、リンパ様および骨髄様の系統の造血素、ならびに間葉腫の起源の腫瘍 において同定された。さらに、黒色腫、奇形癌、神経芽腫および神経膠腫は、ま た、ｒａｓ腫瘍遺伝子を有することが示された。

腫瘍遺伝子および癌の可能な関連性を考慮して、腫瘍遺伝子の産生物ｐｌｆまた は変異の腫瘍遺伝子の存在を検出する診断試験にかなりの研究が集中されてきた 。早期の試験は、多数の場合においてなお使用されており、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を 形質転換するその能力によりｐ２１を同定するトランスフェクションアッセイに おけるｒａｓ腫瘍遺伝子の存在を同定する。Ｌａｎｅら、１９８１．Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ　１．、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８：５１８５およびＢ、５ｈｉｌ ＯおよびＲ，Ａ、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１．Ｎａｔｕｒｅ、２８９：６０７ を参照のこと。この方法は感度が低く、労力を要し、そして適切に実施されなけ ればならず、訓練を積んだ技術者を必要とする。

第２診断方法はオリゴヌクレオチドのプローブに中心を置いて、ゲノムＤＮＡの 中の単一の点変異を同定する。この技術はオリゴヌクレオチドの間のハイブリッ ドがゲノムの配列と完全な合致を形成する、すなわち、非変異配列は単一の不一 致を含有するものより安定であるという観察に基づく。後者の１例はｒａｓ腫瘍 遺伝子に関連するｐ２１の中の点突然変異である。この技術はトランスフェクシ ョンアッセイより明らかに感受性であり、そして実施が容易であるが、それにも かかわらず実施が面倒である９なぜなら、ｒａｓ腫瘍遺伝子を生ずることができ る、理論的にほとんど１００の塩基の置換が存在するからである。こうして、こ れらの置換を検出することができるためには、特定の残基において３つの可能な 置換各々を含有する、多数のオリゴヌクレオチドのプローブを使用しなくてはな らない。Ｂｏｓら、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ、３１５−：　７２６およびＶａｌ ｅｎｚｕｅｌａら、１９８６、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、ｊ４：８４３を参 照のこと。

トランスフェクションおよびオリゴヌクレオチドアッセイに加えて、追加の核酸 ハイブリダイゼーシゴン技術がｒａｓ腫瘍遺伝子を同定するために開発されてい る。１つのこのような方法は変性勾配ゲルにおける単一に基づく不一致を含有す るＤＮＡ異種二本鎖の異常な電気泳動の移動に基づく。Ｍｙｅｒｓら、１９８５ ．Ｎａｔｕｒｅ、３ユ３：４９５を参照のこと、この技術はすべての可能な塩基 の置換の約２５〜４０％のみを検出し、そして変性勾配ゲルの調製に熟練した技 術者を必要とする。この技術の洗練されたより感受性の技術は、ｗ　ｉ　ｎ　ｔ 　ｅ　ｒら、１９８５．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔし−ｈｃａｄ、Ｓｃ↓２其）人、−８ ２ニア５７５およびＭｙｅｒｓら、Ｌ９８５，５ｃｉｅｎｃｅ、２３０：１２４ ２に記載されている。

免疫学的アプローチはｒａｓ腫瘍遺伝子の産生物の検出のためになされている。

ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体はＩｉｌ瘍遺伝子ｐ２１に対して 、あるいは腫瘍遺伝子ｐ２１に類似する配列を有する化学的に合成されたペプチ ド、または非形質転換性対応物に対して発生された。Ｃ１ｉｎｅらへの欧州特許 発行１０８．５６４号ＨＴａｍｕｒａら、１９８３゜Ｃｅｌユ、３４：５８７； ＷｅｉｎｂｅｒｇらへのＰＣＴ出１１ＷＯ／８４１０１３８９号を参照のこと。

はとんどの場合、ヒト組織の切片の中のｒａｓｌｉｉｉ瘍遺伝子の同定の診断道 具として失望されてきている。なぜなら、今日までに発生されてきている抗体は 正常細胞のｒａｓ　ｐ２１タンパク質ならびに腫瘍遺伝子タンパク質を認識する か、あるいは腫瘍遺伝子タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体が発 生されてきている場合において、腫瘍のバイオプシーの非特異的染色がなお観察 されるからである。

ｒａｓｌｌｌ瘍遺伝子のｐ２１は効果的な！！瘍全発生因子あるが、最近の研究 は正常ｒａｓ　ｐ２１が悪性の表現型を誘発することができることを示した。Ｃ ｈａｎｇら、１９８２゜Ｎａｔｕｒｅ、２９７：１９８５．Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ、 ＢＩＡ、、ｉ、、５　：　２８３６を参照のこと。例えば、正常Ｈ−ｒａｓ　Ｄ ＮＡのトランスフェクションは悪性の形質転換を誘発することが示された。さら に、正常ｒａｓ遺伝子の増幅はいくつかのヒト腫瘍において観察されてきており 、そして約１％の目かけ上の発病率を有することは注目に値する。Ｐｕ１ｃｉａ ｎら、上ＨＹｏｋｏｔａら、１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｐ２１の検出に使用される種々の診断試験は、同様な制限された成功率で正常ｒ ａｓ　ｐ２１の検出に応用されてきている。

以上から明らかなように、ｒａｓｌｌｌ瘍遺伝子またはそれらの形質転換性タン パク質の存在を決定する多数の診断方法が存在するが、広範な種類のｒａｓ関連 腫瘍の日常的同定を可能とする迅速なかつ信鯨性ある診断方法がなお必要とされ ている。

完−朋一の二！、、、豹 本発明に従えば、正常または腫瘍遺伝子のｒａｓ　ｐ２１タンパク質の過度の発 現を示す癌についての診断因子として有用であるペプチドを記載する。

本発明の第２面は、ＧＡＰの存在下および不存在下の両者においてｒａｓ　ｐ２ １タンパク質によるＧＴＰの加水分解を阻害する、診断的にかつ治療学的に有用 なペプチドの記載である。

本発明の第３の面は、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体からのＧＤＰの解離を仲介 する、診断的にかつ治療学的に有用なペプチドの記載である。

本発明の第４の面は、癌の診断において有用であるペプチドを使用してｒａｓ　 ｐ２１タンパク質をアンセイする方法の記載である。

本発明の第５の面は、上のペプチドに対する抗体の記載である。

本発明の第６の面は、癌の診断において有用である抗体を使用してｐ２１タンパ ク譬をアンセイする方法の記載である。

本発明の第７の面は、ヒトの癌の処置において、ペプチドまたはその断片を、単 独でまたはリガンドと接合して、使用する方法の記載である。

本発明のそれ以上の面は、本発明の次の説明を考慮すると明らかになるであろう 。

第１図は、ＴＳＫフェニルカラムの溶離のプロフィルおよびそのＳＤＳ　ＰＡＧ Ｅ分画の銀染色を示す。

第２図は、カチオン、およびアニオンのクロマトグラフィーおよび引き続く第２ のカチオンクロマトグラフィーから成る３工程のクロマトグラフィーの方法によ り精製したＧＡＰのＳＤＳゲルのプロフィルを示す。

第３図は、ラムダｇｔｌｌの同定に使用したＤＮＡプローブを作るために使用し たＧＡＰアミノ酸配列配列す。また、可能なコドンの重複をもつ配列をコードす る対応するＤＮＡを示す。

第４図は、ＧＡＰ６の同定に使用したＤＮＡプローブを示す。

第５図は、ラムダクローン、クローン１０１のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す 。

第６図は、ラムダクローン、クローン１６およびクローン「スリービイ（Ｓｌｅ ｅｐｙ）」のＤＮＡ配列を表す。

第７図は、クローン７および１０１のラムダリソゲン（上部のパネル）の、およ びｐＡｃｃ１２−ＧＡ、Ｐ５でトランスフェクションしたＳｆ９細胞のリゼイト （底のパネル）の存在下に実施したＧＡＰアッセイの結果を示す。

第８図は、ｐＡｃｃ１２の構成を示す。

第９図は、ラムダクローン１０１のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表し、そして次 のペプチドに相当するＤＮＡおよびアミノ酸セグメントを同定する：Ｇ６５．Ｇ ７３．ｃＧＡＰ１３についての配列、およびペプチド８９１゜第１０図は、ペプ チドＧ６５．Ｃ７３，ｃＧＡＰ１３およびペプチド８９１の対応するＤＮＡおよ びアミノ酸配列を示す。

第１１図は、Ｖｙｄａｃ　Ｃ４ＰｒｅｐＰＡＫカラムからのｃＧＡＰ１３の溶出 プロフィルを示す。

第１２図は、ｃ　ＧＡＰ　１３のアミノ酸分析を示す。

第１３図は、ｃＧＡＰ１３の質量分光光度計の分析を表す。

第１４図は、放射性ｐ２１−ＧＴＰ複合体の存在およびこうしてＧＡ、Ｐの存在 下および不存在下のＧ　Ｔ　Ｐのｐ２１の加水分解のときのペプチドＧ６５．Ｃ ７３およびペプチド８９１の作用を示すグラフである。

第１５図は、ＧＡＰの存在下および不存在下の、Ｇ６５゜ｅＧＡＰ１３およびペ プチド８９１を包含する実験におけるＧＤＰ／ＧＴＰの放射能のカウントの比を 示す棒グラフを表す。

第１６図は、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体からのＧＤＰの解離をペプチド８９ １が引き起こすことを示す実験の結果を表す。

第１７図は、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰｒＳからのＧＴＰｒＳの解離をペプチド８ ９１が引き起こさないことを示す実験の結果を表す。

本発明は、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体またはｒ ａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合するペプチドの記載を提供する。本発明は、 さらに、これらのペプチドに対する抗体を記載する。ペプチドおよびそれらの抗 体、およびそれらから誘導された断片は癌の診断剤とし７て有用であり、正常ま たは腫瘍遺伝子のｒａｓ　ｐ２１タンパク質の過度の発現を示す癌の診断に特に 有用である。さらに、ペプチドおよびそれらの断片は、単独でまたはりガントと 接合して、癌の治療に有用である。本発明のペプチドの同定および分離はＧＡＰ 配列の入手可能性により促進される。このようなペプチドの配列はヒトＧＡＰま たはＧＡＰ１１タンパク質のアミノ酸配列の知識に基づいて発生されたので、本 発明の論考の順序は次の通りであろう：ＧＡＰの精製二ＧＡＰをアッセイする方 法、ＧＡＰの部分的アミノ酸配列；アミノ酸配列に基づ＜ＧＡＰプロ・−ブを使 用するＧＡＰのクローニングおよびｃＤＮＡライブラリーの中のＧＡＰ　ＤＮＡ 配列特異的の同定、ならびに配列のサブクローニング、ＧＡ、Ｐのペプチド断片 の合成；ｒａｓ　Ｐ２＋またばｒａｓ　ｐ２１グアニジンヌクレオチド複合体に よるＧＴＰの加水分解を阻害するＧＡＰペプチド断片の同定；ｒａｓ　ｐ２１− ＧＴＰ複合体およびＧＴＰγＳａ合体の解離を仲介する能力についてのこのよう なペプチドの試験；ペプチドに対する抗体の合成；ｐ２１タンパク質のアッセイ のためのこのような抗体の使用；およびペプチドまたはペプチド断片を、単独で またはリガンドと接合して、癌の治療に使用すること。

光１）−詳鴬方、説朋。

ここに記載する本発明のよりよい理解は、本発明δこおいて使用する材料および 方法のいくつかの簡単な記載を提供することによって実現されるであろう。

正常細胞のｒａｓ遺伝子およびその腫瘍遺伝子対応物は、Ｎ、Ｂａｒｂａｃｉｄ 、１９８７．−渠ｎｎ、Ｒｅ−５ｙ４Ｂｉｑ−二尼虹恵ユー、５６８７７９に記 載されている。同様に、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質はＢａｒ ｂａｃｔｄにより記載されている。そのうえ、ＧＴＰに結合し、そしてＧＡＰ刺 激ＧＴＰアーゼ活性を示す正常細胞のｐ２１の断片は、ｒａｓ　ｐ２１タンパク 質の定義内に入ることを意図することが理解されるであろう。

ＧＡＰはグアニントリホスファターゼ活性化タンパク質の頭文字であり、これは ここに記載する分子量およびアミノ酸配列を有し、そして正常細胞のｒａｓ　ｐ ２１タンパク質のＧＴＰアーゼ活性を刺激する更なる性質を有するが１、ｒ　ａ 　５ｐ２１タンパク譬およびＧＴＰと組み合わせたとき、刺激活性をほとんどあ るいはまったく持たない。もちろん、当業者は理解するよ・）に、ＧＡＰは、ま た、ある条件下に凝集体またはマルチマーとして存在し、そしてこれらの形態は 定義の範囲内に入ることを意図する。そのうえ、定義は活性を示すＧＡＰの断片 を包含することを意図する。このよ・）な断片の例は、ここに示すように約３， ０００の減少し７たサブユニットの分子量を有する分子である。

ここに記載する本発明は、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ 複合体またはｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合することができる、合成また は組換え的に産生されたペプチドを包含する。これらのペプチドは次の形態を取 る。第１はＧＡＰの断片に構造的に類似する６第２の形態はｒａｓ　ｐ２１タン パク質、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体またはｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体へ の結合において前の形態と競争する。第３は第１と同一部位に結合する。本発明 は、さらに、上のペプチドに対しで特異的な、ポリクローナル抗体およびモノク ローナル抗体の両者の抗体、ならびに上のペプチドまたは抗体を使用してｒａｓ 　ｐ２１タンパク質をアツセイする方法を包含する。

ペプチドの発明に加えて、Ｇ　Ａ、　Ｐの正確な化学的構造、および合成ペプチ ドは多数の因子に依存することがあることが理解されるであろう。ペプチドはイ オン化可能なアミノ基およびカルボキシル基を含有するので、もちろん、ペプチ ドは酸または塩基の塩の形態でまたは中性の形態で得ることができることは明ら かである。さらに、第１アミノ酸配列は糖分子を使用する誘導体化（グリコジル 化）により増大することができるか、あるいはしばしばサツカライドとのアソシ エーションを通して起こる、例えば、ホスフェート、アセチルなどの基をもつペ プチドへの共有結合またはイオン的結合を包含する他の化学的誘導化により増大 することができることが明らかである。ごれらの修飾は試験管内または外体内で 起こることができ、後者は宿主細胞により翻訳後のプロセシング系を通して実施 される。このような修飾は、ここにおいて定義するペプチドの活性が有意に変更 しないかぎり、それらが起こる方法に無関係に、ペプチドの定義に入ることを意 図する。

ここで使用するとき、ｒｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体１はｒａｓ　ｐ２１タン パク質のＧＴＰ結合状態として定義される。

ここで使用するとき、ｒｒａｓ　ｐ２１−Ｃ；ＤＰＩ合体」はｒａｓ　ｐ２１タ ンパク質のＧＤＰ結合状態として定義される。

ここで使用するとき、ｒｒａｓ　ｐ２１−グアニジンヌクレオナト複合体」は、 ｒａｓ　ｐ２１タンパク質のグアニジンヌクレオチド結合状態として定義される 。

ここで使用するとき、「クロマトグラフィー」は、通常勾配または順次の溶離剤 で溶離される、咬着剤または他の支持体物質に、化合物の混合物を含有する溶液 を適用することを包含する。支持体のマトリックスから溶離される物質は溶離液 と表示する。順次の溶離は、カラムの中の支持体を分［、、そして支持体マトリ ックスに対する親和性を変化する１または２以上の溶離溶液を、段階的にまたは 好ましくは勾配により、マトリックスに通過させることによって、最も日常的に 実施される。フィルターの中に支持体マトリックスを配置し、そしてフィルター を通して、またはバッチのモードで溶離剤を順次に投与することは、「クロマト グラフィー」の定義内に包含されることは理解されるであろう。

用語「疎水性相互作用マトリックス」は、疎水性固体、例えば、ポリスチレン、 ゴム、シリカ被覆シリカゲル、材料を疎水性とするために十分な疎水性官能基で 置換した架橋したアガロースである吸着剤を意味することを意図する。アルキル 置換アガロースおよびアリール置換アリール、例えば、フェニルまたはオクチル アガロースは代表的な疎水性物質である。疎水性相互作用クロマトグラフィーマ トリックスでクロマトグラフィー的に分離される物質の混合物は、−ｉに、最初 にマトリックスに高い塩の溶液中で吸着させ、引き続いて低い塩の溶液、または 炭化水素の溶媒、例えば、ポリオール中で溶離することによってマトリックスか ら脱着する。

「アニオン交換マトリックス」は、水溶液中で帯電する固体またはゲルのマトリ ックスを意味すると定義される。支持マトリックスは、水溶液中で正味の電荷を 有するアミン官能基で十分に置換されたアガロースであることができる。吸着す べき物質を一般に低い塩溶液中でアニオン交換マトリックスに結合させ、そして アニオン交換マトリックスに結合しそして吸着された物質を置換するアニオン、 例えば、塩素イオンを含有する高い塩の溶離剤中でアニオン交換マトリックスか ら溶離する。

用語「高い塩濃度の条件」とは、高いイオン強度の条件をつくるイオン性物質が 存在する水溶液を意味する。イオン強度はこの分野において一般に理解されてお り、そしてそれらの活性係数により修飾された溶液の中に配置された種々のイオ ンの推定上の濃度から計算することができる。日常的に使用される高い塩濃度は 、典型的には、高い濃度の硫酸アンモニウムを含有する溶液である；しかしなが ら、他の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸ナトリウム、または リン酸ナトリウムを、また、使用することができる。

「親和性クロマトグラフィー」の定義は、Ｗ　ｉ　ｌ　Ｃ＋１　ｅ　ｋら、１９ ８４．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｔｎ　Ｅｎｚ　ｍｏ’ｌ。

ｉ、１０４：３のそれに類似すると理解される。その最も広い意図する定義にお いて、「親和性クロマトグラフィー」は「生物学的認識に基づく精製方法」であ る。簡単に述べると、この手順はりガントを固体の支持体にカップリングし、そ してこのリガンドに結合するりガントの認識分子をその中に含有する溶液とこの リガンドと接触することを包含する。引き続いて、リガンドを認識する分子をリ ガンドから解放し、そして純粋な形態で分離する。種々のりガントをＷ　ｉ　ｌ 　ｃ　ｈ　ｅｋらにより論考される親和性クロマトグラフィーにおいて使用する ことができ、そしてこれらの例はレクチン、抗体、レセプター結合タンパク質お よびアミノ酸を包含する。

「細胞」または「Ｍｉ換え宿主」は、この関連から明らかなように、しばしば互 換的に使用される。これらの用語は中間体の主題細胞、および、もちろん、その 子孫を包含する。変異または環境の差の機会があるために、すべての子孫が親細 胞と正確に同一であるわけではないことが理解される。しかしながら、上の用語 を使用したとき、このような変更した子孫は包含される。

次は抗体の発明に関する： 用語「抗体」は、ここで使用するとき、ポリクローナル抗体およびモノクローナ ル抗体の両者を包含する。さらに、この用語は全免疫グロブリンならびにその抗 原結合性断片を包含する。ポリクローナル抗体は、宿主動物、例えば、ウサギ、 ラット、ヤギ、マウスなどに、ペプチドまたはペプチドのセグメントを注射する ことによって産生ずることができる。血清を宿主動物から抽出しそしてスクリー ニングして、ペプチドの免疫原に対して特異的なポリクローナル抗体を得る。モ ノクローナル抗体は、例えば、マウスを前述のペプチドで免疫化することによっ て産生ずることができる。マウスを免疫原看のペプチドで腹腔内的に接種し、次 いで同様な量の免疫原ペプチドで促進する。最後の促進互換的に数日後に肺臓を 免疫化したマウスから集め、そして細胞懸濁液をそれから調製して融合において 使用する。

ハイブリドーマを肺細胞およびネズミ腫瘍の相手から、Ｋｏｈｌｅｒ、Ｂ、およ びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，１９７５゜■土↓且工ｅ、２５６：４９５−４９７の 一般の体細胞のハイブリダイゼーション技術を使用して調製することができる。

入手可能なネズミ骨髄腫系統、例えば、ソータ・インスチチュート、細胞分配セ ンター（Ｓａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ）、米国カリフォルニア州 すンジエゴをハイブリダイゼーションにおいて使用することができる。基本的に は、この技術は融合原としてポリエチレングリコールを使用して腫瘍細胞および 肺細胞を融合することを包含する。融合後、細胞を融合媒質から分離し、そし° ζ選択的成長培地、例えば、ＨＡＴ培地中で成長させて、ハイブリダイゼーショ ンしなかった親細胞を排除する。ハイブリドーマは、必要に応じて、拡張し、そ し７て上澄み液を普通のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、 酵素イムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイ）により抗原として免疫化因子を 使用してアッセイすることができる。陽性のクローンをさらに特性決定して、そ れらが本発明の抗体の基準を満足するかどうかを決定することができる。

このような抗体を産生ずるハイブリドーマは、既知の手順を使用して、試験管内 または生体内で成長させることができる。モノクローナル抗体は培地または体液 から、場合に応じて、普通の免疫グロブリン精製手順、例えば、硫酸アンモニウ ムの沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過により、 必要に応じて、分離することができる。

タンパク質への抗体の結合は、十分に高い濃度の親和性精製した抗体を使用する 場合、増大することができる。親和性精製はこの分野においてよく知られている 技術であり、ここで抗原ペプチドを免疫化に使用したものと異なる担体に結合し 、そして抗原を担体を通して展開して精製する。

二人を皇猜裂 グアノシントリホスファターゼ活性化タンパク質、またはＧＡＰは、高等の真核 生物において広く発現される。ＧＡＰはヒトおよびマウスの正常組織、例えば、 脳、肝臓、Ｂ細胞および血小板において検出されてきている。それは、さらに、 ＮＩＨ３Ｔ３を包含する非形質転換細胞培養物、ならびにヒト哺乳動物癌細胞（ ＭＣＦ−７）、網膜芽細胞腫細胞（Ｙ７９）、およびウィルム（Ｗｉ１ｍ’ｓ） 腫瘍（Ｇ４０１）を包含する形質転換された細胞の中に発見された。ＧＡＰは、 昆虫の細胞、例えば、スボドプテラ・フラギベドラ（Ｓｐ。

ｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒａｇｉｐｅｄｒａ）の中に存在する。

これらの細胞または組織の多くから、精製のプロトコルなどに小さい変動がある にもかかわらず、ＧＡＰを分離することができる。

ＧＡＰの分離および精製の一般の方法は、適当な細胞、組織または器官の細胞質 から分子を解放し、次いで不溶性物質を除去し、そして可溶性ＧＡＰＯ分画をカ チオン交換クロマトグラフィーにかけ、次いで第２クロマトグラフイ一工程にか け、ここでカチオン交換体からの溶離液をアニオン交換体に通過させる。ＧＡＰ をアニオン交換体から溶離し、そしてさらにそれを第３クロマトグラフイ一工程 、疎水性クロマトグラフィー、または第２カチオン交換工程にかける。

ざらに詳しくは、ＧＡＰは、凍結融解、超音波処理、温和な消化抽出などを包含 するある数の技術を使用して、細胞質ゾルから分子を解放することによって調製 される。この手順は好ましくは１または２以上のプロテアーゼ阻害因子を含有す る生理学的に緩衝化した溶液中で実施する。そのうえ、プロテアーゼ活性、こと に活性について金属イオンに頼るプロテアーゼをさらに阻害するために、抽出溶 液は金属イオンキレート剤を含有することができる。好ましい抽出溶液は、キレ ート剤のエチレングリコールトリクロロ酢酸（ＥＧＴＡ）、またはエチレンジア ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、＋プロテアーゼ阻害因子のフェニルメチルスルホニ ルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有する生理学的にバランスした塩溶液である。

１または２以上の金属イオンのキレート剤、ならびに１または２以上のプロテア ーゼ阻害因子は、タンパク質分解を効率的に阻害する濃度、好ましくは、それぞ れ、約５ミリモルおよび１００μモルの濃度で存在する。しかしながら、もちろ ん、当業者は理解するように、プロテアーゼの型および量は、ＧＡＰの抽出に使 用する出発物質に依存して変化するので、プロテアーゼ阻害因子またはキレート 剤を、事実使用する場合、その使用する濃度は、また、変化するであろう。

ＧＡＰを含有する混合物は遠心、または他の方法で清浄化して水性細胞質ゾル分 画から不溶性物質を除去することができる。細胞質ゾル分画は少量のＧＡＰを含 有する場合、それは高い塩の沈澱、例えば、硫酸アンモニウムを使用する沈澱を 包含する当業者によく知られているいくつかの技術のいずれか１つによるか、あ るいは限外濾過により濃縮することができる。ＧＡＰを沈澱により濃縮する場合 、それは好ましくは引き続いて１または２以上のプロテアーゼ阻害因子、好まし くは約０．１％の非イオン性洗浄剤、例えば、Ｎ、Ｐ２Ｏを含有する、適当な生 理学的にバランスされた塩溶液の中に再懸濁させる。次いで、この溶液はそれを 混和性的緩衝化したクロマトグラフィー溶液、好ましくはミリモルのホスフェー ト、金属イオンキレート剤、還元剤、およびプロテアーゼ阻害因子を含有する溶 液に対して透析することによってイオン交換クロマトグラフィーのために調製す る。さらに、ＧＡ、Ｐ活性は２価のカチオン、例えば、塩化マグネシウムの存在 下に刺激されるので、それは溶液の中に存在することもできる。

この溶液のＰＨは好ましくは約６．０である。

次いで、ＧＡＰ透析物は好ましくは３工程から成るクロマトグラフィーの精製に かける。第１はＧＡＰ抽出緩衝液と適合性のイオン交換クロマトグラフィーを使 用して精製を包含する。好ましい抽出緩衝液はホスフェートを含有するので、初 期工程はカチオン交換クロマトグラフィーによるＧＡＰの精製である。第２工程 は、イオン交換マトリックスが使用した第１イオン交換体のそれと反対のイオン 交換能力を有するイオン交換クロマトグラフィーから成る。

こうして、好ましい精製方法はＧＡＰを含有するホスフェート溶液をカチオン交 換体に適用し、そして、好ましくはその溶液のｐＨまたは導電性を変更する溶液 を使用して、ＧＡＰをカチオン交換体から溶離することがら成るであろう。より 好ましくは、ＧＡＰは勾配または非勾配の塩溶液を応用することによって溶離し 、そして最も好ましくは約０〜０．６モルの範囲にわたる塩化すトリウムの直線 の勾配を使用して溶離されるであろう。

好ましいカチオン交換体はＳＰ−セルロースのカチオン交換体である。このよう なものは、ＡＭＦモレキュラー・セバレイシゴン・ディビジョン（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｄｉｖｉｓｈｏｎ）、コネチカット州メリディ ７ンから商標ＺｅｔａＰｒｅｐＳＰカートリッジで商業的に入手可能である。Ｓ Ｐ−セルロースカチオン交換体は、ペンダントのスルホニル官能基を含有するビ ニルポリマーと架橋したセルロースの主鎖から構成された弾性３次元のネットワ ークである。このマＩ・リックスは好ましくはＧＡＰ溶液のラジアル流れ通路に 適合させる。マＩ・リックスを通る溶液の流速は、使用するマトリックスの大き さおよび形状寸法に依存するであろう。しかしながら、当業者にとって明らかな ように、ＧＡＰを保持するマトリックスの単位能力を越えることを回避するため に注意すべきである。能力を越える場合、ＧＡＰは完全に保持されず、そして過 剰の保持されないＧＡＰは溶離液の中に存在するであろう、ＧＡＰを保持する能 力は、下に記載するアッセイの１つを使用して溶離液の中のＧＡＰについてアッ セイすることによってモニターすることができる。

ＧＡＰを含有する分画を第２クロマトグラフイ一工程、すなわち、アニオン交換 クロマトグラフィーのために調製する。

これは分画を一緒にし、そしてこの溶液をアニオン交換クロマトグラフィーに適 合するｐＨおよびイオン強度を調節することから成る。種々のアニオン交換体は 入手可能であり、そして使用する型に依存して、これらの因子の濃度は変化する であろう。ＤＥＡＥ−セファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）またはＴＳＫ−ＤＥ ＡＥ−５−ＰＷを使用することができる。

好ましいアニオン交換体はＴＳＫ−ＤＥＡＥ−５−ＰＷマトリックスである。そ れはそれを塩素イオンを含有する溶液とｐＨ８，５において平衡化することによ って＄備する。より好ましくは、この溶液をトリス塩酸塩、ｐＨ８，５、土金属 キレート剤、塩化マグネシウム、およびプロテアーゼ阻害因子から成るであろう 。金属キレート剤およびプロテアーゼ阻害因子の濃度は、ＧＡＰをどれだけ高度 にタンパク質分解するか、および応答可能なプロテアーゼが金属イオンにより活 性化されるかどうかに依存して変化するであろう。１価のカチオン、例えば、塩 化マグネシウムおよび還元剤の濃度は、ＧＡＰ活性をモニターすることによって 実験的に決定することができる。最高の活性を維持する濃度が利用されるであろ う。一般に、塩化マグネシウムおよび還元剤は、それぞれ、約０．５〜１ミリモ ル、および０．１〜１ミリモルの範囲で存在することが好ましい。

次いで、この溶液をアニオン交換マトリックスに通過させ、このときＧＡＰはマ トリックスに結合する。引き続いてＧＡＰをマトリックスから、ｐＨまたは導電 性を変更する溶液を使用して、溶離する。好ましい溶離方法は、Ｏ〜０．６モル の塩化ナトリウムの範囲の直線の塩の勾配を使用してＧＡＰを溶離することから 成る。そのようにして得られたＧＡＰの純度および活性は、下に記載するＧＴＰ アーゼのアッセイによるか、あるいは還元性条件下に実施するＳＤＳのポリアク リルアミドゲルの電気泳動によりモニターすることができる。

これらの技術を使用して、Ｇ　Ａ、　Ｐは約１１５，０００〜１２ｏ、ｏｏｏダ ルトンの分子量を有することが決定された。

第３クロマトグラフイ一工程は、アニオン交換クロマトグラフィー後、第２クロ マトグラフイ一工程、または疎水性相互作用クロマトグラフィ一工程を適用する ことから成る。最も好ましい精製方法は第２カチオン交換工程は第２カチオン交 換工程を利用する。これらの方法のいずれの適用も一般にＧＡＰの純度を約９５ ％に増加する。カチオン交換カラムを選択する場合、前述の物質および方法を同 様にここで応用することができる。一般に、これはアニオンカラムの溶離液の中 に存在する塩の濃度を減少し、そしてｐＨを６．０に調節することから成る。こ こで、初期のカチオンクロマトグラフィ一工程におけるように、いくつかの異な る型のカチオン交換マトリックスを使用することができる；しかしながら、好ま しいマトリックスは還元性条件下に使用する５Ｐ−ＴＳＫカラムである。疎水性 クロマトグラフィーを選択する場合、アニオン交換体からのイオン強度は疎水性 相互作用クロマトグラフィーと適合性であるように増加すべきである。次いで、 この溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィーのマトリックスに通過させ、そし て塩濃度の減少またはチャオトロソビク剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔ ）を使用する溶離を包含する、この分野において知られている技術を使用して溶 離する。後者の溶液のいずれをも、単独でまたは組み合わせて、使用することが できる。

種々の疎水性相互作用クロマトグラフィーのマトリックスを利用する。一般に、 疎水性クロマトグラフィーを利用する材料および方法は、Ｓ、５ｈａｌｔｉｅ、 １９８４．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏ−Ｌ」−ＬＬ、１０４：６９に 記載されている。ＧＡＰの精製に使用することができる多数の疎水性クロマトグ ラフィーの材料および方法が存在するが、フェニルセファロースは好ましく、そ してクロマトグラフィーは高い圧力下に使用することはさらに好ましい。フェニ ル誘導化マトリックスを包含する高圧液体クロマトグラフィーを形成する一般手 段は、Ｆ、Ｒｅｇｍａｅｒ、１９８３．ＭＢｈＯｄｓ　ｉ　ｎ　Ｅｎ　ｚ４−ｍ 凪土■Ｌ、　−９１：　１３７に記載されている。好ましいフェニル誘導化マト リックスはパイオーラド・コーポレーション（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎ）から商標Ｂｉｏｇｅｌ　ＴＳＫ　フ、ｚ−ルー５−ＰＷで販売されて いる。

さらに、当業者は理解するように、別の精製方法はカチオンおよびアニオンのク ロマトグラフィー交換工程および引き続く親和クロマトグラフィ一工程から成る ことができる。これは、ＧＡＰ上に存在することができる炭水化物と特異的に適 合性の既知の炭水化物を有する１または２以上のレクチンにＧＡＰを結合させる か、あるいはＧＡＰを抗ＧＡＰ抗体に結合することによって達成することができ る。いずれの場合においても、マトリックスがレクチンから構成されている場合 適当な糖を使用するか、あるいはマトリックスが抗体から構成されている場合ｐ Ｈまたはチャオトロビック剤により、ＧＡＰを引き続いて親和性マトリックスか ら解放することができる。

ＧＡＰはＧＡＰ活性を有するより低い分子量の種に分解するプロテアーゼ感受性 分子であるので、本発明の好ましい実施態様において、全体の精製手順は冷時に おいて実施してプロテアーゼ活性を減少する。一般に、この温度は１０°Ｃ以下 であり、好ましい温度範囲は約２〜８°Ｃである。約４　”Ｃの温度は最も好ま しい。

最後に、ここに記載するイオン交換物質の好ましい応用はカラムのフォーマット であるが、理解されるように、それらは、また、同様によ（バッチのフォーマッ トで使用することができることに注意すべきである。

好ましい実施態様の精製の方法は、次のようにしてヒト胎盤からＧＡＰを分離す ることから成る。

ＧＡＰは３００ｇのヒト胎盤から３工程のクロマトグラフィー手順により分離し た。胎盤を分娩後短時間に得、そして処理するまで氷上に保持した。胎盤からＨ ＩＶ抗体を含まないことが標準の試験により決定された後、胎盤を次のように処 理した。初期の工程は、結合組織を機械的に除去し７、そしてリン酸塩緩衝液（ ＰＢＳ）の中の多数のソーキングにより胎盤から過剰の血液を除去した。次いで 、この組織を一７０゛Ｃにおいて凍結し、次いで５ミリモルのＥＧＴＡ、１００ μモルのＰＭＳＦを含有するＰＢＳの溶液の中に組織を配置し、次いで均一な懸 濁液が明らかになるまで、組織をブレングー中で崩壊させることによって、胎盤 を断片化した。懸濁液を１００．０００Ｘｇで遠心して、破片を除去し、上澄み 液を除去し、そしてその中の胎盤質を４０％の硫酸アンモニウムで沈澱させた。

硫酸アンモニウムを除去し、そして沈澱したタンパク質を０．１％のＮＰ４０お よび１００μモルのＰＭＳＦを含有するＰＢＳＯ中に再懸濁させた。この溶液を 直ちに２０ミリモルのリン酸カリウム、１ミリモルのＭｇＣ１，，５ミリモルの ＥＧＴＡ、０．１ミリモルのＤＴＴ、１００μモルのＰＭＳＦ、ｐＨ６，１、に 対して６時間透析した。次いで、この溶液を、２０ミリモルのリン酸カリウム、 １ミリモルのＭｇＣ１□、５ミリモルのＥＧＴＡ、０．１ミリモルのＤＴＴ、１ ００μモルのＰＭＳＦＸｐＨ６゜１、中で前以て平衡化した、カチオンマトリッ クス、Ｓ−セファロース〔ファースト・フロー、ファーマシア・コーポレーショ ン（Ｐｈａｒｒｒｈａｃｉａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能〕のクロ マトグラフィーに直ちにかけた。

カチオン交換体に吸収されたタンパク質を、０〜０．６モルの塩化ナトリウムを 含有する直線の勾配で溶離した。下に記載するＧＡＰアッセイを使用して、ＧＡ Ｐ活性の大部分は２つのピークで存在し、主要なピークは１００〜１５０ミリモ ルの塩化ナトリウム濃度で溶離し、そして小さいピークは２２０〜３００ミリモ ルの塩化ナトリウム濃度で溶離した。

主要なピークを３０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、１ミリモルの塩化マグネシウム 、１ミリモルのＥＧＴＡ、０．１ミリモルのＤＴＴ、１００μモルのＰＭＳＦ、 ｐＨ８，５、に対して透析した。透析物をアニオン交換カラム、ＴＳＫ−ＤＥＡ Ｅ５　ＰＷ（１５０Ｘ２１．５ｍｍ）に適用した。アニオン交換マトリックス０ 〜０．６モルの塩化ナトリウムの範囲の直線の塩の勾配で処理して、付着するタ ンパク質を溶離した。

ＧＡＰ活性の大部分は約１３０ミリモルのＮａＣ１の塩化ナトリウム濃度におい て溶離した。ＧＡＰ活性を含をする分画をプールし、０．５モルの硫酸アンモニ ウムにし、そして疎水性カラム、フェニル−４ＳＫ−Ｈ！１）ＬＣに通過させた 。増加するエチレングリコールＯ〜３０％および減少する硫酸アンモニウム０． ５モル−０から成る十字形勾配を使用して、疎水性カラムからタンパク質を溶離 した。ＧＡＰ活性の主要な部分は２４％のエチレングリコールおよび０．１モル の硫酸アンモニウムの濃度で溶離した。下のように実施したＧＡＰ活性のアッセ イは、６％のゲルで還元性条件下に実施したドデシル硫酸ナトリウムのポリアク リルアミドゲルの電気泳動により明らかなように、約１２０，０００ダルトンの タンパク質バンドと相関関係づけられた（第１図）。

第２実施態様の精製方法を使用してＧＡＰを精製した。ヒト胎盤を再び分娩後短 時間に得、そして実施例１に記載するように、水冷ＰＢＳ中でソーキングし、均 質化し、そして清浄化した。硫酸アンモニウムを再び清浄化したホモジネートに ４０％の最終濃度に添加してタンパク質物質を沈澱させた。

硫酸アンモニウム溶液を４℃において１時間放置した後、沈澱したタンパク質物 質を１０，０００Ｘｇで１５分間遠心することによって回収した。沈澱物を０． １％のＮＰ４０および１００μモルのＰＭＳＦを含有するＰＢＳの中に再懸濁し た。この溶液を４°Ｃにおいて１ミリモルのＭｇＣ１ｚ、５ミリモルのＥＧＴＡ 、０．１ミリモルのＤＴＴ、および１００ミリモルのＰＭＳＦを含有する２０ミ リモルのリン酸カリウム、ｐＨ６，１、に対する４時間透析した。ＧＡＰはタン パク部分解しやすいので、より長い透析時間は望ましくない。

ＧＡＰ透析物を０．０２ミリモルのＭｇＣ１ｚ、１ミリモルのＥＧＴＡ、０．１ ミリモルのＤＴＴ、および１００ミリモルのＰＭＳＦを含有する４ミリモルのリ ン酸カリウム、ｐＨ６，１、で３回希釈して、この溶液の導電性を１ミリシーメ ンスに低下させた。この導電性はＳ−セファロースのカチオン交換カラムへの透 析物の適用と適合性であった。透析物を１０、ＯＯＯＸｇで１０分間遠心し、次 いで０．４５μｍのフィルターを通す濾過から成るそれ以上の清浄化工程により 清浄化し、次いでＳ−セファロースのカラム（ファースト−フロー、ファーマシ ア）に添加した。タンパク質を含有する大部分をＳ−セファロースのカラムに通 過させ、そして吸着したタンパク質をＯ〜０．６モルのＮａＣ１から成る１、５ リツトルの塩の勾配で溶離した。ＧＡＰ活性を含有する分画を下に記載するＧＡ Ｐアッセイを使用して同定した。

最初の実施例において観測されるように、ＧＡＰは主として２つの主要なピーク でカチオン交換カラムから溶離された。

１００〜１５０ミリモルの塩化ナトリウム濃度にわたって溶離する第１ピークを プールし、そして１ミリモルのＥＧＴＡ、１ミリモルのＭｇＣ１□、０．１ミリ モルのＰＭＳＦを含有する３０ミリモルのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８，５、 に対して透析した。この溶液を４℃において透析し、そして０．４５μｍのフィ ルターを通して濾過することによって清浄化した。濾液を等しい半分に分割し、 そして各半分を２つの連続的アニオン交換カラムを使用して精製した。

２つの濾液を寸法１５０ｘ２１．５ｉｎを有するＴＳＫ−ＤＥＡＥ−５−ＰＷカ ラム上に負荷した。カラムを前述のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，５の透析緩衝液中 で前以て平衡化した。

ＧＡＰを０〜０．６モルのＮａＣ１勾配で６０分間３ａ＋１７分の流速でカラム から溶離した。両者の濾過からのＧＡＰ活性の大部分は、約１３０ミリモルの塩 化ナトリウム濃度で単一のピークとして溶離された。ＤＥＡＥのドデシル硫酸ナ トリウム、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動の分析は、ＧＡＰがピーク活性分 画における主要なタンパク質であることを示した。両者の精製からのＧＡＰを含 有する分画をプールし、そして０．１モルのＥＧＴＡ、１０μモルのＤＴＴを含 有する２ミリモルのリン酸カリウム、ｐＨ６，１、の中に５倍に低い塩濃度に希 釈して、この溶液が第２カチオン交換クロマトグラフイ一工程、すなわち、５Ｐ −ＴＦＫカラムを使用するクロマトグラフィーとクロマトグラフィー的に適合性 であることを保証した。この溶液のｐＨを検査し、そして必要に応じて酢酸ナト リウム（３モル、ｐＨ４，８）でｐＨ６，１に調節した。ＤＥＡＥカラムから分 離したＧＡＰ分画の両者をさらに別々にカチオンカラム、？、５Ｘ７，５ｗｎの 寸法を有するＴＳＫ−ＤＥＡＥ−５−ＰＷで精製した。１ミリモルのＥＧＴＡ、 ０．１ミリモルのＤＴＴおよび０．１ミリモルのＰＭＳＦを含有する２０ミリモ ルのリン酸カリウム、ｐＨ６，１、を含有する溶液をカラムに通過させ、次いで ＧＡＰを４５分の０・−０，６モルの塩化ナトリウムの勾配で１ｓ＋１／分にお いて溶離した。ＧＡＰを含有する分画を下に記載するアッセイおよびドデシル硫 酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲルの電気泳動を使用して同定した。ＧＡＰ 活性は約１１６．０００ダルトンの分子量を有するタンパク譬に相当した。アミ ノ酸分析を精製したＧＡＰについて実施してタンパク質濃度を決定した。約３０ ０ｇのヒト胎盤を使用して出発して、はぼ４３０ｕｇの精製したＧＡＰが得られ た。第２図は前述の精製の種々の段階におけるＧＡＰのＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析を 示す。

ＧＡＰのアッセ± ＧＡＰ活性を測定するいくつかのアッセイが最近記載され３８：５４２；Ａｄａ ｒｉら、１９８８　５ｃｉｅｎｃｅ。

２４０：５１８゜これらの参考文献の全体をここに引用によって加える。−ＧＡ Ｐを試験管内でアッセイし、そＬ７ていくつかの異なる型の試験管内のアッセイ を実施することができる。

好ましいアッセイはＧＴＰの加水分解から生ずるＧＤＰの存在を測定することを 包含する。このアッセイは適当な生理学的に緩衝化した水溶液の中に一緒にし、 正常細胞のｐ２１、およびα−３２Ｐ−ＧＴＰ、＋ＧＡＰの最適な量を実験的に 決定することを包含する。この溶液は、また、プロテアーゼ■害因子および還元 剤を含有することができる。また、カチオンはＧＡＰ活性を大きく刺激するので 、それらはを動量で存在すべきである。好ましいカチオンは塩化マグネシウムで ある。

反応溶液を種々の時間の間インキュベーションし、そして酵素アッセイの実施に 典型的に使用される温度、好ましくは１０〜４０°Ｃ１より好ましくは３７°Ｃ において実施することができる。適当な時間において、アリコートを取り出し、 そしてα−３２Ｐ−ＧＤＰについてアッセイする。これはまず溶液の中の他の反 応成分からの結合したα−３２Ｐ−（１，ＤＰ、とくに遊離α−３２Ｐ−ＧＤＰ を含有するｐ２１を分離することによって達成される。これはｐ２１をそれに対 して向けられた抗体で免疫沈澱することによって達成することができる。免疫沈 澱の技術および抗ｐ２１抗体は既知であり、そして当業者により日常的に使用さ れている。好ましくは試料を変性洗浄剤の中に高温において、好ましくは１％の ドデシル硫酸ナトリウム中で６５°Ｃにおいて５分間溶解し、そしてこの混合物 を適当な薄層クロマトグラフィーのプレートのクロマトグラフィーにかけること によって、α−３２Ｐ−ＧＤＰを免疫沈澱物から解放する。クロマトグラフィー は好ましくは１モルのＬｉＣ１の中のＰＥＩセルロースプレートで実施する。α −３２Ｐ−ＧＤＰは適当な放射線検出技術、好ましくはオートラジオグラフィー を使用して、既知の標準に関するその移動度により同定する。

ＧＡＰ活性についての別のアッセイは上のアッセイ系においてガンマ標識した３ 　２　Ｐ−ＧＴＰＯ代わりにα標識した３２Ｐ−ＧＴＰを使用し、そして活性炭 を使用して遊離の３２Ｐｉ識したホスフェートについてアッセイする。このアッ セイはＴｊｉａｎら、１９８０．Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｌエ ム」ｕａｒｉｔ　Ｂｉｏｌ、、４４　：　１０３に記載されているようにして実 施することができる。

追加のアッセイは免疫沈澱を含まない。むしろ、前述のＧＡＰアッセイ反応から のアリコートを１モルのＬｉＣ１中でＰＥＩセルロースのクロマトグラフィーに 直接かけることができる。しかしながら、このア・ソセイは実質的に精製したＧ ＡＰを有する溶液をアッセイするために最も有用である。

典型的なＧ　Ａ、　Ｐアッセイは次のようにして実施することができる。Ｔｒａ ｈｅｙら、−鉦Ｊ」しＬ」−に記載されているようにして得られたほぼ０．８μ ｇのＨ−ｒａｓタンｉ＜り質をα−３２Ｐ−ＧＴＰに結合し、次いでこの複合体 を１３Ｐｇの分子のカルボキシル末端を認識する抗ｒａｓ抗体、１５７−１８１ で沈澱させた。詳しくは、’１５７−１８１は位置１５７−１８１におけるカル ボキシル末端の残基を認識する。Ａｄａｒｉら、１９８８，５ｃｉｅｎｃｅ、２ ８０：５１８゜次に、１０Ｐｇのヒツジ抗マウスＩｇＧ、および１０μｌのプロ ティンＡ−セファロースビーズを添加した。対照として、同一反応成分を一緒に し、ただしう・ソトＩｇＧの代わりに１５７−１８１を使用し、そしてヤギ抗ラ ットＩｇＧの代わりにヒツジ抗マウスＩｇＧを使用した。沈澱物を２０ミリモル の塩化ナトリウム、１ミリモルの塩化マグネシウムおよび１ミリモルのＤＴＴを 含有する２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐ）１７．４、で洗浄し、そして同一 溶液の中に再懸濁した。次いで、４μｍの免疫複合体のアリコートを１０μＩの ＧＡＰ、または、対照として、ＧＡＰを含まない緩衝液と混合した。

室温において６０分開インキュベーションした後、セファロースのビーズを再び 洗浄し、そして結合したヌクレオチドを溶媒として１モルのＬｉＣ１を使用して 薄層クロマトグラフィーにより分析した。薄層プレートを１〜２時間オートラジ オグラフィーにかけ、次いでそれを展開した。オートラジオグラフは十分なＧＡ Ｐの添加はＧＴＰのＧＤＰへのほぼ完全な加水分解を引き起こすが、対照のＧＡ Ｐを欠く対照においてＧＴＰの加水分解はほとんど起こらないことを明らかにし また。このアッセイはＧＡＰを半定量的な投与量依存性の方式で検出する。定量 はプレートの関連する領域を引っ掻きそしてガンマカウンターの使用によりＧＤ Ｐ　（ｃｐｍ）を測定することによって改良することができる。マウス抗体に・ ついて置換したラッ）ＩｇＧを有する免疫沈澱の対照は、ＧＴＰまたはＧＤＰを 明らかにしなかった。

上の方法に加えて、ＧＡＰは好ましくは次のようにし７てアッセイすることがで きる。８０ミリモルのβ−グリセロホスフェート、５ミリモルのＭｇＣ１□、１ ミリモルのＤＴＴ。

ｐＨ７，５，’−，２５５ｄモルの〔α−３２Ｐ：ｌ　ＧＴＰ　（１６Ｃ１／ミ リモル）、４ミリモルのＡＴＰ、およびウシ血清アルブミン（２、５ｗａｇ／畷 １）を含有する緩衝液の中に４μモルの正常細胞ｐ２１を溶解した。この混合物 を３７°Ｃにおいて３０分間予備インキュベーションし、次いでＧＡＰを含有す ることが疑われる試料または等しい体積の緩衝液を添加した。

室温において１時間後、０．５％のＮＰ４０の存在下にモノクローナル抗体Ｙ　 １３−２５９を溶液中に存在するすべてのｐ２１に結合するために十分な量で添 加した。次に、ヤギ抗うッｌ−ｆ　ｇ−プロティンＡセファロースを添加してＹ ｌ　３−２５９に結合したｐ２］を集め、そして免疫複合体を分離し、６２０ミ リモルの）’Ｊスス−ＮＣ１，、ｐＨ８，０，１００ミリモルのＮａＣｌ、５ミ リモルのＭｇＣ１，、および０．５％のＮＰ４０中で１０回洗浄した。これらの 工程の間のＧＴＰＯ結合および加水分解の程度を決定するために、Ｙ１１２５９ の添加直に５μｇのｐ２１を添加することがら成る対照を実施した。

ヌクレオチドをｐ２１から１％のＳＤＳ、２０ミリモルのＥＤＴＡで６５°Ｃに おいて５分間溶離し、そして１モルのＬｉＣ１中でＰＥＩセルロースのクロマト グラフィーにかけた。

ＧＴＰおよびＧ　Ｄ　Ｐを標準のオートラジオグラフィーの技術を使用して可視 化した。結果は、同様にアッセイした突然変異のｒａｓ腫瘍遺伝子のタンパク質 Ａｓｐ１２およびＶａ１１２と比較したとき、正常細胞のｐ２１がＧＴＰのＧＤ Ｐへのほぼ完全な転化に影響を与えることを示した。そのうえ、対照試料中でＧ ＴＰまたはＧＤＰのほとんどあるいはまったく検出されなかった。

前述のアッセイはＴｒａｈｅｙおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ。

１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ、２３８：５４２およびＡｄａｒｉｅら、１９８８　 、　）匹」」ＬＬ免見、２４０　：　５１８により詳細に説明されている。これ らの参考文献の両者をここに引用によって加える。

ＧＡＰの一″Ｌ糺３口吸配刀− ＧＡＰタンパク質またはぞれから誘導した断片を当業者に知られている標準の技 術により配列決定することができる。

ブロックされたアミノ末端を有するＧＡＰが分離される場合において、分子を、 例えば、リシルエンドペプチダーゼで断片化し、そして１または２以上の生ずる 断片を配列決定することによって、内部の配列決定を達成することができる。こ れは必ずしも胎盤以外の源から分離したＧ　Ａ、　Ｐの場合であることではない が、本発明において、ＧＡ、Ｐはブロックされたアミノ末端を示すことが決定さ れた。

前述の精製方法により得られた約１２０．０００の分子量を有するタンパク質を 、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する０８０５モルの重炭酸アンモニ ア中の６％のドデシル硫酸ナトリウム、ポリアクリルアミドゲルから電気溶離し た。従った手順はＨｕｎｋａｐ　ｉ　ｌ　ｌａ　ｒら、１９８３゜Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　Ｅ且１工旦庶↓ｆｆｌ、９　上’　２２７に記載されている。電気溶 離したタンパク質をリシルエンドペプチダーゼ（５％ｗ／ｗ、１３時間、４０″ Ｃ，、、ＷＡＫＯ）。

ペプチドを逆相高性能液体クロマトグラフィーによりブロウシリー・アクアポア （Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ）ＲＰ−３００カートリツジ（１００Ｘ ２．１ｍｍ、アプライド・バイオラステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ 、ｅｍｓ））を使用して分画した。ペプチドを０〜７０％のアセｌ−ニトリルの 勾配（緩衝液Ａ、Ｈ，Ｏの中の０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；ＩＩ衝 液Ｂ、８５％のアセトニトリルの中の０．０８５％ＴＦＡ）で１２０分間溶離し た。ペプチドの自動化した配列分析をアプライド・バイオシステムス４７０Ａ気 相配列決定装置で報告されているようにして実施した。ＧＡＰのペプチド特性は 次のアミノ酸配列を有する：ＩＭＰＥＢＥＹＳＥＦＫ　。

ＧＡＰのクローニング ＧＡＰをエンコードする全長のｃＤＮＡ配列を次のようにして得た：第１に、オ リゴヌクレオチドのプローブとしてＧＡＰの部分的アミノ酸組成物から誘導した ＤＮＡを使用して、部分的ｃＤＮＡ配列をｃＤＮＡライブラリー中で同定した。

１つのこのような部分的ｃＤＮＡ配列、ＧＡＰ６と呼ぶ、をサブクローニングお よび配列決定した。究極的に全長のクローン、クローン１０１を生ずる、より長 いｃＤＮＡインサートのためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため に使用した追加のプローブに、そのＤＮＡの知識は引き続いてに導いた。種々の 手順の各々を下に説明する。

１、二瓜立久ユニ玉Ｚ久茨酉 所望のＧＡＰ解読配列を含有する適当なベクターの構成は、この分野においてよ （理解されている標準の結合および制限技術を使用する。分離したベクター、Ｄ ＮＡ配列、または合成したオリゴヌクレオチドを切断し、要求通りに作り、そし て所望の形態に調節した。

一般にこの分野において使用されている条件下に１または２以上の適当な制限酵 素で処理することによって、部位特異的ＤＮＡ切断を実施し、そしてそれらの特 定のものはこれらの商業的に入手可能な酵素の製造業者により規定されている。

参照、例えば、ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｂｉｏｌａｂｓ）、製品のカタログ。

一般に、約ｌｐ！ｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を約２０μｌの緩衝液溶液中 で１ユニツトの酵素により切断した。ここにおける実施例において、典型的には 、過剰の制限酵素を使用して、ＤＮＡ基質の完全消化を保証した。約３７°Ｃに おいて約１または２時間のインキュベーションは存効であるが、変動は許容する ことができる。各インキュベーション後、タンパク質をフェノール／クロロホル ムを使用する抽出により取り出し、次いでエーテルで抽出し、そして核酸を水性 分画からエタノール沈澱により回収し、次いでセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ ｘ）Ｇ−５０スピンカラムを使用するクロマトグラフィーを実施することができ る。必要に応じて、切断した断片の大きさの分離をポリアクリルアミドゲルまた はアガロースゲルの電気泳動により標準の技術を使用して実施することができる 。大きさの分離の一般的記載は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（ １９８０）６５：４９９−５６０に見いだされる。

５０ミリモルのトリスｐＨ１，６，５０ミリモルのＮａＣ１゜６ミリモルのＭｇ 　Ｃｌｚ　、６ミリモルのＤＴＴおよび１０ミリモルのｄＮＴＰ中で２０〜２５ ℃において約１５〜２５分のインキュベーション時間を使用して、４つのデオキ シヌクレオチドトリホスフェ−）　（ｄＮＴＰ）の存在下に、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ ＮＡポリメラーゼ■の大きい断片、すなわち、りレノー断片で処理することによ って、制限切断断片を平滑末端とすることができる。クレノーで処理後、この混 合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させる。適当 な条件下に８１ヌクレアーゼで処理すると、−末鎖の部分の加水分解が生ずる。

結合は１５〜３０μｌの体積中で次の標準の条件および温度において実施する： 　「粘着末端」の結合について、２０ミリモルのトリス−ＣＩｐＨ７，５，１０ ミリモルのＭｇＣ１，。

１０ミリモルのＤＴＴ、３３■／−１のＢＳＡ、１０ミリモル〜５０ミリモルの ＮａＣ１、および１ミリモルのＡＴＰ。

０．３〜０．６　（Ｗｅ　ｉ　ｓ　５）−Ｌ＝７トのＴ４ＤＮＡリガーゼ、１４ °Ｃ１あるいは「平滑末端」の結合について、１ミリモルのＡＴＰを使用した、 および０．　３〜０．　６　（Ｗｅ　ｉ　ｓＳ）ユニットのＴ４リガーゼ。分子 間の「粘着末端」の結合は通常３３〜１００　ｘ／ｍｌの合計のＤＮＡ濃度にお いて実施する。平滑末端結合において、末端の合計ＤＮＡ濃度は約１μモルであ る。

「ベクター断片」を使用するベクターの構成において、ベクター断片はバクテリ アのアルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理して、５′ホスフエートを除去 しそしてベクターの再結合を防止する。ＢＡＰ消化はｐＨ８においてほぼ１５０ ミリモルのトリス中で、Ｎａ”およびＭｇ“の存在下に約１ユニツトのＢＡＰ／ 、のベクターを使用して６０℃において約１時間実施する。調製物をフェノール ／クロロホルムで抽出し、次いでエタノール沈澱することによって、核酸断片を 回収する。あるいは、不要の断片の追加の制限酵素の消化により二重に消化され たベクターにおいて再結合を防止することができる。

下に記載する構成において、正しい結合はまず適当なＥ。

ｃｏｌｉ株を結合混合物で形質転換することによって確証する。この分野におい て理解されるように、成功した形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリン または他の抗生物質に対する抵抗性によるか、あるいはプラスミドの構成のモー ドに依存して他のマーカーを使用して選択する。ミニブレブ（Ｍｉｎｆｐｒｅｐ ）ＤＮＡを形質転換体からり、Ｉｓｈ−Ｈｏｗｏｗｉｃｚら、　（１９８１Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ二８．工：２９８９）の方法により調製し、そ して制限酵により分析するおよび／またはＦ、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒ ｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡｈ、７４　：　５４６３のジデオ キシ方法により、さらにＭｅｓｓｉｎｇら、１９８１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、、９：３０９に記載されているように、あるいはＭａｘａｍら、 １９８０．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍ。

Ｊ」」ユ、６５　：　４９９の方法により配列決定することができる。

Ｍ１３の中のクローニングにおいて使用した宿主株は、ファージの感染を受け易 いＥ、ｃｏｌｔ株、例えば、Ｅ、ｃ。

１ｉ　Ｋ１２株ＤＣ，９８を使用する。ＤＧ９８株はＡＴＣＣに１９８４年７月 １３日に受託され、そして受け入れ番号１９６５を有する。

使用する宿主細胞に依存して、形質転換はこのような細胞に対して適当な標準の 技術を使用して実施する。Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ、１９７２．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、５ｃ土−−←Ｗ杢ノｑ、６９：２１１０に記載されているようなり ロライドを使用するカルシウム処理、またはＭａｎｉａｔｉａｎ、ｕａｌＪ、コ ールド・スプリング・ハーバ−・プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｐｒｅｓｓ）。

ｐ、２５４に記載されているＲｂＣ１２方法を原核生物について使用した。Ｓｆ ９細胞のトランスフェクションは、昆虫細胞に適合する（Ｊ、Ｐ、Ｂｕｒａｎｄ ら、１９８０．Ｖ±エユ」」ＬＬＬ、１０１　；Ｅ、Ｂ、Ｃａ５ｓｔ、ｅｎｓら 、１９８０、Ｖｉｒｏｌｏ　、上ｌ上：３１１）カルシウムホスフェートの沈澱 技術（Ｃ；ｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、ら、１９７３Ｖｔｒｏｌｏ　、５２：４５６） の変更を使用して達成した。Ｓｒ１のトランスフェクションの関する追加の詳細 な説明は、Ｓｕｍｍｅｒｓおよび５ｒｎｉｔｈ、ｒバクロウィルスのベクターに ついての方法のマニュアルおよび昆虫細胞の培養手順（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　 Ｉｎｃｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」、Ｔｅｘ ａｓ　Ａ　＆　Ｍ　Ｐｒｅｓｓ：１９８６に記載されている。ここにおいて使用 したバクロウィルスの転移ベクターは、上のＧ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈら、１９８３が 記載した転移ベクターから誘導する。これらのベクターは、Ｖｉｅｒｉａら、１ ９８２．Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６８に記載されているように、多面体の遺 伝子を含有するＡｃＮＰＶ　ＥｃｏＲＴ−１断片をＥ、ｃｏｌｉプラスミドｐＵ ｃ８のＥｃ。

Ｒ■部位の中にクローニングすることによって本来構成した。

多面体の遺伝子の中の種々の位置に単一のＢａｍＨＩクローニング部位を有する プラスミドの族は、上のＳｍ１ｔｈら、１９８３に記載されているようにつ（っ た。これらの使用した大部分、ｐＡｃ　３７３は、多面体のキャップ部位から５ ０塩基対下流、すなわち、ＡＴＧ翻訳開始コドンの８塩基対前の独特ＢａｍＨ１ 部位を有する（ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　 、Ｖｏｌ、６．ｐ。

４７（１９８８））。

２、オリゴヌクレオチドのプローブ 合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、１９８１、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈ ｅｍ、Ｓｏｃ、、１０３：３１８５のトリエステルの方法によるか、あるいは商 業的に入手可能な自動化されたオリゴヌクレオチドの合成装置を使用して調製し た。アニーリングの前のまたは標識っけのための一本鎖のキナーゼ化は、５０ミ リモルのトリスｐＨ７，６，１０ミリモルのＭｇ　ＣＩｚ　、５ミリモルのジチ オスレイトール、１〜２ミリモルのＡＴＰ、１．７ピコモルのガンマ”Ｐ−ＡＴ Ｐ（２，９ｍＣ１／ミリモル）、０．１ミリモルのスペルミジン、０．１ミリモ ルのＥＤＴＡの存在下に０．１ミリモルの基質に対して過剰の、例えば、はぼ１ ０ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを使用して達成される。

前述の部分的ＧＡＰアミノ酸配列配列よびそれに対する既知の重複体を使用して 、いくつかのＤＮＡオリゴヌクレオチドのプローブを合成し、そしてこれらを第 ３図および第４図ＧＡＰ　ＤＮＡ配列を同定するいくつかの手順は利用可能こと である。ｃＤＮＡライブラリーはこの分野において知られている技術を使用して 構成することができるか、あるいは商業的に購入することができる。

ＧＡＰを含有するｃＤＮＡライブラリーを作る例示の手順は、適当な出発物質か ら合計の細胞質ＲＮＡを分離し、そしてさらにメツセンジャーＲＮＡをそれから 分離することから成る。後者をさらにポリ（Ａ＋）メツセンジャーＲＮＡに分画 し、引き続いてこれをＧＡＰメツセンジャーＲＮＡを含有するポリ（Ａ＋）メツ センジャーＲＮＡ分画になおさらに分画する。次いで、適当なＧＡＰメツセンジ ャーＲＮＡを逆転写しそして適当なベクターの中にクローニングしてｃＤＮＡラ イブラリーを形成することができる。

さらに詳しくは、出発物質（すなわち、組織、細胞）をリン酸塩緩衝液で洗浄し 、そして非イオン性洗浄剤、例えば、エチレンオキシド、ポリマー型（ＮＰ−４ ０）を細胞を溶解するが、核の膜を溶解しない量で、一般に０．３％の量で添加 する。次いで、核を１．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心することによって除去するこ とができる。核後の上澄み液を０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）お よび１０ミリモルのＥＤＴＡを含有する等しい体積のＴＥ（１０ミリモルのトリ ス、１ミリモルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７，５）飽和フェ ノール／クロロホルム（１：１）に添加する。上澄み液を４回再抽出し、そして ２，０００％ｇで１２０分間遠心することによって相を分離する。試料を０．２ ５モルのＮａＣ１に調節し、２体積の１００％のエタノールを添加し、そして− ２０°Ｃにおいて貯蔵することによって、ＲＮＡを沈澱させる。次いで、ＲＮＡ を５，０００％ｇで３０分間沈澱させ、７０％および１００％のエタノールで洗 浄し、そして乾燥する。これは合計細胞質ＲＮＡを表す。ポリアデニル化（ポリ Ａ＋）メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）はオリゴ（ｄＴ）セルロースのクロ マトグラフィーにより合計の細胞［ＲＮＡから得ることができる（Ｊ、Ａｖｉｖ ら、１９７２、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、６９罎１４０８−１ ４１２）。ＲＮＡをＥＴＳ（１０ミリモルのｌ・リス、１ミリモルのＥＤＴＡ、 ０．５％のＳＤＳ、ｐＨ７，５）の中に２＋＋＋ｇ／ｍｌの濃度で溶解する。こ の溶液を６５°Ｃに５分間加熱し、次いで４°Ｃに急冷する。ＲＮＡ溶液を室温 にした後、それを０．４モルのＮａＣ１に調節し、そして結合緩衝液（５００ミ リモルのＮａＣｌ、１０ミリモルのトリス、１ミリモルのＥＤＴＡＸｐＨ７，５ ）で前取て平衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにゆっくり通過させる。

流れをカラムにさらに２回通過させ、そしてカラムを１０体積の結合緩衝液で洗 浄する。ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡをアリコートのＥＴＳで溶離し、ＴＥ−飽和フェ ノールクロロホルムで１回抽出し、そしてＮａＣ１を０．２モルのに添加しそし て２体積の１００％のエタノールを添加することによって沈澱させる。

ＲＮＡを２回沈澱させ、７０％のエタノール、次いで１００％のエタノールで洗 浄し、次いで乾燥する。次いで、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡライ ブラリーを構成することができる。

ｃＤＮＡは、濃縮したｍＲＮＡ分画から、Ｈ，Ｏｋａｙａｍａら、１９８３．Ｍ ｏ１．Ｃｅ１）、Ｂｔｏｌ、、３：２８０、その開示をここに引用によって加え る、の方法に従い、ポリＡテイルのオリゴ（ｄＴ）ブライミングおよびＡＭＶ逆 トラスクリブターゼを使用して作ることができる。

ｃＤＮＡを調製する他の方法は、もちろん、この分野においてよく知られている 。１つの現在古典的な方法は、オリゴ（ｄＴ）プライマー、逆トラスクリブター ゼ、二本鎖ｃＤＮＡのポリ（ｄＧ）を使用するティリング、および適当なベクタ ー、例えば、ｐＢＲ３２２または所望の制限部位で切断しそしてポリ（ｄＣ）で ティリングしたその誘導体を使用する。

この別の方法の詳細な説明は、例えば、本出願人の米国特許第４，５１８，５８ ４号、１９８５年５月２１日発行、その開示をここに引用によって加える、に見 いだされる。

前述したように、ｃＤＮＡライブラリーは商業的に入手可能である。特に有用な ライブラリーは、クロンチク（Ｃｌ　ｏ−ｎｔｅｃｈ）（カタログＮＯ，ＬＨ１ ００８）により販売されている。それは合計のポリ（Ａ＋）メツセンジャーＲＮ Ａがら作られたラムダｇｔｌｌヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーである。

４、ＧＡＰ　旦ＮＡｉび痕λ圀定 前述のオリゴヌクレオチドのプローブ、ＧＷ１３．ＧＷＩ５、ＧＷ１７およびＧ Ｗ１９を使用して、商業的に入手可能なりロンチク（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）のライ ブラリーをスクリーニングした。このライブラリーを約５０，０００プラーク／ プレートで１７プレートを使用してプレイティングした。

こうして、約８５０，０００のプラークをプラークのハイブリダイゼーション手 順を使用してスクリーニングし７た。種々のこのような手順は知られているが、 好ましい手順を下に説明する。各１５０ミリモルのプレートを二重反復試験のニ トロセルロースの濾紙（Ｓ　＆　Ｓ　ＢＡ−８５型）上に複製した。０．５Ｎの ＮａＯＨ＋１．０モルのＮａＣ１；１．５モルのＮａＣ１＋０．５モルのトリス ＨＣＩ、ｐｌｉ８；および２０ミリモルのトリス＋２ミリモルのＥＤＴＡ　ｐｈ ｓで５分間順次に処理して、ＤＮＡをフィルターに固定した。フィルターを空気 乾燥し、そして８０℃において２時間ベーキングした。

二重反復試験のフィルターを５５℃において２時間１０ｗ１／フイルターのＤＮ Ａハイブリダイゼーション緩衝液、５×５ＳＣＸｐＨ７，０１５Ｘデンハルト溶 液（ポリビニルとロリドン、＋フィコールおよびウシ血清アルブミン；ｌ×０． ０２％の各々）、５０ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０，５ミ’） 　モルのＥＤＴＡ、０．１％（７）ＳＤＳ、　および１００　ｇ／ｍｌの酵母Ｒ ＮＡと予備インキュベーションした。予備ハイブリダイゼーション緩衝液を除去 し、そして試料をキナーゼ処理したプローブの混合物と、所望の厳格さに依存す る条件下にハイブリダイゼーションした。約２×１ｏ６ｃｐ＋ｗ　／ｍｌの合計 を使用した。典型的な適度に厳格な条件は、プローブを含有する１〜５ｍｌ／フ ィルターのＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液とともに、４２℃の温度＋５０ ％のホルムアミドを２４〜３６時間使用する。より高い厳格さについて、高い温 度およびより短い時間を使用した。好ましいハイブリダイゼーション条件は、５ ＸＳＳＣ（標準の生理的クエン酸塩類溶液）、デンハルト溶液、５０ミリモルの Ｎａ５ＰＯａ　ｐＨ７，０，５ミ’Ｊ−Ｔ−ルのＥＤＴＡ、Ｏ，１％（７）ＳＤ Ｓ。

および１１００ｔａ／ｍｌの酵母ＲＮＡ中で５５℃において一夜ブローブをフィ ルターに対してハイブリダイゼーションすることから成っていた。次に、フィル ターを２ＸＳＳＣ，０，１％のＳＤＳおよび５０ミリモルのリン酸ナトリウム緩 衝液ｐｉ（７で室温において各回３０分間２回洗浄し、次いで２ＸＳＳＣおよび ０．１％のＳＤＳで５０℃において１回洗浄し、そして空気乾燥した。最後に、 フィルターを一７０″Ｃ３６時間オートラジオグラフィーにかけた。

オートラジオグラフィーの結果は単一の陽性のプラークを明らかにした。前述の 洗浄およびハイブリダイゼーションの条件を使用して、いくつかのラムダｇ　ｔ １１プラーク精製した分離物を同定し、そして取り上げた。ウィルスのＤＮＡを 、次のようにして、これらの１つ、ＧＡＰ６と呼ぶ、がら得た。

ＧＡＰ６を高い密度でＥ、ｃｏｌｉ株Ｙ１０９０　（ｒ−）の菌叢上でプレイテ ィングした。Ｅ、ｃｏｌｉの溶菌後、ファージの粒子を３Ｍ緩衝液（０，１モル のＮａＣ！、８．１モルのＭｇＳＯ４，５０モルのトリスＨＣＩ、ｐＨ７，５， ０゜０１％のゼラチン）の中にＥ、ｃｏｌｔを緩衝液でカバーし、そしてプレー トを冷時に数時間の間インキュベーションすることによって溶離した。ファージ 粒子を含有するリゼイトを１１．５００Ｘｇで２０分間遠心して細胞の破片を除 去し、そして生ずる上澄み液を標準の技術により力価決定した。１０　”ＰＦＵ 　／ｍｌの力価が決定された。最後に、ファージＤＮＡを上のＭａｎｉａｔｉｓ らの手順により分離した。

５、ＧＡＰ６の　゛ ＧＡＰ６を適当なベクターの中にサブクローニングして、ＥｃｏＲＩ制限部位お よび部分的ＤＮＡ配列の両者としてＤＮＡを特性決定した。ＧＡＰ６ＤＮＡは種 々のベクターの中にクローニングすることができるが、本発明において、それは Ｍｌ３の中にクローニングした。さらに詳しくは、ＧＡＰＤＮＡを次のようにし てＭ１３ベクターの中にクローニングした。ＧＡＰ６ＤＮＡをＥｃｏＲＩ酵素で 処理し、これは２つの断片、約２．Ｏｋｂおよび０．２４ｋｂを産生じた。これ らの断片を標準のアガロースゲルの技術により分離し、そしてＭ１３ｍ、ｐ１８ の中に結合した。ＤＮＡインサートをもたないベクターが適切な培養条件下にブ ルーを示すが、ＤＮＡインサートをもつベクターが透明であるように、Ｍ１３ベ クターは設計した。

結合したＭｌ　３ｍｐ　１８フアージを凍結した受容Ｅ、Ｃ。

１ｉ　Ｋ１２株ＤＧ９８の中に形質導入し、そしてシグマ・ケミカルス（Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍ、）（ミゾリー州セントルイス）から入手した５Ｘ１０−’モル のイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）および４０　ｘ／ｍｉｘ　ｇ　ａ 　１を含有する培地上でプレイティングすることによって培養した。非アルファ ー相補的白色プラークを新鮮な培地上に取り上げた。

ミニ培養物を組み換え一末鎖ＤＮＡ含有インサートについてスクリーニングした 。

白色Ｍ１３プラークを直接ゲル電気泳動によりインサートについてスクリーニン グした。後者の手順は、本質的にＪ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９８３．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｍｏｌｏ　、１０１ ：２０．その開示をここに引用によって加える、に記載されているように実施し た。４つのＭ１３ｍｐ　１８のサブクローンをこの方法により同定した。２つの サブクローン、ＧＡＰ２およびＧＡＰ８は、両者の向きで２ｋｂの断片を含有し た。残りの２つのサブクローン、ＧＡＰ１２およびＧＡＰ１８は両者の同きに０ ．２４ｋｂの断片を含有した。

ＧＡＰ２およびＧＡＰ８の部分的ＤＮＡ配列は、前述のＴ。

Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ、Ｎ１ｃｋｆｅｎおよびＨ，Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、１９７７、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７土：５４６３−５４６７の技術により決定した。

５′　へＭ＾ＣＴＣＡ丁ＧＣＭＧＧＧ八八Ｇへへ　ＣＡ八へＡＣＣＣＡＧ　ＴＡ ＴＧＧ″ｒｃＡＧＡＡＧＡＧ丁ＴＴＧＴＣＴＴ丁ＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣ ＴＧＡ　ＣＡＴＣＭＴＡＧＡ　ＴＴ丁ＧＭ八τ八ＡＣＴＣＴＴＡＧＴＡＡ　ＴＭ ＭＣＡＡＡＧ　ＭＭＧＣ八ＡＡへ　ＡＴＣＣＴＧＡＴＡ丁　ＣＴＴＡＴＴＴＡＴ ＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴ　ＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴ　ＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧ　ＣＡ ＴＧＣＣＡＣＡＧ　ＡＴＧＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＡＴＡ ＴＡＣＣＡＴ丁ＡＡＡＡＧＧ　ＴＡＴＴＧＡＡＣＣＡ　ＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧ ＴＧＴＴＣＧＡＧＣＡＣＧＡＴＡＣＴＣＴ　ＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡ　ＴＣＡＴＧ ＣＣＡＧＡ　ＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣ八ＧＴＧＭＴＴＴＡへ　八ＡＧＡＧＣＴＴＡ Ｔ　ＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ　ＧへへＣＴＴＣＡＴＧ　’ＴＡＧＴＣＴＡＴＧＣＴ 丁ＴＡＴＣＡＣＡＴ　３’ ６、ＧＡＰ６よ２し月βＣ」ンＡＰ　ＤＮＡへ５同一のＪ１定。

−膜技術：新規な手順を使用して、ＧＡＰ６の中に存在するものより大きいＧＡ Ｐ　ｃＤＮＡを含有するプラークを同定し、これは前述のラムダｇｔｌｌライブ ラリーまたは下に記載するライブラリーｇｔｌＯライブラリーの中に存在するイ ンサートを説明することから成っていた。この手順は、ＧＡＰ６の５′領域に対 して相補的な配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびラムダｇｔｌｌま たはラムダｇｔｔＯのＥｃｏＲＩ挿入部位をフランキングするオリゴヌクレオチ ドブライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲを使用して、ｃＤ ＮＡインサートを合成することから成っていた。新しく同定したＰＣＲ産生物を 配列決定し、したがってＧＡＰ６の５′の配列を有するＤＮＡプローブを合成し た。これらのプローブを引き続いて使用して、より大きいＧＡＰ　ｃＤＮＡイン サートを含有するプラークを同定した。

新しく合成したｃＤＮＡインサートの各ラウンドから同定された漸進的にそれ以 上のＧＡＰ６の５′のＤＮＡ配列をプロ−ブとしてを使用して、この手順を数回 反復した。

ＰＣＲは米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，６８３゜１９５ 号、それらの両者の開示をここに引用によって加える、に記載されている。一般 に、ＰＣＲによるＤＮＡ配列の合成／増幅は、特定のＤＮＡ配列を指数的量で産 生ずる酵素連鎖反応を包含し、ただし配列の末端が十分に詳細に知られており、 こうしてそれに対してハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドのプライ マーを合成することができ、そして配列の一部分を利用して連鎖反応を開始する ことができるようにする。一方のプライマーは陰性の鎖に対して相補的であり、 そして他方は陽性の鎖に対して相補的である。本発明に適用するとき、使用する プライマーはＧＡＰ６の５′末端に対して相補的であり、ぞしてラムダｇｔｌｌ またはラムダｇｔｌＯのＥｃ　ｏＲ１部位に対して相補的でありかつそれをフラ ンキングする。いずれのベクターの中の特定のｃＤＮＡＯ向きは知られていない ので、ＥｃｏＲＩ部位の両側をフランキングするオリゴヌクレオチドと別々の反 応を実施することが必要である。ラムダｇｔｌｌとともに使用可能なプライマー の例は、ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎ　ｅ　ｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）により産生された、２つの２４塩基の配列決定プライマー、１２ １８および１２２２である。同様に、ラムダｇｔｌＯに匹敵するプライマーは、 また、ニュー・イングランド・バイオラプスから入手可能であり、そしてこれら の１２３１および１２３２である。こうして、別りの反応は１２１８，１２１９ 、または１２３１および１２３２および適当なＧＡＰ６プライマーである。

プライマーは変性したＤＮＡ酸にアニーリングし、次いで適当なりＮＡポリメラ ーゼ酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片（クレノー）または好ま しくは洗浄剤およびヌクレオチドの存在下に安定であるＤＮＡポリメラーゼで伸 長し、これは新しく合成された士および−の標的配列を含有する鎖を生ずる。あ るいは、バクテリアの中に存在する熱安定性酵素を使用することができる。この 酵素は欧州特許公開第２５８０１７号、１９８８年３月２日発行、に記載されて いるようにＤＮＡ組み換え技術を使用して産生ずることができる。

新しく合成した配列は、また、プライマーのだめの鋳型であるので、変性、プラ イマーのアニーリングおよび伸長の反復したサイクルはプライマーにより規定さ れる領域の指数的蓄積を生ずる。こうして、ＰＣＲは使用した特定のプライマー の末端に相当する末端を有するｃＤＮＡインサートの明確な核酸の二重らせんを 生成する。

ＰＣＲは、前述の参考文献に記載されているように、種々の反応条件を使用して 実施することができるが、好ましい反応条件は次の通りである。特定のプラーク にハイブリダイゼーションするプラークを０．５ｍｌの水、またはＳＭＩ衝液の 中に溶離し、そして５０μｍの溶離液を１０μｍの１０×ＰＣＲ緩衝液、１．５ μｍのｌＯミリモルのｄ、　Ｎ　Ｔ　Ｐ、１μｌの第１および第２のプライマー 、各々は約２０ピコモルの濃度である、１ユニツトの活性に等しい０．２μｍの Ｔａｑポリメラーゼと一緒にする。最後の体積は１００μｌである。

ＰＣＲｌ、ＯＸ緩衝液は５００μｌモルのＫＣＩ、２００ミリモルノドリスＨＣ ｉ、ｐｔ＋８．　４．２５　ミ’）　モル０）Ｍ　ｇ　Ｃ！　ｔおよび１ｍｇ／ ｍｌから成る。

ＧＡＰをエンコードする配列：ＧＡＰ６ＤＮＡを配列決定し、そして配列ＧＷ５ ０に基づくオリゴヌクレオチドのプローブを合成し、放射線標識し、そしてクロ ンチクのラムダｇｔＵｔの再スクリーニング、およびＫ　５６２細胞から作った 第２ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。Ｋ５６２ｃＤＮＡ、を ラムダｇｔ、１０中でクローニングし、そしてこのライブラリーの説明は、Ｍｅ ｓ−Ｍａｓｓｏｎら、１９７６８見いだされる。この刊行物をここに引用によっ て加える。オリゴヌクレオチド、ＧＷ５０、は、次の配列を有する： ５’　ＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＣ丁ＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＣＡＴＧＡＴ 　３’ＧＷ５０のいずれかのライブラリーへのハイブリダイゼーションは前述し たように実施したが、ただしハイブリダイゼーション後の洗浄工程はより厳格で あった。詳しくは、プラークを含有するフィルターを、０．１％のＳＤＳを含有 する２ＸＳＳＣで、各回１５分間、室温において２回洗浄し、次いで２回の追加 の洗浄を、各回１５分間、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含有するＱ、２ ＸＳＳＣで５５°Ｃにおいて実施した。クロンチクのライブラリーから調製した フィルターのオートラジオグラフィーは１６０の陽性のプラークを明らかにした が、ただ１つのプラークはに５６２ライブラリーから検出された。

ＧＡＰ６の配列を使用して、ＧＡＰ６の５′領域に対する相補性をもつＤＮＡプ ライマー、ＬＣＩ２１およびＬ　Ｃ１２２を合成した。

ＬＣ１２１５’　ＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣ八ＡＡＧＡＣＡＡ八ＣＴＣへ３’ ＬＣ１２２へ　５’　ＴＣＴＧＴＭＴＣＧＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＧ　３ ’ＬＣ１２１はアンチセンス方向のＧＡＰ６の５′末端に相当する。

クロンチクのライブラリーからの１６３の陽性のプラーク、およびに５６２ライ ブラリーからの１つの陽性のプラークを、パスツールピペットを使用してアガロ ースプレートから除去し、そして０．５ｍｌの３Ｍ緩衝液の中に３０分間溶離し た。

次いで、各分離物を前述したように適当なラムダプライマーと組み合わせてＬＣ １２１を使用してＰＣＲ処理した。典型的には、変性工程を９４℃において２分 間実施し、そして伸長工程を７２°Ｃにおいて５分間実施した。この反応は最も しばしば３０サイクルで実施した。生ずる増幅されたｃＤＮＡを配列決定した。

配列決定は上に下筋した技術を使用するか、あるいはＰＣＲにより産生された一 本鎖のＤＮＡの直接の配列決定により実施することができる。

典型的には、約５０μｍのＰＣＲ反応を１％のアガロースＴＡＥゲル上で分離し 、増幅された産生物を含有するゲルの領域を切除し、そしてＰＣＲ産生物をアガ ロースから抽出し、そして約１０μｍ〜２０μ！のＴＩＪｔ衝液の中に懸濁した 。

一般に、この体積の約１／１０を非対称ＰＣＲ増幅にかけた。

使用した反応条件は上に引用した特許出願に記載されている。

典型的には、プライマーは約１００：１または約５０：０゜５ピコモルの比で使 用した。

ＬＣ１２１を使用して、１６３のラムダｇｔｌｌのうちのから分離された単一の プラーク、Ｋ１６と呼ぶ、は、ＧＡＰ６；それに対して５′の追加の７００塩基 対から成るｃＤＮＡインサートを有することが決定された。後者の配列に基づい て、い（つかの追加のオリゴヌクレオチド、ＬＣｌ、３６゜Ｌ　Ｃ１３８および ＬＣ１４０を合成し、そしてＬＣ１２１と組み合わせて使用して、クロンチクの ライブラリーから１６３のプラークをスクリーニングした。プライマーは次の配 列を有する： ＬＣ１３６５’　ＣＧ７ＡＡｊ１．ＴＴＧＣＭＭＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＴ丁 Ｇ３’ＬＣｉ３８５’　ＧＴＴ丁子３’ＬＣｉ３８５’ＴＴＴＴ丁ＣＡＧＡＡＧ Ａ丁ＡＡＣ３’Ｌご１４０５’　ＴＧＴＣＡＴＴＧＡＧ丁ＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴ ＧＡＴＣＣＴＧＣ３’１６３のプラークをＬＣ１３６で再スクリーニングすると 、８２プラークは陽性であることが明らかにされたが、ＬＣＩ３８＋ＬＣ１４０ で再スクリーニングすると、プラークのうちの６３は陽性であることが明らかに された。６３の陽性のプラークのうちで、３８をプライマー１２１８およびＬＣ Ｉ３８；および１２２２およびＬＣ１３８を使用してＰＣＨにかけた。これらの うちで、６はＤＮＡ５’〜ＧＡＰ６の長いストレッチを有することが発見された 。Ｍ１３ｍｐ１Ｂ中で配列決定すると、それらは異なる長さの同一の型の転写の 断片を表すことが明らかにされた。クローンの２つを詳細に研究した、クローン ７およびクローン１０１゜クローン１０１は１０４７のアミノ酸のタンパク質を エンコードするために十分なりＮＡを含有し、これは１１６，０００ダルトンの 分子量を有するであろう。これは前述したヒト胎盤から精製したＧＡＰタンパク 質の分子量に類似する。こうして、クローン１０１は全長のＧＡＰｃＤＮＡを含 有する。クローン１０１を配列決定し、そして配列を第５図に示す。クローン７ を、また、配列決定し、そしてクローン１０１と同一の配列を有することが示さ れたが、５′末端から３３塩基対を欠いていた。

上に加えて、２つのプラークを最初に陽性であると決定された１６３のプラーク からＧＷ５０を使用して同定し、これらはクローン１０１のヌクレオチド５３７ と５３８との間に挿入された追加の６５塩基対から成るｃＤＮＡインサートを含 有した。２つのクローンの一方のクローン１６はクローン１０１の最初の１８０ アミノ酸を欠如するが、他方のクローン、クローン「スリービイ」は最初の１８ ０アミノ酸を欠如し、そしてさらにクローン１０１の約塩基２４４８に切頭３′ 末端を有する。６５塩基対のインサートのＤＮＡ配列は、クローン１６について 、第６図に示されている。

７、旦人旦少光里 ラムダリソゲン：ＧＡＰ活性をクローン７．１６および１０１のラムダリソゲン のリゼイトから検出した。リソゲンをＥ、ｃｏｌｉ株Ｙ１０８９中で発生させた 。細胞を成長させ、誘発し、収穫し、そして溶菌する手順は、Ｔ、Ｈｕｙｎｈら 、ｒＤＮＡのクローニング技術；実際のアプローチ（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ　Ｔ ｅｃｈｎｉｑｕｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｄ、Ｇｌ ｏｖｅｒＷ（ＩＲＬｒｅｓｓ、オックスフォード、１９８５）ｐｐ４９−４８に 記載されている。この刊行物をここに引用によって加える。

簡単に述べると、リゼイトから得られた懸濁液を２０ミリモルのトリス）ｆｃｌ 、ｐＨ７，０，１ミリモルのＭ　ｇ　ＣＩ　ｚ、０．１ミリモルのＤＴＴ、０． １％のＳＦ４０．１００ミリモルのＰＭＳＦから成るＧＡＰアッセイ緩衝液の中 に透析し、そしてＧＡＰ活性を前述のＴＬＣに基づ＜ＧＴＰアッセイを使用して 測定した。２．２μモルの位置１２にグリシンを有する正常のＮ−ｒａｓ　ｐ２ １タンパク質、またはグリシンがアミノ酸またはバリンで置換されている突然変 異ｐ２１タンパク質を、０．２５μモルの〔α−”Ｐ）　ＧＴＰ　（８００Ｃ１ ／ミリモル）と３７°Ｃにおいてラムダリゼイトの存在または不存在下に１５分 間インキュベーションした。前述したように、突然変異ｐ２１タンパク質は形質 転換活性を有し、そして有意のＧＡＰ刺激可能なＧＴＰアーゼ活性を示さない。

約１０μｌのリゼイトまたはＧＡＰアッセイ緩衝液を添加し、そして室温におい て１時間後、ｐ２１を免疫沈澱し、そして関連するヌクレオチドを１モルのＬｉ Ｃｌ中でＰＥＩセルロースのクロマトグラフィーにより分析した。追加の対照を ＧＡＰ活性のために実施し、それは無関係のりソゲンリゼイト、最終生成物ｃＤ ＮＡインザートを欠如するラムダｇｔｌＬを試験することから成っていた。結果 をクローン７およびクローン１０１について第７図に示す。パネルＡの上部はク ローン７についての結果を示すが、パネルの下の領域はクローン１０１について の結果を示す。明らかなように、両者のクローンからのリゼイトは正常ｐ２１の 存在下にＧＴＰからＧＤＰへの加水分解を刺激するが、突然変異ｐ２１タンパク 質の存在下にでは刺激しない。そのうえ、ＧＡＰ緩衝液が正常ｐ２工または突然 変異と置換されるとき、ＣＴＰの加水分解への作用は存在しなかった。無関係の りソゲンリゼイＩ・は、また、ＧＴＰの加水分解を支持しなかった。

スボドブテラ・フラギペドラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒａｇｉｐｅｄｒａ） のトランスフェクション：クローン１０１の中の全長のｃＤＮＡインサートを昆 虫の細胞、スボドプテラ・フラギベドラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒａｇｉｐ ｅｄｒａ）中で発現させた。昆虫の細胞系、ＳＦ３、を、バクロウィルスの発現 ベクター、ｐＡｃｃ１２、クローン１０１のＧＡＰをエンコードするＥｃｏＲＩ 断片を含有する、でトランスフェクションし、そしてＧＡＰ活性を細胞抽出物中 で測定した。

バクロウィルスのベクターｐＡｃｃ１２は、前取て存在するベクター、とくにｐ Ａｃ３１１およびｐＡｃ３７３がら、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌＬ工り、Ｖｏ　１．６．ｐ、４７　（１９８８）；米国特許第 ４．７４５，０５１号；および欧州特許出願（ＥＰ八）第１２７，８３９号に記 載されているように、構成した。追加の詳細は、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔ ｈ、ｒバクロウィルスおよび昆虫の細胞培養手順についての方法のマニュアル（ Ａ　Ｍａｎｕａｌｆｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｖｅ ｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄ ｕｒｅｓ）」、Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 　５ｔａｔｉ。

ｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｋ１５５５．１９８７年５月により表わされている。こ れらの参考文献のすべてをここに引用によって加える。

ｐＡｃ　Ｃ１２を後述するようにかつ第８図に示すように構成した。転移ベクタ ーｐＡｃ３１１をＭ１３突然変異原技術を使用して部位特異的突然変異化して、 多面体の遺伝子の開始コドン、ＡＴＧ、をＡＴＴに転化した。生ずるベクターを ｐＶＬ９４１と表示し、そしてＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏ 　、標題「オートグラフ７’カルフォルニア・ニュークリア・ポリヘドロリス・ ウィルス・発現ベクターを使用する非融合外来遺伝子の高いレベルの発現（Ｈｉ ｇｈ　Ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＮｏｎ−Ｆｕｓｅｄ　Ｆ ｏｒｅｉｇｎ　Ｃｙｅｎｅｓ　ｗｉｔ−ｈ　Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　Ｃａ１ｉｆ ｏｒｎｉａ　Ｎｕｃｆｅａｒ　Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ）」に詳細に記載されている。ポリリンカーを ｐＬＩ、９４１の中にＡＴＴ配列の下流の３０塩基対の独特ＢａｍＨｒ部位に挿 入した。ｐＶＬ９４１をＢａｍＨＩで消化し、そして下に示す配列を有する、２ つの相補的な自己アニーリングしたオリゴマー、ＥＫ１２９およびＥ　Ｋ　１． ３０から成るポリリンカーを結合して、ポリリンカーを異なる向きで有するｐＡ ｃＣ８およびｐＡｃＣ９を生成した。ポリリンカーは、Ｕ！、　ｃ　ｏ　Ｒ１な らびに他の制限酵素のための制限部位を有する。

Ｅ）’、１２９： ５　’ＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡ丁ＴＣＴＧ ＣＡＧＣＣＣＧＧＧＴＡ：ＣＧ八へｃ　３１ｐＡｃＣ８およびｐＡｃＣ９は、第 ８図に示すように、一方がポリリンカーの中および他方がプラスミドＤＮＡの中 に存在する９、２つのＥｃｏＲＩ制限部位を有するので、クローン１０１のＧＡ Ｐ　ＥｃｏＲＩをエンコードする断片がポリリンカーの部位の中に挿入すること ができるように、プラスミドのＥｃｏＲ１部位を除去することが望ましかった。

これはベクターｐＡｃ　３７３を使用して達成した。ｐＡｃ３７３はｐＡｃ３１ １に類似するが、ただし多面体の開始コドンをスバニングするヌクレオチド配列 は異なる。こうして、ＥｃｏＲ１部位をｐＡｃ３７３から、ベクターをＥｃｏＲ Ｉで完全に消化することによって除去し、そして末端をクレノー断片で適当な反 応条件下に平滑末端とした。結合およびＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５の中への形質転換 後、ミニプレプＤＮＡの制限分析によりＥｃｏＲ１部位を欠如するコロニーを同 定した。

ベクターをＢａｍ、ＨＩで消化し、次いでオリゴマーを結合することによって、 上に示すオリゴマーＥＫ１２９およびＥＫ１３０から成るポリリンカーを組み込 むことによって、ＥｃｏＲＩ部位を欠如するＰＡＣ３７３をさらに修飾した。生 ずるベクターｐＡｃＣ６およびｐＡｃＣ７は、ポリリンカーを異なる向きで含有 する。

最後の構成体ｐＡｃｃ１２を第８図に示すようにｐＡｃ　Ｃ７およびｐＡｃＣ８ から発生させた。これらのベクターはポリリンカーを同−向きで含有する。両者 のベクターをＢｓｔＥＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして生ずる断片を電気 泳動で精製した。ｐＵｃ８および部分的ポリリンカー配列を含有するｐ　、Ａ　 ｃ　Ｃ７のＢｓｔＥＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＡｃＣ９の大きいＢｓｔＥＩＩ ／ＥｃｏＲＩ断片と結合した。

転移ベクターｐ　Ａ　ｃ　Ｃ１２は両者の向きで挿入されたクローン１０１のＥ ｃｏＲＩ　ＧＡＰ断片を有する。正しい向きをｐＡｃｃ１２ＧＡＰ５で表示する が、正しくない向きをｐＡｃｃ１２ｃ；ＡＰＩＯＬ−７と表示した。約２４のい ずれかのプラスミドを２Ｘ１０’Ｓｆ９細胞の中にトランスフェクションし、細 胞を４日間成長させ、遠心により分離し、そして細胞の沈澱を可溶化することに よって抽出物を作った。好ましい可溶化溶液は、０．５％のＮＰ４０．１０ミリ モルのトリスＨＣＩ、ｐＨ８，０および１５０ミリモルのＮａＣ１から成る。抽 出物を１５．ｏｏｏｘｇで１５分間遠心し、そしてアリコートをＧＡＰアッセイ 緩衝液の中に希釈し、そして前述したようにＧＡＰ活性についてアンセイした。

Ｓｒ１を成長させる方法はこの分野においてよく知られており、ぞしてそれらの 培養の詳述された手順は、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ、「バクロウィルス および昆虫の細胞培養手順についての方法のマーｓアル（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆ ｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎ ｄ　Ｉｎ、５ｅｃｔ　Ｃｅ１１．　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」 、Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉ ｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔ　ｉｎ　Ｎα１５５５　（１９８７年５月）またはＧ、　Ｅ 、５ｒｎｉｔｈおよびＭ、Ｄ、Ｓｍ１ｔｈへのＥＰＯ１２７，８３９号に見いだ すことができる。好ましい培地および培養条件は、同時継続の本出願人の国際公 開第ｗｏ８９１０１０２９号、発明の名称「エアーリフト昆虫の細胞培養」、１ ９８９年２月９日発行；および国際公開第ｗｏ８９１０１０２７号、発明の名称 「培地について脂質マイクロエマルジョン」、１９８９年２月８日発行に見いだ すことができる。これらの刊行物および特許出願をここに引用によって加える。

ｐＡｃｃ１２ＧＡＰ５およびｐＡｃＣ１２ＧＡＰ１０１−７の効果は、それぞれ 、レーンｌおよび２に示されている；レーン３は緩衝液の対照を表す。ｐＡｃｃ １２ＧＡＰ５は正常のｒａｓ　ｐ２１ＧＴＰアーゼ活性を刺激するが、それはｐ ２１突然変異に作用を示さないことに注意すべきである。対照的に、正常のｒａ ｓ　ｐ２１タンパク質または突然変異のｐＡｃｃｌ　２ＧＡＰ　１０　］、−７ によるＧＴＰアーゼ活性の刺激は存在しない。

バクロウィルスは前述の転移ベクターでトランスフエクションしたＳｆ９細胞か ら、上の５ｕｒｎ、ｒｎｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈにより記載された技術を使用し て回収することができる。

このようなウィルスを使用して、適当なＧＡＰクローンで細胞を直接形質転換す ることができる。

ニブ土工ｊＥＪ１Ω名城。

ｒａｓ　ｐ２１タンパク質、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体またはｒａｓ　ｐ２ １−ＧＴＰ複合体へ結合するＧＡＰの活性部位を決定するために、クローン１０ １のいくつがの断片を合成し、そして試験しまた。ペプチドはこの分野において よく知られている方法により合成することができる。ペプチド合成の好ましい方 法は、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）９５００自動化ペプチド機械を使用 する、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｒ，Ｂ、、（１９８５）、Ｓｃｉ、２３２：３４ １−３４７より詳細に記載されている、固相法、フッ化水素による切断、および ウォーターズ・デルタ・ブレブ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐｒｅｐ）３００ ０計器を使用する１５−２０ミリモルのＶｙｄａｃ　Ｃ４ＰｒｅｐＰＡＫカラム の調製用ＨＰＬＣである。別の方法はＡＢＩオートマチック合成装置による。

こうして、位置８７７−８９１　（ペプチドＧ６５と表示する）、９７５−９９ ０　（ペプチドＧ７３と表示する）、８９］、−９０６（ペプチド８９１と表示 する）、および８９０−９０６（ペプチドｃＧ１３と表示する）に相当するペプ チドを回収した。（第９図はペプチド配列の位置を示ず；第１０図は対応する位 １０表である）。これらのペプチドをＧＡＰの存在または不存在下にＧＴＰのｒ ａｓ　ｐ２１タンパク質の加水分解に影響を与えるそれらの能力について試験し た。ペプチド８９１およびｃＧＡＰ１３はＧＡＰの存在および不存在下にｐ２１ によるＧＴＰの加水分解の刺激を阻害するが、他のペプチドはこの反応に影響を 与えないことが発見された。ペプチド８９１は次の配列を有する：　？ＩＲＴｌ ？ＶＶＳＧＦＶＦＬ１？ＬＩＣ，ペプチドの開始における余分のスレオニンを除 外して、ｃＧＡＰ１３はペプチド８９１と同一の配列を有する。第１１図に示す ように、ｃＧＡＰ１３をＶｙｄａｃ　Ｃ４Ｐｒｅ　ｐ　ＰＡＫカラムから集めた 分画４３〜４６からプールした。

ｃＧＡＰ１３のアミノ酸分析を第１２図に示す、ｃＧＡＰ１３の質量分光光度計 の分析を第１３図に示す、有意の量のメトキシベンジルが存在することを認める ことは価値がある。

次の２つの実験において、上の４つのペプチドを、ＧＡＰの存在および不存在に おいて、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質によるＧＴＰの加水分解を阻害する能力につ いて試験した。それは次のようにして実施した：精製した野生型のｒａｓ　ｐ２ １タンパク質を０．２５ミリモルの３２−Ｐガンマ−ＧＴＰと１００ミリモルの Ｎａｘ　ＰＯａ　、ｐＨ６，８，０，５ミリモルのＤＴＴ、０．５ミリモルのＥ ＤＴＡ、０．００５％のＮａコレート、およびＱ、、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中で ３０°Ｃにおいて１５分間インキュベーションした。次いで、この混合物をＴＮ Ｍ緩衝液（２０ミリモルのトリスＭＣＩ、ｐＨ７，０，１００ミリモルのＮａＣ １，５ミリモルのＭ　ｇ　Ｃｌ　ｚからなる）で１０倍に希釈した。次いで、こ の混合物の２０μｌ（０，０５μｌのｐ２１）を２μＩのペプチドと２５ミリモ ルのＮａ０Ａｃ、ｐＨ５，５中で一緒にし、そして室温において５分間インキュ ベーションした。ＧＡＰアッセイを５μｍのＴＮＭ結合中の１２ｎｇのＧＡＰお よび１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡまたは５μＩのＴＮＭ　ＢＳＡ緩衝液を添加すること によってＧＡＰの独立の反応について開始し、そして生ずる混合物を室温におい て３０分間インキュベーションした。次いで、試料をニトロセルロースの膜を通 して濾過し、そして冷ＴＮＭで３回洗浄した。フィルターを乾燥し、そしてそれ らの放射能をカウントした。データに基づくグラフを第１４図に示す、この図の ｙ軸は放射性ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体についての放射能のカウント／分を 示す。ｙ軸はペプチドの添加！（ナノモル）を示す。第１の図は対照として働く 。ＧＡＰの存在下に、放射性ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体はＧＤＰおよびｒａ ｓ　ｐ２１タンパク質に加水分解し、こうしてフィルターに結合する放射性ｐ　 ２１−ＧＴＰＯ量を減少し、結局、放射能のカウントが検出される。ＧＡＰの不 存在下に、ＧＡＰ刺激加水分解を欠如するので、放射能のカウントは相対的高い レベルに止まる。第１４図に示すように、ＧＡＰの不存在下であってさえ、ペプ チドは単独でＧＴＰのｒａｓｐ２１タンパク質の加水分解を有意に阻害ことに注 意することは重要である。この図が示すように、ペプチドＧ６５およびＣ７５は ＧＴＰの加水分解に影響を与えない。しかしながら、ペプチド８９１はＧＴＰの 加水分解に悪影響を及ぼす。

ＧＴＰの加水分解の防止におけるｃＧＡＰ１３およびペプチド８９１の効能を比 較する他の実験を、次のようにして実施した。このアッセイは、アッセイ溶液の 中の（１，ＴＰの加水分解から生ずる形成したＧＤＰ／残留するＧＴＰの比を測 定する。ペプチド８９１、ｃＧＡＰ１３および０６５をＧＡＰの存在および不存 在において別々に測定した。ペプチドＧＡＰ６は、対照として働き、そしてα− ３２Ｐ−ＧＴＰを使用した。

このアッセイは次のようにして実施した。ｐ２１−ＧＴＰをＴＮＭ、ｐＨ７，０ ，１ミリモルのＤＴＴおよび１００μモルのＧＴＰから成るアッセイ緩衝液中で １／１０の比で希釈した。２０λのｐ２１．０．２５μモルおよび２λのペプチ ド（ＴＮＭ、１ミリモルのＤＴＴおよび１００μモルのＧＴＰ中）から成る混合 物を調製した。この混合物に、５λ、ずなわち、ＴＮＭおよびｌｅｇ／ｍｌのＢ ＳＡ中で希釈した１２ｎｇのＧＡＰを添加した。ＧＡＰを使用しない実験につい て、５λのＴＮＭ／ＢＳＡをその代わりに添加した。反応を停止し、そしてヌク レオチドをｒａｓ　ｐ２１タンパク質から２％のＳＤＳ、４０ミリモルのＥＤＴ Ａで６５°Ｃにおいて５分間溶離した。ヌクレオチドを１モルのＬｉＣｌ中でＰ ＥＩセルロ−スのクロマトグラフィーにかけた。ＧＴＰおよびＧＤＰのスポット をオートラジオグラフィーにより可視化し、そして標準の溶液により同定した。

ＰＥＩセルロースのプレートからの個々のスポットを削り取り、そして放射能を カウントした。

ＧＤＰ／ＧＴＰの放射能のカウントの比を棒グラフでプロットしく第１５図）こ れが示すように、５０〜１００μモルおよびそれ以上の濃度において、ペプチド ８９１およびｃＧＡＰｌ３の両者はｐ　２１−ＧＴＰの加水分解を明らかに阻害 し、したがってＧＤＰの産生を阻害する。限界の阻害はペプチドの１０μモルの 濃度において観測された。上の阻害作用はＧＡＰの存在下に観測された。ＧＡＰ の不存在下では、使用したペプチドの濃度範囲にわたって形成したＧＤＰの小さ いが、有意の変化が存在する。Ｇ６５、対照、は、ＧＡＰの存在下にｐ２１−Ｇ ＴＰの加水分解に阻害作用を示さない。

ｒａｓ　２１一旦且尺複金生か亥 のＧＤＰのペプチド　ｊｌ ペプチド８９１およびｃＧＡＰｌ３は、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体からのＧ ＤＰの解離を仲介するが、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰｒＳ複合体からのＧＴＰ、Ｇ ＴＰＴＳの非加水分解性類似体の解離を仲介しない。次の実験は上の事実を確証 した。使用した対照はマストポラン（ＭＰ）であった。ＭＰは次の配列を有する ：　ＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨｚ。ＭＰは次の理由で選択した。第１ に、ペプチド８９１に似て、ＭＰは４つの正電荷をもつペプチドであった。第２ 、ＭＰは異なるクラスのグアニンヌクレオチド結合性タンパク質、すなわち、Ｇ ＴＰ結合性調節タンパク質（Ｇタンパク質）に影響を与えることが示された。Ｍ ＰはＧタンパク質からのＧＤＰの解離を仲介する。Ｈｉｇａｓｈｉ　ｊ　ｉｍａ 、Ｔ、ら、去＝免工−−−−Ｗユニ」−２二Ｊ」−皿一、２６３：６４９１−６ ４９４、標題トキシン、ミミックス・レセプター（Ｍａｔｏｐａｒａｎ。

ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｔｏｘｉｎ、ｆｒｏｍ　Ｗａｓｐ　Ｖｅｎｏｍ、Ｍｉｎｎ ｉｃｓ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｈ）’　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ＧＴＰ−ｂｉｎ ｄｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　（Ｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ）４゜実験は次のようにして実施１１７．た：Ｎ−ｒａｓ、、ｒａｓ　ｐ２】族 の１メンバーを２０ミリモルのトリス７．５．０．５ミリモルのＤＴＴ、０．１ ％のＮＰ４０．１ミリモルのＥＤＴＡ中で５００ナノモルの非［９識ＧＤＰおよ び１０ナノモルの［α−”ｐ］ｃＤｐと３０°Ｃにおいて３０分間インキユベー シゴンした。次いで、ＭｇＣｌ□濃度を５ミリモルに調節した。非標識ＧＤＰ（ １００ナノモル）を添加し、そしてインキュベーションを２０ミリモルのトリス ７．５．０．５ミリモルのＤＴＴ、０．１％のＭｇＣｌ２中で、それぞれ５、次 の厳格さで続けた：１０μモルおよび５０μモルの８９１ペプチド、１０μモル および５０μモルのＭＰ、対照培地にはペプチドを添加しなかった。示した時点 において、１０μｌのアリコート（０，５ピコモル）を、ニトロセルロースのフ ィルター上に、２０ミリモルのトリス７．５、ｌＯＯミリモルのＮ　ａ　Ｃ］、 および５ミリモルのＭ　ｇ　Ｃｌ　ｚを含有する洗浄緩衝液を使用して、結合し た［α−”Ｐ］ＧＤＰについてアッセイした。

第１６図に示すように、正方形はペプチドを添加しない対照を示す。最初の５分 後、対照培地中の結合した［α−３２Ｐ］ＧＤＰの放射能のカウントはほとんど 一定であった。試験した２つの濃度でＭＰを含有する培地の放射能のカウントは 対照培地のそれに密接に従った。こうして、ＭＰは結合した「α−”Ｐ］ＧＤＰ の解離に比較的作用を与えなかった。ペプチド濃度を１０μモルから５０μモル に増加すると、解離するＧＤＰの速度および量は増加した。

上の実験をｃＧＡＰｌ３を使用して実施し、同様な結果が得られた。さらに、Ｈ −ｒａｓ、ｒａｓ　ｐ２ｉ族からの他のメンバーは、また、ペプチド８９１およ びｃＧＡＰｌ、３の両者について同様な結果を生じた。

さらに、ペプチド８９１およびＰ２１−ＧＴＰＴＳを使用して、上の実験を反復 した。結果を第１７図に示す。正方形はペプチドを添加しない対照培地を示す。

対照培地の放射能のカウントはペプチド８９１のそれに密接に従った。こうして 結果が示すように、ペプチド８９１はｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰＴＳからｃ”ｒｒ ”ｒｓを解離させない。

ペプチド配置の勝　・ ここに記載するペプチドは、ことに正常または腫瘍遺伝子のｒａｓ　ｐ２１タン パク質の過度の発現を伴う腫瘍における、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質の存在をア ッセイするとき使用することができる。こうして、これらのペプチドが大量に入 手可能であることは、現在の癌の診断法に価値を付加するであろう。当業者は理 解するように、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質またはｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体 に結合する能力を保持するペプチド９８１またはｃＧＡＰｌ３の断片；およびｒ ａｓ　ｐ２１タンパク質またはｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体への結合について ペプチド９８１またはｃＣ，ＡＰ１３と競争するペプチドは、次に記載するアッ セイにおいて有用であろう。

例えば、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質を次の方法でペプチド９８１およびｃＧＡＰ ｌ３によりアッセイした。まず、１０ミリモルのｒａ、５ｐ２１タンパク質の溶 液を１μモルのＧＴＰ　Ｔ　Ｓ”　（１３５ｏｃｉ／　ミ１，１　モル）を含有 すル２０　ミＩＪ　モルのトリス、ＰＨ７，５，１ミリモルのジチオスレイトー ル、０．１モルのＮａＣ１，０，１％のＮＰ４０．１ミリモルのＥＤＴＡ中で、 ３０°Ｃにおいて３０分間インキユベーシヲンすることによって、標識したｒａ ｓ　ｐ２１−ＧＴＰタンパク質を調製した。

ペプチドの１ミリモルの溶液（２，５ミリモルのＮａアセテート、ｐＨ５，５） の１０μｍをフィルター上に真空濾過を使用してピペッティングすることによっ て、合成ペプチドをニトロセルロースのフィルター上に固定化した。２０ミリモ ルのトリス、ｐＨ７，５，０，１％のウシ血清アルブミン、０６１％のオバルブ ミンおよび０．０５％のツイーンを含有するブロッキング緩衝液中で、フィルタ ーを室温において３０分間インキュベーションした。次いで、フィルターを１゜ ＯμＩの種々の濃度の２０ミリモルのトリス、ｐＨ７，５，０，１％のＮＰ４０ ．５ミリモルのＭｇＣ１，に移した。このフィルターに、工および１００μモル の３つの遊離のペプチドおよび１μｍのｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰｒＳｌｉ製物を 添加した。室温において３０分間インキュベーションした後、緩衝液を除去し、 そしてフィルターを各１ｍｌの５ミリモルのＭｇＣ１□を含有する冷２０ミリモ ルのトリス、ｐＨ１，５で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、そして放射能の カウント７分（ＣＰＭ）をシンチレーションカウンターにより決定した。当業者 は理解するように、他のアッセイ法を使用することができる。例えば、ｒａｓ　 ｐ２１タンパク質を酵素または蛍光発生物質で標識し、そして酵素または蛍光の 手段により検査した。

ペプチドに刃ｊｊＬｉ！Ｅ ペプチドｃＧＡＰ１３および８９１に対する抗体を、この分野において知られて いる標準の手順を使用して生成する。

米国特許第４，７６２．７０６号、１９８８年８月９日にＭｃＣｏｒｍｉｃｋら に対して発行された、をここに引用によって加える。例えば、宿主動物、例えば 、ウサギ、マウスなどにペプチドまたはペプチド断片を注射することによって、 抗体を産生ずる。注射前に、ペプチドをまずキーホールリンベットヘモシアニン （ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と接合させる。接合はシスティ ン残基中のスルフヒドリル基を経て達成される。ヘテロ２官能性架橋剤、１−ヒ ドロキシ−２−ニトロ−ベンゼン−４−スルホン酸ナトリウム塩のＮ−マレイミ ド−６−アミノカプロイルエステルを次の手順により調製した。

１モル当量（２，２４ｇ）の４−ヒドロキシ−３−ニトロ−ベンゼンスルホン酸 ナトリウム塩（ＨＮＳＡ）を、１モル当量（２，０６ｇ）のジシクロへキシルカ ーポジイミドおよび１モル当量（２，ｌ　Ｏｇ）のＮ−マレイミド−６−アミノ カプロン酸を２５ａ＋！のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で室温において一 夜と一緒に混合した。ジシクロヘキシル尿素の白色沈澱が形成した。沈澱を濾過 し、そして３００階ｌのジエチルエーテルを母液に添加した。ｌＯ分〜４時間後 、母液から沈澱したガム状固体が形成した。この固体は５８％の活性ＨＮＳＡエ ステルおよび４２％の遊離Ｎ（Ｎ　Ｓ　Ａを含有する見いだされた。

この分析は少量の沈澱をリン酸塩緩衝液の中にｐＨ７，０において溶解し、そし て４０６ｎｍにおいて吸収を測定することから成る；この読みはＨＮＳＡエステ ルの調製において汚染物質である未反応の遊離のＨＮＳＡの量を提供する。非常 に少量の４強塩基（例えば、５ＮのＮａ０Ｈ）の添加は形成したエステル瞬間的 に加水分解し、そして第２の読みを取った。

第１の読みを第２の読みから減すると、もとの物質の中のエステルの量を生じた 。次いで、固体をＤＭＦ中に溶解し、ＬＨ２０セファデンクスのカラム上に配置 し、そしてＤＭＦで溶離し、こうしてエステルを汚染する遊離ＨＮ　Ｓ　Ａから 分離した。精製の進行を薄層クロマトグラフィーによりクロロホルム、アセトン および酢酸（６：　３　：　１　ｖ／ｖ）の溶離溶媒を使用してモニターした。

生成物はアミンとのその反応性によりｍａ　１−ｓ　ａ　ｃＨＮＳＡエステルと して陽性に同定された。純粋なエステルの収率は理論値のほぼ３０％であると推 定された；精製した物質は９９％のエステルから成っていた。

こうして得られたエステルは水の中に完全に溶解し、そしてヌクレオチドを添加 しないかぎり、抽出の中で数時間安定であることが発見された。ｌＮのアンモニ アの中に配置すると、エステルは一部分が遊離酸に加水分解した対応するアミド を生成した。精製したエステルは、解離して貯蔵したとき、延長した期間の間安 定であることが発見された。

約０．５ｍｇの精製した？−５ａｃＨＮＳＡエステルを１＋１の蒸留水中に溶解 した。この溶液のアリコートを１ｍｌの１０ミリモルのリン酸塩緩衝液ｐＨ７， ０の中に希釈した。４０６ｎｍの吸収を使用して、前述したように遊離ＨＮＳＡ の濃度を計算した。５０μＩの４．８Ｎの水酸化ナトリウム溶液を希釈したエス テルのアリコートに添加し７、そして混合したとき、この溶液の４０６ｎｍにお ける吸収は有意に増加し、水酸化物の親核物質が急速に加水分解して、成分の酸 および遊離ＨＮＳＡアニオンになることを示す。

塩基後および初期のＨＮＳＡ濃度の間の差はエステルの濃度を表す。エステルお よびタンパク質のアミノ基の実際の濃度から、タンパク質溶液に添加して所望の 程度の置換を達成する量を計算することができる。

次いで、精製したＨＮＳＡをＢＳＡと次のようにして反応させた（　Ｋ　Ｌ　Ｈ との反応はこの手順に類似した）：合計２２ｍｇ（２０ｇモル）のＢＳＡ、　（ ６６，２９６の分子量の）を２．０ｍｌの０．１モルのリン酸塩緩衝液ｐＨ７， ５中に溶解して、１．０ＸＩＯ−”モル／リットルの合計のアミン濃度を生成し た（５９リジン／ＢＳＡ分子を仮定する）。計算したｔ（ｌｌｎｔｇ、２−　３ ５Ｘ１０−’モル）の上の調製したｍａ　１−ｓ　ａ　ｃＨＮｓＡエステルＣ９ １，’７％）を粉末の形態で２．　０ＩＩｌｌのＢＳＡ溶液中に溶解した。この 反応は室温において実施した。１０μｍアリコートを溶液から時限した間隔で取 り出し、そして各々を１．０■Ｉの０．０１モルのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，０の 中に希釈した。各希釈したアリコートのスペクトルをヘラレット−パラ力−Ｆ　 （Ｈｅｗｌ　ｅｔ　ｔ　−Ｐａｃｋａｒｄ）分光光度計で記録し、そして４０６ ｒ＋ｎ＋における吸収を測定した。次いで、合計５０μｍの４．８ＮのＮａＯＨ を各アリコートに添加し、各アリコートを混合し、そのスペクトルを再び取り、 そして４０６ｎａｅにおける吸収を測定した。結果を表１に示す。

塩基の添加の前後の４０６ｎｍにおける吸収から、残留するエステルの濃度およ び反応したエステルの百分率を反応混合物について決定した。結果が示すように 、反応速度は１５分の期間にわたって本質的に直線である。１５分の反応時間に おいて、反応混合物を０．１モルのリン酸塩緩衝液ｐＨ６，０と平衡化したＰＤ ＩＯ脱塩セファデックスＧ〜２５カラム（ファーマシア、インコーホレーテッド ）に適用することによって、反応を停止させた。２．６Ｘ１０−”モル／リット ルのエステルは反応し、こうしてＢＳＡの５９ニブシロン−アミノ基の２５．９ ％は仮定的に置換されたことが発見された。

こうして、生成物は１６ｍａｌ−ｓａｃ基／分子を含有した。

カラムを溶離し、次いで吸収スペクトルをモニターし、そしてｍａ　Ｉ−ｓ　ａ 　ｃ−ＢＳＡを含有するピークの分画をプールした。前述したように合成したｃ ＧＡＰｌ３またはペプチド９８１を添加し、そしてプールした混合物を室温にお いて一夜撹拌した。接合体を蒸留水に対して広範に透析し、凍結乾燥し、そしで ある場合において、アミノ酸組成の変化について分析した。

ニューシイランド白ウサギをペプチドのＫ　Ｌ　Ｈ＝導体でフロイント完全アジ 工バンドの中の末梢リンパ節の注射し、次いで数週間後フロインド不完全アジュ バントの中の皮下（Ｓｕｂ、ｑ、）注射することによって免疫化する。３回の追 加のｓｕｂ、ｑ、を敗退の間隔で与える。１月またはそれ以上の期間後、静脈内 の促進を数日の間隔で与え、そして血清の試料を数日後に取った。

当業者は理解するように、上のペプチドに対するモノクローナル抗体を、この「 光皿■罫史星脱所」に記載するように、ハイブリドーマの技術により産生ずる。

五葬至並逝句使艮 前述の抗体は、と（にｒａｓ　ｐ２１タンパク譬を過度ζ′全発現る腫瘍におい て、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質アッセイするとき、使用することができる。こう して、大量のこれらの抗体の入手可能性は、現在の癌の診断法に追加の価値を提 供するであろう。ｃＧＡＰｌ３およびペプチド９８１に対する抗体を使用する。

しかしながら、当業者は理解するように、次のものに対する抗体はこのアッセイ において使用することができる：ｒａｓ　ｐ２１タンパク質、ｒａｓ　ｐ２１− ＧＤＰ複合体またはｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合する能力を保持するペ プチド９８１またはｃＧＡＰｌ、３の断片；ｒａｓ　ｐ２１タンパク質、ｒａｓ 　ｐ２１−ＧＤＰ複合体またはｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体への結合について ペプチド９８１またはｃＧＡＰｌ３と競争するペプチド。

アッセイ法の１例は、ペプチド９８１、標識したｐ２１タンパク質、およびペプ チド９８１に対する抗体による。ペプチド９８１に対する抗体を固体の支持体に 結合する。それζを免疫測定アッセイにおいて使用する共通の支持体の任意のも のの上に固定化することができる。これらの例はポリエチレン、ポリスチレン、 ポリプロピレンまたは他の適当な材料から作られた濾紙、プラスチックビーズま たは試験管である。

また、粒状材料、例えば、アガロース、架橋したデキストラン、および他の多糖 類は有用である。このような結合のための技術は当業者によく知られている。例 えば、抗体は米国特許第３．６４５．８５２号に記載されている方法を使用して 多糖ポリマーに結合することができる。

ンバク質およびペプチド９８１の試料をインキュベーションして、ペプチド９８ １およびｐ２］の接合体を形成する。

次いで、アガロース粒子上に固定化した抗体の懸濁液をインキュベーションして 、抗体−ペプチド９８１−ｐ２１複合体を形成する。インキュベーション期間後 、アガロース粒子を緩衝液の添加により洗浄し、そして遠心した。吸引により洗 浄液を除去した後、アガロース粒子の生ずる沈澱を結合し標識したｐ２１につい てカウントする。この実験のための対照は同一手順に従うが、既知量の標識し７ たｐ２１を使用する。

対照および試料の生ずる放射能を比較することによって、試料の中のｐ２ｆの量 を決定する。

当業者は理解するように、他のアッセイ法を使用することｒａｓ腫瘍遺伝子形質 転換細胞にペプチドを投与して、それらの腫瘍遺伝子の挙動を逆転することがで きる。最適な投与量は腫瘍細胞を正常に逆転するであろうが、正常細胞への悪影 響は最小であるか、あるいは存在しないであろう。したがって、本発明の他の特 徴として、ヒトにペプチドまたはすガントに接合されたペプチド（以後、ペプチ ド−リガンドと呼ぶ）を投与して、ｒａｓ腫瘍遺伝子により引き起こされた腫瘍 を処置する方法は、また、開示されている。リガンドの例は、ｒａｓ！ｌ瘍遺伝 子の形質転換された細胞を認識する抗体またはペプチドである。接合はこの分野 において知られている手順に従い実施する。この手順の例は、米国特許第４，３ ４０．５３５号、それをここに引用によって加える、に詳細に記載されている。

特定の個体の処置において使用される方法は、個体の状態および処置の目的に依 存する。投与量は個体の大きさおよび年令、病気の状態、与えられる現在の処置 、例えば、放射線治療、および使用するペプチドまたはペプチド−リガンドの型 のような因子とともに変化する。いずれの処置においても、ペプチドまたはペプ チド−リガンドは、有効な投与量を血液の流れの中に入れ、引き続いて腫瘍細胞 に入れて、腫瘍細胞を正常細胞に逆転することができる方法で個体に投与しなく てはならない。

ペプチドまたはペプチド−リガンドは、経口的、経直腸的、鼻、局所的（頬およ び舌の下を包含する）、膣および胎盤（皮下、筋肉内、動脈内および皮肉を包含 する）を包含する適当なルートにより投与する。例は静脈内注射であり、そして 望ましい血液レベルは連続的注入または間欠的注入により投与することができる 。

ペプチドまたはベブナドーリガユ／ドは他の薬物または放射線治療と組み合わせ て使用することができる。ペプチドまたはペプチド−リガンドは製剤学的配合物 の一部分として提供することができる。本発明の配合物は少なくとも１つの投与 成分、すなわち、ペプチドまたはペプチド−リガンドを１種または２種以上のそ の許容されうる担体および必要に応じて他の治療学的成分からなる。１種または ２種以上の担体は、配合物の他の成分と適合性でありそして受容体に悪影響を及 ぼさないという意味において「許容されうる」ものなくてはならない。非経口的 投与に適当な配合物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および配合物を意図する受 容体の血液と等張とする溶質を含有することができる水性および非水性の無菌の 注射溶液；および懸濁剤および増粘剤を包含する水性および非水性の無菌の懸濁 液を包含する。配合物は単位投与または多数回投与の容器、例えば、密閉したア ンプルおよびバイアル中で提供することができ、そして使用直前の無菌の液体の 担体、例えば、注射のための水の添加のみを必要とする凍結乾燥した状態で貯蔵 することができる。即席の注射溶液および懸濁液は無菌の粉末、顆粒および錠剤 から調製することができる。

この手順の例は次の通りである：生理学的に許容されうる担体中のペプチドまた はペプチド−リガンドを２．０−２０ｍ　ｇ　／　ｍ　”の出発投与量で毎日５ 日間、愚者に静脈内投与する。

腫瘍形成細胞を正常に逆転することによ、：、て、ペプチドまたはペプチド−リ ガンドは細胞の過度の増殖を防止する。こうして、腫瘍は成長を停止する。さら に、正常に逆転したが、腫瘍遺伝子をなお含有する細胞は、ペプチドまたはペプ チド−リガンドの処置と組み合わせで化学療法および／または放射線治療の投与 により殺される。５日の期間の終わりにおいて、患者を評価する。この評価は物 理学的検査および広範な実験室の試験を包含する。試験は毒性の評価および含ま れる特定の腫瘍に向けられた特別の試験を包含する。例えば、白血病の場合にお いて、試験は白血球のカウントの決定を包含する。患者の状態が安定である場合 、愚者を同一投与量で２回、７週で再処置し、そして毎週評価する。患者の状態 が安定である場合、処置を５か月間続ける。５か月の期間の終わりにおいて、患 者庖再び評価し２そしてＸ線撮影する。処置前および処置後のＸ線写真の比較は 、腫瘍がそれ以上の成長しているか１、あるいは大きさが減少し７ているかどう かを示すことによ−って、組み合わせた処置の効能を示す、！ＩＩみ合わせた処 置の効能および患者の状Ｍに従い、ペプチドまたはペプチド−リガンドの投与量 、化学療法および放射線治療を処置の間に増加するか、あるいは維持することが できる。患者の状態および腫瘍の状態を周期的に医師の検査、実験室の試験およ びＸ線によりモニターする。ペプチドまたはペプチド−リガンドの出発投与量、 化学療法および放射線治療は、悪い反応を示す患者について減少する。

本発明の配合物は、問題の配合物の型に関し７でこの分野において普通の他の因 子を包含することができる。さらに、上の処置法は例示であり、そして当業者に 知られているものを排除し、ない。

生物学的物質の受託：次のプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ）に１９８８年１０月１１日に受託された。

支承ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＭＣＣＮｏ。

ｐＡｃｃ１２ＧＡＰ５ （ｐＡｃｃＩ２ＧＡＰ５）　６７８２１　３４３７ｐＧＡＰ　１６−４ （クトノ１６）　４０５０３　３４７９ｐＧＡＰ−５ＬＩＥＩ （クトン　スリー・ビイ）　４０５０４　３４８０本発明を記載したが、本発明 の範囲は添伺する請求の範囲によってのみ限定された、そして前述の特定の物質 および方法によって限定されないことが理解されるであ７）うＦＩＧ、　１ 分画 ＦＩＧ、　２ ０Ｋ　− ＬＥ　ＭＥＴＰＲＯＧＬＵＧＬＵＧＬｔＪＴＹＲ５ＥＲＧＬＵＰ）ＩＥＬＹＳＧ Ｃ 工 ＦＩＧ、　４ ＧＷ１３５’ＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＡＧ　ａ〔ＧＡＧＴＡＣＥＩ’ＧＡＧＴｒＣ ＡＡＧ’３ＧＷ１５５’ＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＡＧ　ｃＭ：１ＧＡＧＴＡＣ厘］ ＧＡＧＴＴＣＡＡＧ’３５　ＧＷ１７５’ＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＡＧΩ但ＧＡＧ ＴＡＣＴ！：ＸＧＡＧπＣ品Ｇ’３ＧＷＩ９５’ＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＡＧ脚Ｇ ＡＧＴＡＣ皿ＧＡＧＴＴＣ品Ｇ’３ＦＩＧ、　７Ａ　ｇｌｙ　１２　ａｓｐ１２ 　ｖａｌ　１２ＦＩＧ、７Ｂ　ｇｌｙ１２　ａｓｐ１２　ｖａｔ１２ｐＡｃ、Ｃ ６，ｐＡｃＣ８中のポリリンカーの方向ｐＡｃＣ６，ｐＡｃＣ９及びｐＡｃｃ１ ２中のポリリンカーの方向ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、１０ ペプチド　１位　置 Ｇ７３　９７５−９９０ ｃＧＡＰ　１３　ｇ９０−９０６ Ｐｅｐｔｉｄｅ　８９１　８９１−９０６ＦＩＧ、１２ 八ｈＮＲｏＡＣＩＤＡＮＡＬＹＳＩＳＯＦｃＧＡＰ１３ＦＩＧ、１１ 分画 ＦＩＧ、　１３ 質量 ＦＩＧ、　１４Ａ Ｏ，０００，２５０，５００，７５１，００１，２５１，５０ＦＩＧ、１４Ｂ Ｏ，０００，２５０，５００，７５１，００１，２５１，５０ＦＩＧ、１４Ｃ Ｏ，０００，２５０，５００，７５１，００１，２５１，５０ｎ　Ｍ　ＯＬＥ　 ５ ＦＩＧ、１６ 時間（分） 国際調査報告 ＋１喀ｅ＋ｗｓ＋ｌｍｍ−ム−１，１１ｗｍ＋ρＣＴ／ＵＳ９０１０４７０９

Claims (59)

【特許請求の範囲】
1. １．ＧＴＰの加水分解を阻害するｒａｓ　ｐ２１タンパク質と相互作用すること ができるペプチド。
2. ２．ＧＴＰの加水分解を障害するｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体と相互作用する ことができるペプチド。
3. ３．ＧＴＰのＧＡＰ刺激加水分解を阻害するｒａｓ　ｐ２１タンパク質と相互作 用することができるペプチド。
4. ４．ＧＴＰのＧＡＰ刺激加水分解を阻害するｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体と相 互作用することができるペプチド。
5. ５．ＧＡＰタンパク質の断片に機能的に類似する配列を含んでなり、前記断片は ｒａｓ　ｐ２１タンパク質に結合することができる、ペプチド。
6. ６．ｒａｓ　ｐ２１タンパク質への結合について請求項５記載のペプチドと競争 することができるペプチド。
7. ７．ＧＡＰタンパク質の断片に機能的に類似する配列からなり、前記断片はｒａ ｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合することができる、ペプチド。
8. ８．ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体への結合について上記第５項記載のペプチド と競争することができるペプチド。
9. ９．式： 【配列があります】 を含んでなる、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質に結合するペプチド。
10. １０．ｒａｓ　ｐ２１タンパク質への結合について請求項９記載のペプチドと競 争することができるペプチド。
11. １１．式： 【配列があります】　 を含んでなる、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合するペプチド。
12. １２．ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体への結合について請求項１１記載のペプチ ドと競争することができるペプチド。
13. １３．式： 【配列があります】 を含んでなる、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質に結合するペプチド。
14. １４．ｒａｓ　ｐ２１タンパク質への結合について請求項１３記載のペプチドと 競争することができるペプチド。
15. １５．式： 【配列があります】 を含んでなる、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合するペプチド。
16. １６．ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体への結合について請求項１５記載のペプチ ドと競争することができるペプチド。
17. １７．ｒａｓ　ｐ２１タンパク質に結合する能力を保持する請求項６記載のペプ チドの断片。
18. １８．ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合する能力を保持する請求項９記載の ペプチドの断片。
19. １９．ｒａｓ　ｐ２１タンパク質への結合について請求項１７記載のペプチド断 片と競争することができるペプチド。
20. ２０．ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体への結合について請求項１８記載のペプチ ド断片と競争することができるペプチド。
21. ２１．ＧＴＰの加水分解を阻害するペプチドへ結合するｐ２１タンパク質を検出 することを含んでなる、ｐ２１タンパク質についてアッセイする方法。
22. ２２．前記ペプチドがＧＴＰのＧＡＰ刺激加水分解を阻害するＧＡＰタンパク質 の断片に基づく配列を含んでなる、請求項２１記載の方法。
23. ２３．前記ペプチドが式： 【配列があります】　　 を含んでなる、請求項２２記載の方法。
24. ２４．前記ペプチドが式： 【配列があります】　 を含んでなる、請求項２２記載の方法。
25. ２５．工程： ａ）ｒａｓ　ｐ２１タンパク質を標識し、ｂ）標識したｒａｓ　ｐ２１タンパク 質をペプチドと接触させることによって、標識したｒａｓ　ｐ２１タンパク質お よびペプチドからなる複合体を形成し、前記ペプチドはｒａｓ　ｐ２１タンパク 質に結合してＧＴＰの加水分解を阻害することができ、そして ｃ）前記複合体を検出する、 を含んでなる、試料の中のｐ２１タンパク質についてアッセイする方法。
26. ２６．前記ペプチドが、ＧＴＰの加水分解を阻害するＧＡＰタンパク質の断片に 機能的に類似する配列を含んでなる、請求項２５記載の方法。
27. ２７．前記ペプチドが式： 【配列があります】　 を含んでなる、請求項２５記載の方法。
28. ２８．前記ペプチドが式： 【配列があります】　 を含んでなる、請求項２５記載の方法。
29. ２９．前記ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体の検出が、前記ｒａｓ　ｐ２１タンパ ク質を放射性ＧＴＰで標識し、そして前記ＧＴＰを検出することを含んでなる、 請求項２５記載のｒａｓ　ｐ２１タンパク質についてアッセイする方法。
30. ３０．前記ペプチドがＧＴＰのＧＡＰ刺激加水分解を阻害するＧＡＰタンパク質 の断片に基づく配列を含んでなる、請求項２９記載の方法。
31. ３１．前記ペプチドが式： 【配列があります】 を含んでなる、請求項３０記載の方法。
32. ３２．前記ペプチドが式： 【配列があります】 を含んでなる、請求項３０記載の方法。
33. ３３．前記ペプチドが、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質に結合する能力を保持する第 １ペプチドの断片であり、該第１ペプチドは式： 【配列があります】　 を含んでなる、請求項２５記載の方法。
34. ３４．工程： ａ）ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体を標識し、ｂ）標識したｒａｓ　ｐ２１−Ｇ ＴＰ複合体をペプチドと接触させることによって接合体を形成し、前記ペプチド はＧＴＰの加水分解を阻害するｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合することが でき、そして ｃ）前記接合体を検出する、 を含んでなる、試料の中のｐ２１の存在または濃度を決定する方法。
35. ３５．前記ペプチドがＧＴＰの加水分解を阻害するＧＡＰタンパク質の断片に機 能的に類似する配列を含んでなる、請求項３４記載の方法。
36. ３６．前記ペプチドが式： 【配列があります】 を含んでなる、請求項３４記載の方法。
37. ３７．前記ペプチドが式： 【配列があります】　　 を含んでなる、請求項３４記載の方法。
38. ３８．前記ペプチドが、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体に結合する能力を保持す る第１ペプチドの断片であり、該第１ペプチドは式： 【配列があります】　　 を含んでなる、請求項３４記載の方法。
39. ３９．式： 【配列があります】　　 を含んでなるペプチドに対して抗体。
40. ４０．式： 【配列があります】　 を含んでなるペプチドに対する抗体。
41. ４１．工程： （ａ）ｐ２１とＧＴＰのｐ２１加水分解を阻害するペプチドとの接合体を形成し 、 （ｂ）前記ペプチド−ｐ２１接合体を前記ペプチドに対する抗体と接触させ、そ して （ｃ）前記接合体を検出する、 を含んでなる、試料の中のｐ２１についてアッセイする方法。
42. ４２．前記ペプチドがＧＴＰの加水分解を阻害するＧＡＰタンパク質の断片に機 能的に類似する配列を含んでなる、請求項４１記載の方法。
43. ４３．前記ペプチドが式： 【配列があります】 を含んでなる、請求項４１記載の方法。
44. ４４．前記ペプチドが式： 【配列があります】　 を含んでなる、請求項４１記載の方法。
45. ４５．腫瘍を有するヒトに有効量のペプチドを投与することからなり、前記ペプ チドはｒａｓ　ｐ２１タンパク質、ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体、およびｒａ ｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体から成る群より選択されるメンバーに結合することが できるＧＡＰタンパク質の断片からなる、前記ヒトを処置する方法。
46. ４６．前記ペプチドが、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質によりＧＴＰの加水分解を阻 害することができる、請求項４５記載の方法。
47. ４７．前記ペプチドがＧＡＰの存在下にｒａｓ　ｐ２１タンパク質によりＧＴＰ の加水分解を阻害することができる、請求項４５記載の方法。
48. ４８．前記ペプチドがｒａｓ　ｐ２１タンパク質、ｒａｓｐ２１−ＧＴＰ複合体 、およびｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体から成る群より選択されるメンバーから のＧＡＰを置換することができる、請求項４５記載の方法。
49. ４９．前記ペプチドがｒａｓ腫瘍遺伝子の形質転換された細胞を認識するリガン ドに結合する、請求項４６記載の方法。
50. ５０．前記ペプチドを非経口的に投与する、請求項４５記載の方法。
51. ５１．前記ペプチドが式： 【配列があります】　 を含んでなる、請求項４５記載の方法。
52. ５２．前記ペプチドが式： 【配列があります】 を含んでなる、請求項４５記載の方法。
53. ５３．前記ペプチドが式： 【配列があります】　 を含んでなるペプチドの断片であり、前記断片はｒａｓ　ｐ２１タンパク質、ｒ ａｓ　　ｐ２１−ＧＴＰ複合体、およびｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体から成る 群より選択されるメンバーに結合する能力を保持する、請求項４６記載の方法。
54. ５４．癌を有するヒトに有効量のペプチドを投与することからなり、前記ペプチ ドはｒａｓ　ｐ２１タンパク質、　ｒａｓ　ｐ２１−ＧＴＰ複合体、およびｒａ ｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体から成る群より選択されるメンバーへの結合について ＧＡＰまたはＧＡＰタンパク質の断片と競争することができる、前記ヒトを処置 する方法。
55. ５５．前記ペプチドがｐ２１タンパク質によりＧＴＰの加水分解を阻害すること ができる、請求項５４記載の方法。
56. ５６．ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体に結合しそして前記複合体からのＧＤＰの 解離を仲介することができるペプチド。
57. ５７．前記ペプチドがＧＡＰタンパク質の断片を含んでなる、請求項５６記載の ペプチド。
58. ５８．前記ペプチドが、【配列があります】から成る群より選択される式を含ん でなる、請求項５７記載のペプチド。
59. ５９．ｒａｓ　ｐ２１−ＧＤＰ複合体への結合および前記複合体からのＧＤＰの 解離の仲介について請求項２８記載のペプチドと競争することができるペプチド 。